phân lập và tuyển chọn môt số chủng vi khuẩn cố định nito tự do azotobacter sp. trên một số loại đất ở đắc lắc

B

GIÁO D C VÀ ÀO T O

TRƯ NG

I H C TÂY NGUYÊN

LÊ QUANG DŨNG

PHÂN L P VÀ TUY N CH N M T S
VI KHU N C

NH NITƠ T

TRÊN M T S

LO I

CH NG

DO Azotobacter sp.
T

ĂK LĂK

LU N VĂN TH C SĨ SINH H C

BUÔN MA THU T, NĂM 2011

L I CAM OAN
Tôi xin cam oan ây là công trình nghiên c u c a riêng tơi, các s li u
và k t qu nghiên c u trong lu n văn là trung th c, ư c các

ng tác gi cho

phép s d ng và chưa ư c công b trong b t kỳ m t cơng trình nào khác.

H tên tác gi

Lê Quang Dũng


L I C M ƠN
Trong quá trình h c t p nghiên c u và

hoàn thành b n lu n văn này, tơi

xin bày t lịng bi t ơn chân thành và kính tr ng

n:

PGS.TS. Nguy n Anh Dũng, ngư i tr c ti p hư ng d n khoa h c, ã t n
tình ch d n tơi hồn thành lu n văn t t nghi p.
PGS. TS. Nguy n H u Hi p, TS. Võ Th Phương Khanh, Th y cô giáo
trong b môn sinh h c khoa KHTN&CN, cùng t p th các th y cô giáo c a
trư ng

i h c Tây Nguyên ã giúp

tôi trong su t quá trình h c t p nghiên

c u và óng góp nh ng ý ki n quý báu cho tơi hồn thành lu n văn này.
Nh ng anh ch l p cao h c Sinh H c Th c Nghi m khóa 3, ã cùng tơi san
s nh ng bu n vui, cùng nhau h c t p và trao

i ki n th c trong quá trình làm

tài.
Các em sinh viên CN Sinh K07 và các anh ch làm vi c trong b môn sinh
h c th c v t, b môn khoa h c v
th c hi n

t, ã s n sàng giúp

tơi trong q trình

tài.

Cu i cùng tôi xin chân thành c m ơn nh ng nhà khoa h c trong ngành, các
ng nghi p, b n bè và ngư i thân ã

ng viên giúp

và t o i u ki n thu n

l i cho tôi trong quá trình h c t p và nghiên c u làm lu n văn t t nghi p.

ăk Lăk, tháng 10 năm 2011.
Tác gi

Lê Quang Dũng


DANH M C CÁC B NG
2.1

N ng

IAA thành l p

th

ư ng chu n

29

3.1

Ký hi u,

3.2

Mơ t Hình thái khu n l c c a 24 ch ng vi khu n phân l p ư c

36

3.3

Kh năng c

40

3.4

Kh năng sinh IAA c a các ch ng vi khu n Azotobacter sp.

a i m phân l p các ch ng vi khu n trên môi trư ng Ashby

nh nitơ c a các ch ng vi khu n Azotobacter sp.

42

3.5

nh hư ng c a các ch ng vi khu n Azotobacter sp.

3.6

nh hư ng các ch ng vi khu n Azotobacter sp.

3.7.

nh hư ng c a các ch ng VK Azotobacter sp.

n kh i lư ng r cây c i

3.8.

nh hư ng c a các ch ng VK Azotobacter sp.

n năng su t cây c i ng t 48

3.9.

nh hư ng c a m t

vi khu n Azotobacter sp.

n s lá cây c i ng t

3.10.

nh hư ng c a m t

vi khu n Azotobacter sp.

n chi u cao cây c i ng t 52

3. 11.

nh hư ng c a m t

vi khu n Azotobacter sp.

3.12.

nh hư ng c a m t

vi khu n lên di n tích lá cây c i ng t

3.13.

nh hư ng c a m t

vi khu n Azotobacter sp.

n s lá cây c i ng t

34

44

n chi u cao cây c i ng t 45
47

50

n kh i lư ng r cây c i ng t 53
55

n năng su t cây c i ng t 56

3.14. Hàm lư ng nitơ t ng s (mg/l) c a 4 ch ng vi khu n Azotobacter sp. tuy n
ch n nuôi c y t các ngu n carbon khác nhau.

58

3.15. Hàm lư ng nitơ t ng s (mg/l) c a 4 ch ng vi khu n Azotobacter sp.
tuy n ch n nuôi c y

các n ng

glucose khác nhau

61

3.16. Hàm lư ng nitơ t ng s (mg/l) c a b n ch ng vi khu n Azotobacter sp.
tuy n ch n nuôi c y trên các kho n nhi t

khác nhau

63

3.17. Hàm lư ng nitơ t ng s (mg/l) c a 4 ch ng vi khu n Azotobacter sp.
tuy n ch n ư c nuôi c y

các pH khác nhau

65

3.18. Hàm lư ng nitơ t ng s (mg/l) c a 4 ch ng vi khu n Azotobacter sp.
tuy n ch n nuôi c y

các th i gian khác nhau

67


M

1. Tính c p thi t c a
Gi a

U

tài

t, vi sinh v t và cây tr ng có m i quan h tác

nhau. Quá trình hình thành

t và

phì c a

ng qua l i l n

t ch u nh hư ng c a các y u t

v t lí, hóa h c và vi sinh v t. Vi sinh v t t ng h p và gi i phóng vào
ch t h u cơ c n thi t t o
thi t cho vi sinh v t,

phì cho

t, ngư c l i

t và vi sinh v t cùng tác

t nh ng

t là môi trư ng s ng c n

ng r t l n

n cây tr ng,

c

bi t cung c p ngu n dinh dư ng, m t trong các ngu n dinh dư ng quan tr ng
cho cây tr ng là ngu n nitơ [8].
Ngư i ta nh n th y mu n thu ho ch 12 t h t trên m i hecta, cây tr ng
l y i kh i

t kho ng 30 kg nitơ [3]. Theo th ng kê hàng năm các s n ph m

nông nghi p trên th gi i l y i kh i

t kho ng 100 – 110 tri u t n nitơ (G.

Colar và Greenland) [3]. Trong khi ó lư ng phân nitơ hóa h c hi n nay ch bù
p ư c m t ph n lư ng nitơ mà cây l y i kh i
s d ng phân hóa h c làm

t x u i, m t cân

t. L m d ng quá m c vi c
i các ch t dinh dư ng và làm

gi m h vi sinh v t có ích, hơn n a vi c s n xu t phân nitơ hóa h c cịn g p

nhi u khó khăn, giá thành khá cao. V n
lư ng dinh dư ng nitơ cho
phí s n xu t, b o v

t ra là làm th nào

b sung

t m t cách có hi u qu nh t, v a ti t ki m ư c chi

ư c môi trư ng.

M t trong nh ng gi i pháp ang ư c áp d ng

c it o

t hi n nay là

s d ng phân bón vi sinh v t. Nhóm vi sinh v t trong phân có tác d ng c i thi n
phì, cân b ng dinh dư ng trong

t, c i thi n các tính ch t lý, hóa c a

t, và

c bi t h n ch ô nhi m môi trư ng, cũng như ô nhi m môi trư ng nư c do q
trình r a trơi [1].
Trong t nhiên, ngồi ngu n nitơ ư c t o ra cho

t t quá trình amon hóa,

q trình nitrat hóa, ngu n nitơ cịn ư c t o ra t quá trình c
ư c th c hi n b i các nhóm vi sinh v t trong
nhóm vi khu n c

t, trong ó có s

nh nitơ phân t
óng góp c a

nh nitơ t do Azotobacter sp. Các vi sinh v t thu c nhóm


này có kh năng chuy n hóa nitơ phân t thành các h p ch t ch a nitơ mà cây
tr ng có kh năng h p th

ư c [3].

Azotobacter sp. là m t lo i vi khu n hi u khí, s ng t do trong
có kh năng c

nh

t, chúng

m cao và không ph thu c vào cây ch . Ngồi

c i m

trên thì m t s ch ng thu c chi này cịn có kh năng sinh t ng h p nên IAA

(ch t kích thích sinh trư ng

th c v t). Chính nh

c i m quan tr ng ó vi

khu n Azotobacter sp. ư c ng d ng r ng rãi trong các ch ph m phân bón vi
sinh v t làm tăng năng su t cây tr ng.
Vi t Nam ã có m t s cơng trình nghiên c u v vi sinh v t c
t do trên m t s lo i

t

nh nitơ

làm phân vi sinh, nhưng hi n nay chưa có m t

nghiên c u nào v thành ph n loài thu c chi Azotobacter sp. trên m t s lo i

t

ăk Lăk.
Xu t phát t th c t

ó, chúng tơi ti n hành nghiên c u

và tuy n ch n m t s ch ng vi khu n c
m t s lo i

t

2. M c tiêu c a

nh nitơ t do Azotobacter sp. trên

ăk Lăk”.
tài

- Tuy n ch n ư c m t s ch ng Azotobacter sp. c
s lo i
-

t

tài: “Phân l p

nh

m cao trên m t

ăk Lăk.

ánh giá hi u qu c a m t s ch ng vi khu n Azotobacter sp.

iv is

sinh trư ng c a cây c i ng t (Brassica juncea)
3. Ý nghĩa c a

tài

Ý nghĩa khoa h c
tài góp ph n phân l p, tuy n ch n m t s ch ng vi khu n Azotobacter sp.
b n

a có kh năng c

nh

m cao trên m t s lo i

vào công công tác b o t n a d ng vi sinh v t

t

ăk Lăk, góp ph n

ăk Lăk và Tây Nguyên.

Ý nghĩa th c ti n
tài là cơ s cho vi c l a ch n các ch ng Azotobacter sp. trên m t s
lo i

t

ăk Lăk có ho t tính c

nh nitơ cao

s n xu t phân vi sinh có hi u

qu , nâng cao

phì nhiêu c a

t, h n ch bón phân hóa h c, tăng năng su t

cây tr ng và góp ph n phát tri n m t n n nông nghi p sinh thái b n v ng.


Chương 1. T NG QUAN TÀI LI U
1.1. Ngu n nitơ trong t nhiên
Trong nư c, nitơ ch y u

d ng h p ch t c a NH4+, NO2-, NO3-. Trong

t

có 2 d ng nitơ t n t i ó là nitơ vơ cơ trong các mu i khống và nitơ h u cơ
trong xác, ch t bài ti t t sinh v t. Các h p ch t ch a nitơ trong xác, ch t bài ti t
c a

ng v t và th c v t b m t s lo i n m và vi khu n phân gi i.
Trong

t amon h u như chuy n hóa tồn b thành h p ch t nitrat. Ph n l n

h p ch t nitrat ư c th c v t h p th , ph n còn l i b m t i do mưa r a trôi và
tác d ng c a ph n nitrat hóa.

H p ch t

m mà th c v t hút t

ph n còn l i ư c
bài ti t tr l i

t m t ph n như g c r

t,

ng v t và th c v t d dư ng tiêu th , l i bi n thành các ch t

t. Nh ng ch t h u cơ này dư i tác d ng c a nhi u lo i vi sinh

v t, n m b kh thành

m

d ng h u hi u.

Nitơ trong khơng khí t n t i ch y u
80%,

ư c tr l i

d ng nitơ phân t (N2) chi m kho ng

d ng nguyên t kép (N2) ư c khóa ch t v i nhau thơng qua liên k t

c ng hóa tr b n v ng (N≡N). M c dù r t c n nguyên t này, nhưng cây ch có
th h p th

ư c nitơ

d ng NO3- và NH4+ [3].

s d ng ư c ngu n nitơ l n

t khơng khí có 2 con ư ng chính là hóa h c và sinh h c.
Hóa h c: K t năm 1920, phương pháp công nghi p Haber - Bosch ã
giúp con ngư i phá v liên k t ba này. Bi n pháp này òi h i ph i th c hi n
nhi t

r t cao (450 – 500oC), áp su t là 125 atm và Fe3+ là ch t xúc tác. Các

h p ch t nitơ ư c t ng h p hóa h c trên cung c p cho cây tr ng m t ngu n nitơ
l n và n

nh. Tuy nhiên, bên c nh vi c s d ng phân

m t ng h p hóa h c

cho nơng nghi p có th làm tăng năng su t cây tr ng thì cũng em l i nh ng tác
h i cũng khơng nh , vì trung bình ch có 40 – 50 % lư ng
thu, ph n cịn l i gây ơ nhi m mơi trư ng

m bón ư c cây h p

t, nư c, khơng khí… t

ó gây h i

th m chí là tiêu di t các sinh v t có l i. Các h p ch t ch a nitơ c a phân bón hóa
h c gây h i r t l n

i v i cá,

ng v t thân m m và k c con ngư i.


Sinh h c: Nh các vi sinh v t có th ti t ra enzyme nitrogenase
quá trình sinh h c

c bi t - quá trình c

th c hi n

nh nitơ. Nhóm vi sinh v t có kh năng

th c hi n quá trình này ư c g i là các vi sinh v t c

nh nitơ. Vi c s d ng

phân bón vi sinh làm

m t t hơn, tăng cư ng

kh năng c i t o

t không b ô nhi m, kh năng gi

t do các h sinh v t có ích ho t

ng m nh làm cho

t tơi

x p hơn, cây d hút ch t dinh dư ng hơn. Ngồi ra, cịn có các con ư ng t o
nitơ khác như do s m ch p hay cháy [12].
1.2. Vai trò c a nitơ

i v i th c v t

Nitơ là thành ph n quan tr ng c u t o nên các phân t h u cơ như protein,
di p l c, ATP… Hàm lư ng nitơ trong thành ph n các ch t khô c a th c v t dao
ng t 1 – 3%. Tuy hàm lư ng trong cây th p nhưng nitơ có vai trò sinh lý
bi t quan tr ng trong

c

i s ng sinh trư ng phát tri n và hình thành năng su t c a

cây tr ng. Thi u nitơ, cây sinh trư ng kém, chlorophyll không ư c t ng h p
y

, lá vàng,

nhánh và phân cành kém, sút gi m ho t

năng su t gi m. N u th a nitơ cũng s

ng quang h p nên

nh hư ng nghiêm tr ng

n sinh trư ng,

phát tri n và năng su t c a cây tr ng. như cây sinh trư ng m nh thân lá tăng
nhanh nên cây r t y u, d

, thu ho ch g p nhi u khó khăn.

1.3. Q trình chuy n hóa nitơ trong t nhiên
1.3.1. Q trình khống hóa
Q trình khống hóa là quá trình phân h y xác h u cơ dư i tác

ng c a

qu n th vi sinh v t thành các ch t khống hịa tan hay các ch t khí và t a nhi t,
tùy thu c vào i u ki n khống hóa mà cho các s n ph m khác nhau. Giai o n
này có s tham gia c a các ch ng vi sinh v t nitrat hóa như Nitrosomonas và
Nitrobacter - nh ng vi khu n tham gia vào q trình oxy hóa nh ng h p ch t
ch a nitơ thành nitrat (NO3-), m t d ng thích h p

cho cây tr ng h p thu.


Vi khu n amon hóa
NH4+

H p ch t h u cơ
Vi khu n nitrat hóa
NH4

+

NO2Nitrosomonas
Nitrobacter

NO2-

NO3-

1.3.2. Q trình ph n nitrat hóa
Là q trình phân h y chuy n hóa h p ch t nitrat trong i u ki n y m khí
dư i tác d ng c a vi sinh v t t o thành nitơ.
Vi khu n ph n nitrat hóa
NO3-

N2

1.3.3. Q trình c

nh nitơ phân t

Q trình này ư c th c hi n do các vi sinh v t c
s ng c ng sinh

r cây h

nh nitơ như Rhizobium

u hay Azotobacter s ng t do, s bi n

i N2 trong

khơng khí thành NH3, t NH3 s t ng h p ra các h p ch t ch a nitơ khác cung
c p cho cây tr ng và

ng th i làm giàu thêm nitơ cho

ra thì ph i có l c kh m nh, ATP và th c hi n
i u ki n này enzyme nitrogenase m i ho t

ng).
H2O

N 2 + H2

NH3
nh

t.

NH4+

m

Cơ ch hóa sinh c a quá trình c

trong

quá trình này x y

i u ki n k khí (do ch trong

Nitrogenase
Vi khu n c

t.

nh nitơ c a vi khu n s ng t do


Cơ ch hóa sinh c a q trình c

nh N2 c a vi sinh v t cho

chưa ư c sáng t hoàn toàn, nhưng a s các nhà nghiên c u
thuy t cho r ng NH3 là s n ph m
thuy t v 2 con ư ng c

n nay v n
ng ý v i gi

ng hóa sơ c p c a N2 và có th nêu ra gi

nh N2 c a vi khu n s ng t do trong

t như sau:

Trong công nghi p, nh các ch t xúc tác nên năng lư ng dùng cho ph n
ng c

nh N2 ư c gi m nhi u, ch vào kho ng 16 – 20 Kcal/M, song lư ng

năng lư ng v n còn l n so v i trong cơ th sinh v t. T c
chóng trong t bào vi sinh v t

nhi t

ph n ng nhanh

th p nh có h th ng hydrogenase ho t

hóa H2 và nitrogenase ho t hóa N2.
Năm 1961 – 1962, ngư i ta ã tách t Clostridium pasteurrianum hai ti u
ph n ho t hóa H2 và N2. Sau này ngư i ta tìm th y

Azotobacter cũng có các

ti u ph n ó. Trong quá trình ho t hóa này có s tham gia c a 2 nguyên t
khoáng Mo và Fe.


Ngu n hydro

kh N2 có th là hydro phân t (H2). Trong trư ng h p này

thì dư i tác d ng c a hydrogenase, i n t

ư c chuy n theo h th ng:

Ngu n cho i n t và hydro là acid pyruvic.

áng chú ý là trong quá trình

chuy n i n t có s tham gia tích c c c a feredoxine (Fd). Fd là c u n i gi a 2
h enzyme hydrogenase và nitrogenase

S c

c

nh N2.

nh N2 c a vi khu n n t s n có th x y ra theo sơ

ph c t p hơn.

Trong các n t s n có m t ch t có b n ch t HEM r t gi ng v i hemoglobin trong
máu g i là leghemoglobin. Nó d
oxyhemoglobin. Leghemoglobin ch
v i cây b

bi n thành

ư c t o nên khi vi khu n s ng c ng sinh

u, cịn khi ni c y tinh khi t các Rhizobium s khơng t o

leghemoglobin và khơng c
trình c

dàng liên k t v i O2

nh ư c N2. Nh ng nghiên c u g n ây v quá

nh N2 cho th y q trình c

nh này ịi h i:

Có s tham gia c a enzyme nitrogenase. Có th coi ây là nhân t chìa khóa
cho q trình này. Enzyme này ho t

ng trong i u ki n y m khí.

Có l c kh m nh v i th năng kh cao (NAD, NADP,...)


Có năng lư ng ATP
ho t

và có s

tham gia c a nguyên t vi lư ng. Nhóm

ng c a enzyme nitrogenase có ch a Mo và Fe. Vì v y s d ng Mo và Fe

cho cây h

u thư ng có hi u qu r t cao.

Ti n hành trong i u ki n y m khí. Các ch t kh là NADH2 và Fd cùng v i
năng lư ng do hô h p, quang h p c a cây ch cung c p. S c
nhi u năng lư ng, c n 16 ATP

nh N2 c n r t

kh 1 N2. NH3 t o thành trong quá trình c

nh N2 ư c s d ng d dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid
m t cách nhanh chóng các acid amine, t
nhi u quá trình trao
Ph n ng c

t ng h p

ó tham gia vào t ng h p protein và

i ch t khác.
nh nitơ ư c xúc tác b i enzyme nitrogenase theo phương

trình sau:
N2 + 8 H+ + 8 e- +16 ATP → 2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi
Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho ph n ng kh N2 thành NH3
trong s hi n di n c a ATP và ch t kh như dithionite trong phịng thí nghi m
hay ferredoxin trong cơ th s ng. Nitrogenase là m t ph c h enzyme ư c c u
t o b i 2 thành ph n, ó là protein có phân t nh . M t thành ph n g i là protein
s t – molypden (Mo – Fe protein) còn g i là thành ph n I, thành ph n kia g i là

protein s t (Fe protein), còn g i là nitrogenase kh hay thành ph n II. Thành
ph n I và thành ph n II c a nitrogenase
ho t

ng c

u r t m n c m v i oxy, vì v y nên

nh nitơ c a vi sinh v t di n ra trong i u ki n k khí [18].

1.4 . T ng quan v vi khu n c

nh Nitơ

Ngư i ta nh n th y mu n thu ho ch 12 t h t trên m i hecta, cây tr ng l y
i kh i

t kho ng 30 kg nitơ [3]. Theo th ng kê hàng năm các s n ph m nông

nghi p trên th gi i l y i kh i

t kho ng 100 – 110 tri u t n nitơ (G. Colar và

Greenland) [3]. Trong khi ó lư ng phân nitơ hóa h c hi n nay ch bù
m t ph n lư ng nitơ mà cây l y i kh i
b i m t quá trình sinh h c

p ư c

t, nh ng t n th t v nitơ ư c bù

c bi t g i là quá trình c

p

nh nitơ do vi sinh v t

th c hi n, chúng có kh năng chuy n hóa nitơ phân t trong khơng khí thành các


h p ch t ch a nitơ và làm giàu thêm ngu n

m trong

t, có th x p chúng

thành ba nhóm l n:
+ Nhóm vi sinh v t s ng c ng sinh v i th c v t.
+ Nhóm vi khu n s ng t do.
+ Nhóm vi khu n lam.
1.4.1. Nhóm Vi sinh v t s ng c ng sinh v i th c v t
1.4.1.1. Vi khu n n t s n c ng sinh v i cây b

u

Nhà khoa h c Hà Lan M.W. Beijrinck ã phân l p ư c loài vi khu n s ng
c ng sinh trong n t s n

r m t cây thu c b

u và ông

t tên là Bacillus

radicicola, vi khu n này ư c x p vào chi riêng Rhizodium.
Trên môi trư ng

c, vi khu n n t s n thư ng có khu n l c trơn bóng, nh y,

vơ màu. Khi cịn non t

bào c a chúng có d ng hình que ho c c u

0,5 – 0,9 x 1,2 – 3,0 m, có kh năng di
b t

ng nh tiêu mao; khi già t bào tr nên

ng kích thư c l n phân nhánh g i là th gi khu n [3], [8].
ây là các loài hi u khí, tuy nhiên vi khu n n t s n v n có th s d ng

ư c ngay c

trong trư ng h p ch có m t áp l c oxy r t th p kho ng 0.01atm.

a s chúng thích h p
hơn 8.0 nhi t

pH = 6,5 – 7,5, b c n tr khi pH= 4,5 – 5,0 ho c l n
o

thích h p 24 – 26 C,

o

37 C s phát tri n c a chúng b c n tr

[6], [7].
Vi khu n n t s n xâm nhi m vào r cây b
thông qua v t thương
khu n n t s n c n

u thông qua lông hút, ôi khi

v r . Ngư i ta nh n th y mu n xâm nhi m t t thì vi

t t i 104 t bào/gam

t. Dư i nh hư ng c a vi khu n, r

ti t ra enzyme polylacturonase phân h y thành lông hút, t o i u ki n cho vi
khu n xâm nh p vào r . H ng năm vi khu n n t s n c ng sinh trong r cây b
u có th làm giàu cho

t kho ng 50 – 600 kg nitơ/ha [3].


1.4.1.2. Vi sinh v t c

nh

m c ng sinh trong m t s cây khơng thu c b

u
Ngồi nh ng lo i cây thu c b

u thì nh ng lồi cây khơng thu c b

u

cũng có kh năng t o n t s n như: m t s th c v t thu c ngành h t tr n:
Bowenia, Cycas...m t s th c v t hai lá m m: Coffee, Coriaria,... Ngoài ra m t
s th c v t cịn có kh năng t o n t s n trên lá.
Qua nghiên c u cho th y, ngoài vi khu n n t s n m t s loài x khu n
thu c chi Frankia (c ng sinh trong r loài Casuarina) nhi u loài n m r (khu n
căn hay mycorhiza ) cũng có kh năng c

nh nitơ phân t , t o n t s n. Có

nhi u nghiên c u cho th y, nh tác d ng c a n m r mà

t thông Pinus radiala

M h ng năm làm giàu thêm kho ng 50 kg nitơ/ha [3].
Ngày nay, các nhà khoa h c có th phân l p, nuôi c y vi khu n c

nh nitơ

c ng sinh Rhizobium

s n xu t ch ph m Nitragin

khi gieo. Vi khu n s

ư c nuôi c y trên mơi trư ng thích h p sau ó h p ph

vào ch t mang là

t, than bùn

1.4.2. Nhóm Vi khu n c
1.4.2.1. Vi khu n c

x lý h t gi ng

b o qu n và s d ng.

nh nitơ t do

nh nitơ t do k khí Clostridium

Clostridium ư c phát hi n l n

u tiên b i Vinogradxki (1893). T bào

Clostridium hình que có kích thư c 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 m, có th
r ho c k p ơi thành chu i ng n. Khi cịn non có kh năng di
kh năng di

ng, bào t n m

ch u ư c nhi t

u trư c

ng riêng

ng, khi già m t

trung tâm, khu n l c nh n và tr ng có kh năng

cao và khơ h n [5].

Vi khu n Clostridium có nhi u lồi có kh năng c

nh nitơ phân t như:

Cl. pasteurianum, Cl. butylicum .... nhưng lồi có kh năng c
là Clostridium pasteurianum. Chúng có kh năng c
khi tiêu th h t 1g carbon. Ph m vi ho t

ng c

nh

m cao nh t

nh ư c 5 – 10 mg nitơ

nh nitơ c a Clostridium trong

kho ng pH khá r ng 4,7 – 8,5, t i thích là 6,9 – 7,3.


1.4.2.2. Vi khu n c

nh nitơ t do hi u khí

Nhóm này g m hai chi chính là Beijerinskia sp. và Azotobacter sp.
1.4.2.2.1. Nhóm vi khu n thu c chi Beijerinskia sp.
Beijerinskia sp. là loài vi khu n hi u khí c

nh nitơ r t gi ng v i

Azotobacter sp. Chúng ư c phân l p b i R. J. Starkey (1939), t bào có hình
d ng thay

i như hình c u, hình que, hình b u d c. Beijerinski là vi khu n gram

âm, không sinh bào t và bào xác,

c i m chung c a vi khu n thu c chi này là

ch u chua cao. Có kh năng s ng t t trong môi trư ng acid (pH=3), và nhi t
t 16 – 37OC.
Trên môi trư ng vơ
Vi khu n có kh năng c

m, sau 3 ngày nuôi c y xu t hi n khu n l c nh y. L i.
nh ư c 16 – 20 mg nitơ khi

dư ng carbon. Ngồi kh năng c

ng hóa h t 1g dinh

nh nitơ chúng cịn có kh năng t ng h p các

ch t kích thích sinh trư ng cho cây tr ng.
1.4.2.2.2. Nhóm vi khu n thu c chi Azotobacter sp.
Azotobacter sp. u c phân l p l n

u tiên vào năm 1901 (M. Beijerinck).

Chúng thu c vi khu n hi u khí nhưng chúng có th phát tri n trong i u ki n k
khí. H u h t các loài Azotobacter sp.

u s ng d dư ng.

Azotobacter sp. là vi khu n gram âm, không sinh bào t có kh năng c
nitơ t

nh

do. Khi chưa trư ng thành t bào thư ng có hình que, kích thư c

2,0 – 7.0 x 1,0 – 2,5 m, sinh s n b ng cách phân c t, di chuy n nh tiêm mao.
Khi trư ng thành m t kh năng di chuy n, kích thư c thu nh thành d ng c u
ư c bao b c b i m t l p nh y.
Trong môi trư ng không ch a nitơ, Khu n l c c a Azotobacter sp. có d ng
c u l i, nh n bóng, có khi nhăn nheo. Khi ni c y trong mơi trư ng

c. Khu n

l c có màu h ng ho c nâu en, sinh s c t hình quang màu vàng l c ho c lam
l c, s c t khu ch tán vào môi trư ng [5], [16].


Azotbacter sp. r t nh y c m v i
t khống có trong

mc a

t và hàm lư ng c a các nguyên

t (P, K, MO, B, Cu...)

Nhi u nghiên c u cho bi t Azotobacter sp. có th phát tri n ươc trên mơi
trư ng có pH trong kho ng 4,5 – 9. quá trình c
trong kho ng pH 5,5 – 7,2. Nhi t

nh nitơ ch

ư c th c hi n

thích h p nh t t 26 – 30oC [6], [7].

Các ch ng phân l p t t nhiên có kh năng c

nh 10 – 15 mg nitơ khi tiêu

th h t 1g dinh dư ng Carbon. M t s nịi tuy n ch n có kh năng c

nh t i

30 mg/1 g dinh dư ng Carbon.
Trong

t, Azotobacter sp. t p trung

vùng

t xung quanh r cây. Ngoài kh

năng cung c p dinh dư ng nitơ cho cây nó cịn có kh năng kích thích n y m m,
kích thích sinh trư ngTrong

t, Azotobacter sp. thư ng ph bi n các ch ng sau:

+ Azotobacter chrococum: Kích thư c t bào 2,0 x 3,1 micromet, có kh
năng di

ng khi cịn non. Khi già hình thành nang xác, khu n l c có màu nâu

ho c en khi v già, khơng khu ch tán ra môi trư ng [24], [25].
+ Azotobacter beijerinckii: Có kích thư c 2,4 x 4,6 m. Khơng có kh
năng di

ng và hình thành nang xác. Khu n l c khi già có màu nâu sáng, s c t

khơng khu ch tán ra mơi trưịng ni c y.

+ Azotobacter vinelandii: T bào có kích thư c 1,5 x 3,4 m, có kh năng
di

ng và hình thành nang xác. Khu n l c màu l c huỳnh quang, s c t khu ch

tán vào môi trư ng [19], [26].
+ Azotobacter agilis: T bào có kích thư c 2,8 x 3,3 m, có kh năng di
ng, khơng hình thành nang xác, khu n l c màu vàng l c huỳnh quang, s c t
khu ch tán vào môi trư ng [2].


1.4.3. Nhóm vi khu n lam
Năm 1928, Drewes (
năng c

c) l n

u tiên ch ng minh m t cách xác áng kh

nh nitơ c a ba lo i khu n lam và ã phân l p chúng m t cách thu n

khi t.
a s các lồi khu n lam có kh năng c

nh nitơ s ng t do trong

t,

trong nư c nhưng cũng có m t s s ng c ng sinh trong th c v t.
ây là vi sinh v t hi u khí, chúng thích h p phát tri n trong mơi trư ng

trung tính ho c ki m. Nhi t
c p cho

thích h p t 28 – 30oC. Chúng có kh năng cung

t kho ng 50 kg nitơ/ha/năm [2].

Ngồi các nhóm vi sinh v t c

nh nitơ ch y u nói trên ngư i ta cịn th y

nhi u vi sinh v t thu c nhóm khác cũng có kh năng
xanh L c, m t s

ng hóa nitơ như: T o

i di n c a n m men và n m m c (Saccharomyces

apiculatus, Oidium Lactic...)
Có th nói vi sinh v t óng vai trị h t s c quan tr ng
trong vi c cung c p

m sinh h c cho

t. V n

i v i nông nghi p

t ra cho các nhà khoa h c

hi n nay là nghiên c u phương pháp nuôi c y hi u qu nh t
bào. T

ó ng d ng vào nơng nghi p, hư ng

sinh thái v ng b n trong c nư c nói chung và

tăng sinh kh i t

n m t n n s n xu t nông nghi p
t nh Tây Ngun nói riêng.

1.5. Tình hình nghiên c u ngoài nu c
Hi u qu c a vi c nhi m ch ph m Azotobacter sp. cho
cây con ã ư c ch ng minh trên các thí nghi m

t và h t gi ng,

ng ru ng. Theo nghiên c u

c a Puneet (1998) cho th y vi c nhi m Azotobacter sp. kích thích n y m m c a
h t, kích thích ra r và sinh trư ng, năng su t lúa mỳ, ngô tăng 10 – 15 % so v i
i ch ng [27], [28] T ng k t các k t qu nghiên c u c a Nh t B n, Hoa Kỳ,
Trung Qu c, n

cho th y s d ng ch ph m Azotobacter có th cung c p cho

cây tr ng t 30 – 60 kg nitơ /ha/năm và t ng lư ng nitơ do vi sinh v t t ng h p
trên hành tinh có th

t

n 240 tri u t n/năm. Vi khu n c

nh nitơ t do


Azotobacter cịn có kh năng t ng h p B1, giberellin, cytokinin, IAA kích thích
tăng trư ng cây tr ng.
Theo Subba Rao (1988) cơng b

n

ti n hành bón ch

ph m

Azotobacter cho lúa mì 3 l n trong năm:
- L n 1: bón 20 kg ch ph m Azotobacter/ha vào tháng 4 – 5.
- L n 2: bón 15 kg/ha vào tháng 7.
- L n 3: bón 15 kg/ha vào tháng 10.
V i qui trình bón như v y, có th
cây tr ng

áp ng ư c 30 % nhu c u nitơ c a

gi m lư ng bón phân hóa h c, góp ph n phát tri n b n v ng nông

nghi p.
Bagyaraj và Menger (1978) ã nghiên c u tương tác gi a Azotobacter

chroococcum và các vi sinh v t vùng r và sinh trư ng c a cà chua. K t qu cho
th y cà chua ư c

v i ch ng c

c a cà chua lên 65 % so v i
ch ng Azospirillum

nh nitơ Azotobacter s tăng sinh kh i khô

i ch ng. Fulchieri (1994) nghiên c u s d ng 3

x lý h t cho ngô. K t qu cho th y ã làm chi u cao cây,

tăng sinh kh i và tăng năng su t ngô lên 59 % so v i

i ch ng [16].

Nghiên c u c a Puneet (1998) cũng cho th y n u bón ph i h p
Azotobacter sp. v i các ch ng phân gi i photpho như Aspergillus niger s làm
tăng năng su t lúa mì tăng 17,7 %, trong khi Azotobacter ch tăng 9 % [20].
Kapoor cũng cho k t qu tương t khi ph i h p ch ng Azotobacter sp. v i các
ch ng phân gi i phosphat như Bacillus sp., Pseudomonas sp. Thí nghi m làm
tăng năng su t lúa, bông v i lên 10 – 20 % [21].
El–Komy (2005) nghiên c u ph i h p hai ch ng c

nh nitơ

Azospirillum và phân gi i lân Bacillus megaterium x lý cho lúa mì. K t qu cho
th y hàm lư ng nitơ trong thân lúa mì c a các thí nghi m có x lý hai ch ng này

tăng 37 – 53 %; hàm lư ng photpho trong thân tăng 48,6 %; hàm lư ng kali tăng


10 – 14,3 % so v i

i ch ng không x lý. K t qu nghiên c u cũng cho th y x

lý ph i h p hai ch ng có tác d ng c ng hư ng, t t hơn x lý ơn ch ng [18].
Zemrany (2006) nghiên c u s d ng ch ng A. lipoferum cho ngô. K t qu
cho th y khi s d ng ch ng này ã làm gi m 50 % lư ng nitơ cho cây mà năng
su t v n

m b o.

1.6. Nghiên c u trong nư c
Nh m m c tiêu phát tri n nông nghi p sinh thái b n v ng và ng d ng công
ngh sinh h c vào nông nghi p, trong nh ng năm g n ây Vi t Nam có khá
nhi u nghiên c u v Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh h c [5].
Ph m Bích Hiên và c ng s (2003) ã nghiên c u 10 ch ng Azotobacter c a
Vi t Nam và nh n th y r ng ngoài kh năng c

nh nitơ chúng cịn có kh năng

sinh t ng h p ch t kích thích sinh trư ng IAA. Nhi t

thích h p c a các ch ng

này là 25 – 30oC, pH thích nghi r ng t 5,5 – 8,0 [8].
Ph m Ng c Lan (1999) ã phân l p ư c 37 ch ng Azotobacter trên

t gò

i vùng Th a Thiên- Hu . Nhóm nghiên c u cũng tuy n ch n ư c hai ch ng
có kh năng kháng sinh, t n t i ư c

pH ki m (pH=8). K t qu th nghi m

gây nhi m cây gi ng keo tai tư ng trong vư n ươm ã làm tăng t l s ng, sinh
kh i, chi u cao cây và hàm lư ng nitơ trong lá cũng cao hơn so v i

i ch ng

[12].
Nguy n Th Phương Chi (1999) nghiên c u bón th nghi m ch ng c
nitơ t

nh

do Azotobacter và ch ng phân gi i phosphate Archomobacter,

Pseudomonas aeruginosa. K t qu cho th y ch ph m sinh h c làm tăng sinh
trư ng chi u cao m 7,47 – 16,93 %, và năng su t lúa tăng t 13,39 – 55,85 %
[2].
Vũ Thúy Nga và Nguy n Ng c Quyên (2003) nghiên c u kh năng sinh t ng
h p IAA và phân gi i phosphate khó tan c a vi khu n Bradyrhizobium. K t qu


cho th y nhi u ch ng có kh năng t ng h p 20 – 100 microgam/ml môi trư ng
nuôi c y [13].
Lâm Minh Tú và Tr n Văn Tuân (2003) nghiên c u s n xu t m t s phân

bón ơn ch ng, a ch ng cho cây tr ng. Các ch ng s d ng trong nghiên c u là
Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus
polymyxa. Th nghi m trên khoai tây làm tăng năng su t t 100 – 300 % so v i
i ch ng [17].
Ph m Văn To n (2003) s d ng phân bón sinh h c gi m ư c 20 % phân bón
vơ cơ N, P, K nhưng năng su t khoai tây v n tăng so v i

i ch ng 15 – 50 %,

cà chua tăng 12 – 34 %, l c tăng 30 % và gi m áng k b nh héo xanh [16].
Nguy n Ng c Dũng và H Th Kim Anh (1999) nghiên c u nh hư ng c a
các ch ng c
tác gi

nh nitơ trong r lúa

n sinh trư ng c a m m lúa CR 203. Nhóm

ã phân l p ư c 78 ch ng c ng sinh v i r lúa. Các ch ng này có

c

i m c a chi Azospirillum. Các ch ng này kích thích s n y m m và ra r c a
lúa CR 203 [5]


Chương 2. N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
2.1. N i dung nghiên c u
t ư c m c tiêu c a

tài c n ti n hành nghiên c u các n i dung sau:

+ Phân l p, mô t m t s
c

c i m sinh h c và

nh danh các ch ng vi khu n

nh nitơ t do ã phân l p.
+ Tuy n ch n m t s ch ng Azotobacter sp. có ho t tính c

nh nitơ và IAA

cao.
+
cao

ánh giá hi u qu c a các ch ng Azobacter sp. có ho t tính c

nh nitơ

n kh năng sinh trư ng c a loài cây c i ng t Brassica juncea.

+ Xây d ng qui trình ni c y các ch ng Azotobacter sp. có ho t tính c

nh

nitơ cao.
+

nh hư ng ngu n dinh dư ng carbon

n sinh trư ng c a Azotobacter sp.

tuy n ch n.
+ nh hư ng c a nhi t

nuôi c y

n sinh kh i Azotobacter sp.

+ nh hư ng pH môi trư ng nuôi c y
+ nh hư ng th i gian nuôi c y
2.2.

i tư ng và

2.2.1.

n sinh kh i Azotobacter sp.

a i m nghiên c u

i tư ng nghiên c u

Các ch ng vi khu n c
t bazan nâu

nh nitơ t do Azotobacter sp. ư c phân l p

t i Tp. Buôn Ma Thu t và huy n Krông Ana,

Huy n Ea Kar và huy n Buôn ôn thu c
2.2.2.

n sinh kh i Azotobacter sp.

lo i

t xám t i

a bàn t nh ăk Lăk.

a i m nghiên c u

Thí nghi m ư c th c hi n t i:
- B môn Sinh h c th c v t, Khoa Nông Lâm Nghi p, trư ng
Nguyên.

i H c Tây


- Phịng thí nghi m Cơng ngh Sinh h c & Môi trư ng, Trư ng

i h c Tây

Nguyên.
- Tr i th c nghi m Khoa Nông Lâm.
2.2.3. Th i gian nghiên c u

tài th c hi n t tháng 09/2010 t i tháng 09/2011.
2.2.4 Thi t b và hóa ch t nghiên c u
- Các hóa ch t: K2HPO4, K2SO4, MgSO4.7H2O, NaCl, K2SO4, CaSO4.2H2O
CaCO3, Na2MoO4, FeCl3....Agar, Glucose là các hóa ch t tinh khi t.
- Thi t b nghiên c u:
+ ĩa petri, micropipette, ng nghi m, que c y, …
+ Box c y vô trùng,
+ Máy quang ph spectrophotometer Plus 100 (Nh t B n)
+T

m.

+ N i h p kh trùng.
+ Máy l c.
2.3. Phương pháp nghiên c u
2.3.1. Phương pháp phân l p
2.3.1.1. Phương pháp thu và b o qu n m u.
Phương pháp thu m u: m u
d ng c và túi

ng vô trùng, kho ng 100 g

c u ư c thu t i ba
khác nhau,

t ư c l y cách b m t

a i m khác nhau m i

ng nh t m u

l p ngay ho c b o qu n

có m t m u

nhi t

t kho ng 5cm b ng

t/1 m u. M i lo i hình

t nghiên

a i m thu 10 m u

10 v trí

t

t c n phân tích. M u thu c n phân

8oC.

2.3.1.2. Phương pháp pha loãng dung d ch.
- Cân 10 g m u

t cho vào 90 ml nư c c t vô trùng.

- Chu n b năm ng nghi m ánh s th t t 1
trùng.

n 5.

ng 1: ch a 10 ml nư c c t vô trùng, 4 ng còn l i ch a 9 ml nư c c t vô


- Dùng Micropipet hút 1ml dung d ch t bình tam giác ã hòa 10g
vào ng 1 l c

u. Sau ó hút 1ml t

ng 1 cho vào ng 2, l c

n ng 5. như v y chúng ta ti n hành pha loãng dung d ch

t cho

u. C ti p t c

các n ng

: 10-2,

10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
2.3.1.3. Môi trư ng phân l p Ashby.
Thành ph n môi trư ng Ashby:
Glucose

: 20 g.

K2HPO4

: 0,2 g.

MgSO4.7H20

: 0,2 g.

NaCl

: 0,2 g.

K2SO4

: 0,1 g.

CaCO3

: 5,0 g.

Agar

: 20 g.

Nư c c t v a

:1000 ml

pH = 7
Mơi trư ng Ashby l ng thì khơng b sung agar.

Môi trư ng th ch Ashby ư c h p kh trùng

1atm trong th i gian 30

phút. Sau ó, phân ph i môi trư ng vào các ĩa petri.
Khi môi trư ng ông
các n ng

c và ngu i dùng micropipet hút 100 µl dung d ch

pha lỗng khác nhau cho vào ĩa (3 ĩa/1 n ng

que g t th y tinh dàn

pha lỗng). Dùng

u trên ĩa th ch.

Gói các ĩa ã c y và

t vào t

m

khu n l c, mơ t và ch p hình.
2.3.1.4. B o qu n và gi gi ng thí nghi m.

nhi t

30oC sau 3 – 7 ngày quan sát

Sau khi thu úng khu n l c theo tài li u mô t , ch n các khu n l c ơn, c y
dòng thu n t 4 – 5 l n, sau ó c y vào ng th ch nghiêng,

t vào t

m

nhi t

30oC.
Sau 4 – 5 ngày làm tiêu b n, quan sát dư i kính hi n vi

xác

nh úng

i tư ng nghiên c u.
Các ng gi ng cho vào t l nh, b o qu n
kì sau 1 – 2 tháng

4oC. C y truy n

nhi t

nh

gi gi ng.

2.3.1.5. Phương pháp chu n b gi ng thí nghi m.
Trư c khi ti n hành m i thí nghi m chu n b 2 ng nghi m có ch a 5 ml
môi trư ng Ashby l ng, dùng que c y l y vi khu n Azotobacter sp. t các ng
gi ng, hòa tan vào 2 ng nghi m. L c
máy l c

m

nhi t

30oC trong t

u 2 ng nghi m b ng tay, ho c l c trên
m.

Sau 24 gi , dùng gi ng t 2 ng nghi m này

ti n hành các thí nghi m

ti p theo trong n i dung nghiên c u.
2.3.2. Phương pháp mô t m t s

c i m sinh h c.

Sau khi nuôi c y 4 ngày ti n hành quan sát khu n l c ơn dư i kính lúp
i n

phóng

i 4 x 10

xác

nh hình d ng, c u trúc, và b m t c t ngang

c a khu n l c và ch p hình khu n l c
sát t bào và ch p hình t bào
2.3.3 Phương pháp

phóng

phóng

i trên. Làm tiêu b n

quan

i 100 x 10.

nh danh các ch ng vi khu n ư c tuy n ch n b ng k
thu t PCR.

+ Nguyên t c:
nh danh Azotobacter sp. d a trên c p m i
nif H (gene c

c hi u cho khu ch

nh N) c a các ch ng Azotobacter sp. [23]

M i phát hi n Azotobacter có trình t như sau:

i gene