phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ nƣớc thải làng nghề làm bánh pía sóc trăng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG
VI KHUẨN PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ NƢỚC THẢI
LÀNG NGHỀ LÀM BÁNH PÍA SÓC TRĂNG



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ THANH BẢO NGỌC
MSSV: 3103967
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36



Cần Thơ, tháng 4/2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC


PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG
VI KHUẨN PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ NƢỚC THẢI
LÀNG NGHỀ LÀM BÁNH PÍA SÓC TRĂNG


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ THANH BẢO NGỌC
MSSV: 3103967
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36


Cần Thơ, Tháng 4/2014
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)

PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Lê Thanh Bảo Ngọc



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

LỜI CẢM TẠ
Trong quá trình tham gia học tập khóa học chuyên ngành Vi Sinh Vật Học–
Trường Đại Học Cần Thơ đến nay tôi đã hoàn thành khóa học và đặc biệt là trong quá
trình làm luận văn, tôi luôn được sự hỗ trợ về mặt tinh thần và vật chất từ gia đình,
Thầy Cô và bạn bè để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến:
PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh Học Vi sinh
vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần thơ, thầy

hướng dẫn đề tài đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt những phương pháp nghiên cứu mới
và các kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu.
Quý Thầy Cô trong Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,
Trường Đại học Cần thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt đề tài luận
văn.
Cô Nguyễn Thị Pha đã quan tâm, động viên tôi trong suốt thời gian làm cố vấn
học tập.
Các anh chị tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đặc biệt là hai chị Nguyễn Thị Thúy
Duy, Trần Trà My đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.
Gia đình, các bạn cùng lớp Vi Sinh Vật k36 và các bạn thực hiện đề tài cùng
Thầy hướng dẫn đã động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận
văn này.
Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý thầy cô và tất
cả bạn bè của tôi.
Cần Thơ, ngày 09 tháng 04 năm 2014



Lê Thanh Bảo Ngọc
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

i
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

TÓM LƢỢC

Ô nhiễm nước thải đang là vấn đề đã và đang được xã hội quan tâm hiện nay.
Hàm lượng tinh bột cao trong nước thải gây ảnh hưởng trực tiếp đến hệ sinh thái và
sức khỏe của những người sống trong khu vực đó. Việc xử lý ô nhiễm bằng vi khuẩn

phân hủy tinh bột đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước.
Đề tài nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng
phân hủy tinh bột từ nước thải làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng. Từ ba mẫu nước
thải thu được ở làng nghề làm bánh Pía Sóc Trăng, mười tám dòng vi khuẩn được
phân lập trên môi trường chứa 1% tinh bột và là nguồn Carbon duy nhất. Kết quả
khảo sát khả năng phân hủy tinh bột bằng phương pháp xác định vòng phân hủy nhờ
dung dịch thuốc thử lugol đã tìm ra 7 dòng vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme
amylase. Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen 16S rRNA kết
hợp sử dụng công cụ Blast nucleotide trên ngân hàng gen NCBI cho thấy dòng vi
khuẩn phân hủy tinh bột triển vọng thuộc loài Bacillus fexus với độ tương đồng 97%.
Từ khóa: Bánh Pía, vi khuẩn phân hủy tinh bột, vi khuẩn Bacillus.













Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

ii
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC

Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 3
2.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 3
2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 4
2.2. Nguyên liệu 5
2.2.1. Sơ lược về nghề làm bánh Pía Sóc Trăng 5
2.2.2. Đặc điểm của nước thải công nghiệp 7
2.2.3. Tổng quan về tinh bột 9
2.2.3.1. Amylose 9
2.2.3.2. Amylopectin 10
2.2.4. Quá trình phân hủy tinh bột 11
2.2.5. Enzyme tham gia vào quá trình phân hủy tinh bột 12
2.2.6. Các vi sinh vật phân hủy tinh bột 16
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Phương tiện nghiên cứu 23
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

iii
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

3.1.1. Nguyên vật liệu và địa điểm thực hiện 23
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị 23
3.1.3. Hóa chất và môi trường 24
3.2. Phương pháp nghiên cứu 27
3.2.1. Phương pháp thu mẫu 27
3.2.2. Phương pháp làm môi trường 27
3.2.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột, xác định hình thái và
các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn 27
3.2.3.1. Phương pháp phân lập 27
3.2.3.2. Xác định hình thái và các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn 28
3.2.4. Phương pháp tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tốt
33
3.2.5. Phương pháp xác định thời gian tăng trưởng tối ưu của các dòng vi khuẩn
34
3.2.6. Định danh dòng vi khuẩn 35
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn 38
4.1.1. Phân lập vi khuẩn 38
4.1.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập được 39
4.1.3. Đặc điểm tế bào vi khuẩn trên môi trường phân hủy tinh bột 42
4.2. Đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn đã phân lập 44
4.2.1. Thử nghiệm Catalase 44
4.2.2. Thử nghiệm Methyl red 45
4.2.3. Hoạt tính Lipase 46
4.3. Kết quả khảo sát hoạt tính Amylase 48
4.4. Kết quả xác định thời gian tăng trưởng của một số dòng phân hủy tinh bột .51
4.5. Kết quả nhận diện dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột 52
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

iv
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55
5.1. Kết luận 55
5.2. Đề nghị 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả
Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

v
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Các vi sinh vật có hệ enzyme amylase 17
Bảng 2. Thành phần môi trường bổ sung tinh bột 24
Bảng 3. Thành phần môi trường LB. 25
Bảng 4. Công thức môi trường MSB 26
Bảng 5. Công thức môi trường MR-VP broth 26
Bảng 6. Các giai đoạn của phương pháp nhuộm Gram 30
Bảng 7. Thành phần các chất trong phản ứng PCR 36
Bảng 8. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA 36
Bảng 9. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được. 38
Bảng 10. Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập sau 24 giờ cấy. 39
Bảng 11. Đặc tính các dòng vi khuẩn được phân lập 42
Bảng 12. Giá trị đo OD và đo mực dầu của các dòng vi khuẩn 46

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

vi
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Bánh Pía thành phẩm 6
Hình 2. Nước thải từ cơ sở sản xuất bánh Pía Tân Huê Viên (THV) và Mỹ Trân (MT) 8
Hình 3. Cấu trúc của phân tử Amylose 9
Hình 4. Hồ tinh bột 10
Hình 5. Cấu trúc của phân tử Amylopectin 10
Hình 6. Quá trình chuyển hóa tinh bột của vi sinh vật 11
Hình 7. Cơ chế phân hủy tinh bột 12
Hình 8. MINIGADINE & NEOPEPTINE DROPS 15
Hình 9. Vi khuẩn Bacillus subtilis 20
Hình 10.


Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 22
Hình 11. Khuẩn lạc phát triển trên môi trường bổ sung tinh bột sau 24 giờ 41
Hình 12. Hình nhuộm Gram 43
Hình 13. Hiện tượng sủi bọt khí khi cho H
2
O
2
tiếp xúc với bề mặt khuẩn lạc 44
Hình 14. Phản ứng màu của các dòng vi khuẩn khi nhỏ thuốc thử Methyl red 45
Hình 15. Các dòng vi khuẩn trong môi trường MSB bổ sung dầu ăn ủ 4 ngày 47
Hình 16. Độ đục và mực dầu của dòng Q7 trước và sau khi ủ trong 4 ngày ở 37

o
C so
với ống đối chứng (ĐC) 48
Hình 17. Khuẩn lạc tạo vòng phân hủy sau 24 giờ 49
Hình 18. Đĩa được nhuộm Lugol để thấy vòng phân hủy tinh bột sau 68 giờ 49
Hình 19. Biểu đồ so sánh tỉ lệ đường kính vòng phân hủy và đường kính khuẩn lạc của
các dòng vi khuẩn 50
Hình 20. Đĩa đếm khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt 51
Hình 21. Biểu đồ biểu diễn sự tương quan giữa mật số tế bào và thời gian nuôi cấy của
dòng vi khuẩn Q7 và Q5 51
Hình 22. Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn 16S-rRNA 51
Hình 23. Mức độ tương đồng của dòng Q7 so với các dòng vi khuẩn khác trên cơ sở
dữ liệu NCBI 51
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

vii
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

TỪ VIẾT TẮT
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
COD Chemical Oxygen Demand
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
LB Luria - Bertani
MSB Mitis salivarius bacitracin
OD Optical Density
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic Acid
VK Vi khuẩn

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

1
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 . Đặt vấn đề
Sự bùng nổ dân số cùng với sự phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghệp hóa
đất nước, lượng nước thải công nghiệp cũng ngày một gia tăng. Hầu hết các sông hồ ở
các thành phố lớn, nơi có dân cư đông đúc và nhiều khu công nghiệp đều bị ô nhiễm.
Hậu quả của tình trạng ô nhiễm gây ảnh hưởng trực tiếp đến hệ sinh thái và sức khỏe
của những người sống trong khu vực đó.
Trong những năm qua, cùng với sự phát triển của kinh tế, xã hội, nhiều ngành
nghề thủ công truyền thống ở Việt Nam đã được khôi phục và phát triển khá mạnh.
Các làng nghề thủ công truyền thống là nét đặt trưng của nhiều vùng nông thôn Việt
Nam. Trong các ngành công nghiệp đó thì phải kể đến làng nghề làm bánh Pía truyền

thống của nước ta từ xưa đến nay. Không ít công ty đã đầu tư dây chuyền công nghệ
ngoại nhập làm bánh Pía khép kín, trị giá hàng chục tỉ đồng. Không chỉ đáp ứng nhu
cầu trong nước, các công ty này còn xuất khẩu sản phẩm sang Mỹ, Canada, Úc,
Campuchia, Hiện nay cả nước có nhiều cơ sở sản xuất bánh Pía nhưng nổi tiếng nhất
và tạo nên thương hiệu là bánh Pía Sóc Trăng. Tại Sóc Trăng hiện có gần 50 lò chuyên
sản xuất bánh gồm các thương hiệu nổi tiếng như: Tân Huê Viên, Lập Hưng, Quảng
Trân… Bánh Pía Sóc Trăng hầu như được sản xuất quanh năm, là một sản phẩm đặc
trưng đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển kinh tế, quảng bá văn hóa và du lịch
của địa phương. Cũng chính vì vậy mà lượng nước thải phát sinh trong quá trình làm
bánh Pía là không nhỏ. Nước thải từ các cơ sở sản xuất bánh Pía có hàm lượng chất
hữu cơ cao. Nguyên liệu chính của bánh là bột mì được đưa vào máy và trộn đều với
đường cát trắng, chứa hàm lượng tinh bột và đường cao.
( />Trang.html, ngày 21/07/2013).
Ngày nay, bên cạnh công nghệ xử lý nước thải bằng phương pháp lý, hóa thì việc
ứng dụng những dòng vi khuẩn có khả năng chuyên biệt để hoàn thiện công nghệ xử lý
chất thải đang chiếm một vai trò vô cùng quan trọng. Nhóm vi sinh vật phân hủy tinh
bột sống trong nước có khả năng tiết ra môi trường hệ enzyme amylase nhằm phân
hủy tinh bột thành các hợp chất đơn giản.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

2
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Nhằm tìm hiểu về khả năng chuyển hóa các chất hữu cơ của vi sinh vật trong
nước thải bánh Pía và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh
bột tốt trong nước thải sản xuất bánh Pía nên đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số
dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nƣớc thải làng nghề làm bánh
Pía Sóc Trăng” được tiến hành.
1.2 . Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột

trong nước thải từ làng nghề làm bánh Pía ở Sóc Trăng. Khảo sát hoạt tính enzyme
amylase của các dòng vi khuẩn này và định danh dòng vi khuẩn triển vọng bằng kỹ
thuật PCR.



















Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

3
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc

Như chúng ta đã biết, thế giới ngày càng phát triển và dân số ngày càng tăng.
Điều đó làm cho môi trường xung quanh chúng ta phải nhận đủ mọi loại rác thải công
nghiệp, trong đó có nguồn nước thải. Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của
Công nghệ sinh học trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các nhà khoa học đã sử dụng
vi sinh vật cho quá trình xử lý nước thải.
Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý (2009) đã thực hiện thành công nghiên
cứu phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tại làng nghề sản xuất
bột gạo tại thị xã Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp, góp phần bảo vệ nguồn nước cho cộng
đồng trong khu vực. Trong số 23 dòng vi khuẩn phân lập được trong 25 mẫu nước thải
thu được có 13 dòng vi khuẩn thuộc gram âm và 10 dòng vi khuẩn thuộc gram dương.
Các dòng vi khuẩn phân lập được có hoạt tính enzyme amylase từ 72,44U/ml đến
910,89U/ml sau 72 giờ nuôi cấy. Trong số này có 4 dòng có hoạt tính enzyme amylase
cao 9
35
, VD2, 9
2
và 16, Hai dòng 9
35
và VD2 có khả năng xử lý đến 97% lượng tinh
bột có trong nước thải chỉ sau 24 giờ. Việc nghiên cứu, phân lập các vi khuẩn có khả
năng tiết ra enzyme amylase và ứng dụng các vi sinh vật này vào xử lý nước thải tinh
bột là một việc làm rất thiết thực, mang tính ứng dụng
( />dong-vi-khuan-co-kha-nang-phan-huy-tinh-bot, ngày 27/07/2013).
Nghiên cứu khả năng xử lý tinh bột của một số chủng vi sinh vật phân lâp được
từ nguồn nước thải của nhà máy chế biến tinh bột và ứng dụng chúng vào phương
pháp xử lý hiếu khí nước thải nhà máy sản xuất nui đã được Vũ Thị Hương Lan (2010)
tiến hành tại phòng thí nghiệm của trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố
Hồ Chí Minh. Kết quả từ mẫu bùn và nước thải nhà máy sản xuất tinh bột, phân lập và
tuyển chọn được 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột mạnh. Các thí
nghiệm xử lý đều đạt tiêu chuẩn xả thải loại B theo QCVN 24: 2009/BTNMT.

( ngày 01/08/2013)
Các nghiên cứu hiện trạng và giải pháp xử lý nước thải cho làng nghề tinh bột
Hoài Hảo-Tỉnh Bình Định, nhóm nghiên cứu đã đề nghị xử lý nước thải tinh bột mì
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

4
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

bằng phương pháp sinh học, áp dụng mô hình phân hủy kỵ khí hai giai đoạn (giai đoạn
acid hóa và metan hóa) kết hợp với mô hình lọc sinh học hiếu khí (Nguyễn Văn Phước
và Nguyễn Thị Thanh Phương, 2004).
Ngoài ra còn rất nhiều nghiên cứu về quá trình phân hủy tinh bột cũng như các vi
sinh vật tham gia và enzyme amylase do chúng tiết ra để phân hủy tinh bột trong thực
phẩm, nước thải sản xuất,
Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng tác viên (2002) đã nghiên cứu hoạt tính của
enzyme amylase của hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4 nhằm ứng dụng trong xử lý
rác thải làm phân bón hữu cơ. Qua kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký bản
mỏng cho thấy rằng hệ amylase của hai chủng Bacillus được khảo sát là α-amylase, β-
amylase và glucoamylase. Kết quả thử nghiệm cho thấy cả hai chủng đều có khả năng
đồng hóa từ các nguồn cơ chất khác nhau: bột gạo, bột mì, cám gạo, dextrin, bột bắp.
Lượng đường khử sinh ra là cao nhất khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất là bột bắp.
Tuy nhiên, những thí nghiệm này chỉ dừng lại ở phòng thí nghiệm.
2.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Phương pháp phân hủy tinh bột mà không dựa trên việc nhuộm iod hay việc sử
dụng tạo phức màu với tinh bột đã được Motiram R. et al. (1982) tìm thấy.
Những dòng vi khuẩn được thử nghiệm, S.sanguis, S.mutans, A.viscosus và
A.naeslundii có khả năng phân hủy tinh bột và sử dụng cơ chất maltose như là nguồn
carbohydrat chính trong môi trường phát triển (G.B.Glor et al., 1988).
Một vài loài vi khuẩn Clotridum tạo bào tử, hiếu khí, chịu nhiệt được phân lập từ
môi trường có chứa tinh bột của hai hệ thống xử lý nước thải chế biến khoai tây (H.

Weber et al., 1990).
Kết quả nghiên cứu của
Sh
al
i
n
i
A
gg
a
rw
al (2006) đã phân lập được dòng vi
khuẩn trong nước thải có khả năng phân hủy tinh bột và chuyển hóa các phân
tử đường thành acid lactic. Vi khuẩn này đã được ứng dụng vào xử lý nước thải
của ngành chế biến thực phẩm, đồng thời biến nước thải trở nên có giá trị và là
nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp khác.
Arlem et al. (2007) đã phân lập được sáu dòng vi khuẩn nốt rễ có khả năng
sử dụng các nguồn tinh bột khác nhau như nguồn cung cấp carbon. Trong đó
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

5
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

tinh bột bắp là nguồn carbon tốt cho sự sinh enzyme amylase. Kết quả nghiên
cứu có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp tinh bột.
2.2 Nguyên liệu
2.2.1 Sơ lƣợc về nghề làm bánh pía Sóc Trăng
Những năm gần đây, ngành công nghiệp, tiểu thủ công nghiêp tỉnh Sóc Trăng có
những bước phát triển mạnh mẽ. Kết cấu hạ tầng phát triển nhanh chóng, các khu-cụm
công nghiệp, các khu dân cư, khu thương mại đang được tỉnh và các nhà đầu tư đẩy

nhanh tiến độ thực hiện nhằm đem đến cho tỉnh Sóc Trăng một diện mạo mới. Ngành
tiểu thủ công nghiệp có bước phát triển vững chắc, không chỉ phục vụ nhu cầu trong
nước mà còn được chấp nhận tại các thị trường khó tính như: Mỹ, Nhật Bản, Châu Âu
với các nhãn hiệu bánh Pía: Tân Huê Viên, Quảng Hưng, Lập Hưng, Công Lập
Thành, và hơn 50 lò bánh Pía ở làng nghề Vũng Thơm (,
ngày 21/07/2013).
Bánh Pía có nguồn gốc từ bánh trung thu kiểu Tô Châu (loại bột bánh có nhiều
lớp mỏng và nhân bánh có trộn mỡ). Bánh do một số người Minh Hương di cư sang
Việt Nam từ thế kỷ 17 mang theo. Trước đây, việc làm bánh Pía hoàn toàn mang tính
thủ công và phục vụ cho nhu cầu của từng gia đình. Đến đầu thế kỷ 19, người đầu tiên
làm bánh Pía để kinh doanh và truyền nghề cho con cháu sau này là ông Đặng Thuận
sinh sống ở làng Vũng Thơm (nay là xã Phú Tâm, huyện Châu Thành, tỉnh Sóc Trăng)
( ngày 21/07/2013).
Bánh Pía Sóc Trăng có hương vị rất đặc trưng, đó là mùi thơm của sầu riêng, vị
béo của hột vịt muối (trứng vịt muối), vị bùi của đậu xanh, khoai môn, và thơm mùi
bột mì của vỏ bánh nướng vàng.







Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

6
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 1. Bánh Pía thành phẩm
(*Nguồn: , ngày 06/03/2013)
Thông thường, bánh Pía Sóc Trăng có hai loại là bánh Pía khoai môn và bánh Pía
đậu xanh. Muốn có được mùi vị, màu sắc hấp dẫn, bánh Pía phải qua rất nhiều công
đoạn làm bánh đòi hỏi sự khéo léo và khá cầu kỳ:
Đầu tiên, bột mì được cán mỏng để làm vỏ. Để có những lớp vỏ mỏng, người ta
phải chế biến bột mì qua nhiều công đoạn như: trộn bột, cán mỏng và cuộn tròn, gấp
lại nhiều lần để tạo nên vỏ bọc với những lớp “bột nước” và “bột dầu” chồng lên nhau.
Khâu làm nhân bánh quan trọng từ việc lựa chọn nguyên liệu cho đến cách phối
hợp hài hòa chúng với nhau để làm nên hương thơm riêng. Nhân bánh được thực hiện
như sau: đậu xanh hoặc khoai môn đem hấp chính, chà nhuyễn, xào với đường rồi trộn
chung với chút sầu riêng tươi, lòng đỏ trứng muối.
Sau khi cho nhân vào vỏ bánh, người ta thoa bên ngoài vỏ bánh lòng đỏ trứng
muối và đưa vào lò nướng ở nhiệt độ trung bình khoảng 270
o
C.
Sau 5-7 phút, thợ đứng lò sẽ lấy bánh ra, lật ngược mặt bánh rồi thoa lên một lớp
lòng đỏ trứng và đưa vào lò trở lại. Để 15 phút, khi chiếc bánh chuyển sang màu vàng
ươm chính là lúc chiếc bánh đã thành phẩm và dùng được ngay.
( ngày 21/07/2013)
Hiện nay không phải chỉ có Sóc Trăng mới sản xuất món bánh Pía, nhưng bánh
Pía Sóc Trăng vẫn nổi trội so với nhiều địa phương khác. Với sự cần cù nghiêm cẩn,
những người thợ bánh Sóc Trăng đã tạo nên những chiếc bánh Pía có hương vị rất
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

7
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

riêng, không quá ngọt cũng không quá béo khiến người thưởng thức có thể ăn hoài mà
không cảm thấy ngán…
Có dịp đến Sóc Trăng, du khách sẽ ngạc nhiên với hàng trăm cửa hàng bán bánh
Pía nhộn nhịp kẻ bán người mua chỉ trên đoạn đường dọc quốc lộ 1A dài chừng 10km
từ thành phố Sóc Trăng đi An Hiệp, điều này đủ chứng tỏ bánh Pía Sóc Trăng đã đi
vào lòng người như thế nào. Bánh Pía Sóc Trăng đã từng có mặt trong nhiều kỳ hội
chợ được tổ chức trên khắp cả nước, được tặng thưởng nhiều huy chương vàng và đạt
danh hiệu “hàng Việt Nam chất lượng cao được người tiêu dùng bình chọn”. Ngày nay
bánh Pía Sóc Trăng đã có mặt tại nhiều nơi trên thế giới, là cơ hội để tên tuổi bánh Pía
Sóc Trăng vươn cao, bay xa,… ( />dac-san-soc-trang.html, ngày 21/07/2013).
2.2.2 Đặc điểm của nƣớc thải công nghiệp (nƣớc thải sản xuất)
Nước thải công nghiệp là loại nước thải từ các nhà máy đang hoạt động sản, phụ
thuộc loại hình công nghiệp.
Nước thải công nghiệp nói chung khác nhau ở mỗi ngành nghề, ở mỗi cơ sở sản
xuất, đồng thời khác nhau về tính chất vật lý, hóa học và tính chất sinh học. Phụ thuộc
vào quá trình sản xuất của mỗi làng nghề (nước rửa nguyên liệu, sản phẩm, thiết bị,
nước thải trong qua trình chế biến). Điều này quyết định sự phát triển của vi sinh vật
và khả năng chuyển hóa vật chất của vi sinh vật. Trong nước thải công nghiệp vi
khuẩn thường chiếm một số lượng lớn, ngoài ra còn có nấm men, tảo đơn bào, nguyên
sinh động vật,…
Đặc tính ô nhiễm và nồng độ của nước thải công nghiệp rất khác nhau phụ thuộc
vào loại hình công nghiệp và chế độ công nghệ lựa chọn.
Nước thải chế biến có chứa hàm lượng cặn lơ lửng là chất hữu cơ rất cao, thường
có lượng oxy hòa tan tương đối thấp. Thành phần nước thải chế biền gồm tinh bột,
đường, protein, cellulose, các khoáng chất và độc tố công nghiệp,
Khi nước thải mới vừa ra khỏi nhà máy thì lượng vi sinh vật không nhiều. Sau

một thời gian thì những vi sinh vật này sẽ thích nghi được với đặc trưng của nước thải
và sẽ phát triển nhanh chóng về số lượng và đa dạng loài. Quá trình trao đổi chất của
vi sinh vật trong nước thải gồm hai quá trình cơ bản là quá trình đồng hóa và dị hóa.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

8
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

* Đặc điểm nước thải của cơ sở sản xuất bánh Pía:

Hình 2. Nƣớc thải từ cơ sở sản xuất bánh Pía Tân Huê Viên (THV) và
Mỹ Trân (MT)
Đặc điểm của nước thải từ cơ sở sản xuất bánh Pía Tân Huê Viên:
 Màu sắc: màu hơi vàng, có ít ván mỡ trên bề mặt.
 Mùi: hôi khó chịu.
 Độ đục: nước đục ít.
Đặc điểm của nước thải từ cơ sở sản xuất bánh Pía Mỹ Trân:
 Màu sắc: màu trắng đục, có nhiều cặn ở dưới đáy và trên bề mặt
 Mùi: rất hôi.
 Độ đục: đục nhiều.
Đặc điểm của nước thải từ cơ sở sản xuất bánh Pía Quảng Trân:
 Màu sắc: màu hơi nâu, có nhiều cặn màu đen ở dưới đáy.
 Mùi: rất hôi.
 Độ đục: đục nhiều.
Có sự khác nhau về đặc điểm của nước thải do mẫu được thu từ 3 cơ sở sản xuất
bánh Pía khác nhau, cũng như quá trình chế biến, thành phần nguyên liệu và nồng độ
các chất,… không giống nhau nên đầu ra của mỗi cơ sở sản xuất sẽ khác nhau.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

9

Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

2.2.3 Tổng quan về tinh bột
Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu trong thực vật, được hình thành trong quá trình
quang hợp của cây xanh, đặc biệt là trong các quả, củ như ngũ cốc. Tinh bột có nguồn
gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lý và thành phần hóa học khác nhau.
Tinh bột ở dưới dạng hạt thường có kích thước và hình dáng khác nhau, không tan
trong nước lạnh, đun với nước thì tinh bột dần dần bị hồ hóa và độ nhớt của dung dịch
tăng lên.
Tinh bột tiếng Hy Lạp là amidon (công thức hóa học là (C
6
H
10
O
5
)
n
) là một
polysacarit carbohydrates chứa hỗn hợp amylose và amylopectin. Tỷ lệ phần trăm
amylose và amylopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thường từ
20:80 đến 30:70. Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công
thức phân tử là C
6
H
12
O
6
) ( ngày
23/7/2013).
2.2.3.1 Amylose

Amylose có trọng lượng phân tử 5000-160000 Dallton, được cấu tạo từ 200-1000
phân tử α-D glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4 glucosid tạo thành một mạch
thẳng dài không phân nhánh.
Hình 3. Cấu trúc của phân tử Amylose
(*Nguồn: ngày 23/07/2013)
Khi ở trong hạt tinh bột, trong dung dịch, hoặc ở trong trạng thái bị thoái hóa
amylose có cấu hình mạch giản, khi thêm tác nhân kết tủa vào amylose mới chuyển
thành dạng xoắn ốc, mỗi vòng xoắn gồm 6 đơn vị glucose. Trong nước nóng tạo trạng
thái dung dịch keo (hồ tinh bột), khi đó amylose tồn tại ở trạng thái xoắn, ổn định nhờ
các liên kết hydro. Một phần cấu trúc của amylose tạo phức với Iot cho dung dịch màu
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

10
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

xanh đặc trưng, màu này mất đi khi đun nóng và trở lại màu xanh khi nguội. Ngoài ra,
amylose bị kết tủa bởi rượu butylic.

Hình 4. Hồ tinh bột
(*Nguồn: ngày 23/7/2013)
2.2.3.2. Amylopectin
Amylopectin có trọng lượng phân tử từ 500000 đến hàng trục triệu Dallton, được
cấu tạo từ 600-6000 phân tử D glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4 glucosid
và α-1,6 glucosid tạo thành một mạch thẳng phân nhánh, mỗi nhánh có khoảng 8-30
gốc α-D glucopyroranose.

Hình 5. Cấu trúc của phân tử Amylopectin
(*Nguồn: ngày 23/07/2013)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

11
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Amylopectin thường phân bố bên ngoài hạt tinh bột. Amylopectin bắt màu tím
hay màu đỏ tím với Iot. Amylopectin chỉ tan được trong nước ở nhiệt độ cao tạo thành
dung dịch có độ nhớt cao và rất bền vững. Amylopectin không có khả năng tạo phức
với butanol và các hợp chất hữu cơ khác, không bị hấp phụ trên cellulose.
2.2.4 Quá trình phân hủy tinh bột
Tinh bột bị phân hủy bởi enzyme amylase. Sản phẩm của quá trình phân hủy tinh
bột gồm: đường glucose, đường maltose, dextrin,…
C
6
H
12
O
6
(C
6
H
10
O
5
)
n
+ nH
2
O → (1+n)C
2
H
12

O
6
Tinh bột Glucose
Một phần các đường này sẽ tan trong nước, một phần đi vào tế bào vi sinh vật và
tham gia vào các quá trình chuyển hóa khác trong tế bào.

Hình 6. Quá trình chuyển hóa tinh bột của vi sinh vật
(*Nguồn: Nguyễn Đức Lượng (2003), Công nghệ sinh học môi trường - Công nghệ xử lý nước thải)


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

12
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Phân hủy
- Các phức chất và các chất không tan như protein, lipid, polysaccharid được phân
giải thành các tiểu đơn vị, các phức đơn giản hơn hoặc chất hòa tan (đường, các amino
acid, acid béo).
- Do vi sinh vật sản xuất ra các enzyme ngoại bào.
- Đây là một quá trình xảy ra chậm.
Phân hủy tinh bột bằng enzyme:

Hình 7. Cơ chế phân hủy tinh bột
(*Nguồn: Nguyễn Tiến Thắng (2008), Giáo trình công nghệ enzyme, ngày 26/07/2013)
Tinh bột có nguồn gốc khác nhau, enzyme có nguồn gốc khác nhau thì khả năng
phân hủy cũng khác nhau.
Khi sự phân hủy xảy ra thì độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột giảm dần, khả năng
khử tăng lên và khả năng khử Iot chuyển dần từ màu xanh sang tím rồi sang màu hồng
( ngày 25/07/2013).

2.2.5 Enzyme tham gia vào quá trình phân hủy tinh bột
a) Giới thiệu enzyme amylase
Nhóm enzyme có tên gọi chung là glycosid hay carbohydase xúc tác cắt đứt liên
kết glucosid nối các đơn vị đường đơn trong cấu trúc của tinh bột, giải phóng glucose
và các loại đường khác. Trong đó glucose là nguyên liệu đầu vào để sản xuất ra nhiều
sản phẩm công nghiệp quan trọng.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

13
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Các vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy tinh bột thường có khả năng sinh
tổng hợp enzyme amylase ngoại bào. Các enzyme này được chia ra thành 4 nhóm:
 Enzyme α-amylase (α-1,4 glucan-4-glucanohydrolase): còn được gọi là
endoamylase, do có khả năng cắt đứt các liên kết α-1,4-glucosid nằm ở phía bên trong
phân tử tinh bột một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên
tinh bột, enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn
gọi nó là α-amylase. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể bị phân cắt thành
nhiều đoạn ngắn gọi là sự dịch hóa tinh bột.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:
 Giai đoạn dextrin hóa:
α-amylase
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
 Giai đoạn đường hóa:
Dextrin  tetra và trimaltose  disaccharid và mono saccharid.
Amylase  oligosacharid  poliglucose.
Maltose  maltotriose  maltotetrose.
α-amylase không chỉ phân hủy hồ tinh bột mà nó phân hủy cả hạt tinh bột nguyên
song với tốc độ rất chậm.
 Enzyme β-amylase (α-1,4 glucan-maltohydrolase): có khả năng cắt đứt liên kết

α-1,4-glucosid ở cuối phân tử tinh bột, bởi thế còn gọi là exoamylase, tạo ra sản phẩm
là maltose và β-limit dextrin (chiếm khoảng 40-45%). β-amylase chỉ phổ biến trong
giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy mầm).
 Glucoamylase (còn gọi là Amyloseglycosidase): phân hủy hoàn toàn tinh bột
thành glucose và các oligosaccharid, enzyme này có khả năng phân cắt cả hai loại liên
kết 1,4 glucosid và 1,6 glucosid.
 R-enzyme (α-1,6-glycosiadase) có khả năng cắt đứt mối liên kết 1,6 glucosid tại
những chỗ phân nhánh của amylopectin.
Dưới tác động của 4 loại enzyme trên, phân tử tinh bột được phân hủy thành
đường glucose. Có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT

14
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh pía, bánh cuốn, chế biến nông sản
ngô, khoai, sắn,…
Các enzyme trên là các enzyme ngoại bào. Vi sinh vật tổng hợp chúng trong tế
bào và các enzyme này sẽ thoát ra ngoài tế bào và thực hiện các quá trình phân hủy
tinh bột ở bên ngoài tế bào. Tinh bột là một chất cảm ứng. Sở dĩ, vi sinh vật tạo ra hệ
enzyme amylase ngoại bào là do tinh bột là một đại phân tử, chúng không có khả năng
xâm nhập trực tiếp vào tế bào. Các vi sinh vật tạo ra cơ chế phân cắt chúng thành
những phân tử nhỏ hơn. Các phân tử nhỏ sẽ dễ dàng qua các lỗ màng chất nguyên sinh
vào trong tế bào theo gradient nồng độ. Sự phân hủy này không mang ý nghĩa là cung
cấp năng lượng cho tế bào, đây chỉ đơn thuần là quá trình xé nhỏ vật chất để sau đó
những đơn vị phân tử nhỏ chui được vào trong tế bào tham gia vào các quá trình
chuyển hóa sinh học (Nguyễn Đức Lượng (2003),Công nghệ xử lý nước thải).
Ngoài amylase, trong thực tế còn có sự hiện diện của các enzyme khác phân hủy
tinh bột và đường oligo như dextranase, glycosidase, β-glucosidase, lactase. Tuy nhiên
hệ enzyme amylase là enzyme được quan tâm nhiều nhất và được sử dụng phổ biến

hơn ( />vat-co-kha-nang-phan-huy-tinh-bot-va-ung-dung-trong-xu-ly-nuoc-thai-6991/, ngày
25/07/2013).
b) Ứng dụng của enzyme amylase
Trong chế biến thực phẩm gia súc
Trong chế biến thức ăn gia súc thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn.
Trong khối lượng này thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng
lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm enzyme amylase vào.
Enzyme amylase sẽ tham gia phân hủy tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá
trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn.
Trong dược phẩm
Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP,
carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh. Mặt khác, amylase
phối hợp với enzyme để chữa bệnh thiếu enzyme đường tiêu hóa.