ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phân giải bã mía của nấm men s cerevisiae h13

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI BÃ MÍA CỦA
NẤM MEN S. cerevisiae H13

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN NGUYỄN LÊ BẢO TRÂN
PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3102871
LỚP: CNSH TT K36



Cần Thơ, tháng 12/2014
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI BÃ MÍA CỦA
NẤM MEN S. CEREVISIAE H13

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN NGUYỄN LÊ BẢO TRÂN
PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3102871
LỚP: CNSH TT K36
Cần Thơ, tháng 12/2014

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)


Ths. Võ Văn Song Toàn Nguyễn Lê Bảo Trân




PGs. Ts. Trần Nhân Dũng

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học

LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh sự cố gắng
của bản thân, tôi còn nhận được sự động viên khích lệ to lớn cả về vật chất lẫn tinh
thần từ gia đình. Đó chính là động lực to lớn giúp tôi vượt qua các khó khăn để
hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Xin gửi lới tri ân sâu sắc đến PGs. Ts Trần Nhân Dũng cùng với Ths. Võ
Văn Song Toàn, hai người đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí
nghiệm và hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảnh ơn tất cả các thầy cô trong Viện nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ dạy những kiến thức hữu ích giúp cho
việc thực hiện luận văn được thuận lợi.
Cám ơn các cô chú công nhân viên của Viện đã giúp đỡ trong quá trình làm
việc trong và ngoài giờ để tôi hoàn thành đề tài đúng tiến độ quy định.
Tôi cũng vô cùng biết ơn tất cả các thành viên của phòng Công nghệ

Enzyme, phòng Sinh hóa cùng các bạn lớp CNSH TT K36 đã tận lực giúp đỡ, chia
sẻ kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến gia đình và những người thân
đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên
trong cuộc sống.
Cuối lời, kính chúc mọi người luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, vui vẻ và thành
đạt trong cuộc sống.
Xin trân trọng cảm ơn!
Nguyễn Lê Bảo Trân
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh học

TÓM LƯỢC
Đề tài "Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phân giải bã mía của
nấm men H13" được tiến hành với mục tiêu chọn lọc điều kiện tối ưu để nấm men
H13 sinh trưởng và phân giải bã mía. Kết quả cho thấy mật số nấm men tăng cao
sau quá trình nuôi cấy. Với mật số ban đầu là 10
6
tế bào/ml, sau khi nuôi cấy với
cơ chất bã mía không rửa qua nước sau khi xay thu được 5,34x10
7
tế bào/ml. Khi
chủng 5% dịch nấm men vào môi trường thu được 6,66x10
7
tế bào/ml sau nuôi cấy,
tại pH5 thu được 5,35x10
7
tế bào/ml. Nhiệt độ tối ưu là 35
o
C thu được 9,28x10

7
tế
bào/ml . Cuối cùng với nghiệm thức thời gian cho kết quả thời gian nuôi cấy tối ưu
là 3 ngày với mật số thu được là 8,82x10
7
tế bào/ml. Cùng với các điều kiện tối ưu
trên, Hàm lượng vật chất khô cũng tăng đáng kể lần lượt là 8,07%; 10,73%;
8,94%; 9,52% và 9,81%. Hàm lượng xơ thô được phân giải theo thứ tự khảo sát là
12,08%; 13,27%; 13,07%; 14,17% và 14,38%. Trong quá trình nuôi cấy nấm men
hoàn toàn không sinh ra amoniac gây độc cho tế bào.
Từ khóa: bã mía, CF, DM, mật số nấm men, nấm men.









Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học

MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ii
TÓM LƯỢC iii
DANH SÁCH HÌNH vii
DANH SÁCH BẢNG viii
TỪ VIẾT TẮT x
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1

1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Bã mía 3
2.2. Các thành phần chính trong bã mía 3
2.2.1. Cellulose 3
2.2.2. Hemicellulose 4
2.2.3. Lignin 5
2.3. Nấm men 6
2.3.1. Giới thiệu chung về nấm men 6
2.3.2. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men 7
2.3.3. Đặc điểm sinh lý của nấm men 9
2.3.4. Saccharomyces cerevisiae 11
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện nuôi
cấy thu sinh khối tế bào 11
2.4. Sơ lược về enzyme thủy phân cellulose 12
2.4.1. Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase 12
2.4.2. Exoglucanase 12
2.4.3. β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase 12
2.5. Sơ lược về một số phương pháp nghiên cứu 13
2.5.1. Phương pháp đếm mật số vi sinh bằng buồng đếm hồng cầu. 13
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh học

2.5.2. Khảo sát hàm lượng xơ thô (CF) trong bã mía 13
2.5.3. Khảo sát hàm lượng vật chất khô (DM) của bã mía 13
2.5.4. Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulose bằng đường kính vòng halo 13
2.5.5. Phương pháp chuẩn độ đạm ammoniac 13
2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế 14
2.6.1. Trong nước 14

2.6.2. Nước ngoài 15
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1. Phương tiện nghiên cứu 16
3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16
3.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm 16
3.2.1. Thiết bị 16
3.2.2. Dụng cụ 16
3.2.3. Hóa chất 16
3.3. Nguyên vật liệu 17
3.4. Môi trường nuôi cấy nấm men 17
3.5. Phương pháp nghiên cứu 19
3.5.1. Khảo sát thành phần hóa học của bã mía 19
3.5.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất lên sự phân giải bã
mía của H13 19
3.5.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính exoglucanase và endoglucanase của H13
20
3.5.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dịch tế bào nấm men đến sự
phân giải bã mía của H13 21
3.5.5. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của pH đến sự phân giải bã mía của H13
21
3.5.6. Thí nghiệm 5: Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phân giải bã mía của
H13 22
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học

3.5.7. Thí nghiệm 6: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian đến sự phân giải bã mía của
H13 23
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Kết quả khảo sát thành phần bã mía 24
4.2. Ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất lên sự phân giải bã mía của H13 25

4.3. Khảo sát hoạt tính exoglucanase và endoglucanase của H13 28
4.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch tế bào nấm men đến sự phân giải bã mía của H13 29
4.5. Ảnh hưởng của pH đến sự phân giải bã mía của H13 32
4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phân giải bã mía của H13 35
4.7. Ảnh hưởng của thời gian đến sự phân giải bã mía của H13 38
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
5.1. Kết luận 42
5.2. Kiến nghị 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THỐNG KÊ






Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Cấu trúc phân tử cellulose 4
Hình 2: Cấu trúc của xylan trong Hemicellulose 5
Hình 3: Cấu trúc các liên kết trong lignin polymer 6
Hình 4: Nấm men 7
Hình 5: Cấu tạo tế bào nấm men 8
Hình 6: Ảnh hưởng của bã mía rửa và không rửa tới mật số nấm men 25
Hình 7: Ảnh hưởng cũa bã mía rửa và không rửa tới hàm lượng DM 26
Hình 8: Ảnh hưởng cũa bã mía rửa và không rửa tới hàm lượng CF 27

Hình 9: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nấm men tới mật số nấm men 29
Hình 10: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nấm men tới hàm lượng DM 30
Hình 11: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nấm men tới hàm lượng CF 31
Hình 12: Ảnh hưởng của pH tới mật số nấm men 32
Hình 13: Ảnh hưởng của pH tới hàm lượng DM 33
Hình 14: Ảnh hưởng của pH tới hàm lượng CF 34
Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới mật số nấm men 356
Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng DM 367
Hình 17: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng CF 378
Hình 18: Ảnh hưởng của thời gian ủ tới mật số nấm men 39
Hình 19: Ảnh hưởng của thời gian ủ tới hàm lượng DM 40
Hình 20: Ảnh hưởng của thời gian ủ tới hàm lượng CF 40
Hình 21: Đường chuẩn glucose Phụ lục 2




Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Thành phần hóa học của bã mía 3
Bảng 2: Thành phần sinh khối khô của nấm men 9
Bảng 3: Thành phần môi trường Potatose Glucose Agar (PGA) (M1) 17
Bảng 4: Thành phần môi trường Potatose Glucose (PG) (M2) 17
Bảng 5: Thành phần môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M3) 18
Bảng 6: Thành phần môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M4) 18
Bảng 7: Thành phần môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M5) 19
Bảng 8: Hàm lượng các thành phần trong 2 loại bã mía 24
Bảng 9: Hàm lượng đạm ammoniac sinh ra sau nuôi cấy 28
Bảng 10: Đường kính vòng halo 29

Bảng 11: Bố trí đo đường khử bằng phương pháp nelson Soymogi Phụ lục 1
Bảng 12: Hàm lượng vật chất khô (DM) của hai loại bã mía Phụ lục 2
Bảng 13: Hàm lượng xơ thô (CF) của hai loại bã mía Phụ lục 2
Bảng 14: Kết quả đường chuẩn glucose Phụ lục 2
Bảng 15: Kết quả đo OD hai loại bã mía Phụ lục 2
Bảng 16: Số liệu thí nghiệm 1 Phụ lục 2
Bảng 17: Thể tích H
2
SO
4
chuẩn độ đạm ammoniac thí nghiệm 1 Phụ lục 2
Bảng 18: Số liệu thí nghiệm 3 Phụ lục 2
Bảng 19: Số liệu thí nghiệm 4 Phụ lục 2
Bảng 20: Số liệu thí nghiệm 5 Phụ lục 2
Bảng 21: Số liệu thí nghiệm 6 Phụ lục 2
Bảng 22: Kết quả thống kê mật số tế bào TN1 Phụ lục 3
Bảng 23: Kết quả thống kê DM TN1 Phụ lục 3
Bảng 24: Kết quả thống kê CF TN1 Phụ lục 3
Bảng 25: Kết quả thống kê mật số tế bào TN3 Phụ lục 3
Bảng 26: Kết quả thống kê DM TN3 Phụ lục 3
Bảng 27: Kết quả thống kê CF TN3 Phụ lục 3
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 28: Kết quả thống kê mật số tế bào TN4 Phụ lục 3
Bảng 29: Kết quả thống kê DM TN 4 Phụ lục 3
Bảng 30: Kết quả thống kê CF TN4 Phụ lục 3
Bảng 31: Kết quả thống kê mật số tế bào TN5 Phụ lục 3
Bảng 32: Kết quả thống kê DM TN5 Phụ lục 3
Bảng 33: Kết quả thống kê CF TN5 Phụ lục 3
Bảng 34: Kết quả thống kê mật số tế bào TN6 Phụ lục 3

Bảng 35: Kết quả thống kê DM TN6 Phụ lục 3
Bảng 36: Kết quả thống kê CF TN6 Phụ lục 3


















Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TỪ VIẾT TẮT
BSA: Bovine serum albumin
CF: Crude fibers
CMC: Carboxymethyl cellulose
DM: Dry matter
kDa: Kilodalton
OD: Optical density
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một nước nông nghiệp đang trong giai đoạn công nghiệp hóa,
mỗi năm có một lượng lớn chất thải công nông nghiệp được thải ra gây nên những
vấn đề lớn đối với môi trường. Đặc biệt là những phế phẩm nông nghiệp sau thu
hoạch như rơm rạ, vỏ trấu, bã mía (chứa khoảng 40 – 50% cellulose) nếu không có
biện pháp xử lý sau một thời gian sẽ bị vi sinh vật trong tự nhiên phân hủy tạo nên
mùi thối và ngấm xuống đất gây ô nhiễm môi trường. Thông thường các chất thải
hữu cơ có chứa cellulose sẽ được đốt để làm sạch và hậu quả là gây ô nhiễm không
khí nặng nề (Miyamoto,1997). Điều đáng chú ý ở đây là bã mía khó đốt và khó
phân hủy hơn so với các phế phẩm cùng loại nhưng lại có hàm lượng cellulose cao
(45 – 50 %). Lượng bã mía thải ra từ các nhà máy mía đường khoảng 3,5 triệu tấn
mỗi năm, chiếm khoảng 20% mía nguyên liệu (www.epu.com.vn). Chính vì thế nên
ta có thể tận dụng lượng bã mía thải ra để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật thủy
phân cellulose nhằm tận dụng lượng chất thải để thu được nguồn sinh khối vi sinh
vật dồi dào.
Trong giới vi sinh vật, khi nhắc tới những ứng dụng của nấm men thì
Saccharomyces được xem là một trong những loài phổ biến nhất. Từ rất lâu, chúng
đã được sử dụng trong chế biến thực phẩm cho con người như lên men rượu, bia,
sản xuất men bánh mì, nước giải khát có cồn,… Và trong vài thập kỷ gần đây nó đã
được sử dụng nhiều trong chăn nuôi như chế biến thức ăn giàu tinh bột từ các phế
phụ phẩm công nông nghiệp, sản xuất sinh khối giàu protein và vitamin từ các
nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền hoặc sử dụng trong sản xuất các chế phẩm
sinh học dùng làm thức ăn bổ sung cho vật nuôi. Với xu hướng đó, việc nghiên cứu
khả năng sinh trưởng và phát triển giống nấm men Saccharomyces trên các loại môi
trường khác nhau nhằm thu được lượng sinh khối cao với chi phí nuôi cấy thấp là
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

công việc quan trọng và cần thiết. Đó cũng là lý do đề tài “Ảnh hưởng của một số
yếu tố lên khả năng phân giải bã mía của nấm men H13” được tiến hành.
1.2. Mục tiêu đề tài
Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng phân giải bã mía của
nấm men H13.

















Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Bã mía
Bã mía là các thành phần sợi còn lại sau khi mía được nghiền để lấy nước
(Marcela và Jorge, 2013). Theo Cerqueira et al., (2007) một tấn mía tươi tạo ra

280kg bã mía. Trong bã mía chứa trung bình 49% là nước, 48% là xơ (trong đó
chứa 45-50% cellulose) 2,5% là chất hòa tan (đường). Bã mía có thể dùng làm
nguyên liệu đốt lò, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural –
nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp (www.wikipedia.org\wiki\mía). Các thành phần
hóa học trong bã mía được trình bày trong bảng sau:
Bảng 1: Thành phần hóa học của bã mía
Thành phần
Phần trăm (%)
Cellulose
46,0
Hemicellulose
24,0
Lignin
20,0
Các thành phần khác
10
(*Nguồn: Chu Thị Thơm, 2006)
2.2. Các thành phần chính trong bã mía
2.2.1. Cellulose
Cellulose là polymer sinh học có sinh khối lớn nhất trong các polymer sinh
học trong môi trường mặt đất. Mỗi năm sự quang hợp cố định CO
2
sinh ra hơn 10
11

tấn trọng lượng khô vật chất có nguồn gốc thực vật khắp thế giới (Schlesinger,
1991), gần một nửa số vật chất này chứa cellulose (Eriksson, 1990).
Cellulose là một hợp chất hữu cơ có công thức phân tử (C
6
H

10
O
5
)
n
, một
polysaccharide gồm mạch thẳng từ hàng trăm đến hơn mười nghìn đơn phân D-
glucose thông qua liên kết β-1,4 glycosidic (Crawford, 1981). Cellobiose là cấu trúc
lặp của cellulose, với mỗi glucose xoay 180 độ so với các glucose bên cạnh. Ở thực
vật, cellulose có độ polymer hoá dao động từ 7000 – 14000 đơn phân, nhưng có khi
chỉ 500 đơn phân (Ljungdahl và Eriksson, 1985).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

Hình 1: Cấu trúc phân tử cellulose
Phân tử cellulose được bền hoá bằng các liên kết hydro trong và liên phân tử
và lực Van der Waals, thành lập các vi ống cellulose. Các vi ống này kết hợp lại tạo
chất xơ. Các phân tử cellulose sắp xếp song song. Cấu trúc này tạo thành domains
tinh thể trật tự chặt chẽ xen lẫn với các domain phân tán không chặt chẽ.Mức độ
tinh thể hoá đạt 60-90% (Marchessault và Sundararajan, 1983).



(*Nguồn:Heinze and Lieberd, 2012)
2.2.2. Hemicellulose
Hemicellulosic polymers là những thành phần phức trong vách tế bào của
các loài thực vật.Hemicellulose thành lập các liên kết hydro với cellulose và thành
lập các liên kết cộng hoá trị (đa phần là α-benzyl ether) với lignin và liên kết ester
với các đơn phân acetyl và hydroxycinnamic acids. Các liên kết trên giữ chặt
hemicellulosic polymers vào vách tế bào (Jing et al., 2012). Trong khi cellulose ở

dạng tinh thể, mạnh và kháng phân giải, hemicellulose có cấu trúc ngẫu nhiên, lớn
và dễ bị phân giải khi hoà tan bằng acid, kiềm hoặc enzyme. Hemicellulose bao
gồm xylan, glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan và xyloglucan.
Hemicellulose chứa đa phần là đường D-pentose. Trong đó, Xylose là thành phần
có lượng lớn nhất ở hemicellulose. Theo Sabiha-Hanim (2006), hemicellulose
chiếm 33,5% trọng lượng khô của bã mía. Hemicellulose bao gồm những đoạn ngắn
từ 500-3000 đơn vị đường với 7000-15000 phân từ glucose.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

Hình 2: Cấu trúc của xylan trong Hemicellulose






(*Nguồn: Heinze and Lieberd, 2012)
2.2.3. Lignin
Lignin là một hợp chất hoá học tìm thấy ở gỗ, và là một thành phần bên
trong của vách thứ cấp tế bào thực vật (Lebo et al., 2001) và một số tảo (Martone et
al., 2009). Lignin là polymer hữu cơ thông dụng nhất trên trái đất, chỉ sau cellulose,
chiếm khoảng 30% nguồn carbon hữu cơ phi hoá thạch (Boerjan, et al., 2003), và
chiếm 25-30% trọng lượng khô của gỗ. Như là một polymer sinh học, lignin không
có cấu trúc xác định.Lignin giúp gia cố cấu trúc gỗ ở thực vật (Wardrop, 1969).
Lignin chiếm các khoang trống giữa cellulose, hemicellulose và pectin.
Pectin liên kết cộng hoá trị với hemicellulose và tạo các liên kết chéo với các
polysaccharide trong cây trồng. Từ đó, lignin gia cố các cấu trúc của tế bào, kết nối
các bộ phận của cây (Chabannes, 2001). Lignin đóng vai trò quan trọng trong quá
trình vận chuyển nước cho thực vật từ rễ đến các nhánh. Trong khi các thành phần

polysaccharide của vách tế bào thực vật đều ưa nước và vì vậy thẩm thấu nước, thì
lignin kỵ nước hơn. Các liên kết chéo của lignin ngăn cản hiện tượng thẩm thấu
nước.Vì vậy, lignin cho phép mô vận chuyển của cây hoạt động hiệu quả (Sarkanen
và Ludwig, 1971).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

Hình 3: Cấu trúc các liên kết trong lignin polymer
Theo Kamstra et al. (1958), lignin ngăn cản sự phân giải cellulose nhờ có cấu
trúc rất bền, ngay cả với acid mạnh và enzyme vi khuẩn. Vách tế bào thực vật gồm
các cấu trúc phức chất lignin – cellulose làm giảm khả năng phân giải cellulose của
vi khuẩn.








(*Nguồn: Shimin et al., 2013)
2.3. Nấm men
2.3.1. Giới thiệu chung về nấm men
Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có những đặc điểm như cấu tạo
đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, nhiều loại
có khả năng lên men đường. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong
các môi trường có chứa đường, pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉ
đường, mật ong, trong đất ruộng trồng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có
nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Nấm men có nhiều ứng dụng rộng rãi
trong lĩnh vực thực phẩm, con người từ lâu đã biết ứng dụng nấm men vào các sản

xuất các loại thực phẩm truyền thống như rượu, bia, bánh mì,…

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ sinh học







(*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 1999)
2.3.2. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men
2.3.2.1. Hình thái
Tế bào nấm men có hình cầu, hình elip, hình ovan, hình quả chanh, hình trụ,
hình chùy hoặc đôi khi là hình sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích
thước theo các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh.
Tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1µm,
chiều dài 8µm. Trọng lượng riêng của nấm men khoảng 1,055 – 1,060 kDa không
khác mấy so với vi khuẩn có trọng lượng riêng 1,050 – 1,142 kDa (Lương Đức
Phẩm, 2006).
2.3.2.2. Cấu tạo
Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào cơ bản giống thực vật, so với vi khuẩn
tế bào nấm men tiến hóa hơn về mặt cấu trúc.
Hình 4: Nấm men
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Hình 5: Cấu tạo tế bào nấm men

(a) Mô hình mặt cắt tế bào (*Nguồn: />science/metabolomics/enzyme-explorer/learning-center/lysing-enzymes.html)
(b) Hình mô phỏng các thành phần của tế bào
(*Nguồn:
 Vỏ tế bào
Bao quanh nấm men và được cấu tạo bởi protein, polysaccharide, phosphate
và lipid. Trong thành phần polysaccharide có chứa glucan (chủ yếu) và manan
(chiếm 90% chất khô của vỏ). Glucan – một polymer của glucose là thành phần
chính của vỏ. Nằm phía trong tiếp giáp màng tế bào chất. Nếu lớp glucan bị phá
hỏng thì toàn bộ tế bào bị phá hủy. Manan có thế kết hợp với protein tạo thành lớp
manoprotein rất khó phá hủy (Lương Đức Phẩm, 2006).
 Màng tế bào chất
Là lớp màng mỏng, dày 0,1nm dính chặt với tế bào chất.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

Chức năng của màng tế bào chất:
 Bảo vệ, làm hàng rào thẩm thấu
 Điều chỉnh chất dinh dưỡng từ ngoài vào trong và ngược lại
 Thực hiện tổng hợp thành phần của vỏ tế bào
 Nơi cư trú của một số enzyme và bào quan (ribosome)
 Tế bào chất
Ở thể keo, được cấu tạo từ protein, lipid, khoáng, nước (90%) và các hợp
chất khác. Có độ nhớt cao, chứa các bào quan. Cấu trúc thay đổi tùy theo tuổi của
nấm men (Lương Đức Phẩm, 2006).
 Nhân
Cấu tử bất biến, nhân thật chứa DNA và RNA. Kích thước nhân không đồng
nhất ngay khi trong cùng một chủng hay ở các chủng nấm men khác nhau (Lương
Đức Phẩm, 2006).
 Các bào quan khác
Không bào, ribosome, mạng lưới nội chất, thể gogi,… có cấu tạo giống như

tế bào thực vật (Lương Đức Phẩm, 2006)
2.3.3. Đặc điểm sinh lý của nấm men
2.3.3.1. Thành phần hóa học của tế bào nấm men
Nước chiếm 75% khối lượng. Các thành phần sinh khối khô khác:
Bảng 2: Thành phần sinh khối khô của nấm men
Thành phần
%
Chất vô cơ
5 – 10
Cacbon
25 – 50
Nitơ
4,8 – 12
Protein (N x 6,25)
30 – 75
Lipid
2 – 5
(*Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2006).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

2.3.3.2. Dinh dưỡng nấm men
 Cacbon
Nấm men có thể sử dụng đường làm nguồn cacbon, không sử dụng trực tiếp
tinh bột, cellulose, hemicellulose. Nấm men Saccharomyces sử dụng glucose,
fructose, maltose, saccharose, galactose, không sử dụng được pentose, lactose và
melibiose.
 Nitơ
Nguồn nitơ rất cần thiết cho việc tổng hợp các cấu tử trong tế bào. Tuy nhiên
nấm men không sử dụng được nitrat, nguồn nitơ chính là muối amoni: amoni

sunlfat, phosphate, muối acetate, … Trong môi trường chứa muối sunlfat thì nấm
men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid sử dụng sau hoặc dùng để acid hóa môi
trường. Môi trường lỏng ammoniac (NH4
+
) là môi trường lý tưởng cho nấm men.
Nấm men sử dụng cả ure và pepton.
 Chất vô cơ
Các nguyên tố vô cơ rất quan trọng. Trong đó nhu cầu phospho được quan
tâm trước hết, tiếp đến là kali, magie, lưu huỳnh, … Bên cạnh đó các nguyên tố vi
lượng như mangan, đồng, sắt, kẽm, … cũng rất cần thiết cho quá trình sinh lý của tế
bào.
2.3.3.3. Đặc tính sinh sản của nấm men
Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh
sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính: chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi
nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi
Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans).
Sinh sản hữu tính: nấm men hình thành bào tử túi ở các chi Saccharomyces,
Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

2.3.4. Saccharomyces cerevisiae
Tế bào nấm men S. cerevisiae được Meyen mô tả vào năm 1938 có dạng
hình trứng, bầu dục…, kích thước trung bình 3 – 6 * 5 – 12 µm, sinh sản bằng hình
thức nảy chồi không theo qui luật, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một
chuỗi. Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh, đường
kính 1 – 2 mm vào ngày thứ ba. Phát triển tối ưu ở 33 – 35
0
C trong môi trường

chứa 10 – 30% glucose. Nhiệt độ tối thiểu là 4
0
C trong 10% glucose và 13
0
C trong
50% glucose, nhiệt độ tối đa là 38 – 39
0
C (Jermini and Schmidt-Lorenz, 1987). Có
khả năng lên men đường glucose, galactose, maltose, saccharose, rafinose và các
dextrin đơn giản, không lên men lactose, manitol, không đồng hóa nitrate, không
phân giải tinh bột. Là loài nấm men hay được sử dụng làm men bánh mì, lên men
rượu, bia và hiện còn được sử dụng làm probiotic phục vụ cho chăn nuôi gia súc và
nuôi trồng thủy sản nhờ có khả năng chịu được acid dạ dày và muối mật tốt, đề
kháng tự nhiên với kháng sinh.
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của nấm men trong điều
kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào
2.3.5.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn
cacbonhydrate, nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Mg, Na, Ca và
vitamin. Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà
nguồn cacbon duy nhất là tinh bột.
2.3.5.2. Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát
triển của chúng. Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 28 – 30
0
C, trên
43
0
C và dưới 28
0

C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc dừng hẳn.
Ở 30
0
C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S. cerevisiae 2 – 3 lần, ở
35 – 38
0
C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

men giảm nhanh, còn ở nhiệt độ thấp khoảng 20 – 23
0
C lại hạn chế được mức độ
tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn.
2.3.5.3. pH của môi trường
pH tối ưu cho nấm men ở khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc độ tích lũy sinh
khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men dừng lại. Mức độ hấp thu chất
dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein
đều bị ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm nếu pH môi trường
nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6.
2.4. Sơ lược về enzyme thủy phân cellulose
Liên kết chủ yếu trong cellulose là β-1,4 glycosidic và để phá hủy cấu trúc
này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt.
2.4.1. Endoglucanase hoặc β-1,4-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)
Enzyme endoglucanase hoặc β-1,4-D-glucan glucanohydrolase (còn gọi là
carboxyl methyl cellulose) thủy phân liên kết β-1,4 glycosidic trong phân tử
cellulose bởi tác động ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi
khử tự do và các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy
phân tinh thể hiệu quả nhưng nó phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương
đối dễ tiếp cận (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

2.4.2. Exoglucanase
Enzyme exoglucanase gồm cả β-1,4-D-glucan glucanohydrolase (EC
3.2.1.74) – giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin cùng với β-1,4-D-
glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) – giải phóng D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân
của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi
cellulose.
2.4.3. β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ sinh học

β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử D-
glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác.
2.5. Sơ lược về một số phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp đếm mật số vi sinh bằng buồng đếm hồng cầu.
Đây là phương pháp định lượng số tế bào nấm men dựa trên sự quan sát và
đếm trực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng kính hiển vi và buồng đếm.
2.5.2. Khảo sát hàm lượng xơ thô (CF) trong bã mía
Lượng xơ tổng số trong mẫu vật là khối lượng còn lại sau khi phân tích và
sấy khô được xác định bằng cách đun nóng trong dung dịch acid (H
2
SO
4
1,25%) và
kiềm (NaOH 1,25%) để loại bỏ các thành phần khác xơ như glucid và protein.
2.5.3. Khảo sát hàm lượng vật chất khô (DM) của bã mía
Dùng nhiệt làm bay hơi nước có trong nguyên liệu. Cân trọng lượng nguyên
liệu trước và sau khi sấy khô ở 105
0
C bằng cân phân tích. Phần còn lại của vật chất
khô là nguyên liệu (AOAC, 2000).

2.5.4. Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulose bằng đường kính vòng halo
Congo Red có thể liên kết với cầu nối 1,4-β-glucoside trên CMC hoặc
cellulose tạo màu đỏ trên bề mặt môi trường khi nhuộm. Sau khi nhuộm 15 – 60
phút rửa lại bằng dung dịch NaCl 1M (Wood và Bhat. 1988). Khi đó các dòng vi
sinh vật có khả năng sản sinh enzyme cellulose phân giải cầu nối β-1,4-glucoside sẽ
tạo vùng không bắt màu với Congo Red xung quang khẩn lạc (vòng halo). Vùng
này có đường kính càng lớn thể hiện vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose càng
cao (Teather và Wood. 1981).
2.5.5. Phương pháp chuẩn độ đạm ammoniac
Ammoniac trong nguyên liệu không tồn tại ở dạng NH
3
mà thường tồn tại ở
dạng muối amon. Để định lượng ammoniac thì cần phải đẩy muối amon ra thể tự do
(dưới tác dụng của muối NH
4
Cl) bằng một chất kiềm mạnh hơn như Mg(OH)
2
.