Nghiên cứu chủng streptomyces 13 312 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
1=0
ĐỖ THỊ THUÝ NGA
NGHIÊN CỨU
CHỦNG STREPTOMYCES 13.312
CÓ KHẢ NĂNG SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHO Á 1999-2004)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
Thời gian thực hiện
TS. CAO VÃN THƯ
BỘ MÔN CÔNG NGHIỆP D ược
15/02/2004- 20/05/2004
ỵ 4
¡nir-viỆN
ũ Ù I.
Hà Nội, 05-2004
OA'.'/
ị •*:, v.
ism.
\ - V r y
LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bầy tỏ lời cảm ơn chân
thành tới thầy giáo TS. Cao Văn Thu, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ
bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới các thầy cô ban giám hiệu nhà
trường, các thầy cô, cán bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Công nghiệp dược và các
bộ môn khác, cùng các phòng ban đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiên cho tôi
trong quá trình thực nghiệm.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã giúp đỡ và động viên tôi trong

thời gian qua.
Do trình độ bản thân, và thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những khiếm
khuyết. Rất mong được sự chỉ bảo của các thầy cô và sự đóng góp ý kiến của
bạn bè.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2004
Sinh viên
Đổ Thị Thuý Nga
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đ ề 1
Phần 1: Tổng quan 3
1 .1 .Kháng sinh 3
1.1.1.Lịch sử

3
1 .1 .2 .Định nghĩa
3
1.1.3.Phân loại
.
3
1.1.4.SƠ đồ sản xuất kháng sinh 4
1.2.Đại cương về Streptomyces 5
1.2.1 .Một số đặc điểm chung của Streptomyces 5
1 .2 .2 .Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptomyces .6
1.2.3.Phân loại Streptomyces 7
1.2.4.Khả năng STH kháng sinh của Streptomyces

.

8
1.3.Cải tạo giống vsv 8
1.3.1.Mục đích 8
1.3.2.Các phương pháp cải tạo giống 9
1.4.Lên men STH kháng sinh 10
1.4.1.Lên men bề m ặ t 1 0
1 .4 .2 .Lên men chìm
1 0
1.5.Chiết tách-tinh chế 1 2
15.1.Chiết xuất 13
15.2.Tách sản phẩm

13
l.ó.Một số thành tựu trong nghiên cứu kháng sinh

14
Phần 2: Thực nghiệm và kết qu ả
16
2 .1 .Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm

16
2.1.1 .Nguyên vật liệu 16
2.1.2.Phương pháp nghiên cứ u 19
2.2.Kết quả thực nghiệm và nhận xét
.

28
2 .2 .1 .Kết quả phân loại theo IS P 28
2.2.2.Khả năng STH kháng sinh của chủng Streptomyces 13.312
trên môi trường phân lập(MT3) 29

2.2.3.Kết quả lựa chọn MT nuôi cấy và các v s v kiểm định của
chủng Streptomyces 13.312 29
2.2.4.Kết quả chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp
chọn lọc ngẫu nhiên
32
2.2.5.Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v 34
2.2.6.Kết quả lên men sau đột biến

36
2.2.7.Kết quả lựa chọn dung môi chiết thích hợp của dịch lên m en

37
2.2.8.Kết quả sắc ký lớp mỏng 38
Phần 3: Kết luận 39
3.1.Kết luận 39
3.2.Đề xuất 39
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
A
Agitation
ADN
Acid deoxyribonucleic
AIDS
Acquired immunodeficiency syndrome
As
Aspergillus niger
BC
Bacillus cereus ATCC 9946
BP

Bacillus pumilus ATCC 10241
BS
Bacillus subtilis ATCC 6633
D(min)
Đường kính vòng vô khuẩn trung bình
Dmhc
Dung môi hữu cơ
DO
Dissolved oxygen
E
Aeration
EC
Escherichia coli ATCC 25922
Gy
Grey
Ha
hair
HIV
human immunodeficiency virus
MT
Môi trường
MTdd
Môi trường dung dịch
N
Pha nước
Pseu
Pseudomonas aeruginosa VM 201
Pro
Proteus mirabilis BV 108
RA

Retinaculiaperti
RF
Rectiflexibiles
s
Spirales
s
Sai số chuẩn đã hiêu chỉnh
I
Sal
Salmonella typhi DT 220
Shi
Shigella flexneri DT 112
SL
Sarcina lutea ATCC 9341
sp
spiny
Sta
Staphylococcus aureus ATCC 1228
STH
Sinh tổng hợp
V
Verticillati
vsv
Vi sinh vật
w
White
Wa
warty
Y
Yellow

ĐặTV/ỀRĐỂ
Đ
ề kháng kháng sinh là một vấn đề đang gây lo âu lớn không chỉ
ở Việt Nam mà còn trên khắp thế giới. Các nhà khoa học và
chuyên gia y tế không ngừng tìm kiếm những phương sách để
chống lại hiện tượng này, trong đó không thể không kể đến sự
nỗ lực không ngừng nhằm phát minh các kháng sinh mới có
hiệu lực mạnh. Trên con đường nghiên cứu và phát triển kháng sinh mới bằng
nhiều phương pháp khác nhau nhờ những thành tựu to lớn của khoa học hiện
đại như: tổng hợp, bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh
cũng đang tiếp tục khẳng định vai trò quan trọng của nó, nhằm đưa lại những
ứìig dụng thực tế trong các lĩnh vực Y- Dược học.
Trong số khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trên
thế giới thì có đến trên 60% là do xạ khuẩn sinh ra. Các công trình nghiên
cứu đã chứng minh Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn,
một số loài trong chi này còn có khả năng sinh tổng hợp các chất chữa ung
thư và điều trị HIV/AIDS.
Bộ môn Công nghiệp Dược- TĐH Dược tìà nội đã tiến hành phân lập và
nghiên cứu một số chủng Streptomyces có trong đất, bùn v.v Việt Nam. Từ
những nghiên cứu khởi phát, Streptomyces 13.312 là một chủng xạ khuẩn có
độ ổn định di truyền học tốt, có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng
và có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực phòng bệnh và chữa bệnh.
Do đó, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chủng Streptomyces 13.312 có
khả năng sinh tổng hợp kháng sinh ” với mục tiêu:
* Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh bằng đột biến cải tạo
giống và tối ưu hoá quá trình lên men.
1
* Nghiên cứu sơ bộ về chiết tách và tinh chế.
* Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại, xác

định tên khoa học của chủng Streptomyces 13.312 theo khoá phân loại ISP
(International Streptomyces Project).
2
Phần 1
TỔNG QUAN
1.1. Kháng sinh [1] [3] [5] [9]
1.1.1. Lịch sử.
Loại kháng sinh đầu tiên là Penicillin được một nhà bác học người Anh
là Alecxander Pleming(1881-1955) phát hiện ra năm 1928. Có thể nói ông là
người mở ra một kỷ nguyên mới cho nhân loại trong việc dùng kháng sinh để
điều trị các bệnh nhiễm trùng, là một trong căn nguyên chính gây bệnh và tử
vong trong những năm đầu của thế kỷ XX. Tiếp sau đó là hàng loạt các kháng
sinh khác lần lượt ra đời.
1.1.2. Định nghĩa.
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các
nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu
diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm,
nguyên sinh động vật ) hay tế bào ung thư.
1.1.3. Phân loại kháng sinh.
Kháng sinh có thể được phân loại theo nguồn gốc, cơ chế tác dụng, cấu
trúc hoá học. Trong đó phân loại theo cấu trúc hoá học được xem là phân loại
khoa học nhất: kháng sinh được phân loại thành 7 nhóm như sau:
❖ .Nhóm P-Lactam: Phân nhóm penicillin, cephalosporin, ức chế P" lactamase
❖ .Nhổm Aminosid: Streptomycin, gentamicin,
A.Nhóm Phenicol: Cloramphenicol, thiamphenicol
*.Nhóm Tetracyclin: tetracycline, oxytetracyclin, doxycyclin
❖ .Nhóm Macrolid: Erythromycin, spiramycin
*.Nhóm Rifamicin: Rifampicin
Ạ.Nhóm Quinolon: Ciprofloxacin,
3

1.1.4. Sơ đồ sản xuất kháng sinh:
Được giới thiệu ở hình 1 dưới đây
Hình 1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
4
1.2. Đại cương vê Streptomyces [3] [4] [9] [11] [15] [16]
1.2.1. Một sô đặc điểm chung của Streptomyces.
Streptomyces là một chi thuộc lớp phụ Actinomycetales phân bố rất rộng
rãi trong tự nhiên như: đất, nước, bùn ao và các chất thải hữu cơ. Phần lớn xạ
khuẩn là các tế bào Gram dương, hiếu khí hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân
nhánh (khuẩn ty). Trong mỗi gam đất nói chung thường có trên một triệu xạ
khuẩn (tính theo số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch). Số lượng xạ khuẩn
trong một gam đất ở các mẫu đất khác nhau là khác nhau phụ thuộc vào độ
ẩm, nhiệt độ, pH, dinh dưỡng
Một số đặc điểm của xạ khuẩn:
- Đường kính khuẩn ty xấp xỉ trong khoảng từ 0,2-l,0|um đến 2-3 |um.
- Màu sắc của khuẩn ty rất phong phú: trắng, vàng, đỏ lục, tím, nâu,
đen
- Thành tế bào xạ dầy khoảng 7,5 - 10,0nm, không có cellulose, kitin.
- Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính.
- Nhuộm mầu Gram(+)
*.Phân loại:
Actinomycetales
Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae
Ỷ Ỷ
Streptoinyces Micromoủospora
Hình 2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
5
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptomyces
*. Khuẩn lạc:
- Bề mặt: thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp toả ra theo

hình phóng xạ vì vậy mới có tên xạ khuẩn.
- Khuẩn lạc có chân vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy.
*. Khuẩn ty cơ chất:
- Mọc sâu trong môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá
trình phát triển.
- Bề mặt nhẵn hoặc sần sùi.
- Khuẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan
trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
*. Khuẩn ty khí sinh:
Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí
thành những khuẩn ty khí sinh và có đường kính 1 - l,4|um.
*. Chuỗi bào tử:
Được hình thành từ khuẩn ty khí sinh, có nhiều hình dạng khác nhau:
thẳng, uốn cong hoặc xoắn lò xo.
*. Bào tử:
- Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn là bào tử trần.
- Được hình thành trên các nhánh phân hoá của khuẩn ty khí sinh (gọi là
cuống sinh bào tử) do sự kết đoạn tức là nguyên sinh chất trong khuẩn ty co
lại thành cụm và được bao bọc bằng một màng đặc biệt hoặc do sợi cắt khúc
tức là sự hình thành vách ngăn.
- Trên mỗi nhánh có từ 10-100 bào tử, bào tử có thể là hình cầu, elip hoặc
hình trụ hai đầu tròn, đường kính của bào tử thường tương ứng với đường kính
của khuẩn ty.
- Bề mặt của bào tử có thể có các kiểu trơn, nhẩn(sm) hoặc xù xì(wa)
hoặc có gai (sp) hoặc có tóc(ha).
*. Streptomyces là vi sinh vật có thành tế bào kiểu CWI có chứa L.DAP
(diaminopimelat) và glycin.
*. Streptomyces có thể phát triển ở nhiệt độ 20- 40°c nhưng nhiệt độ thích
hợp là 30°c và pH thích hợp là 6 ,8-7,5.
*. Khả năng tạo sắc tố của Streptomyces:

Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4 loại: sắc tố hoà tan,
sắc tố khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanin, sắc tô khuẩn lạc.
1.2.3. Phán loại Streptomyces:
Chi Streptomyces bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng
sinh tổng hợp ra các kháng sinh ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau.Viêc phân loại để định tên của xạ khuẩn là rất quan trọng. Có rất nhiều
khoá phân loại Streptomyces khác nhau: khoá phân loại Krasillnikov,
Waksman, Gauze, Shilling và Gottlieb. Hội nghị “vi sinh vật thế giới lần X”
(được tổ chức tại Mêhicô vào năm 1970) chọn khoá phân loại của E.B.Shirling
và D.Gottlieb làm khoá phân loại chính để phân loại chi Streptomyces và đặt
tên là International Streptomyces Project(ISP).
*. Khoá phân loại này dựa vào các đặc điểm:
- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn:
+ Màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh,
+ Hình dạng chuỗi bào tử,
+ Bề mặt bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học:
+ Khả năng tạo sắc tố hoà tan,
+ Khả năng tạo sắc tố melanoid,
+ Khả năng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn.
7
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces:
Một số khá lớn kháng sinh do một số loài Streptomyces sinh tổng hợp
được nghiên cứu và sử dụng thuộc nhiều nhóm kháng sinh khác nhau:
Nhóm kháng sinh
Kháng sinh
Chủng Streptomyces
Sinh tổng hợp
Nhóm
aminoglycosid

Kanamycin
Neomycin
Paromomycin
Streptomycin
Tobramycin
S.kanamyceticus
s.ỷradỉae
S.rimosus
S.griseus
S.tenebrarìus
Nhóm Tetracyclin
Tetracyclin
Oxytetracylin
S.aureoỷaciens
S.rimosus
Nhóm Macrolid
Erythromycin
Oleandomycin
Spiramycin
S.erythreus
S.antibioticus
S.amboỷaciens
Kháng sinh chống
nấm
Nystatin
Amphotericin B
Candicidin
Pyramycin
S.noursei
S.nodosus

S.griseus
S.nalanensis
1.3. Cải tạo giống Vi sinh vật [3] [5] [6] [9] [11] [16]
1.3.1. Mục đích.
Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng vi sinh vật
có khả năng tạo chất kháng sinh mong muốn với một hàm lượng đủ để thoả
mãn yêu cầu của sản xuất công nghiệp. Các vi sinh vật phân lập từ cơ chất tự
nhiên thường có hoạt tính thấp đồng thời trong quá trình nuôi cấy, hoạt tính
của chúng thường giảm dần. Vì vậy việc cải tạo giống bằng nhiều biện pháp
khác nhằm thu được những chủng có hoạt tính cao, ổn định là một trong
những điều kiện quan trọng và cần thiết ở qui mô phòng thí nghiệm trước khi
đưa ra công nghiệp hoá.
8
1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống:
A. Tuyển chọn ngẫu nhiên.
Tuyển chọn ngẫu nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên là tuyển chọn
lấy những biến chủng có đặc tính sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, xuất hiện
ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh.
B. Đột biến nhân tạo:
Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột
biến (lý, hoá, sinh học ) với tần xuất đột biến tăng lên nhiều lần
*. Ánh sáng u v khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vi sinh
vật có kích thước nhỏ (0,3-3|Lim) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân. Vì vậy
được dùng phổ biến trong đột biến cải tạo giống.
*. Cơ chế: Tia u v tác dụng trên ADN và mạnh nhất ở vùng 260nm gây
dime hoá thymin( thymin gần nhau liên kết cộng trị với nhau ở C5 và C6). Hậu
quả là sao chép bị sai lầm vì ADN polymerase dễ lắp một nucleotid không
chính xác vào vị trí trên. Đồng thời trên sợi ADN cũng xuất hiện một dirne
pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4. ở đây C6 của pyrimidin 51 (thymin
hoặc cytozin) được liên kết với C4 của pyrimidin 31 (thường là cytozin). Các

sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi ánh sáng uv.
*. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến:
- Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 yếu tố: thời gian chiếu, khoảng
cách chiếu, độ pha loãng bào tử. Thực nghiệm cho thấy những đột biến dương
thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót từ 0 ,1 -1 %, còn đột
biến âm thường xuất hiện ở liều lượng chiếu cao hơn.
- Ánh sáng: là nguyên nhân gây ra hiện tượng quang phục hoạt sau khi
chiếu ánh sáng u v lên tế bào làm quá trình đột biến không còn ý nghĩa.
Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, môi trường nuôi cấy, trạng thái sinh lý
của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng uv.
9
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [5] [7] [9] [10] [11]
Trừ một số rất ít kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như
cloramphenicol, hầu hết các kháng sinh hiện có đều là sản phẩm của quá trình
lên men hoặc bán tổng hợp.
Lên men là quá trình nuôi cấy v sv trong các điều kiện thích hợp nhằm
tạo ra những sản phẩm trao đổi chất mong muốn. Có hai kiểu lên men chính
hay sử dụng là: lên men bề mặt và lên men chìm.
1.4.1. Lên men bê mặt.
v sv phát triển trên bề mặt môi trường rắn hay lỏng, hấp thụ các chất
dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp. Vì vậy bề
mặt môi trường phải đủ rộng, lớp môi trường không quá sâu( 5 -1 0 cm).
- uú điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp.
- Nhược điểm: hiệu suất trường thấp, rất khó tự động và cơ giới hoá. Chi
phí nhân công cho một đơn vị sản phẩm cao. Do đó, phương pháp này chỉ áp
dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm.
1.4.2. Lên men chìm:
v sv được nuôi cấy trong MT lỏng và phát triển trong toàn bộ MT.
Giống vi sinh vật dùng trong lên men phải là các tế bào sinh dưỡng đang
ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao nhất. Vì

vậy, trước khi lên men phải có giai đoạn nhân giống (giống cấp I, II, ni)
Giống cấp I: nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc(100ml/500ml),
Giống cấp II: nuôi cấy trong bình 501,
Giống cấp III: nuôi cấy trong bình l-5m3.
Tỷ lệ giống trong môi trường lên men: 1-10%. Qui mô giống phụ thuộc
vào qui mô của bình lên men.
Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi
trường: thay đổi pH, nồng độ của các thành phần trong môi trường, các sản
phẩm trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường. Để đảm bảo những điều
kiện tối ưu cho sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men người ta
10
đã đưa ra một số biện pháp như: dùng hệ đệm để ổn định pH, thêm các chất
phá bọt
- Ưu điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để,
tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hoá, tự động hoá trên qui mô lớn. Do
đó, phương pháp này được lựa chọn cho công nghiệp sản xuất kháng sinh.
- Nhược điểm: yêu cầu phải có thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực,
điểu kiện vô trùng tuyệt đối .)• Do đó chi phí đầu tư lớn.
Phân loại:
* Lên men gián đoạn:
Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín. Trong suốt
thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì vào môi trường lên men, trừ
việc cung cấp oxy( dưới dạng khí nén), chất phá bọt, hệ đệm điều chỉnh pH.
Trong lên men gián đoạn, vi sinh vật phát triển qua 4 pha: pha tiềm tàng,
pha luỹ thừa, pha dừng và pha suy tàn( Hình 4).
Hình 4: Đường biểu diễn các giai đoạn phát triển của vsv trong MT lỏng
x: sinh khối khô vsv trong dịch lên men,
t: thời gian lên men.
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh
tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật,

11
hoặc khi việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ
không mang lại hiệu quả kinh tế.
• Lên men có bổ sung:
Nồng độ cao của một số chất (glucose, các hợp chất nitơ ) ức chế việc
tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trong quá trình trao đổi chất. Vì vậy,
trong phương pháp bổ sung, khi bắt đầu lên men, các thành phần đó được đưa
vào với một nồng độ thấp và được bổ sung vào trong hệ thống trong quá trình
lên men.
1.5. Chiết tách - tinh chế [2] [5] [7] [8] [9] [11]
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình
lên men kháng sinh có thể nằm trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin)
hoặc trong dịch lọc (ví dụ: penicillin, streptomycin) tuỳ theo đặc điểm của
loài. Vì vậy, phải chiết tách để lấy kháng sinh. Việc lựa chọn phương pháp
phụ thuộc vào bản chất của kháng sinh
Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ,
- Phương pháp kết tủa,
- Dùng nhựa trao đổi ion.
Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu được
một sản phẩm kháng sinh với độ tinh khiết cao. Trong công nghiệp sản xuất
kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách và tinh chế như:
lọc, chiết, hấp phụ và sắc ký.
1.5.1.Chiết xuất.
* Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không
đồng tan để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
* Nguyên tắc: Dựa trên sự phân bố của chất tan vào 2 pha không đồng tan với
nhau. Đó là pha dung môi chiết và dịch lọc dịch lên men hay sinh khối để tách
lấy riêng chất kháng sinh (có thể là một chất hay một nhóm chất).
12

* Phân loại:
+ Chiết đơn(chiết một lần),
+ Chiết lặp (chiết nhiều lần),
+ Chiết ngược dòng.
1.5.2.Tách sản phẩm.
*.Định nghĩa: Là một nhóm các phương pháp hoá học, vật lý và hoá lý nhằm
đi từ một hỗn hợp phức tạp đến một hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp đơn giản
tách riêng từng chất.
*. Các phương pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay được dùng:
- Phương pháp chia cắt pha: Là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất
(một pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha).
- Phương pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phương pháp:
Chiết, thẩm thấu, các phương pháp sắc ký.
*. Sắc ký:
Sắc ký là phương pháp tách và phân tích dựa vào sự phân bố của hoạt
chất giữa hai pha luôn tiếp xúc và không ho à lẫn vào nhau: Pha động và pha
tĩnh.
Theo bản chất có thể chia sắc ký thành 4 loại: sắc ký phân bố(sắc ký
lớp mỏng), sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion và sắc ký trên gel.
Khi chiết tách và tinh chế sản phẩm người ta thường kết hợp cả hai
phương pháp: Phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha.
l.ó.Một số thành tựu trong nghiên cứu kháng sinh [12] [13] [14]
1.6.1.Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn.
Boromycin- kháng sinh chống HIV thuộc nhóm polyether-macrolid có
chứa một nguyên tử Bo trong phân tử được STH từ Streptomyces sp. A-3376.
Boromycin có khả năng ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có
thể ngăn cản quá trình sao chép của phân tử HIV trong tiến trình trưởng thành.
Trong quá trình lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu
là TMC-25, nghiên cứu chứng minh TMC-25 có cấu trúc giống hệt
13

boromycin. Quá trình lên men STH TMC-25 được tiến hành trên máy lắc ở
27°c trong 5 ngày.Chiết dịch lọc dịch lên men bằng n-butanol, dịch chiết được
tinh chế bởi phân đoạn dung môi kết hợp với sắc ký cột đảo pha trên silicagel
ODS và Sephadex LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu
được TMC-25 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Cứ 24,5 lít dịch lọc dịch
lên men sau quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu được 24,5mg TMC-25.
1.6.2.Phương pháp nâng cấp trong sản xuất Milbemycỉn.
Milbemycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid có tác dụng trên
hầu hết các loại giun, đặc biệt trên giun chỉ. Được chiết từ môi trường nuôi
cấy Streptomyces hygrocopicus subsp.aurecolacrimosus. Quá trình sinh tổng
hợp milbemycin bị ảnh hưởng bởi các yếu tố: oxy hoà tan (DO); độ nhớt môi
trường, sinh khối, khả năng tiêu thụ carbon. Các thông số vật lý: nhiệt độ (T),
áp suất (I), tốc độ khuấy (A), cấp khí (E) ảnh hưởng đến DO và hiệu suất sinh
tổng hợp kháng sinh. Để nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số vật lý đến
hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, sử dụng phương pháp: CMA (thay đổi A);
CMB (thay đổi lần lượt E, A); CMC (thay đổi lẩn lượt T, I, E, A); CMD (thay
đổi lần lượt T, E, A,I); CME (thay đổi lần lượt I, T, E, A); CMF (thay đổi lần
lượt I, E, A, T) để kiểm soát DO. Sau nghiên cứu áp dụng trên qui mô lên men
phòng thí nghiêm và công nghiệp cho thấy phương pháp CMF cho kết quả tốt
nhất nên CMF được áp dụng vào qui mô công nghiệp.
1.6.3. JU-2, kháng sinh kháng nấm chứa phospho phân lập từ
Streptomyces kanamyceticus Mg.
Indrani Datta và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu Streptomyces
kanamyceticus Mg có khả năng STH kanamycin hiệu suất cao bằng tác động
đột biến để tạo ra biến chủng có khả năng STH một hợp chất kháng sinh mới
chống lại Aspergillus niger.Hợp chất kháng sinh này gồm 4 thành phần và
thành phần có hoạt tính mạnh nhất ngoài c, H, o, N còn chứa phospho trong
phân tử, ký hiệu là JU-2.
14
Tiến hành lên men STH kháng sinh từ biến chủng Streptomyces

kanamyceticus Mg. Chiết dịch lọc dịch lên men bằng n-butanol. Dịch chiết n-
butanol bốc hơi chân không ở 45°c được cắn khô. Xử lý cắn khô bằng
chloroform sau đó chấm lên bản mỏng silicagel đã hoạt hoá. Sử dụng hệ dung
môi khai triển Ethylacetat: chloroform(4:l) tách được 4 vết. Vết có Rf=0,33
có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất sau khi rửa giải bằng chloroform. Khảo sát
với các hệ dung môi khai triển khác nhau, kết quả thu được vẫn là một vết có
hoạt tính. Tiến hành chạy sắc ký chế hoá sau đó rửa giải bằng chloroform.
Dịch rửa giải được tập hợp lại và đông khô thu được 50mg JU-2. Phân tích
định tính bằng thuốc thử hoá học, đo phổ uv, phổ IR, phổ khối, phổ NMR
kết hợp với định lượng hoá học đã chỉ ra sự có mặt của 2 phenylalanin, 2
glucose, 1 acid linoleic, 1 acid erucic và 1 phần có hoạt tính mạnh nhất có
chứa phosphonamide. Đánh giá từ những kết quả thực nghiệm cho thấy cấu
trúc hóa học của kháng sinh JU-2 là C
73H|15N20 2()P.
JU-2 là kháng sinh mới có hoạt tính kháng nấm mạnh (0,5|nm/ml MIC)
chống các bệnh nấm ngoài da như Trichophyton rubrum và Trichophyton
mentagrophytes gây bệnh nấm ngoài da hoặc da đầu ở động vật và người.
15
Phần 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu
* Chủng xạ khuẩn.
Chủng Streptomyces 13.312 do phòng thí nghiệm Vi sinh - kháng sinh
Bộ môn công nghiệp Dược, trường đại học Dược Hà Nội cung cấp.
«í» Giống vi sinh vật kiểm định.
Giống vsv kiểm định do bộ môn công nghiệp Dược cung cấp
- Vi khuẩn Gram (-):
Escherichia coli ATCC 25922 (EC)
Proteus mirabilis BV 108 (Pro)

Shigella flexneri DT 1 1 2 (Shi)
Salmonella typhi DT 2 2 0 (Sal)
Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu)
- Vi khuẩn Gram (+):
Staphylococcus aureus ATCC 1128 (Sta)
Bacillus pumilus ATCC 10241 (Bp)
Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs)
Bacillus cereus ATCC 9946 (Be)
Sarcilia lutea ATCC 9341 (SL)
4» Các môi trường sử dụng được ghi ở bảng 1 :
16
Bảng 1: Thành phần các môi trường sử dụng
Thànhphần MT1 MTIdd MT2 MT2dd
MT3 MT3dd
MT4
MT4dd MT5
MT5dd
MT6
MT6dd
MT7
MT7dd
Tinh bôt 2 2
2
2
2,4
2,4
Lactose
3
3
Glucose 2

2
1
1
Cao ngô 0,5 0,5
0,5
0,5
Saccrose
3
3
2
2
Bộtđậu tương
1
1
Pepton
0,3 0,3
0,3
0,3
Cao thit
0,3
0,3
0,5
0,5
KNO3
0 ,1 0, 1
KC1 0,05
0,05
NaN03 0 ,2 0 , 2
NH4N03 0 , 2 0 , 2 0 , 2
0 , 2

CaC03 0,3 0,3 0,4
0,4 0,2 0 , 2
0,4
0,4
(NH4)2S04
0 , 2
0 , 2
FeS04.7H20 0 , 0 0 1 0 , 0 0 1
KH2P04 0,05 0,05
0, 1 0 ,1 0,1 0, 1
0,05
0,05
MgS04.7H20
0,05
0,05 0,05
0,05 0,25 0,25 0,15
0,15
N ad 0,05
0,05
0 ,1
0 ,1
0,5 0,5
Cao nấm men
0,5 0,5
Thach
1, 8
0
2
0 2 0 2
0 2

0 2
0
1, 6
0
Nước
1 0 0
1 0 0 1 0 0
1 0 0
1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0
1 0 0 1 0 0
1 0 0
1 0 0
1 0 0
1 0 0
pH
7,0 - 7,2
6 ,8 - 7,2 7 ,0 - 7,2 7,0 - 7,2
7,0 - 7,2
7,0 - 7,2
7,4-7,6
0
- Thành phần của muối vi lượng trong các môi trường :
KH2P 04 lg; NaCl lg; MgS04.7H20 lg; nước cất vđ 200ml.
- Môi trường canh thang nuôi cấy VK kiểm định:
NaCl 0,5% ; Pepton 0,5% ; cao thịt 0,3% ; nước vđ lOOml.
- Môi trường thạch thường :
NaCl 0,5% ; Pepton 0,5% ; cao thịt 0,3% ; thạch 1,6% ; nước vđ lOOml.
- Môi trường Sabouraud lỏng:
Glucose 2% ; Pepton 1% ; nước vđ lOOml; pH: 6,0 - 6,5.
Môi trường Sabouraud đặc :

Glucose 2% ; Pepton 1% ; thạch 1,8% ; nước vđ lOOml; pH: 6,0 - 6,5.
- Môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISP1 đến ISP 9)
+ Muối vi lượng: MnCl2.4H20 0,lg; FeS04.7H20 0,lg; ZnS04.7H20 0,lg;
nước cất vđ lOOml; pH:7,0 - 7,2.
+ ISP1: Trypton 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất lOOOml; pH: 7,0 -7,2.
+ ISP2: cao nấm men 4,0g; dịch chiết Malt 10,Og; glucose 4,0g; thạch
20,Og; nước cất lOOOml; pH: 7,3-
+ ISP3: Yến mạch 20,Og; dung dịch muối vi lượng l,0ml; thạch 18,0g;
nước cất vđ lOOOml; pH: 7,2.
+ ISP4: Tinh bột 10,Og; K2HP04 l,0g; MgS04.7H20 l,0g; NaCl l,0g;
(NH4)2S04 2,0g; CaC03 2,ơg; dung dịch muối vi lượng l,0ml; thạch 20,Og; nước
cất vđ lOOOml; pH: 7,0 -7,4.
+ ISP5: L-asparagine l,0g; Glycerin 10,Og; K0HPO4 l,0g; dung dịch muối
+ ISP6 :
• Dung dịch A: Pepton 30g; acid citric 0,384g; FeS04 .7H20 0,556g;
NH4OH 25% 0,264g; Na2S20 3 lOml; K2HP04 lg; nước cất l.OOOml
• ISP6 : dung dịch A 36,Og; cao nấm men l,0 g; thạch 15g; nước cất
l.OOOml; pH: 7,0 -7,2.
+ ISP7: Glycerin 15,Og; L-tyrosine 0,5g; L-asparagine l,Og; K2HP04 0,5g;
MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 0,0lg; dung dịch muối vi lượng
l,0ml; thạch 20,Og; nước cất vđ lOOOml; pH:7,2 -7,4.
+ ISP9:
• A. Các nguồn đường khử trùng được sử dụng:
1 . D-Glucose 4 .1-inositol 7. Raffinose
2. L-arabinose 5. D-mannitol 8 . Saccarose
3. D-Xylose 6 . Rhamnose 9. D-fructose
• B. Dung dịch muối Pridham và Gottlieb:
CuS04.5H20 0,64g; FeS04 .7H20 0,1 lg; MnCl2 .4H20 0,79g; ZnS04.7H20
0,15g; nước cất lOOml.
• c. Môi trường thạch - muối khoáng:

(NH4)2S04 2,64g; KH2P04 2,38g; K2HP04.3H20 5,65g; MgS04.7H20 l,0g;
dung dịch muối B l,0ml; thạch 15g; nước cất vđ l.OOOml; PH: 6 ,8-7,0.
• Khử trùng môi trường c, để nguội tới 60°c cho lần lượt các nguồn
đường đã tiệt trùng (dùng phương pháp tyndal) vào sao cho nồng độ đường trong
môi trường là 1 %.
• Các dung môi đã sử dụng:
- Aceton d = 0,79 t°s = 56°c
- Butylacetat d = 0,880 - 0,885 t°s = 117 - 118°c
18