Nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
PHAN THI BÍCH NGOC
NGHIÊN CỨU TRÍCH LY PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM
SÚ
Luận văn tốt nghiệp đại học Ngành: CÔNG NGHỆ THựC PHẲM
&
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THựC PHẨM
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TRÍCH LY PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM
sú
Giảo viên hưám.2 dẫn: PGs.Ts.
Nguyễn Văn Mười
Sinh viên thưc hiên:
Phan Thị Bích Ngọc
MSSV: 2101943
Lóp Công nghệ Thực phẩm K36
Cần Thơ, 2013
w
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Phan Thị Bích Ngọc với
sự hướng dẫn của PGs. Ts. Nguyễn Văn Mười. Các số liệu và kết quả trình bày trong
luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo đây, với
đề tài “Nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú” đã được hội đồng chấm
luận văn thông qua.
Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013 Người viết
Nguyễn Văn Mười
Người hướng dẫn
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và
Phan Thị Bích Ngọc

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
Thầy Nguyễn Văn Mười và cô Trần Thanh Trúc, những người đã trực tiếp hướng
dẫn, giúp đỡ em tận tình. Đồng thời cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận
lợi cũng như giải đáp những thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cô Nguyễn Thị Hoàng Minh, cán bộ phòng thí nghiệm D006 đã tạo điều kiện thuận
lợi cho em hoàn thành tốt đề tài của mình.
Chân thành cám ơn sự giảng dạy và truyền đạt kiến thức của các Thầy Cô ở Trường
Đại học Cần Thơ, đặc biệt là Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng, Trường Đại học cần Thơ.
Anh Trần Bạch Long - học viên Cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 19, anh đã
truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm, giúp đỡ em tận tình về kiến thức cũng như
phương pháp học tập, nghiên cứu.
Các bạn bè thân yêu và thầy cố vấn học tập kính mến của lớp Công nghệ thực phẩm
khóa 36 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập bên
nhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu đề tài.
Các anh chị và các bạn thực tập cùng phòng thí nghiệm D006 đã giúp đỡ rất nhiều
trong quá trình nghiên cứu đề tài.
Con cảm ơn cha mẹ, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hành
trang cho con bước vào đời.
Cuối lời em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học
Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại
trường.
Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công.
Em xin chân thành cảm ơn.
Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013 Sinh viên thực hiện
Phan Thị Bích Ngọc
TÓM TẮT
Đe tài tiến hành khảo sát một số yếu tổ ảnh hưởng đến khả năng trích ly protease từ
mẫu thịt đầu tôm sú - sản phẩm phụ của ngành chế biến tôm đông lạnh. Ảnh hưởng

của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly, điều kiện pH của môi trường, đặc
biệt là tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận
protease từ thịt đầu tôm sú đã được khảo sát theo phương pháp bề mặt đáp ứng với
cấu trúc có tâm. Kết quả khảo sát cho thấy, dịch chiết protease thu được từ thịt đầu
tôm sú có hoạt tỉnh tối ưu là 13,48 u/g CKNL (chất khô nguyên liệu) khi sử dụng
dung dịch đệm glycine - NaOH với pH 9 làm dung môi trích ly với tỷ lệ nguyên liệu
và dung môi là 1: 4 (w/v). Việc áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng đã xác định
được điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ tối ưu lần lượt là 46 °c và 44,6 phút.
Từ khóa: nhiệt độ, pH, protease, thịt đầu tôm sứ, thài gùrn, tỉ lệ dung môi.
MỤC
LỤC
soOca
DANH SÁCH HÌNH
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH TỪ VIÉT TẮT
CCD Central Composite Design
CKNT Chất khô nội tạng
CKTĐT Chất khô thịt đầu tôm
CPE Chế phẩm enzyme
DC Dịch chiết
DFP Diisopropyl Fluoridate Phospho
Đvtn Đơn vị thí nghiệm
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EMS Early Mortality Syndrome
HLSO Head Less Shell On
IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology
LysNA Lys-P- Naphthylamide
PMSF Phenyl Methane Sulfonyl Flouride (PMSF)
SBTI Soya Bean Trypsin Inhibitor
RSM Response Surface Methods

TCA Trichloacetic acid
u/g Units per weight (gam) of substrate
U/mL Units per volume (mL) of substrate
VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers
w/v
Weighưvolume
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng -Vỉ»-
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 ĐẶT VẤN ĐÈ
ứng dụng enzyme trong chế biến thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác đã và đang là một
trong những vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn. Hiện nay, các nước
phát triển đang áp dụng các chế phẩm enzyme trong sản xuất để tạo ra những sản
phẩm có năng suất và chất lượng cao với giá thành hạ (Saurel, 2003; Suutarinenn và
Autio, 2004; Ngô Tiến Hiển, 2001). Việt Nam là nước giàu tiềm năng về nông sản,
nhu cầu các loại enzyme phục vụ trong chế biến thực phẩm là rất lớn. Tuy nhiên, ở
Việt Nam hoàn toàn không có xưởng sản xuất chế phẩm enzyme, hàng năm nước ta
vẫn phải nhập ngoại một khối lượng lớn những loại enzyme này (Đặng Thị Thu và
Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b).
Protease là enzyme thủy phân có giá trị thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% tổng
lượng enzyme công nghiệp được cung cấp trên thị trường thế giới (Joo và Chang,
2006) với nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông
nghiệp, mỹ phẩm và đặc biệt trong y học hiện hiện đại (Joo và Chang, 2006 ; Nedra
et al., 2011). Hơn thế nữa, các nghiên cứu ứng dụng protease gần đây đã chỉ ra vai trò
tích cực của việc sử dụng các protease trung tính và đặc biệt là protease ưa kiềm
trong việc tầm soát các bệnh liên quan đến sự nghẽn mạch do sự đông tụ của fibrin
(Phan Thị Bích Trâm et al., 2007) hay ứng dụng trong thủy phân protein, làm mềm
thịt (Heu và Kim, 2002), thủy phân tạo dịch trích protein từ phụ phẩm cá (Prasertsan
và Prachumratana, 2013), khử protein trong phụ phẩm tôm, giúp quá trình chiết tách
chitin, chitosan đạt hiệu quả tốt (Nedra et al., 2011). Chính điều này đã mở ra triển

vọng cho việc nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú, giúp tận dụng
triệt để lượng phụ phẩm của tôm trong quá trình chế biến và tăng hiệu quả kinh tế cho
ngành thủy sản nói chung, ngành xuất khẩu tôm nói riêng.
Với tỷ lệ đầu tôm được loại bỏ trong quá trình ché biến khoảng 34% khối lượng ban
đầu (Tran et al., 2011), trung bình hàng năm Việt Nam có khoảng 35.000 -ỉ- 46.000
tấn đầu tôm được thải ra tà các nhà máy. Hiện nay, lượng đầu tôm chủ yếu dùng làm
phân bón, thức ăn gia súc, thủy sản. Tuy nhiên giá trị thành phẩm của các sản phẩm
này chưa cao. Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm trong thời gian gần
đây là một hướng mới nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn đầu tôm phụ phẩm, đây được
xem như là một loại bao bì có tính năng bảo vệ và có thể sử dụng như thực phẩm mà
không hề ảnh hưởng đến môi trường chung quanh (Trung et al., 2003). Tuy nhiên,
việc sản xuất chitosan đòi hỏi phải loại bỏ lượng thịt trong đầu tôm (chiếm đến
15,25% khối lượng đầu tôm và 5,5% so với nguyên liệu tôm SÚ tươi), tạo ảnh hưởng
tiêu cực đến môi trường. Chính YÌ thế, yêu cầu đặt ra là nghiên cứu biện pháp sử
dụng nguồn nguyên liệu giàu protein và enzyme protease nhằm nâng cao giá trị
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nâng nghiệp và SHƯD 7
thương phẩm của tôm sú, đồng thời làm giảm tác động ô nhiễm môi trường do quá
trình xử lý đầu tôm gây ra là vấn đề có tính cấp thiết.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục đích chung của đề tài là xác định một số yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến hiệu
quả trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Để đạt được mục tiêu đã được đặt ra, đề tài
tập trung vào các nội dung cụ thể sau:
> Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly protease thích hợp.
> Xác định pH của dung môi thích hợp giúp gia tăng hiệu quả trích ly protease
Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian trích ly protease tò
thịt đầu tôm sú.
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 THỊT ĐẦU TÔM sú - NGUỒN NGUYÊN LIỆU LY TRÍCH ENZYME
PROTEASE

2.1.1 Tôm sú - nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu
2.1.1.1 Tổng quan
Tôm sú (có tên khoa học là Penaeus monodon, Fabricius, 1798, trích dẫn bởi
Holthuis, 1980) là loài sống ở nơi đáy bùn pha cát với độ sâu tò ven bờ đến 40 m
nước. Khi tôm trưởng thành thường di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước
sâu hơn.
Tôm sú được phân loại như sau:
Giới: Animalia Ngành:
Arthropoda Phân ngành:
Crustacea Lớp:
Malacostraca Bộ: Decapoda
Phân bộ: Dendrobranchiata Họ: Penaeidae
Chi: Penaeus
Loài: Penaeus monodon.
(Nguồn: Holthuis, 1980)
Trong tự nhiên tôm sú nước mặn đến mùa sinh sản sẽ tiến vào gần bờ để đẻ trứng,
trứng nở ra ấu trừng và trải qua năm thời kỳ biến thái: Naupilus, Zoea, Mysis,
Postlarvae, Juvenile. Từ đây ấu trùng theo sóng biển dạt vào cửa sông nơi nước biển
và nước sông pha trộn lẫn nhau nên độ mặn thấp hơn. Đây chính là điều kiện tốt cho
ấu trùng phát triển. Tôm sú có đặc điểm sinh trưởng nhanh, trong 3^-4

tháng có thể
đạt cỡ bĩnh quân 40 50 gam.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nâng nghiệp và SHƯD 8
(Holthuis, 1980)
Tôm đông lạnh đã và đang là một mặt hàng xuất khẩu có kim ngạch cao ở Việt Nam
và đang cạnh tranh mạnh mẽ với thị trường xuất khẩu lớn trên thế giới đặc biệt Thái
Lan đang gặp khó khăn do vấn đề tôm bệnh. Hơn thế nữa, nguồn cung tôm thế giới bị
hạn chế bởi sản lượng tôm từ Thái Lan giảm mạnh do ảnh hưởng của EMS khiến giá

tôm tăng trên toàn cầu. Nhờ đó, giá trị xuất khẩu tôm Việt Nam sang các thị trường
lớn tăng lên.
Trong đó, tôm sú là sản phẩm chính, chiếm hơn 50% tổng lượng tôm xuất khẩu trong
cả nước. Theo số liệu của VASEP (2010), tổng khối lượng xuất khẩu của mặt hàng
tôm sú là 121.399 tấn, chiếm 10,44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản trong cả nước và
56,7% tổng giá trị xuất khẩu ngành tôm. Đến cuối tháng 6 năm 2013, tổng lượng xuất
khẩu tôm sú có sụt giảm, nhưng vẫn là ngành hàng chủ lực nhất. Trong đó, mặt hàng
tôm sú bỏ đầu HLSO là sản phẩm được ưa chuộng trên nhiều thị trường, đặc biệt trên
thị trường Nhật Bản. Tôm sú HLSO Việt Nam cỡ 16/20 cuối tháng 6/2013 tăng thêm
5,5 USD/kg so với tháng 1/2013, từ 10,72 USD/kg lên 16,23 USD/kg. Tôm sú HLSO
cỡ 16/20 từ Ấn Độ cũng tăng thêm gần 5 USD/kg, từ
11,3 USD/kg lên 15,95 USD/kg.
(Nguồn: http://www. vasep. com. vn/Tin-Tuc/378_30440/Hien-trang-va-tiem-nang-thi-truong-xuat-
khau-tom- Viet-Nam. htm)
Tình hình hiện nay mở ra hướng khai thác nguồn thịt đầu tôm sú dồi dào này cho chế
biến các sản phẩm giá trị gia tăng, nâng cao giá trị của con tôm sú ở Việt Nam.
2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta
Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của thịt đầu tôm sú (bảng 2.1) cho thấy,
đây chính là nguồn giàu protein, đồng thời thịt đầu tôm có giá trị pH khá cao (7,3)
khi so sánh YỚi pH của thịt tôm tươi (pH = 6,8 6,9; Nguyễn Xuân Phương,
2003). Điều này cho thấy, thịt đầu tôm rất dễ chịu sự tấn công của các vi sinh vật và
các biến đổi sinh hóa, hóa học gây hư hỏng (Tran et al., 2011).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nâng nghiệp và SHƯD 9
Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon
(Nguồn: />2.1.1.2 Tình hình sản xuất tôm đông lạnh ở Việt Nam
Một trong những ứng dựng phổ biến nhất là sử dụng đầu tôm trong chế biến chitin,
chitosan. Ngô Thị Hoài Dương et al., 2008 cũng đã nghiên cứu đưa ra giải pháp tiền
xử lý bằng acid formic trong quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm thiểu
lượng hóa chất và chất thải gây ô nhiễm môi trường. Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc

Tú (2008) đã nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu - vỏ tôm bằng các phương pháp sinh
học (sử dụng Bromelanin trong dịch ép vỏ dứa). Nhiều nghiên cứu trong nước đã tận
dụng nguồn đầu tôm chủ yếu cho chế biến thức ăn gia súc. Phan Thị Bích Trâm và
Phạm Thu Cúc (2004) đã xác nhận thành công của việc xử lý vỏ đầu tôm với rỉ
đường và enzyme dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm. Trịnh Ngọc Vinh (2006) đã
tiến hành ủ chua đầu vỏ tôm có thêm vi khuẩn Lactobacillus spp. giúp quá trình lên
men được nhanh hơn. Sau đó, khảo sát nồng độ đường, nồng độ muối, nồng độ vi
khuẩn Lactobacillus spp. thích hợp trong việc bảo quản đầu vỏ tôm bằng phương
pháp lên men ủ chua. Qua đó, góp phần tạo ra sản phẩm thức ăn gia súc có chất
lượng cao hơn, có tính phổ biến rộng rãi, giá trị kinh tế cao và giảm thiểu việc gây ô
nhiễm môi trường. Phạm Thị Đan Phượng và các cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu
xử lý carotenoprotein thu hồi từ quá trình sản xuất chitin và bước đầu thử nghiệm
phối ưộn thức ăn cá.
Các nghiên cứu này đều cho thấy tầm quan trọng của việc ứng dụng một hệ enzyme
protease nhằm trợ giúp cho quá trình thủy phân dịch protein có sẵn trong nguồn
nguyên liệu đầu tôm này là cần thiết. Đặc biệt, việc trích ly enzyme protease có sẵn
trong nội tại của đầu tôm là vấn đề có ý nghĩa quan trọng.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nâng nghiệp và SHƯD 10
Bảng 2.1 Thành phần hóa lý CO’ bản của thịt đầu tôm sú
Thành phân Giá trị
Nước (%) 82,30 ± 0,83
Protein (%) 14,82 ±0,38
Lipid (%) 1,48 ±0,48
Tro (%) 1,11 ±0,03
pH 7,30 ±0,10
(Nguồn: Tran et ai, 2011)
2.2 KHÁI QUÁT VÈ PROTEASE VÀ HỆ PROTEASE TRONG THUỶ SẢN
2.2.1 Tổng quan về protease
2.2.1.1 Khái niệm enzyme protease

Protease là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide của protein:
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nâng nghiệp và SHƯD 11
o
Amino
component
- Kim loại peptidase là những protease trong trung tâm hoạt động có chứa các
ion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết peptidase
tạo phức họp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giống như nhóm
aspartic peptidase. Nhóm kim loại peptidase hoạt động mạnh nhất ở vùng pH
trung tính và bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA.
- Serine peptidase: Là những protease có nhóm hydroxyl (-OH) của serine trong
trung tâm hoạt động. Các peptidase serine này thường là hoạt động ở vùng pH
khá rộng tò trung tính đến kiềm, nhóm -OH của serine tác động lên nhóm -CO
của liên kết peptide tạo họp chất trung gian acyl-enzyme. Các enzyme thuộc
nhóm này thông dụng nhất là trypsin và chymotrypsin. Chúng bị ức chế bất
thuận nghịch dưới tác dụng diisopropyl-phosphofluoridate (DFP),
phenylmethanesulfonyl flouride (PMSF), coumarin và một số chất ức chế
thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành (SBTI), aprotinin, chymostatin.
Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lãnh vực
nhất là nhóm serine protease do chứng có khả năng thích ứng trong khoảng
pH khá rộng từ trung tính đến kiềm mạnh đã làm tăng khả năng ứng dụng
nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác. Đặc biệt được ứng dụng
rộng rãi trong các ngành công nghiệp thuộc da và chất tẩy rửa. Hiện nay nhóm
serine protease đã được phát hiện và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác
nhau với các tên thông dụng ở bảng 2.2.
Endopeptidase
NHiCHCOr NHCH NHCHCO - NHCHCONHCHCO NHCHCOOH
R4 R
5

Carboxylpeptidase
Exopeptidase
Hình 2.3 Cv chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase
(Nguồn: Đặng Thị Đăng Phương, 2005)
Aminopeptidase
Serine protease có chung nhóm phân loại EC 3.4.21 là một trong số các enzyme được
nghiên cứu khá rộng rãi ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình tiêu hóa
của động vật phổ biến nhất là trypsine, chymotrypsine và elastase. Serine protease
còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ thể như phá cục máu nghẽn và
hoạt hóa các bổ thể (Phan Thị Bích Trâm, 2011; Gupta et aỉ., 2002). Trung tâm hoạt
động của nhóm enzyme này chứa các amono acid aspartic, histidine và serine trong
đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế được trình bày ở Hình 2.4.
Hình 2.4 Sơ đồ các bước xúc tác Ctf bản của nhóm serine protease
(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 2011)
Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay
Enzyme Vị trí cắt Nguön
Trypsin Arg, Lys
Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài
khác
Chymotrypsin Tyr, Trp, Phe
Hệ thông tiêu hóa ở động vật và một sô loài
khác
Elastase Gly, Ala, Val
Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài
khác
Plasmin Arg, Lys Máu
Thrombin Arg Máu
Carboxypepüdase
A
Đầu c các amin

Hệ thống tiêu hóa ở động vật
(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 2010)
2.2.2 Hệ serỉne protease
H
I*
$#
>’
A
a
P
i.
I
i
r~{
HI
s«
IM / ~H1B2
I í I
o H I«'"" N H o Ỹ
o
liu
-N—c Ç
N-
Ö _ I lì H
H I H
-N—c— Ç —N —c
—Ç-
« ^ I H I I
kA "
(i

T9tr*tr*dral
compte
H
-c

I
MlchfUs
ị
(
Gly,
S«r
1M
Se
*»
p,.
hi*
S7
_ni
H — H j*—H >w«0—
Asp,
(3)
H
2
y
H
N —c —
c-i
* I II
H
-c

-
I
■N- ç
-
N
c

o
Cơ chế theo hình 2.4 gồm 3 phản ứng:
Phản ứng 1: Nhóm -0H của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hựp với
nhóm c=0 của liên kết peptide trong chuẫỉ polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ
diện (tretáhedral complex).
Phản ứng 2: Ở trạng thái phức hợp chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển
diện tích lên o tạo nhóm c=0 mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch
polypeptide đầu N và hình thành các hợp chất trung gian acyl-enzyme mới.
Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu c còn lại và
khôi phục trung tâm hoạt động củã serỉne protease.
Như vậy, ngoài cơ chế chung các enzyme thuộc nhóm này có tính chất cắt riêng biệt
là do trong phân tử protein có một “túi” (pocket) luôn được định vị gần trung tâm
hoạt động nhóm serine (Hình 2.5).
Val2, eU H«" « °
Eỉastasũ
Hình 2.5 Hình dạng các gốc
amlno acid ờ các túi khác
nhau của serine protease
(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 2011)
Hình dạng và sự tích điện của túi khác nhau
sẽ cho các vị trí cắt chuyên biệt của từng
serine proteỉn khác nhau.
Chymotrypsine với túi chỉ chứa các

nhánh amino acid kỵ nước vì vậy nhóm này chỉ thích hợp vởi các mạch bên -R của
phenylalanin, tryptophan, tyrosine của chuỗi polypeptide.
Trypsine với các tủi chửa aspartỉc ở vị trí trong cùng nên chỉ thích hợp với các mạch
bên R của các amỉno acỉd tích điện dương ãíiư argmỉne, lysỉne.
V
a
!
V
chymottypsin Trypsir
Elastase với túi chứa hai phân tử valine nên chỉ chứa đủ các amino acid của mạch
bên R như glycine, alanine và valine.
Plasmin thuộc nhóm serine protease (EC 3.4.21.7) là enzyme quan trọng có mặt trong
máu để thủy phân các cục máu nghẽn fibrin, hoạt động giống trypsine có khả năng
thủy phân các liên kết peptide có mạch bên R của asginine và lysine trong chuỗi
polypeptide.
(Gupta et al., 2002)
2.2.3 Protease của tôm sú
Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hçfp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác
khác nhau rất nhiều. Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác YỚi động vật có
xương sống. Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác
nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có ừong dạ dày của cá. Các
protease tìm thấy trong tôm bao gồm carboxypeptidases A và B, trypsine,
chymotrypsine, cathepsine, và collagenase (Hernandez - Cortes et al., 1997; Honjo et
al., 1990; Kim et al., 1992; Liu and Cheung 1989; Nip et al., 1985; Roy et al., 1996;
Tsai et al., 1986; Van Wormhoudt et al., 1992).
Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội
bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc
biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập
trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác.
Phần lớn các nhỏm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của

một enzyme:
- Hòa tan được ữong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung
tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính
này để tách chiết chúng.
- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol,
acetone để thu nhận chế phẩm enzyme.
- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt
hóa hay ức chế.
- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ, pH
môi trường.
Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu (1993) về protease đầu tôm biển
và Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzyme
tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trường kiềm.
Theo Nguyễn Việt Dũng (1999) thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở
môi trường gần trung tính.
Để ly trích protease từ đầu tôm sú, môi trường được sử dụng tương tự nhau. Theo
một số nghiên cứu cho thấy, hoạt tính protease trên một đơn vị khối lượng nội tạng
cao hơn nhiều so với đầu tôm ở cùng chế độ tách chiết (gấp từ 3,41 -^4,33

lần).
Điều này dễ hiểu vì nội tạng tôm là cơ quan tiêu hóa nên tập trung nhiều enzyme, còn
đầu tôm thì lại có thêm cả phần yỏ và thịt tôm có ít hoạt tính sinh học. Hoạt tính
protease cao của nội tạng tôm cũng giúp giải thích, sự hư hỏng xảy ra thường thấy
nhất ở tôm là hiện tượng long đầu, và thời gian bảo quản tôm đã bỏ đầu, tách chỉ bao
giờ cũng dài hơn tôm nguyên con ở cùng điều kiện chế biến và bảo quản (Nguyễn Lệ
Hà, 2011).
Protease đầu tôm đều thể hiện hoạt tính rất yếu ở vùng acid, đạt cực đại ở vùng trung
tính pH = 7 và giảm dần khi pH tăng ứong vùng điều kiện, điều này phù hợp với đặc
điểm của hệ enzyme tôm là không có pepsin hoạt động ứong môi trường acid
(Baranowski et al., 1984). Protease từ nội tạng tôm nhạy cảm với pH hơn và protease

từ đầu tôm còn nhạy cảm hơn nữa, việc tăng nhẹ pH trong vùng điều kiện cũng làm
hoạt tính của chúng giảm đáng kể.
2.2.4 Khả năng ứng dụng protease
2.2.4.1 Các ứng dụng cơ bản
Protease là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da,
công nghiệp sản xuất xà phòng.
- Trong chế biến thực phẩm: Sử dụng nhiều nhất để cải tiến công nghệ sản xuất
nước mắm hoặc nước tương từ các chế phẩm cá, bánh dầu đậu nành bằng việc
bổ sung protease từ giai đoạn thô sơ dùng dịch chiết mủ đu đủ xanh, vỏ dứa,
một cá, ruột lợn đến giai đoạn cao hơn dùng ché phẩm enzyme thêm vào quá
trình thủy phân như chế phẩm bromelain, papain, ficin, chế phẩm protease từ
nấm mốc A. oryzae, vi khuẩn Bacillus subtỉlỉs hoặc nấm sợi và cả các chế
phẩm từ đầu tôm. Những kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ sung protease
vào cá thì hàm lượng đạm amin tăng cao, quá trình thủy phân nhanh hơn nên
rút ngắn được thời gian chế biến nước mắm.
- Một lĩnh vực khác nghiên cứu sản xuất bột đạm cao cấp cho trẻ em và người
lớn tuổi từ bột đậu nành sử dụng chế phẩm prozima có chứa bromelain để cải
biến kích thước phân tử protein và xử lý các protein ức ché tiêu hóa có sẵn
trong nguyên liệu, hoặc sử dụng các protease thương mại Alcalase,
Novozyme, Flavourzyme thủy phân bột đậu nành tách béo nhằm làm tăng hàm
lượng amino acid tự do đạt hiệu suất thủy phân cao và rút ngắn thời gian thủy
phân làm giảm thiểu sự hoạt động của vi sinh vật. Ngoài ra, enzyme protease
còn được sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm khác như làm
phomat, làm mềm thịt
- Trong y học: Một số protease như trypsine, a-chymotrypsine dùng sản xuất
thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp
rất thông dụng trên thị trường dược phẩm. Nghiên cứu chế phẩm protease có
tên gọi “prozimabo” trong điều trị bỏng giúp giả mạc rụng nhanh, vết bỏng
nhanh khỏi. Đặc biệt hiện nay protease được ứng dụng trong điều trị bệnh tim

mạch, chúng rất đa dạng và có nguồn gốc khác nhau: Từ động vật, thực vật,
đến vi sinh vật, chúng thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy phân
fibrin, fibrinogen.
- Trong nông nghiệp: Protease được bổ sung vào thức ăn động vật nuôi nhằm
tăng khả năng tiêu hóa, chúng được xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sử
dụng hoặc xử lý sơ bộ thức ăn. Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn họp
protease và các enzyme thủy phân khác cũng được sử dụng cho ngành nuôi
trồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường
nước nuôi.
Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi ứong một số ngành khác như công nghiệp
thuộc da để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da nhưng không làm
ảnh hưởng đến chất lượng da. Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả năng
tẩy vết bẩn có thành phần là protein.
(Phan Thị Bích Trâm, 2011)
2.2.4.2 ửng dụng của protease Mần nguồn gốc động vật
Protease ưa kiềm là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu trên thị trường enzyme thế giới
(Godfrey và West, 1996). Bên cạnh nguồn protease ưa kiềm nguồn gốc vi khuẩn
được ứng dụng rộng rãi ừong nhiều lĩnh vực công nghiệp, điển hình như Alkazym
(Novodan, Conpenhagen, Đan Mạch), Tergazyme (Alconox, NewYork, USA),
Ultrasil (Henkel, Dusseldorf, Đức), còn có nhiều enzyme nguồn gốc động vật, điển
hình như Pronod 153 L được ly trích từ máu, keratin protease (trích ly từ da, lông
heo) cũng được biết đến với nhiều ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất xà phòng, xử lý
chất thải, ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc nhờ vào việc thủy phân dịch
protein các phụ phẩm của thủy sản.
2.3Cơ SỞ LÝ THUYẾT CỦA VIỆC TRÍCH LY PROTEASE TỪ TẾ BÀO
ĐỘNG VẬT
2.3.1 Lý thuyết chung
Giai đoạn đầu của quá trình tách chiết enzyme là thu nhận dịch chiết từ một yật liệu
sinh học nghiền nát sơ bộ nào đó (bột, mầm thóc, hạt nảy mầm, một mô động vật nào
đó, một sinh khối vi khuẩn hoặc nấm ) trong dịch chiết đương nhiên chứa protein và

enzyme.
Trong việc nghiên cứu enzyme người ta thường hay sử dụng dịch nghiền đồng thể.
Để thu nhận loại dịch này khối yật liệu sinh học được rửa sạch và nghiền trong cối
hoặc trong một thiết bị chuyên dựng. Trong khi nghiền người ta thêm nước hoặc
dung dịch đệm và kính nghiền nát để giúp phá vỡ tế bào. Sản phẩm thu được sau khi
nghiền được gọi chung là dịch đồng thể. Trong khối dịch này chứa các mãnh tế bào,
nhân, lục lạp của lá, ty thể và các bộ phận khác của tế bào như sắc tố, protein hòa
tan
Dịch nghiền sau đó được ly tâm phân đoạn ở các tốc độ tăng dần khác nhau. Để thu
nhận các enzyme ứong dịch chiết hoặc từ các phân đoạn dưới tế bào có thể dùng
nước, dung dịch đệm, dung dịch muối, hỗn họp glycerine với nước hoặc dung môi
hữu cơ. Cho đến nay không có phương pháp ly trích và tinh sạch chung cho các
enzyme. Để tách và tinh chế một enzyme nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp một
cách có hiệu quả nhất các biện pháp khác nhau.
(Mai Xuân Lương, 2004).
Quá trình ly trích enzyme từ cơ chất rắn, dựa trên sự phân tách cấu tò (enzyme) từ
chất rắn (nguyên liệu) do tác động của dung môi, tuân theo định luật Fick (McCable
etal., 1993):
* dx^
J
Az AB•
(2.1)
Trong đó:
J*A
Z
: Thông lượng chất khuếch tán A theo phương z, kgmolA/ m
2
.giây.
DAB: Hệ số khuếch tán của chất A vào B (dung môi), m
2

/giây.
Xa: Phân mol chất A trong hệ thống.
z: Khoảng cách khuếch tán (m).
Dấu (-) về mặt vật lý nghĩa là quá trinh khuếch tán xảy ra theo chiều giảm nồng độ
của chất khuếch tán.
Nói cách khác, vận tốc truyền của một quá trình truyền tỷ lệ thuận YỚi động lực của
quá trình và tỷ lệ nghịch với trở lực của quá trình (McCabe et al., 1993). Động lực
của quá trình ly trích enzyme phụ thuộc vào sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa
dung môi và cơ chất rắn (Lonsane và Krishnaiah, 1992); chịu sự chi phối của mức độ
xuyên thấu của dung môi vào cơ chất (mô tế bào động vật, nguyên liệu sử dụng trích
ly enzyme) hay khoảng cách khuếch tán - trở lực của quá trình ly trích (Harris,
1995).
Dựa ừên phương trình (2.1), hiệu quả của quá trình ly trích phụ thuộc vào một số yếu
tố cơ bản:
- Sự chênh lệch nồng độ.
- Diện tích tiếp xúc.
- Khả năng hòa tan của chất tan (hay enzyme) vào dung môi.
- Độ nhớt của dung môi.
- Khả năng khuếch tán của dung môi vào bên trong cơ chất rắn.
- Nhiệt độ trích ly.
- Tốc độ khuấy trộn để cải thiện hiệu quả khuếch tán.
(Rao, 2010)
Đối với quá trình ly trích cơ chất rắn từ dung môi lỏng nói chung và enzyme nói
riêng, quá trình khuếch tán chất tan vào dung môi còn chịu ảnh hưởng của đặc tính
liên kết của enzyme và cơ chất, điển hình như tương tác kỵ nước, liên kết hydrogen,
lực Val de Walls (Palit và Banerjee, 2001).
Nói cách khác, đặc điểm của nguồn nguyên liệu - một trong những động lực thúc đẩy
sự chênh lệch nồng độ của enzyme trong cơ chất và dung môi, các điều kiện ly trích
như loại dung dịch đệm, pH của dung dịch sử dụng ly trích, thời gian cũng như nhiệt
độ ly trích là những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả thu hồi enzyme.

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme
2.3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nguyên liệu
Sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa dung môi và canh trường bề mặt sau lên men
càng lớn sẽ thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan ra ngoài dung môi càng tăng
(McCabe et al., 1993). Khi tỷ lệ dung môi và cơ chất thấp, không đủ xâm nhập vào
toàn bộ mẫu sử dụng để trích ly (Lonsane và Krishnaiah, 1992), không đủ cho sự
khuếch tán chất tan (enzyme) vào dung môi. Hơn nữa, một lượng dung môi sẽ được
giữ lại trong nguyên liệu cũng là nguyên nhân làm giảm hiệu quả thu nhận chất tan
(Rao, 2010), hiệu quả thu nhận enzyme thấp. Tuy nhiên, tỷ lệ dung môi và nguyên
liệu cao, không những hoạt tính enzyme bị pha loãng mà còn tạo điều kiện thuận lợi
cho vi sinh vật hoạt động làm ảnh hưởng đến chất lượng của protein hay enzyme
trích ly.
2.3.2.2 Ảnh hưởng củapHmôi trường
Sự thay đổi pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do liên quan đến sự tương
tác giữa enzyme và cơ chất. Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào diện tích phân bố trên cả
enzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt động của phân tò enzyme. Mỗi enzyme
chỉ hoạt động mạnh nhất ở một pH xác định, gọi là pH tối ưu. pH tối ưu cho hoạt
động của các enzyme có nguồn gốc động yật, điển hình như protease từ nội tạng cá
tra (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mần, 2006) hay từ thịt đầu tôm sú (Nguyễn Lệ
Hà, 2011) vào khoảng 7. Giá tri pH quá cao hay quá thấp có thể làm enzyme bị biến
tính. Giá trị pH tối ưu của mỗi enzyme có thể thay đổi trong một khoảng nhất định
tùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và bản chất của các loại dung dịch
đệm (Phan Thị Bích Trâm, 2010).
2.3.2.3 Tác động của nhiệt độ và thời gian trích ly
Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản
ứng. Nhiệt độ tăng kéo theo tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độ
phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Đa số enzyme có nhiệt độ tối ưu
khoảng 40 50 °c. Ở nhiệt độ trên 70 °c, phần lớn enzyme đều mất hoạt tính.
Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau thì không giống nhau, chúng tùy thuộc
vào nguồn gốc sản sinh ra chúng. Phần lớn nhiệt độ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật,

thực vật cao hơn động vật. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme không cố định mà thay
đổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại của
enzyme (Rao, 2010).
Ngoài ra, thời gian trích ly cũng là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến
hoạt tính enzyme. Việc gia tăng nhiệt độ ly trích có tác động tích cực trong việc gia
tăng tính tan của dung môi, làm tăng vận tốc chuyển động và thúc đẩy quá trình thẩm
thấu dung môi vào cơ chất và gia tăng khả năng khuếch tán, hay ly trích protease.
Tuy nhiên, nhiệt độ ly trích cao có thể là nguyên nhân dẫn đến sự kém ổn định và ức
chế hoạt động của enzyme. Điều này cũng xảy ra với trường hợp thời gian ly trích
dài. Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích
thước nguyên liệu cấu trúc loại protein, tác động đến sự khuếch tán enzyme vào dung
môi, khi enzyme phải xuyên qua khoảng trống bên trong với đường đi quanh co, kết
quả là khoảng cách khuếch tán dài (McCabe et al., 1993). Ở cùng tỷ lệ dung môi sử
dụng, thời gian ly trích ngắn sẽ không đủ cho quá trình ngấm dung môi vào nguyên
liệu để khuếch tán enzyme, giảm hiệu suất thu nhận enzyme (Rao, 2010).
2.4 QUY HOẠCH THựC NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY
THÍCH HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng YỚi mô hình phức hợp tại tâm (CCD) thường được sử
dụng để mô phỏng điều kiện hoạt động tối ưu của một quá trình thông qua các
phương pháp thực nghiệm, cấp độ khác nhau hoặc các giá trị của điều kiện hoạt động
bao gồm các yếu tố trong mỗi thí nghiệm. Các yếu tố này có thể là yếu tố phân loại
(ví dụ nguồn nguyên liệu sử dụng) hay định lượng (tỷ lệ thành phần khảo sát, nhiệt
độ, .)• Tuy nhiên, trong thực tế, các biến phân loại phải được xử lý một cách riêng
biệt bằng cách so sánh các điều kiện hoạt động tốt nhất đối với các biến đinh lượng
qua sự kết hợp khác nhau (Lenth, 2011).
Sử dụng phương pháp bình phương nhỏ nhất và các nội dung phân tích hồi quy, phân
tích phương sai để xác định giá trị của các hệ số ừong phương trình hồi quy đa thức.
Tùy theo loại thực nghiệm mà phương trình hồi quy là tuyến tính hay phi tuyến
(Giovanni, 1983). Các dạng phương trình hồi quy thường áp dụng đối với lĩnh vực
công nghệ hóa học và công nghệ sinh học gồm:

Phương trình bậc hai tuyến tính: y = <p(x
l
,x
2
, ,x
k
) = b
a

+ Xv,
+
2
b
ju
x
i
x
u +-
j =1 j . u= l
j7u
(2.2)
Phương trình bậc hai phi tuyến:
b
0
: Là hệ số hồi quy bậc 0.
Xj: Là nhân tố được mã hóa ảnh hưởng đến y.
bj: Là hệ số tuyến tính hay hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố Xj
đối với y.
bj
u

: Là hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời hai nhân tố Xj và
Xu đối với y.
bjj: Là hệ số hồi quy bậc 2 mô tả ảnh hưởng của nhân tố Xj đối với y. k: Là số
yếu tố khảo sát (Xj Xk).
MÔ hình thống kê thực nghiệm chỉ có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu
chuẩn thống kê (Student và Fisher) (Cheynier et al., 1983).
2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TRÍCH LY
VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE NGUỒN GỐC ĐỘNG VẬT
2.5.1 Nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu trích ly proease từ các nguồn động yật đã bắt đầu được quan tâm trong
thời gian gần đây. Nguyễn Lệ Hà (2011) đã tiến hành nghiên cứu tách chiết và ứng
dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản. Kết quả
thu nhận enzyme protease tinh sạch. Chế phẩm enzyme (CPE) protease từ đầu (hoặc
gan tụy) tôm sú có thể thu nhận được qua các bước cơ bản: Chiết rút enzyme từ
nguyên liệu đã nghiền nhỏ bằng Tris-HCl 0,05 M pH 7,5 YỚi tỉ lệ 1: 3 (w/v), thời
gian chiết 40 phút (đối với đầu tôm) và 60 phút (đối với gan tụy). Dịch chiết (DC)
thu được bằng cách cho qua rây có lỗ với kích thước 1 mm
2
để loại lượng lớn vỏ tôm,
sau đó ly tâm 6000 vòng/phút (rpm), 15 phút, loại cặn đem làm thức ăn gia súc. Kết
tủa DC bằng ethanol với nồng độ 80%, 50 phút để điều chế CPE từ đầu tôm hoặc
bằng (NH4)2SC>4 70%, 70 phút để thu CPE từ gan tụy tôm. Công đoạn ly tâm thu
CPE cũng được thực hiện ở 6000 rpm trong 15 phút.
Trước đó, Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Man (2006) cũng đã đề xuất thu nhận chế
phẩm enzyme protease từ ruột cá basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm
thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79 UI/gCKNT (chất khô nội tạng)
trong điều kiện tỷ lệ mẫu và dung môi sử dụng là 1: 1 (w/v); pH 9,5; nhiệt độ 35 °c
và thời gian chiết 10 phút. Dung môi isopropanol là tác nhân thích họp nhất để kết
tủa protease trong dịch chiết từ ruột cá basa. Với tỷ lệ thể tích dịch chiết enzyme và
thể tích isopropanol là 15/85, mức tinh sạch chế phẩm protease kiềm là 1,65 lần và

hiệu suất thu hồi enzyme đạt được là 90,42%.
Bên cạnh đó việc trích ly protease trực tiếp từ nguồn nguyên liệu động thực vật và
ứng dụng trong thủy phân protein cũng được tiến hành tà rất sớm. Phan Thị Hồng
Hải và ctv (2001) đã nghiên cứu tinh chế protease từ sán lá gan (Fasciolagigatica).
Vũ Văn Bội (2004) đã nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng protease từ
Bacillus subtỉlis S5. Trong năm này, Đỗ Văn Ninh (2004) cũng đã công bố tối ưu hóa
quá trình phân giải protein của protease trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản
phẩm mới từ protein được thủy phân.
2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước
Nhiều nghiên cứu ừên thế giới cũng quan tâm đến việc trích ly protease từ phụ phẩm
thủy sản đã được thực hiện từ rất sớm. Corvisat (1857) đã chứng tỏ khả năng chiết
tách trypsine từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa tinh
sạch. Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp
phụ. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính
chất của enzyme cũng như protein. Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách
được Chymosine (trích dẫn tà Nguyễn Lệ Hà, 2011).
Gần đây, Min-Soo Heu et al. (2002) đã nghiên cứu ừích ly, kết tủa phân đoạn hoạt
tính protease từ phụ phẩm tôm. Quá trình trích ly protease được nghiên cứu riêng lẻ
cho từng thành phần các phụ phẩm (đầu, thân, đuôi) được loại bỏ trong quá trình chế
biến. Phụ phẩm sau khi xử lý và được trích ly bằng nước cất, ly tâm thu được dịch
trích thô, dịch trích thô kết tủa phân đoạn bởi ammonium sulfate. Kết tủa ở 2 nồng độ
30 50% (chất chỉ thị NPS-I và SS-I), và 50 70% (chất chỉ thị NPS-II
và
SS-II), sau đó ly tâm thu được kết quả tương ứng. Hoạt động Endoprotease của dịch
trích thô là 0,2 u/mg đối với Hemoglobin (Hb, pH 3,0), 0,16 u/mg đối với azocasein
(Ac, pH 6,0) và 0,12 u/mg đối với benzoyl-Arg-P-Naphthylamide (BANA, pH 7,0).
Hoạt động của exoprotease là 0,11 0,17 u/mg đối với Arg-P'
Naphthylamide (ArgNA, pH 7,0), 0,06-0,11 u/mg đối với Lys-0- Naphthylamide
(LysNA, pH 7,0) và 0,08 -ỉ- 0,09 u/mg đối với Leu-(3- Naphthylamide (LeuNa, pH
7,0). Hoạt động của endoprotase tăng từ 5 7,4 lần đối với NPS-I và SS-I, và 1,9 +

2,7 lần đối với NPS-II và SS-II. Trong khi đó, exoprotease tăng từ 3,6 -ỉ- 4,8 lần đối
với NPS-I và SS-I, và 5,6 7,2 lần đối với NPS-II và SS-II.
Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực trích ly và ứng dụng
protease từ nguồn động vật, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là:
- Sự ổn định của nguồn nguyên liệu cung cấp protease.
- Các điều kiện trích ly enzyme phụ thuộc rất lớn vào đặc điểm từng loại
enzyme và nguồn nguyên liệu, trong đó tỷ lệ dung môi sử dụng để hòa tan
enzyme, tác động của pH, nhiệt độ và thời gian trích là các yếu tố có tầm quan
trọng cao nhất.
- Việc xác định các tính chất cơ bản của enzyme là cơ sở bước đầu trong việc
dự đoán đặc điểm, phương thức hoạt hóa và lĩnh vực ứng dụng của protease
khảo sát.
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
■
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm
Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thí
nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng,
Trường Đại học cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013.
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm
- Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,0 lg, Nhật.
- Cân điện tử Ohaus, model AR-240, độ chính xác 0,0001 g, Nhật.
- Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc.
- Nhiệt kế HANNA, model S42866, độ chính xác 0,1, Ý.
- pH kế HANNA, model TOA pH meter HM-12P, độ chính xác 0,01, Ý.
- Tủ đông Acson International, model Acson R134a, nhiệt độ cấp đông -25 °c,
Nhật.
- Máy khuấy từ Toshiba (Magnestir MG-10, Nhật).
- Bộ điều nhiệt (Memmert, Đức, điều chinh đến cận 100 °c, độ chính xác 0,1

°C).
- Máy xay sinh tố Big Sar Model PP179, 3 tốc độ, từ 2000 vòng/phút (rpm)
đến 4000 rpm.
- Máy quang phổ so màu (Model 722, Trung Quốc).
- Một số dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm và một số dụng cụ khác có liên
quan.
3.1.3 Hóa chất sử dụng
- Kali dihydrogen phosphate dehydrate (KH2PO4), (Trung Quốc, độ tinh khiết
99%).
- Disodium hydrogen photphate dodecahydrate (Na2HP04.12H20), (Merck)
- Glycine, (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%).
- Hóa chất sử dụng để trích ly enzyme (các dung dịch đệm): Phosphate, NaOH,
Na
2
HP0
4
, NaH
2
P0
4
(Merck).
- Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme: Tyrosine; HC1 0,2 N; NaOH 0,5 N;
Trichloacetate acid (TCA); Folin; casein dạng bột (Merck, Đức).
- Các hóa chất có liên quan khác.
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Nguyền liệu
Thịt đầu tôm sú được cung cấp từ ấp Bưng Cốc, xã Phú Mỹ, huyện Thạnh Trị, tỉnh
Sóc Trăng. Mầu được giữ lạnh trong thùng xốp bằng nước đá, nhiệt độ bảo đảm
dưới 4 °c, thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm tối đa 2 giờ.
3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Thịt đầu tôm sú sau khi đưa về phòng thí nghiệm được rửa sơ bộ, để ráo nước,
phân chia thành các mẫu có khối lượng xác định (khối lượng mẫu sử dụng cho một
đơn vị thí nghiệm là 200 g/mẫu), bao gói trong bao bì PA và trữ đông ở -18 ± 2 °c.
3.2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú
Thịt đầu tôm sú đông lạnh được phối trộn với dung môi theo tỷ lệ phù hợp. Nhiệt
độ dung môi trước khi phối trộn là 2 4 °c. Tiếp theo, hỗn hợp được nghiền
bằng
máy quay sinh tố (tốc độ quay của motor ở mức 2, 3000 rpm) trong thời gian 3
phút trước khi quá trình trích ly enzyme bắt đầu. Trong quá trình nghiền, nhiệt độ
không vượt quá 5 °c (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Man, 2006).
Sau khi nghiền, mẫu được đổ vào cốc thủy tinh, ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian
khác nhau để chiết rủt enzyme. Chú ý khuấy đảo mẫu 5 phút/lần. Dịch chiết thu
được bằng cách cho vải lọc có lỗ với kích thước lmm *l m m

để loại lượng lớn
phần chất khô không hòa tan (bã tôm), sau đó làm lạnh (bằng cách cho dịch sau lọc
vào tủ đông) trong 15 phút trước khi chuyển sang ly tâm 3000 rpm ữong thời gian
20 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết, gọi là dịch chiết protease thô (Yaneza
et al., 2004).
Tiến hành xác định hoạt tính protease trong dịch chiết enzyme thô nhằm chọn
được điều kiện trích ly protease tốt nhất.
3.2.4 Phưong pháp phân tích và đo đạc kết quả
3.2.5 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại ít nhất 3 lần. Thông số tương ứng với
kết quả khảo sát đã lựa chọn từ thí nghiệm trước được sử dụng làm nhân tố cố định
cho thí nghiệm kế tiếp.
Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution
16.1, phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD hay Duncan để kết luận về
sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức.
Việc xác định phương trình tối ưu hóa điều kiện trích ly protease dựa trên

phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methods), sử dụng phần mềm
Statgraphics Centurion.
Phương trình tương quan được chọn lựa dựa trên tác động của các yếu tố khảo
sát đến kết quả thu nhận bằng các thử nghiệm mô hình hồi qui đa thức theo phương
pháp bình phương nhỏ nhất.
Các bước tiến hành thiết lập phương trình hồi quy:
Xác định miền biến thiên Xjmin < Xj < Xjmax và tâm quy hoạch:
s max I Y
-
min X
với j = 1, 2, 3, k
Với:
Xj: Là giá trị thực của yếu tố (gọi là biến thực).
% Là giá trị mã hóa của yếu tố (gọi là biến mã).
X?: Là giá ứị thực ở điểm trung tâm (tương ứng với giá trị mã hóa XjO = 0).
ÀXj: Là khoảng giá trị giữa 2 mức khảo sát.
- Chọn dạng phương trình hồi quy: Phương trình 1 hay 2 (viết 2 phương trình
của phần lý thuyết vào đây).
- Tính toán xác định các hệ số hồi quy bj bằng phương pháp bình phương cực
tiểu.
- Kiểm định sự có ý nghĩa của các hệ số hồi quy bj vói chuẩn Student (t-test).
Bảng 3.1 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả được sử dụng
Chỉ tiêu Phương pháp xác định
Hoạt tính protease (U/g) Phương pháp Anson cải tiên (1938)
pH Sử dụng pH kê, theo ISO 2917:1999(E)
Độ ẩm (%) Sấy khô đến khối lượng không đổi, phương pháp
NMKLsô 23-1991
Đạm tổng số (%) Phương pháp Kjedahl, TCVN 8125:2009