thử nghiệm khả năng điều trị bệnh do staphylococcus aureus của cỏ cứt heo (ageratum conyzoides l ) trên chuột bạch (mus musculus domesticus)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG







NGUYỄN KHOA


THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH
DO STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA CỎ
CỨT HEO (Ageratum Conyzoides L.) TRÊN
CHUỘT BẠCH
(Mus musculus domesticus)


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH DƢỢC THÚ Y





Cần Thơ, 2015
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH DƢỢC THÚ Y

Tên đề tài:
THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH
DO STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA CỎ
CỨT HEO (Ageratum Conyzoides L.) TRÊN
CHUỘT BẠCH
(Mus musculus domesticus)


Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiên:
PGS. TS. HUỲNH KIM DIỆU NGUYỄN KHOA
MSSV: 3102954
Lớp: Dược Thú Y K36





Cần Thơ, 2015


i
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y


Đề tài : “Thử nghiệm khả năng điều trị bệnh do Staphylococcus aureus
của Cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides L.) trên chuột bạch (Mus musculus
domesticus)” do sinh viên Nguyễn Khoa thực hiện tại bộ môn Thú Y, khoa
Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 07
năm 2013 đến tháng 11 năm 2014.




Cần Thơ, ngày tháng năm 201… Cần Thơ, ngày tháng năm 201…
Duyệt Bộ môn Duyệt Giáo viên hƣớng dẫn



Huỳnh Kim Diệu


Cần Thơ, ngày tháng năm 201…
Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƢD


ii
LỜI CẢM TẠ
Dưới giảng đường Đại học Cần Thơ, thầy cô là người đã dành bao tâm
huyết cho sự nghiệp trồng người, đã trang bị những hành trang quí báu cho
chúng tôi vững bước vào đời. Với những kiến thức được tiếp thu trong quá
trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là

hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin.
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn thành kính nhất đến ba mẹ và gia đình
của tôi, những người đã vượt khó khăn để nuôi tôi khôn lớn và trưởng thành
như ngày hôm nay.
Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban
Chủ Nhiệm Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, quý thầy cô Bộ môn
Thú Y và Bộ môn Chăn nuôi - Thú y đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian học tập.
Xin chân thành cảm ơn cô Huỳnh Kim Diệu, đã theo sát hướng dẫn tận
tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu, đã chỉ dẫn nhiệt tình, cung cấp
những kiến thức cần thiết để hoàn thành đề tài này.
Xin cảm ơn cô Châu Thị Huyền Trang, cố vấn học tập lớp Dược Thú Y
K36, người đã luôn hết mình quan tâm, lo lắng và giúp đỡ sinh viên chúng tôi
trong suốt quá trình học tập.
Xin cảm ơn các anh chị học viên cao khóa 18, cảm ơn Chị Nguyễn Thị
Hàn Ni đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ, động viên tôi thực hiện đề tài.
Các bạn lớp Dược Thú Y K36 đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ nhau trong
quá trình thực hiện nghiên cứu.
Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố
gắng, tuy nhiên do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không tránh
được những sai sót. Rất mong được sự quan tâm, góp ý của thầy cô để bài luận
hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn !
Cần Thơ, ngày… tháng… năm……
Sinh viên thực hiện


NGUYỄN KHOA

iii
TÓM LƢỢC
Để đánh giá khả năng trị bệnh do nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus
của cây Cỏ cứt heo, thử nghiệm trên chuột bạch được thực hiện. Thí nghiệm
được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức: 3 nghiệm thức điều trị
(NT1, NT2, NT3) và nghiệm thức đối chứng (ĐC). Mỗi nghiệm thức có 4 chuột
với 3 lần lặp lại. Tất cả các con chuột đều được gây nhiễm với vi khuẩn
Staphylococcus aureus nồng độ 1,2x10
10
cfu/ml (liều LD
50
), liều 1 ml/con bằng
đường tiêm xoang bụng. Sau 60 phút gây nhiễm, tiến hành điều trị cho chuột
bằng cao cỏ cứt heo (cho uống 0,1ml/con) ở ba liều khác nhau: NT1 liều 0,217
g/kg thể trọng (P); NT2 liều 0,43 g/kg P; NT3 liều 0,65 g/kg P. Nghiệm thức đối
chứng (ĐC) cho uống 0,1ml/con dung dịch nước cất và DMSO (10%). Kết quả
thu được sau bảy ngày điều trị cho thấy, ở liều 0,65 g/ kg P cho hiệu quả điều
trị cao nhất với tỉ lệ sống 100% so với NT ĐC không dùng cao điều trị tỷ lệ
chuột còn sống 41,6%. Sau khi điều trị tiến hành mổ khám, bệnh tích ghi nhận
được: phổi xuất huyết, thấp nhất ở NT3: 8,3% và cao nhất ở NT ĐC: 80% ;
lách sưng, không có biểu hiện ở NT3 ,NT ĐC cao nhất với tỉ lệ 60%; phổi hoại
tử, NT2 và NT3 không có biểu hiện ,NT ĐC có tỉ lệ biểu hiện là 40%. Các
bệnh tích dạ dày mỏng, thận hoại tử, gan hoại tử chỉ biểu hiện ở NT không
được điều trị bằng cao Cỏ cứt heo. Tiêu bản vi thể trên gan, thận không thấy
biểu hiện tổn thương, không có hiện tượng hủy tế bào gan, thận. Trong 3 NT
điều trị trên Staphylococcus aureus, cao Cỏ cứt heo cho tác dụng điều trị tốt
nhất ở NT 3 (0,65 g/kg P) và không gây độc tính trên gan và thận.
Từ khóa: Cỏ cứt heo, Staphylococcus aureus, điều trị.

iv
MỤC LỤC

TÓM LƢỢC iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH BẢNG vi
DANH SÁCH HÌNH vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii
CHƢƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 2: CƠ SỞ LÍ LUẬN 2
2.1 Sơ lược về cây Cỏ cứt heo 2
2.1.1 Phân loại 2
2.1.2 Đặc điểm hình thái 3
2.1.3 Phân bố sinh thái 3
2.1.4 Bộ phận dùng 4
2.1.5 Thành phần hóa học 4
2.1.6 Tác dụng dược lý 4
2.1.7 Công dụng điều trị bệnh 5
2.1.8 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 5
2.2. Giới thiệu về Staphylococcus aureus 6
2.2.1. Hình thái, đặc điểm sinh hóa 6
2.2.2. Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố 9
2.2.3. Cấu trúc kháng nguyên và độc tố 10
2.2.4. Tính kháng thuốc kháng sinh 11
2.2.5. Đặc tính gây bệnh 12
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1 Thời gian và địa điểm 14
3.2 Nội dung nghiên cứu 14
3.3 Phương tiện nghiên cứu 14

3.3.1 Nguyên liệu 14
3.3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 14
3.4 Phương pháp nghiên cứu 15
3.4.1 Điều chế cao thô 15
3.4.2 Điều trị bệnh do Staphylococcus aureus trên chuột bạch
bằng cao lá cỏ cứt heo 16
3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi 19
3.4.4 Làm tiêu bản vi thể ở các cơ quan nội tạng trên chuột 19
3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 19


v
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20
4.1 Biểu hiện lâm sàng trên chuột khi gây nhiễm Staphylococcus aureus 20
4.2 Kết quả điều trị trên chuột bằng cao Cỏ cứt heo 23
4.2.1 Kết quả khỏi bệnh 24
4.2.2 Kết quả khảo sát triệu chứng sau khi điều trị bằng cao Cỏ cứt heo 25
4.2.3 Kết quả mổ khám bệnh tích 27
4.2.4 Bệnh tích vi thể một số cơ quan chuột sau điều trị 30
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề nghị 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC 37




vi
DANH SÁCH BẢNG

Trang
Bảng 2.1 Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci 9
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm điều trị trên chuột 18
Bảng 4.1 Tỷ lệ khỏi bệnh của chuột sau bảy ngày điều trị 24
Bảng 4.2 Trung bình thân nhiệt chuột qua 7 ngày điều trị 25
Bảng 4.3 Trọng lượng chuột qua 7 ngày điều trị 26
Bảng 4.4 Tần số xuất hiện các bệnh tích trên chuột sau 7 ngày điều trị 27


vii
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hoa Cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides L.) 2
Hình 2.2 Cây Cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides L.) 3
Hình 2.4 Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương dưới kính hiển vi 4
Hình 2.5 Staphylococcus aureus trên môi trường Paird Parker 8
Hình 3.1 Sơ đồ qui trình chiết xuất cao 16
Hình 4.1 Triệu chứng của chuột sau khi tiêm vi khuẩn S. aureus 20
Hình 4.2 Khuẩn lạc S. aureus được phân lập từ gan trên môi trường BP 22
Hình 4.3 Khuẩn lạc S. aureus được phân lập từ lách trên môi trường BP 22
Hình 4.4 Khuẩn lạc S. aureus được phân lập từ phổi trên môi trường BP 23
Hình 4.5 Khuẩn lạc S. aureus được phân lập từ thận trên môi trường BP 23
Hình 4.6 Thận hoại tử (trái) và phổi hoại tử (phải) 28
Hình 4.7 Lách hoại tử (trái) và gan hoại tử (phải) 28
Hình 4.8 Lách sưng to (NT ĐC), lách sau khi điều trị và
lách chuột bình thường 29
Hình 4.9 Phổi bình thường (trái) và phổi xuất huyết (phải) 29
Hình 4.10 Dạ dày bình thường (trái) và dạ dày mỏng (phải) 30
Hình 4.11 Bệnh tích hoại tử vùng tiêm vi khuẩn (trái) và
vùng hoại tử sau khi điều trị (phải) 30

Hình 4.12 Mô gan ở nghiệm thức 3 (trái) và
mô gan ở chuột bình thường (phải) 31
Hình 4.13 Mô thận ở nghiệm thức 3 (trái) và
mô thận ở chuột bình thường (phải) 31





viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BHI
Brain heart infusion
Canh thang não tim
CFU
Colony forming unit
Đơn vị khuẩn lạc
DMSO
Dimethyl sulfoxide

DNA
Deoxyribonucleic acid

LD
50

Lethal dose 50%
Liều gây chết 50%
MBC
Minimum Bactericidal

Concentration
Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
MHA
Mueller Hinton Agar
Thạch Mueller Hinton
MIC
Minimum Inhibitory
Concentration
Nồng độ ức chế vi khuẩn tối
thiểu
NA
Nutrient Agar
Thạch dinh dưỡng
RNA
Ribonucleic acid

UPGMA
Unweighted Pair Group Method
with Arithmatic Mean
Nhóm các cặp số bằng phương
pháp trung bình toán học
MRSA
Methicillin resistant
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus kháng
Methicillin
VRSA
Vancomycin Resistant
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus kháng

Vancomycin
S. aureus
Staphylococcus aureus



1
Chƣơng 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi ở nước ta phát triển nhanh
cả về số lượng lẫn chất lượng. Chăn nuôi gia súc gia cầm đã thật sự trở thành
nguồn thu nhập chính cho nhiều hộ gia đình, góp phần thúc đẩy phát triển kinh
tế nước nhà. Bên cạnh những thuận lợi, tình hình dịch bệnh thường xuyên xảy
ra, dịch bệnh không những làm giảm năng suất, gây thiệt hại kinh tế trong
chăn nuôi mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Trong bối cảnh dịch bệnh ở gia súc, gia cầm diễn biến ngày càng phức
tạp, các bệnh do virus đang có xu hướng gia tăng, nhiều loại vi khuẩn lờn và
kháng nhiều loại thuốc kháng sinh tân dược. Việt Nam là một trong các quốc
gia có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất ở châu Á. Các kháng sinh như
penicillin, methicillin, oxacillin, erythromycin, clindamycin, thậm chí các
kháng sinh phổ rộng và siêu mạnh như cephalosporin thế hệ 3 cũng đã bị
kháng (Châu Anh Tú, 2014).
Những năm gần đây xu hướng sử dụng thảo dược trong chữa trị bệnh
trên động vật được xem như một giải pháp có biên độ an toàn cao trong bảo
quản, điều trị bệnh gây ra trên động vật.
Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, được sự ưu đãi của thiên
nhiên nên thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại thảo mộc. Từ ngàn xưa,
con người đã biết tìm cây cỏ trong tự nhiên để chữa bệnh và tăng cường sức
khỏe. Ông cha ta đã biết cách sử dụng nhiều loại thảo mộc khác nhau để chữa
một số bệnh, mặc dù chưa có nhiều công trình nghiên cứu chuyên sâu về tính
kháng khuẩn và khả năng điều trị của các thảo dược này. Cỏ cứt heo cũng là

một trong những cây có chứa vị thuốc, được dân gian sử dụng điều trị bệnh từ
lâu như trị viêm xoang, chống viêm, chống dị ứng, chống phù nề,… (Đỗ Tất
Lợi, 2004).
Để tìm hiểu khả năng kháng vi khuẩn và khả năng điều trị bệnh trên
động vật thí nghiệm, được sự chấp thuận của Bộ môn Thú y thuộc Khoa Nông
nghiệp & SHƯD, trường Đại học Cần Thơ, đề tài “Thử nghiệm khả năng
điều trị bệnh do Staphylococcus aureus của Cỏ cứt heo (Ageratum
conyzoides L.) trên chuột bạch (Mus musculus domesticus)” đã được thực
hiện với mục tiêu xác định hiệu quả điều trị nhiễm khuẩn S. aureus của cao Cỏ
cứt heo.


2
Chƣơng 2: CƠ SỞ LÍ LUẬN
2.1 Sơ lƣợc về cây Cỏ cứt heo
2.1.1 Phân loại
Tên khoa học: Agenatum conyzoides Linn.
Giới: Thực vật – Plantae.
Phân giới: Thực vật có hoa – Angiospermae.
Bộ: Cúc – Asterales.
Họ: Cúc – Asteraceae (Compositae).
Chi: Ageratum.
Loài: Agenatum conyzoides L.
Tên khác: cây hoa ngũ sắc, cây hoa ngũ vị, cỏ hôi (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Tên nước ngoài: white weed, goat weed, bastard arimony (Anh), agérate
conyzoϊde (Pháp).
Là một loại thảo dược thường niên với lịch sử lâu dài trong việc sử dụng
thuốc truyền thống ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới
và cận nhiệt đới. (Adewole, 2001).

Hình 2.1 Hoa Cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides L.)
(Nguồn: Theo <
2782010/5106735040/in/photostream/>)




3
2.1.2 Đặc điểm hình thái
Theo Đỗ Tất Lợi (2004), cây Cỏ cứt heo là một cây nhỏ, mọc thường
niên, thân có nhiều lông nhỏ mềm, cao khoảng 25–50 cm, mọc hoang ở khắp
nơi trong nước ta. Lá mọc đối xứng hình trứng hay 3 cạnh, dài từ 2–6 cm, rộng
khoảng 1–3cm, mép có răng cưa tròn, hai mặt lá đều có lông, mặt dưới của lá
có màu nhạt hơn. Hoa Cứt heo nhỏ, có màu tím, xanh. Quả màu đen, có 5
sống dọc.

Hình 2.2 Cây Cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides L.)
(Nguồn: Theo < www.lrc-hueuni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/-
thuocdongy/C/CoCutLon.htm&key=&char=C>)
2.1.3 Phân bố sinh thái
Cỏ cứt heo có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ và hiện nay đã phân
tán sang các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới (Juliana et al., 2010).
Có sự phân phối từ Đông Nam Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Cỏ cứt heo cũng
được tìm thấy ở Tây Phi và những vùng của châu Á như Việt Nam, Thái
Lan… và Brazil (Laurent et al., 2011)
Ở Việt Nam, cây phân bố khắp nơi từ vùng núi cao trên 1500m đến các
tỉnh vùng trung du và cả ở đồng bằng. Cây thường mọc ở các nương ngô, bãi
sông, ven đường và trong vườn. Cây con được mọc lên từ hạt, hạt có túm lông
và phát tán nhờ gió (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004).

4
2.1.4 Bộ phận dùng
Lá, thân non, hoa và rễ (Laurent et al., 2011).
2.1.5 Thành phần hóa học
Theo Laurent et al., (2011), Cỏ cứt heo chứa những thành phần hóa học
chính đã được tìm thấy trong cây như sau: 6,7-dimethoxy-2 ,2-
dimethylchromene; 6-demetoxyageratochromene; 6-vinyl-demethoxy-
ageratochromene; ageratochromene (precocene II); α –cubebene; α-pinene; α-
terpinene; β-caryophyllene; β-cubebene; β-elemene; β-farnesene; β-myrcene;
β-pinene; β-selinene; β-sitosterol; cadinene; caryophyllene-oxyde;
conyzorigum; coumarine; dotriacontene; endo-borneol; endo-bornyle-acetate;
ethyl-eugenol; ethyl-vanilline; farnesol; friedeline; HCN; hexadecenoid-acide;
kaempferol; kaempferol-3,7-diglucoside; kaempferol-3-O-
rhamnosylglucoside; linoleid acide; quercetine; quercetine-3 ,7-diglucoside;
quercetine-3-O-rhamnosylglucoside
Cỏ cứt heo Việt Nam chứa tinh dầu (0,7–2%), carotenoid, phytosterol
(ít), tannin, đường khử saponin (hàm lượng trong thân và lá là 4,7%), chất
uronic (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004).
Theo Gonzalez et al., (1991), các hợp chất phân lập được từ cây Cỏ cứt
heo rất đa dạng, bao gồm terpenoid, flavonoid, benzofuran, chromen và
alkaloid. Cho đến nay người ta đã xác định được 21 flavonoid chứa nhiều
nhóm thế có oxy ở các vị trí 3’, 4’, 5’ ít gặp trong các hợp chất tự nhiên nhưng
lại tìm thấy khá nhiều trong cây Cỏ cứt heo.
Cỏ cứt heo chứa hàm lượng tinh dầu ether từ 0,11-0,58% ở lá và 0,03–
0,18% ở rễ, hàm lượng này phụ thuộc vào thời gian trong năm của cây. Hàm
lượng tinh dầu ở hoa tươi là 0,2%, tinh dầu từ hạt giống là 26%. (Adewole,
2002).
2.1.6 Tác dụng dƣợc lý
Cỏ cứt heo có tác dụng chữa viêm xoang mũi dị ứng (Đỗ Tất Lợi, 2004).

Trên động vật thí nghiệm thấy có tác dụng chống viêm, chống phù nề,
chống dị ứng phù hợp với những kết quả thu được trên thực tế lâm sàng điều
trị viêm mũi cấp và mãn (trích dẫn Đỗ Tất Lợi, 2004).
Chiết xuất bằng nước từ cả cây Cỏ cứt heo: cho tác dụng giảm đau, cầm
máu (Abena et al., 1993).
Chiết xuất bằng methanol và nước từ cả cây được ghi nhận có khả năng
kháng khuẩn thông qua ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn


5
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa và vi khuẩn Helicobacter pylori (Ogbeche et al., 1997).
Ngoài ra, cây Cỏ cứt heo còn có tác dụng điều trị vết thương, nhiễm
trùng do vi khuẩn (Gonzalez et al., 1991) và tác dụng giảm đau khi nghiên cứu
trên chuột (Menut et al., 1993).
2.1.7 Công dụng điều trị bệnh
Theo Đỗ Tất Lợi (2004), trong nhân gian người ta thường dùng cây cứt
heo làm thuốc chữa bệnh phụ nữ bị rong huyết sau khi sinh nở: hái khoảng
30–50g cây tươi, đem về rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước uống trong ngày ,uống
liên tục trong 3–4 ngày. Cỏ cứt heo còn có tác dụng chữa viêm xoang mũi dị
ứng mới phát hiện: hái cây tươi về rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước tẩm vào
bông, dùng bông này nhét vào mũi bên bị đau. Ngoài ra Cỏ cứt heo có thể kết
hợp với nước bồ kết nấu nước gội đầu có tác dụng vừa thơm vừa sạch gầu,
trơn tóc.
Ở một số nước Châu phi,dùng Cỏ cứt heo để chữa trị vết thương, các
bệnh truyền nhiễm cũng như đau đầu và khó thở (Adewole, 2001). Ở Brazil
dùng điều trị đau bụng, cảm lạnh, sốt, tiêu chảy, bệnh thấp khớp, co thắt
(Jaccoud, 1961). Ở Ấn Độ, lá Cỏ cứt heo được dùng làm thuốc chữa vết đứt,
vết thương và lở loét. Trong y học dân gian Nepan, nước ép rễ cây Cỏ cứt heo
dùng để chữa bệnh sỏi thận; lá dùng làm thuốc săn da hoặc chữa vết thương.

2.1.8 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Theo Osho et al., (2011), sử dụng phương pháp khuyếch tán và nồng độ
ức chế tối thiểu để nghiên cứu sự nhạy cảm của vi khuẩn và nấm men với tinh
dầu từ thân, lá, rễ của Cỏ cứt heo. Các nồng độ ức chế tối thiểu dao động từ
2,0 – 4,0 mg/ml cho thấy các vi khuẩn thử nghiệm (Bacillus subtilis,
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Candida albicans) đều nhạy
cảm với tinh dầu từ thân, lá, rễ của Cỏ cứt heo, trừ vi khuẩn Pseudomonas
aeruginosa là không nhạy cảm với tinh dầu từ thân, lá, rễ của Cỏ cứt heo.
Nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori) của
cỏ cứt heo. Sử dụng Cỏ cứt heo đã được sấy khô, nghiền mịn, ngâm methanol
(100%) trong 48 giờ, lọc lấy dịch chiết, tiến hành cô quay chân không thu
được sản phẩm cao thô, dùng kỹ thuật silica gel và sắc ký lớp mỏng tách chiết
để có được phần tinh khiết, sau đó dùng phương pháp khuếch tán để xác định
tính nhạy cảm của 15 chủng H. pylori. Pha loãng thành phần tinh khiết với
dung dịch DMSO 10% (2 mg/ml) để tiến hành xác định nồng độ ức chế tối


6
thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC). Kết quả cho thấy nồng độ
MIC thấp nhất là 0,002 mg/ml và MBC là 0,016 mg/ml (Ndip et al., 2009).
Năm 1965, Điều Ngọc Thực (Phú Thọ) phát hiện trong nhân dân dùng
cây Cỏ cứt heo để chữa viêm xoang mũi dị ứng, đã áp dụng trên bản thân và
một số người khác thấy có kết quả tốt. Đoàn Thị Nhu và ctv., (1975) đã xác
định độc tính cấp LD
50
bằng đường uống với liều 82g/kg, dùng trong 30 ngày
không thấy gây những biến đổi bất thường đối với các hằng số sinh hóa trong
một số xét nghiệm về chức năng của thận và gan. Trên vật thí nghiệm thấy có
tác dụng chống viêm, chống phù nề, chống dị ứng và phù hợp với những kết
quả thu được trên thực tế lâm sàng điều trị viêm mũi cấp và mãn tính (trích

dẫn Đỗ Tất Lợi, 2004).
2.2. Giới thiệu về Staphylococcus aureus
Giới: Eubacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Staphylococcaceae
Giống: Staphylococcus
Loài: Aureus
Tên khoa học: Staphylococcus aureus
2.2.1. Hình thái, đặc điểm sinh hóa
Staphylococcus aureus (S. aureus) thuộc giống Staphylococcus, do đó
mang những tính chất chung của Staphylococcus. S. aureus là những vi khuẩn
hình cầu, không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp
thành hình chùm nho, không di động. Thành tế bào kháng với lysozyme và
nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycine của tụ cầu
(Harvey and Gilmour, 2000).


7
catalase

Hình 2.4. Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương dưới kính hiển vi
(Nguồn: Theo <en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus>)

S.aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme
catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:

H
2

O
2
H
2
O + O
2

S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra
enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S. aureus, là tiêu
chuẩn để phân biệt S. aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase:
coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase
“tự do” (“free” coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào. Có hai phương
pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính và trong
ống nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase “cố định”
bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát
hiện những coagulase “tự do” bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua
cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương (Collin et al., 1995).
Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có
khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng
S. aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường
chứa đến 15% muối NaCl (Trần Linh Thước, 2002).


8
Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch
máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan
máu hẹp hơn so với đường kính khuẩn lạc. Hầu hết các dòng S. aureus đều tạo
sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà
thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố được tạo ra
nhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon

khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin và ctv., 1995).
Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có
màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng
sáng rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K
2
TeO
3
và khả năng
thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund and Lee, 1995; Mary and
John, 2002). Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi
trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm
và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol)
(Mary and John, 2002).

Hình 2.5 Staphylococcus aureus trên môi trường Paird Parker
(Nguồn: Theo <in110262864.trustpass.alibaba.com/product/110999363-
0/BAIRD_PARKER_AGAR_BASE.html>)
Đa số các dòng S. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin
trong môi trường có nhiệt độ trên 15
o
C, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở
nhiệt độ 35-37
o
C (Trần Linh Thước, 2002).


9
Bảng 2.1. Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci
Đặc tính
S. aureus

S. epidermidis
Micrococci
Catalase
+
+
+
Coagulase
+
-
-
Thermonuclease
+
-
-
Nhạy với
Lysostaphin
+
+
-
Sử dụng glucose
+
+
-
Sử dụng manitol
+
-
-
Nguồn: Reginald, 2001
2.2.2. Điều kiện tăng trƣởng và sự phân bố
S. aureus phân bố rộng rãi trong tự nhiên có nhiều trong các thực phẩm

như: thịt, trứng, sữa và trên da, tóc, lông của người và động vật.
S. aureus lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh, được xếp
vào nhóm vi khuẩn cơ hội vì nó có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô
chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập.
Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của S. aureus thay đổi tùy thuộc
vào từng dòng (Bremer et al., 2004).
S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7-
48
o
C, với nhiệt độ cực thuận là 30-45
o
C; khoảng pH 4,2-9,3, với độ pH cực
thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl (Harvey and
Gilmour, 2000).
Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ
60%; nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác
như Shigella và Salmonella bị ức chế (Đỗ Thị Hòa, 2006).
Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và
máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc
thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ
yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu
nóng.
S. aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí
chủ. Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng
thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn
(Harvey and Gilmour, 2000).


10
Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60

o
C từ 2-50
phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh
vật khác ức chế (Bremer et al., 2004).
2.2.3. Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
2.2.3.1 Cấu trúc kháng nguyên
Tế bào S. aureus là hỗn hợp của hơn 30 loại kháng nguyên. S. aureus có
kháng nguyên O gồm chủ yếu 2 loại peptidoglycan và protein A
Peptidoglycan: bản chất là một polysaccharide của thành tế bào, có tác
dụng giữ cho thành tế bào được chắc, đồng thời kích thích bạch cầu đơn nhân
sản xuất interleukin 1 để lôi kéo các tiểu thực bào thực hiện quá trình thực
bào. Chúng có hoạt tính như nội độc tố và hoạt hóa bổ thể.
Protein A cũng là thành phần của thành tế bào có tác dụng tham gia trong
phản ứng kết hợp bổ thể.
Ngoài ra S. aureus còn có các kháng nguyên sau:
Teichoic acid: bản chất là những glycerol hay ribitol phosphate, liên kết
với peptidoglycan và nó cũng có tính kháng nguyên. Kháng thể chống lại
teichoic acid đã được tìm thấy ở bệnh nhân viêm nội tâm mạc do S. aureus.
Nang: chỉ có ở một số dòng S. aureus có tác dụng ngăn cản sự thực bào
của bạch cầu trung tính.
2.2.3.2 Độc tố và enzyme
Theo Carter (1991), có các độc tố và enzyme sau:
Độc tố ruột A–E: đây là những protein được cấu tạo từ những chuỗi
polypeptide đơn giản. Có 5 nhóm huyết thanh học được đặt tên là SEA
(Staphylococcus Enterotoxin A), SEB, SEC, SED và SEE. Nhóm thứ sáu: SEF
không được xem là độc tố đường ruột và đặt tên lại là độc tố gây hội chứng
shock toxin-1. Dựa vào kiểu kháng nguyên khác nhau, SEC lại được chia
thành 3 loại SEC1, SEC2 và SEC3. Những độc tố này đề kháng cao với nhiệt
độ.
Độc tố gây dung huyết tế bào α, β, γ, δ: tất cả đều có kiểu kháng nguyên

riêng biệt. Những tế bào hồng cầu của nhiều loài thú khác nhau sẽ có tính mẫn
cảm khác nhau đối với các độc tố này. Độc tố α và β gây dung huyết mạnh,
trong đó độc tố α có ái lực mạnh với hồng cầu thỏ, độc tố này gây co thắt cơ
trơn, hoại tử da và gây chết. Độc tố β phần lớn ái lực với tế bào hồng cầu cừu.
Độc tố γ bị ức chế bởi cholesterol, độc tố δ bị ức chế bởi những phospholipids.


11
Cách tác động của các độc tố γ, δ và vai trò của chúng trong việc gây bệnh thì
được biết đến nhiều.
Độc tố gây ra hội chứng shock: do những dòng vi khuẩn gây ra hội chứng
shock độc tính cho người.
Coagulase: làm đông huyết tương, biến đổi prothrombin thành thrombin,
fibrinogen thành fibrin. Vai trò của enzyme này đối với độc lực thì chưa được
biết đến.
Lipase: gây rối loạn sự bảo vệ các acid béo trên da, những dòng có lipase
dương tính thì có khuynh hướng gây ra những abscess trên da và dưới da.
Hyaluronidase: là một enzyme được biết đến như là “một yếu tố dẫn
truyền”, nó làm phân hóa acid hyaluronic, tạo điều kiện cho vi khuẩn lan tràn
trong mô bào.
Penicillinase: phá hủy vòng β–lactam của penicillin.
Leukocidin: phá hủy bạch cầu hạt và macrophage, nó được tạo thành bởi
hai protein có tác động tương hỗ và rất nhạy cảm với nhiệt độ.
Staphylokinase: làm tan fibrin do biến đổi plasminogen thành plasmin
bởi enzyme fibrinolytic.
Ngoài ra, S. aureus còn có những độc tố và enzyme khác như:
collogenase, acid và alkine phosphatase, lysozyme, nuclease, lysotaphin
pyrogenic exotoxin, fibrinolysin và elastase .v.v.
Độc tố gây tróc vảy: làm bong biểu bì, tạo nốt phỏng ngoài da.
Catalase: biến hydrogen peroxide thành nước và oxygen.

2.2.4. Tính kháng thuốc kháng sinh
Sự kháng kháng sinh của S. aureus là một đặc điểm rất đáng chú ý. Đa số
S. aureus kháng penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase.
Một vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và
những dòng này ngày càng tăng. Một số còn kháng lại được methicillin gọi là
Methicillin resistant S. aureus (viết tắt là MRSA), do nó tạo ra các protein gắn
vào các vị trí tác động của kháng sinh (Lê Huy Chính, 2007). Những dòng
MRSA rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh
khác. Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng
vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S. aureus, và người ta
nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa
chẳng hạn. Ngoài ra, S. aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế
(Kenneth Todar , 2005).


12
S. aureus kháng với penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men
penicillinase, một số còn kháng được methicillin (MRSA: methicillin resitant
S. aureus) do tạo ra một loại protein gắn vào thụ thể hoạt động của methicillin.
Tỷ lệ S. aureus kháng methicillin lên trên 50%.
Theo Nguyễn Thanh Bảo (2003), Staphylococcus kháng với penicillins
và cephalosporins nhờ tiết được men beta-lactamase, tính kháng thuốc được
truyền bởi plasmid bằng cơ chế chuyển nạp hay giao phối. Kháng nafcillin,
methicillin và oxacillin không phụ thuộc vào beta-lactamase, kháng thuốc do
Staphylococcus thiếu 1 loại PBP nên thuốc không gắn vào vi khuẩn được.
Dung nạp: thuốc ức chế nhưng không giết được vi khuẩn. Plasmid cũng có thể
mang nhiều gen kháng với tetracycline, erythromycin và aminoglycoside.
Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình
thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn. Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu
hết kháng sinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cả những kháng sinh mới.

Trong những năm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng vancomycin đã
dẫn đến sự gia tăng các dòng S. aureus kháng vancomycin VRSA
(Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus) (Kenneth Todar , 2005).
Theo Anakalo and Milcah (2004), S. aureus kháng với penicillin cao
(89,4%), kế tiếp là tetracycline (82,4%), trimethoprim-sulfamethazin (80,6%),
chloramphenicol (64,8%), erythromycin (38,4%), và methicillin (35,9%).
2.2.5. Đặc tính gây bệnh
Theo Lê Huy Chính (2007), Staphylococcus aureus gây nên rất nhiều
bệnh lý khác nhau:
- Các bệnh nhiễm trùng khu trú tại da và niêm mạc: những bệnh nhiễm
trùng da và các phần phụ thuộc (chủ yếu là các chân lông và tuyến mồ hôi) tạo
thành bệnh cảnh abcess kinh điển của tụ cầu. Các tụ cầu khuẩn có khả năng
tạo fibrin do đó tạo được một vách fibrin bao bọc ổ abcess. Các ổ nhiễm trùng
này có thể chỉ nhỏ như đầu đinh ghim (bệnh viêm nang lông) hoặc kích thước
như quả táo trong abcess cơ. Các vùng da có lông rậm bao phủ, tụ cầu thường
là nguyên nhân gây nên các mụn đầu đanh. Tổn thương tại chỗ có thể nhẹ
nhàng nhưng nó cũng là một mối nguy cơ phát tán vi khuẩn đến những cơ
quan xa hơn. Mủ của các ổ abcess do tụ cầu vàng thường có màu vàng, đặc và
không hôi.
- Nhiễm trùng các cơ quan sâu: nhiễm trùng các cơ quan bên trong cơ
thể có thể do đường nội sinh: từ một ổ nhiễm viêm nhiễm ngoại vi, vi khuẩn
theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác. Nhiễm trùng cũng có thể


13
do nguyên nhân ngoại sinh: vi khuẩn đi từ môi trường vào cơ thể thông qua
vết rách da sau chấn thương hoặc trong quá trình phẫu thuật. Các bệnh lý điển
hình trong nhóm này có thể kể: viêm xương tủy xương, nhiễm trùng huyết,
viêm tắc tĩnh mạch xoang hang, viêm nội tâm mạc, viêm màng não mủ…
Trong các loài vật, ngựa cảm nhiễm nhất rồi đến chó, bò, heo, cừu. Gia

cầm có sức đề kháng cao với tụ cầu khuẩn (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977; Lưu
Hữu Mãnh, 2010).
Tụ cầu ký sinh trên da, niêm mạc của người và gia súc. Khi sức đề kháng
của cơ thể kém hoặc tổ chức bị tổn thương vi khuẩn sẽ xâm nhập và gây bệnh.
Vi khuẩn có thể gây những ổ mủ ngoài da, niêm mạc. Một số trường hợp vi
khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, huyết nhiễm mủ.
Ngoài ra, ở người còn thấy độc tố ruột do tụ cầu tiết ra gây nên nhiễm
độc thức ăn và viêm ruột cấp tính (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997).


14
Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 7/2013 đến tháng 11/2014.
Địa điểm lấy mẫu: Thành phố Cần Thơ, khuôn viên khu II trường Đại
học Cần Thơ.
Địa điểm thực hiện thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Dược lý (E009), Bộ
môn Thý y thuộc khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng trường Đại học
Cần Thơ.
3.2 Nội dung nghiên cứu
Điều chế cao thô từ lá cỏ cứt heo.
Gây nhiễm chuột bạch với vi khuẩn S. aureus.
Điều trị bệnh chuột bạch bằng cao Cỏ cứt heo.
3.3 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.3.1 Nguyên liệu
Lá cây Cỏ cứt heo của dòng có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất theo
Nguyễn Thị Hàn Ni (2014).
Vi khuẩn S. aureus 081008 có nguồn gốc từ Viện Pasteur thành phố Hồ
Chí Minh.
3.3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Thiết bị: tủ sấy dụng cụ thủy tinh (Classware Drying Oven), tủ ấm
(Incubator), máy lọc chân không, autoclave, máy cô quay chân không, tủ sấy,
cân điện tử.
Dụng cụ: ống pipette, ống micropipette, đèn cồn, bình nón, phễu, đũa
thủy tinh, đĩa petri, que cấy, ống nghiệm, ống đong (100ml, 50ml, 10ml), chai
nấu môi trường.
Hóa chất: Methanol, dung môi DMSO, môi trường MHA (Muller Hinton
agar), NA (Nutrient agar), môi trường BHI (Brain Heart Infusion), môi trường
BP (Baird Parker); cồn 70
o
, cồn 90
o
; BaCl
2
.2H
2
O, H
2
SO
4
, NaCl 0,9%, nước
cất.





15

3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Điều chế cao thô
3.4.1.1 Cách thu mẫu
Lá Cỏ cứt heo (lấy trong khuôn viên khu II trường Đại học Cần Thơ)
được thu hái vào buổi sáng (khoảng 8 – 10 giờ), rửa sạch đất bùn, vết sâu hại,
nấm ký sinh và loại bỏ những tạp chất khác.
3.4.1.2 Cách chiết xuất cao thô
Sau khi Cỏ cứt heo được sấy khô ở 50
o
C cho đến khi khô giòn, mẫu khô
đem nghiền nhỏ và ngâm chiết bằng dung môi methanol ở nhiệt độ phòng
trong 3 ngày, lọc lấy dịch chiết, tiếp tục thêm dung môi methanol ngâm trong
1 ngày (lặp lại 2 lần). Sử dụng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 40
o
C để cô
đặc dịch chiết, tạo ra cao thô (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985).
Sản phẩm thu được là cao thô được sử dụng trong thí nghiệm điều trị bệnh
trên chuột.
Quy trình chiết xuất cao thô được mô hình hóa ở hình 3.1