khảo sát hiệu quả của interferon alpha và gamma gà biểu hiện trên hệ thống pichia pastoris trong phòng bệnh viêm gan do virus type i trên vịt con

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA INTERFERON
ALPHA VÀ GAMMA GÀ BIỂU HIỆN TRÊN HỆ
THỐNG PICHIA PASTORIS TRONG PHÒNG
BỆNH VIÊM GAN DO VIRUS TYPE I TRÊN
VỊT CON

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

ĐOÀN THỊ BÍCH TRÂM
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y
Cần Thơ, 2014
i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÖ Y
  

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


HIỆU QUẢ
CỦA CHICKEN INTERFERON
ALPHA VÀ CHICKEN INTERFERON

GAMMA BIỂU HIỆN TRÊN HỆ THỐNG
PICHIA PASTORIS TRONG PHÕNG BỆNH
VIÊM GAN DO VIRUS TYPE 1 TRÊN VỊT CON












Sinh viên thực hiện:
ĐOÀN THỊ BÍCH TRÂM
MSSV: 3103067
LỚP: THÚ Y – K36
Cán bộ hướng dẫn:
PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU

ii


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÖ Y
  

Đề tài: Hiệu quả của chicken interferon alpha và chicken interferon gama
biểu hiện trên hệ thống Pichia pastoris trong phòng bệnh viêm gan do virus
type 1 trên vịt con. Do sinh viên Đoàn Thị Bích Trâm thực hiện tại Cần Thơ từ
tháng 08/2014 đến tháng 12/2014.



Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2014 Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2014
Duyệt Bộ môn Duyệt Giáo viên hƣớng dẫn



HỒ THỊ VIỆT THU

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2014
Duyệt khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng






iii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu,
kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.
Cần thơ, ngày … tháng … năm 2014
Tác giả luận văn

Đoàn Thị Bích Trâm
iv

LỜI CẢM TẠ

Xin kính dâng lên ông bà, cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc và quý trọng nhất,
những người luôn cố gắng tạo điều kiện để tôi thực hiện hoài bão của mình.
Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho
tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Thầy Lê Hoàng Sĩ – Cố vấn học tập đã tận tình chỉ dạy và giúp đỡ tôi
trong suốt 5 năm học vừa qua.
Quý thầy, cô Trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy, cô thuộc Bộ
Môn Chăn Nuôi và Bộ Môn Thú Y khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng
Dụng đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tại
trường.
Chị Nguyễn Minh Thùy và anh Lê Trần Hoài Khanh đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Chị Nguyễn Thị Thanh Giang (Trung tâm viện Công Nghệ Sinh Học
Thành phố Hồ Chí Minh) đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề
tài.
Các bạn trong và ngoài lớp Thú Y K36 đã giúp đỡ và động viên tôi trong
quá trình học tập cũng như trong cuộc sống.
Xin kính gởi tới quý thầy, cô, người thân lời chúc sức khỏe, thành công
và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc.
Xin gởi đến bạn bè tôi lời chúc sức khỏe và lời chúc thành công trên con
đường sự nghiệp tương lai.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn chân thành đến Hội Đồng Giám Khảo đã dành
thời gian đọc, xem xét và đóng góp ý kiến quý báo cho luận văn của tôi.
Đoàn Thị Bích Trâm

v

TÓM TẮT
Đề tài: “Hiệu quả của chicken interferon alpha và chicken interferon
gama biểu hiện trên hệ thống Pichia pastoris trong phòng bệnh viêm gan do
virus type 1 trên vịt con” được tiến hành từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014
tại Trại nghiên cứu và thực nghiệm Nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp và Sinh
học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. Nghiên cứu được thực hiện nhằm
khảo sát hiệu quả của interferon alpha gà và interferon gamma gà biểu hiện
trên hệ thống Pichia pastoris trong phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1
trên vịt con. Hiệu quả phòng bệnh của sinh phẩm được thực hiện qua 5 thí
nghiệm: Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm (LD
50
) bằng cách cho vịt
uống 0,2ml dịch virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1) từ nồng độ 10
0
đến 10
-6
.
Dùng interferon alpha gà tái tổ hợp (rChIFN-α) và interferon gamma gà tái tổ
hợp (rChIFN-γ) với liều 100µg/0,1ml/con để đánh giá độ an toàn. Thử hoạt
tính kháng virus của rChIFN-α và rChIFN-γ riêng rẽ bằng cách dùng 0,1ml
rChIFN-α và rChIFN-γ với liều lần lượt là 10µg, 50µg và 100µg và kết hợp
với liều 100µg +1µg, 100µg +10µg, 50µg +1µg, 50µg +10µg sau 24h gây
nhiễm virus. Khảo sát liều thích hợp dùng trong phòng DHV-1 của rChIFNs
bằng cách cho vịt nhỏ mắt, mũi 0,1ml/con rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ với
liều 100µg +1µg và 100µg +10µg. Sử dụng dịch rChIFNs liên tiếp trong 3
ngày, mỗi ngày 1 liều, sau đó gây nhiễm DHV-1.
Kết quả thí nghiệm xác định sử dụng 0,2ml DHV-1 với liều 10
3

LD
50
gây
chết 50% vịt con thí nghiệm. Sử dụng sinh phẩm rChIFNs với liều bằng hoặc
thấp hơn 100µg/0,1ml/con thì an toàn cho vịt. Sử dụng rChIFNs làm giảm tỷ
lệ bệnh và tỷ lệ chết của vịt thí nghiệm so với đối chứng dương, đồng thời khi
sử dụng dịch rChIFNs làm tăng hiệu giá kháng thể của vịt. Sử dụng rChIFN-α
ở liều 50μg và 100μg làm giảm tỷ lệ vịt bệnh và chết mạnh hơn so với sử dụng
các liều 10μg rChIFN-α và rChIFN-γ. Mặc khác, sử dụng kết hợp rChIFN-α
với rChIFN-γ mang lại hiệu quả kháng virus cao hơn khi sử dụng riêng rẽ
từng loại rChIFNs, trong đó dùng liều kết hợp 100µg rChIFN-α +1µg
rChIFN-γ và 100µg rChIFN-α +10µg rChIFN-γ làm giảm tỷ lệ bệnh và chết
cao hơn so với các liều còn lại. Đặc biệt, khi sử dụng 2 liều kết hợp 100µg
rChIFN-α +1µg rChIFN-γ và 100µg rChIFN-α +10µgrChIFN-γ trong phòng
bệnh viêm gan vịt do virus type 1 không những làm giảm tỷ lệ vịt bệnh và chết
mà còn giúp cải thiện tăng trọng, làm tăng hiệu giá kháng thể kháng virus
DHV-1 của vịt.
Kết quả thí nghiệm đã chứng minh rChIFN-α và rChIFN-γ có tiềm năng
trong việc phòng bệnh viêm gan do virus type 1 trên vịt con.
vi

MỤC LỤC
TRANG PHỤ BÌA i
TRANG KÝ DUYỆT ii
LỜI CAM ĐOAN iii
LỜI CẢM TẠ iv
TÓM TẮT v
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ix
DANH SÁCH BẢNG xi

DANH SÁCH HÌNH xii
Chƣơng 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Interferon 3
2.1.1 Sơ lược về interferon 3
2.1.2 Phân loại interferon 4
2.1.3 Vai trò interferon 4
2.1.4 Cơ chế hoạt động của interferon 5
2.2 Interferon gà 7
2.2.1 Phân loại interferon gà 7
2.2.2 Interferon alpha gà 8
2.2.3 Interferon gamma gà 8
2.3 Sự biểu hiện của ChIFN-α và ChIFN-γ trên hệ thống Pichia pastoris 9
2.4 Các nghiên cứu sử dụng rChIFN- α và rChIFN-γ 10
2.4.1 Nghiên cứu ngoài nước 11
2.4.2 Nghiên cứu trong nước 11
2.5 Bệnh viêm gan do virus ở vịt 12
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong ngoài nước 12
2.5.1.1 Nghiên cứu ngoài nước 12
2.5.1.2 Nghiên cứu trong nước 13
vii

2.5.2 Căn bệnh 13
2.5.2.1 Đặc điểm hình thái 13
2.5.2.2 Đặc tính sinh học của virus 14
2.5.2.3 Sức đề kháng 14
2.5.3 Truyền nhiễm học 14
2.5.3.1 Loài mắc bệnh 14
2.5.3.2 Phương thức truyền lây 15
2.5.3.3 Cơ chế sinh bệnh 15

2.5.3.4 Triệu chứng 15
2.5.3.5 Bệnh tích 16
2.5.3.6 Chẩn đoán 17
2.5.3.7 Phòng bệnh 18
2.5.3.8 Điều trị 19
Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20
3.1 Nội dung và phương pháp thí nghiệm 20
3.2 Phương tiện thí nghiệm 20
3.2.1 Thời gian và địa điểm 20
3.2.2 Vật liệu thí nghiệm 20
3.3 Phương pháp thí nghiệm 21
3.3.1 Chuẩn bị chuồng nuôi 21
3.3.2 Bố trí thí nghiệm 21
3.3.2.1 Chuẩn độ và xác định liều gây chết 50% vịt của DHV-1
trên vịt con 21
3.3.2.2 Đánh giá độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ
trên vịt con 23
3.3.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng virus của rChIFN-α và rChIFN-γ
trên vịt con 23
3.3.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng virus khi dùng liều kết hợp rChIFN-α với
rChIFN-γ trên vịt con 25
viii

3.3.2.5 Đánh giá hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1 khi dùng
liều kết hợp rChIFN-α với rChIFN-γ trên vịt con 27
3.4 Phản ứng trung hòa 29
3.5 Thống kê và xử lí số liệu 30
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1 Kết quả xác định nồng độ liều gây chết 50% vịt (LD
50

) của DHV-1 trên
vịt con 31
4.2 Kết quả đánh giá độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ ở liều nhỏ mắt,
mũi 100µg/con vịt 32
4.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α và
rChIFN-γ trên vịt con 32
4.3.1 Kết quả theo dõi vịt mắc bệnh và chết ở thí nghiệm 32
4.3.2 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 33
4.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α
kết hợp với rChIFN-γ trên vịt con 34
4.4.1 Kết quả theo dõi vịt mắc bệnh và chết ở thí nghiệm 34
4.4.2 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 36
4.5 Kết quả khảo sát liều thích hợp trong phòng bệnh viêm gan
vịt do DHV-1 của rChIFN-α kết hợp rChIFN-γ trên vịt con 37
4.5.1 Kết quả theo dõi vịt mắc bệnh và chết ở thí nghiệm 37
4.5.2 Kết quả theo dõi tăng trọng của vịt trước và sau khi thí nghiệm 38
4.5.3 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 ở vịt 1 tuần
tuổi và vịt 3 tuần tuổi 39
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
Phụ chƣơng Xử lý số liệu 47






ix

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt
Nguyên chữ
Nghĩa tiếng việt
ATP
cDNA
CEF
ChIFN
COS

DHAV
DHV
DNA
DEL
ĐC
E. Coli
IBDV
IRF
IFN
IFNGR
UI
LD
50


MaIFN
MHC

MEM
mRNA

NDV
NK
NT
P. pastoris
rChIFNs
rChIFN-α
Adenosine triphosphate
Complementary deoxyribonucleic acid
Chicken embryo fibroblast
Chicken interferon
Cell line derived from kidney cells of the
African green mokey
Duck hepatitis A virus
Duck hepatitis virus
Deoxyribonucleic acid
Duck embryo liver
Đối chứng
Escherichia coli
Infectious bursal diease virus
Interferon regulatory factor
Inteferon
Interferon gamma receptor
Units
Lethal dose 50%

Mammalian interferon
Major histocompatibility complex

Minimum essential medium
Messenger ribonucleic acid

Newcastle diease virus
Natural killer
Nghiệm thức
Pichia pastoris
Recombinant chicken interferon system
Recombinant chicken interferon alpha
Phân tử sinh năng lượng
Chuỗi DNA bổ sung
Tế bào xơ phôi gà
Interferon gà
Dòng tế bào từ tế bào thận
của khỉ xanh Châu Phi
Virus viêm gan vịt thuộc A
Virus gây bệnh viêm gan vịt

Tế bào gan phôi vịt


Virus gây bệnh Gumboro
Thụ thể interferon gắn vào
Cảm nhiễm tố
Yếu tố điều hòa cảm nhiễm tố
Đơn vị quốc tế
Liều gây chết 50% động vật
thí nghiệm
Interferon ở loài hữu nhũ
Phức hợp tương thích mô
hóa học
Môi trường nuôi cấy tế bào
RNA thông tin

Virus gây bệnh Newcastle
Tế bào giết tự nhiên

Hệ thống nấm men
Interferon gà tái tổ hợp
Interferon alpha gà tái tổ hợp
x



rChIFN-γ
RNA
SD


Ribosome chicken interferon gamma
Ribonucleotic acid
Standard devitation



Interferon gamma gà tái tổhợp

Độ lệch chuẩn

xi



DANH SÁCH BẢNG

Bảng
Tên Bảng
Trang
3.1
Bố trí thí nghiệm xác định LD
50

của DHV-1 trên vịt con……………
22
3.2
Bố trí thí nghiệm đánh giá độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ ở
liều 100µg/con vịt……………………………………………………

23
3.3
Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α và
rChIFN-γ trên vịt con………………………………………………

24
3.4
Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α kết
hợp rChIFN-γ trên vịt con……………………………………………

26
3.5
Bố trí thí nghiệm khảo sát liều thích hợp phòng bệnh viêm gan vịt do
virus type 1 của rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ trên vịt con………

28
4.1
Tỷ lệ vịt chết ở các nồng độ pha loãng dịch DHV-1 khi dùng riêng rẽ
từng loại rChIFN…………………………………………………….

31
4.2
Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết ở các nghiệm thức khi dùng riêng rẽ
từng loại rChIFN….………………………………………………….

33
4.3
Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 khi dùng liều kết
hợp rChIFN-α với rChIFN-γ ………………………………………….

34
4.4
Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết khi dùng rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ
35
4.5
Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 khi dùng
rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ ……………………………………

36
4.6
Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết khi dùng rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ
trong phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1……………………

37
4.7
Kết quả tăng trọng của vịt vào các thời điểm 0, 8, 14 và 21 ngày…….
38
4.8
Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 ở vịt 1 tuần tuổi
và 3 tuần tuổi…………………………………………………………

39

xii



DANH SÁCH HÌNH

Hình
Tên hình Trang

2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6


Cấu trúc interferon người……………………………………3
Cơ chế kháng virus cảm ứng bởi interferon……………… 6
Đáp ứng kháng virus của interferon……………………… 7
Cấu trúc tinh thể interferon gamma gà…………………… 8
Vịt chết tư thế ngoẹo đầu………………………………… 16
Gan sưng to, nhạt màu, xuất huyết…… …………….…….16

1

Chƣơng 1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi vịt ngày càng phát triển với
quy mô lớn, mang tính chuyên môn hóa cao. Tuy nhiên, bệnh truyền nhiễm là
một vấn đề đáng quan tâm bởi tính nguy hiểm và ảnh hưởng tiêu cực của bệnh
đến vật nuôi cũng như lợi nhuận kinh tế trong chăn nuôi. Bệnh viêm gan do
virus ở vịt là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh, do nhiều loại
virus gây ra với 3 type khác nhau: type 1, type 2 và type 3. Trong đó, virus
viêm gan vịt type 1 có độc lực cao nhất (OIE, 2008). Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt
con từ 1-3 tuần tuổi với tỷ lệ chết từ 50-95%, có khi 100% (Hồ Thị Việt Thu
và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Hiểu rõ được đặc tính cũng như thiệt hại của một bệnh có căn nguyên là
virus nên việc phòng bệnh được đặt lên hàng đầu. Hiện nay, trên thị trường có
một số loại vaccine nhược độc và vô hoạt cùng các loại kháng thể để đối phó
với bệnh. Tuy nhiên do đặc tính của virus này dễ dàng thích ứng với môi
trường cũng như một số vấn đề trong sự biến chủng nên đã làm giảm hiệu quả
của các loại vaccine, kháng thể (Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2013).
Từ thực tế trên, việc sử dụng interferon (IFN) là một lựa chọn hữu hiệu
cho công tác phòng chống bệnh do virus. IFN là một cytokine tự nhiên do tế
bào tiết ra, bao gồm 3 type: type 1, type 2 và type 3. Trong đó IFN type 1 đóng
vai trò quan trọng trong việc kháng virus, ngăn cản sự nhân lên của virus.
Song theo đó, IFN type 2 ức chế quá trình tái sinh virus ngay tại chỗ và hạn
chế sự lan tràn của virus (Trần Ngọc Bích và Hồ Thị Việt Thu, 2012). Đồng
thời, nó đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện tăng trọng của đàn gia
cầm (Lowenthal, 1997). Hiện nay, trung tâm công nghệ sinh học Thành phố
Hồ Chí Minh đã nghiên cứu thành công chế phẩm ChIFN-α và ChIFN-γ, sử
dụng nấm men Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện. Nhận thấy, interferon

gamma gà có cấu trúc tương đồng với interferon gamma vịt xấp xỉ 80%
(Huang et al., 2001).
Từ thực tế trên, nghiên cứu “Hiệu quả của ChIFN-α và ChIEN-γ trong
phòng bệnh viêm gan do virus type 1 ở vịt con” được tiến hành với mục tiêu
xác định hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1 của ChIFN-α và
ChIFN-γ trên vịt con.

2

Mục tiêu đề tài:
Khảo sát tính an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con.
Khảo sát hiệu quả của rChIFN-α và rChIFN-γ trong phòng bệnh viêm
gan do virus type 1 trên vịt con.

3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Interferon
2.1.1 Sơ lược về interferon
Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất bởi các tế bào
của hệ miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai
như virus, vi khuẩn, kí sinh trùng và tế bào ung thư. IFN thuộc một lớp lớn
của glycoprotein được biết đến với cái tên cytokine (chất hoạt hóa tế bào).
Chúng đóng vai trò quan trọng trong cửa ngõ miễn dịch của cơ thể. IFN là một
phần của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu và được kích hoạt bởi giai đoạn
đầu của quá trình cảm nhiễm trước khi hệ miễn dịch đặc hiệu có thời gian để
phản ứng.
Interferon được tế bào sản xuất ra khi tế bào cảm thụ với virus, chất này
có đặc tính ức chế mọi hoạt động của mRNA, dẫn đến ức chế sự sinh sản của
virus. Điều này được nhận thấy bởi Alick Isaacs và Jean Lindenam (1957) khi
gây nhiễm virus cúm sống vào phôi gà đang phát triển mà trước đó đã nhiễm
virus cúm bất hoạt bằng nhiệt thì virus mới không thể nhân lên được. Nếu
nghiền phôi bằng hỗn dịch rồi đem tiêm truyền vào phôi gà khác thì cũng ngăn
cản sự nhân lên của virus trong phôi gà.

Hình 2.1 Cấu trúc interferon ngƣời
(




4

2.1.2 Phân loại interferron
Căn cứ vào thụ thể mà interferon được truyền qua, người ta chia
interferon làm 3 type: type 1, type 2 và type 3 (Nguyễn Văn Nguyên và
Nguyễn Quốc Bình, 2012).
Type 1: bao gồm IFN-α, IFN-β, IFN-δ, IFN-κ, IFN-ω và IFN-ε, IFN-τ và
limitin. Tất cả các IFN type 1 gắn vào 1 phức hợp thụ thể đặc biệt ở bề mặt tế
bào được biết đến như là thụ thể IFN-α bao gồm IFN-α
1
và IFN-α
2
. IFN-α,
IFN-β và IFN-ω được sản sinh từ tế bào khi có sự xâm nhiễm của virus hoặc
vi khuẩn.
Type 2: gồm IFN-γ hay còn gọi là IFN miễn dịch. IFN này gắn vào thụ
thể IFNGR. IFN-γ là một glycoprotein bao gồm 2 chuỗi giống nhau với trọng
lượng phân tử là 21kD và 24kD. Chúng được tạo ra do sự kích thích phân bào
và kháng nguyên. IFN-γ được tổng hợp ít nhất bởi 3 kiểu tế bào của hệ thống
miễn dịch: tế bào CD
4
, tế bào diệt tự nhiên (NK), tế bào CD
8
. Đối với IFN-γ,

chúng không có vai trò kháng virus mạnh như IFN-α, nhưng chúng có vai trò
rất quan trọng trong điều hòa miễn dịch, đặc biệt là trong việc hoạt hóa đại
thực bào, biểu hiện kháng nguyên phù hợp với tổ chức chính lớp II và tác
động đến đáp ứng viêm tại chỗ.
Type 3: bao gồm IFN-λ
1
, IFN-λ
2
, IFN-λ
3
, IFN-λ
4
. IFN type 3 thông tin
qua một phức hợp thụ thể bao gồm IL10R2 và IFNLR1. Có một số nghiên cứu
cho rằng IFN-λ có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh do virus và bệnh ung
thư (Donnelly and Kotenko, 2010).
2.1.3 Vai trò của interferon
Interferon đóng vai trò là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại
virus và tế bào ung thư. Ngoài ra, IFN còn giữ vị trí quan trọng trong việc điều
hòa miễn dịch của cơ thể.
Kháng virus là hoạt tính nổi bật nhất của IFN-α. Chúng cảm ứng tế bào
sản sinh ra protein khởi đầu dịch mã, phá hủy RNA thông tin của virus và ức
chế sự nhân lên của virus. Đã có nhiều nghiên cứu về một số bệnh như viêm
não Nhật Bản, cúm, sốt xuất huyết,…để xác định vai trò kháng virus của IFN.
Các nghiên cứu này nhận thấy vào những ngày đầu khi mới xuất hiện bệnh,
với đặc tính hình thành tại chỗ và nhanh chóng trước cả kháng thể đặc hiệu,
IFN đã xuất hiện trong máu. Tiếp theo, hàm lượng IFN tăng dần và tỉ lệ
nghịch với hàm lượng virus trong máu cho đến khi virus giảm đến dưới
ngưỡng bệnh thì bệnh được đẩy lùi (Phạm Văn Ty, 2005).
5

Ngoài chức năng kháng virus, IFN còn đóng vai trò quan trọng trong
việc chống lại khối ung thư. IFN làm trì hoãn sự phân chia của các tế bào ung
thư bằng việc ngăn cản sự phân bào. Mặc khác, nó còn làm giảm khả năng tự
bảo vệ của các tế bào ung thư đối với hệ miễn dịch của cơ thể. Đồng thời, tăng
cường khả năng miễn dịch của cơ thể. Vì vậy, IFN đã có thể ức chế sự tăng
sinh của các tế bào ung thư một cách hữu hiệu như ung thư bạch cầu tế bào
tua, u hạch ở trẻ,…(Phạm Văn Ty, 2005).
IFN ảnh hưởng đến nhiều chức năng miễn dịch của cơ thể. IFN có thể
hoạt hóa hay ức chế chức năng miễn dịch tế bào hay dịch thể tùy thuộc vào
nồng độ của tác nhân cảm ứng (virus, tế bào ung thư,…). Hoạt tính của tế bào
NK cũng như hoạt tính diệt và ức chế sự phát triển của khối u có thể được tăng
lên đáng kể nhờ IFN-α và IFN-γ. Ngoài ra, IFN-γ có tác dụng tăng cường sự
biểu hiện của glycoprotein MHCII trên bề mặt tế bào đại thực bào, tăng cường
quá trình trình diện kháng nguyên của quá trình này. Nó thúc đẩy biệt hóa tế
bào T, tế bào B, hoạt hóa tế bào NK, nội mạc huyết quản, bạch cầu đa nhân
trung tính (Nguyễn Văn Nguyên và Nguyễn Quốc Bình, 2012).
Sự kết hợp giữa ChIFN-α và ChIFN-γ giúp làm tăng hiệu quả kháng
virus gấp 100 lần so với sử dụng từng loại riêng rẽ. Điều này có ý nghĩa quan
trọng trong việc phòng trị các bệnh do virus của gia cầm (Sekellick et al.,
1994).
2.1.4 Cơ chế hoạt động của interferon
Ở gà cũng như các loài hữu nhũ, IFN-α có tính kháng virus mạnh hơn
IFN-γ. Khi tế bào bị xâm nhập nhập bởi virus hoặc các tác nhân cảm ứng
khác, IFN sẽ được hình thành sau vài giờ hay trễ nhất là 1 ngày sau đó.
Tác dụng của interferon được hình thành theo cơ chế nâng cao hiệu quả
của đáp ứng miễn dịch bằng cách tăng sự biểu hiện của các phân tử MHCI trên
bề mặt các tế bào bị nhiễm virus. Vì thế, các interferon sẽ làm tăng cơ hội cho
các tế bào T gây độc tế bào nhận biết và tiêu diệt các tế bào bị nhiễm. Ngoài
ra, IFN còn có tác dụng diệt virus trực tiếp bằng việc làm thoái hóa RNA

thông tin của virus và ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. Từ đó, làm ngăn
cản sự xâm nhiễm của virus vào tế bào mới (Landolfo et al., 1995).
6

Tác dụng interferon ức chế sự nhân lên của virus được lý giải như sau:
khi bị nhiễm virus, các tế bào có khả năng tổng hợp interferon và tiết nó vào
dịch thể ngoại bào. Tại đó, interferon sẽ gắn kết với các thụ cảm quan đặc hiệu
lên các tế bào kề bên chưa bị nhiễm virus. Có ít nhất là 2 gene được giải
phóng trong tế bào khi có mặt của interferon và chúng cho phép tổng hợp 2
enzyme mới. Enzyme thứ nhất là protein kinase được hoạt hóa bởi sợi đôi
RNA, sẽ xúc tác quá trình photphoryl hóa của một protein của ribosom và làm
bất hoạt eIF-2 – một yếu tố khởi đầu dịch mã của virus làm ức chế tổng hợp
protein. Enzyme thứ 2 là 2,5-oligoadenylat synthetas (OASE) cũng được hoạt
hóa bởi sợi đôi RNA, sẽ xúc tác phân cắt ATP tạo oligoadenylat (2,5A), tiếp
đến hoạt hóa enzyme ribonuclease nội bào (RNAse) phá hủy mRNA của virus
và do đó cũng ức chế luôn quá trình tổng hợp protein của virus. Kết quả là tạo
nên một vòng các tế bào không bị nhiễm virus xung quanh vị trí mà virus xâm
nhập và nhờ đó làm hạn chế quá trình lây lan của virus.
Hình 2.2 Cơ chế kháng virus cảm ứng bởi interferon
(Landolfo et al., 1995)
Bên cạnh đó, trong đáp ứng kháng virus thì IFN không chỉ thể hiện ở tế
bào không bị nhiễm virus mà còn cảm ứng quá trình apoptosis (sự chết của tế
bào theo lập trình-programmed cell death) trên tế bào bị nhiễm virus (Tanaka
et al., 1998). Người ta cũng đã chứng minh được rằng các enzyme đã được mô
tả ở trên có tác dụng ức chế sự phân chia tế bào cũng như ức chế sự tái tạo của
virus. Interferon cũng có thề điều chỉnh hoạt động của tế bào khác như các tế
bào diệt tự nhiên.
7

Hình 2.3 Đáp ứng kháng virus của interferon
(Tanaka el al., 1998)
Hoạt động chống khối u của IFN-α được biểu hiện trực tiếp và gián tiếp.
Về việc biểu hiện trực tiếp được giải thích như sau: IFN-α ngăn cản sự phân
chia của tế bào khối u bằng cách làm tăng độ dài phân chia tế bào. Tham gia
vào cơ chế này là 2,5-OASE. Hơn nữa, IFN-α còn làm mất các chất trao đổi
thiết yếu. Chẳng hạn, IFN-α ức chế sự cảm ứng enzyme ornithine
decarboxylase, do đó làm giảm sinh tổng hợp putrescin và các polyamine thiết
yếu khác. IFN-α có tác động chống khối u gián tiếp qua tế bào lympho Tc và
đáp ứng miễn dịch tế bào vật chủ. IFN-α điều hòa sự biểu hiện của kháng
nguyên bề mặt tế bào để đại thực bào và các tế bào lympho Tc nhận biết và
giết tế bào khối u hiệu quả hơn. Đáp ứng miễn dịch tế bào được tăng cường sẽ
đáp ứng sản xuất kháng thể càng nhiều, khi đó tế bài khối u cũng bị phân giải
càng nhiều (Tompkin,1999).
2.2 Interferon gà
2.2.1 Phân loại interferon gà
Cũng như IFN của các loài khác, IFN gà bao gồm 2 type chính: type 1
(ChIFN-α và ChIFN-β) và type 2 (ChIFN-γ) với chức năng và cơ chế hoạt
động khác nhau.
Interferon gà type 1: bao gồm ChIFN-α và ChIFN-β. ChIFN đầu tiên
được tạo dòng thành công là ChIFN type I, với nguồn gene từ thư viện cDNA
của các tế bào xơ phôi gà. ChIFN tái tổ hợp này được sản xuất khi tế bào bị
nhiễm virus và có khả năng kháng virus cao hơn ChIFN tự nhiên. Mặc khác,

ChIFN-α có hoạt tính kháng virus cao gấp 20 lần so với ChIFN-β.
Interferon gà type 2: bao gồm ChIFN-γ. ChIFN type 2 đầu tiên được tạo
dòng từ thư viện cDNA của các tế bào T được hoạt hóa và các đại thực bào
8

của gà. ChIFN-γ có tác dụng cảm ứng sự biểu hiện MHCII trên bề mặt các đại
thực bào và các loại tế bào trình diện kháng nguyên khác ở gà (Steimle, 1994).
2.2.2 Interferon alpha gà
Nghiên cứu về tạo dòng, biểu hiện và phân tích trình tự ChIFN-α lần đầu
tiên được công bố vào năm 1994. Gene ChIFN-α không có intron, mã hóa cho
1 protein dài 193 amino acid, trong đó đoạn peptid tín hiệu dài 31 amino acid
và protein trưởng thành có chiều dài 162 amino acid với khối lượng phân tử là
18,96 kDa (Sekellick et al., 1994).
ChIFN-α được sản xuất khi cơ thể gà phản ứng lại sư xâm nhiễm của
virus và được sản xuất bởi nhiều loại tế bào khác nhau. ChIFN-α ức chế sự
tăng sinh của virus bằng cách kích thích tế bào phân hủy RNA virus, ức chế
quá trình tổng hợp protein và tăng apoptosis của tế bào nhiễm virus (trích dẫn
Võ Thị Minh Tâm et al., 2014). Mặc khác, nghiên cứu của Yang et al. (2013)
nhận định rằng ChIFN-α có hoạt tính kháng virus mạnh hơn ChIFN-γ về việc
ức chế sự sao chép của virus ở bệnh viêm miệng mụn nước, Newcastle và cúm
gia cầm.
2.2.3 Interferon gamma gà
Nghiên cứu tạo dòng thành công gene mã hóa cho ChIFN-γ và biểu hiện
IFN này trên hệ thống tế bào COS. Kết quả cho thấy: cDNA của ChIFN-γ mã
hóa cho một protein dài 164 amino acid chứa vùng tín hiệu chứa 19 amino
acid và ChIFN-γ trưởng thành dài 145 amino acid, tương ứng với trọng lượng
phân tử 16,8 kDa. ChIFN-γ được sản xuất từ tế bào T được hoạt hóa và các đại
thực bào. Mặc khác, qua kết quả so sánh trình tự acid amin thì ChIFN-γ tương
đồng 32% với MaIFN-γ và 15% với ChIFN-α (Digby et al., 1995).

Hình 2.4 Cấu trúc tinh thể của interferon gamma
(
9

ChIFN-γ có khả năng cảm ứng tổng hợp protein gắn kết guanylate (GBP-
guanylate-binding protein) và cảm ứng tổng hợp các yếu tố điều hòa IFN
(IRF-1 –IRF regulatory factor 1) trên các tế bào đích. Đồng thời, ChIFN-γ có
tác dụng cảm ứng sự biểu hiện kháng nguyên MHCII trên bề mặt các đại thực
bào và các loại tế bào khác ở gà (Janardhana et al., 2007).
Tuy nhiên, ChIFN-γ thể hiện khả năng kháng virus kém hơn so với
ChIFN-α (Song et al., 1997). Nghiên cứu cho thấy, ChIFN-γ không có khả
năng ngăn chặn quá trình cảm ứng gây phá vỡ cấu trúc tế bào chủ của virus
sau khi xâm nhập (Weining et al., 1996).
2.3 Sự biểu hiện ChIFN-α và ChIFN-γ trên hệ thống Pichia pastoris
Tạo dòng nấm men Pichia pastoris
Pichia pastoris là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp nhiều triển vọng
vì biểu hiện protein dạng tiết, dễ nuôi cấy, có thể nâng cấp lên quy mô sản
xuất công nghiệp và giá thành sản xuất thấp. Do đó, việc tạo được dòng nấm
men P. pastoris biểu hiện ChIFNs sẽ mở ra triển vọng sản xuất được các
protein này với giá thành hợp lý, phục vụ cho ngành chăn nuôi gia cầm.
Quá trình tạo dòng nấm men P. pastoris biểu hiện ổn định ChIFN-α và
ChIFN-γ được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm tắt quá trình
này như sau: plasmid pPIC9K tái tổ hợp mang gene mã hóa cho ChIFN-α và
ChIFN-γ được cắt mở vòng bằng SalI và được điện biến nạp vào P. pastoris,
các dòng nấm men mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường các dòng
P. pastoris tái tổ hợp có mang gene mục tiêu được nuôi cấy liên tục trên môi
trường YPD Pichia chứa G418 với nồng độ tăng dần (2, 4, 6, 8, 10 mg/ml)
nhằm tìm ra các dòng có mang nhiều bản sao của gen mục tiêu trong bộ gen
(Võ Thị Minh Tâm et al., 2014).
Ƣu điểm của hệ thống nấm men Pichia pastoris

Pichia pastoris là hệ thống biểu hiện ChIFN đang được ứng dụng gần
đây với nhiều tiềm năng lớn trong việc sản xuất protein bởi nhiều ưu điểm
vượt trội.
Hệ thống P. pastoris có tính bền vững qua nhiều thế hệ tế bào do vector
tái tổ hợp mang gene mục tiêu có thể được sát nhập vào bộ gen nấm men theo
cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa DNA plasmid và vùng trình tự tương đồng
trên bộ gene theo 2 cách: gắn chèn vector vào bộ gene nấm men hoặc thay thế
gene, loại bỏ hoàn toàn gene AOX1 trong bộ gene nấm men. Số lượng bản
sao của gene mục tiêu sát nhập vào bộ gene chủng chủ nấm men có thể là một
trong các yếu tố giúp gia tăng mức độ biểu hiện ChIFN. Hơn nữa, ChIFN
10

được tiết ra ngoài môi trường ở dạng có hoạt tính. Do đó, quá trình thu nhận,
tinh chế ChIFN dễ dàng hơn so với ChIFN được biểu hiện ở dạng nội bào trên
các hệ thống khác (Vương Cát Khánh et al., 2014).
So với hệ thống P. cerevisidae, P. pastoris có thể phát triển mật độ
ChIFN cao hơn gấp nhiều lần. Từ đó hệ thống tạo một lượng sinh khối rất lớn
trong quá trình lên men với thao tác đơn giản (Ngô Thị Kim Hằng et al.,
2012). Đồng thời, P. pastoris sử dụng methanol làm chất cảm ứng. Đây là một
hóa chất rẻ tiền. Vì vậy, hệ thống không những được ứng dụng trong nghiên
cứu mà còn có thể được sử dụng để sản xuất ChIFN với quy mô công nghiệp.
Sự biểu hiện ChIFN-α và ChIFN-γ trên hệ thống Pichia pastoris
Sự biểu hiện của ChIFN-α và ChIFN-γ trong dịch nuôi cấy P. pastoris đã
được xác định bằng SDS-PAGE. Hoạt tính sinh học của ChIFN-α tái tổ hợp
được xác định trên mô hình nguyên bào sợi phôi gà gây nhiễm virus IBDV và
NDV. Khi gây nhiễm tế bào với virus IBDV, tỷ lệ tế bào sống ở lô xử lý với
ChIFN-α liều 1,6 μg/ml là 79-88% trong khi tỷ lệ tế bào sống ở lô đối chứng
âm là 33-34%. Khi gây nhiễm tế bào với virus NDV, tỷ lệ tế bào sống ở lô xử
lý với ChIFN-α liều 1,6 μg/ml là 81-90%, cao hơn đáng kể tỷ lệ tế bào sống ở
lô đối chứng là 27-32%. Như vậy, protein tái tổ hợp ChIFN-α và ChIFN-γ đã

được biểu hiện thành công trên hệ thống P. pastoris và ChIFN-α có hoạt tính
kích thích tế bào kháng virus IBDV và NDV (Võ Thị Minh Tâm et al., 2014).
2.4 Các nghiên cứu sử dụng rChIFN-α và rChIFN-γ
2.4.1 Nghiên cứu ngoài nước
Sekelick el al.(1994) là người đầu tiên tạo ra interferon gà tái tổ hợp từ
E. coli. Sản phẩm dịch mã ban đầu của RNA thông tin của interferon alpha gà
tái tổ hợp có 193 acid amin. IFN gà trưởng thành có khoảng 162 acid amin với
trọng lượng phân tử 19kDa.
Năm 1997, Lowenthal xác định hoạt tính in vitro của ChIFN-γ trên gà
con 7 ngày tuổi bị nhiễm Eimeria bằng cách tiêm vào ổ bụng 5.000 IU/ngày.
Kết quả cho thấy, so với nhóm đối chứng không được tiêm ChIFN-γ, khối
lượng gà của nhóm thí nghiệm tăng đều, không có triệu chứng sụt giảm khối
lượng do tác động xâm nhiễm của virus.
Thử nghiệm hoạt tính của rChIFN-α đối với bệnh Newcastle trên gà
trong suốt 11 ngày được thực hiện bởi Marcus et al. vào năm 1999. Gà được
thử nghiệm điều trị bằng dịch rChIFN-α với nồng độ 1.000-2.000 UI/ml. Kết
quả cho thấy sinh phẩm làm giảm các triệu chứng bệnh, đồng thời tránh được
tình trạng lây lan và bùng phát bệnh. Trong cùng năm, nghiên cứu của Plachy
11

cho rằng ở liều 100 IU/ml, ChIFN-α ức chế được sự tăng sinh khối u do virus
Rous sarcoma gây ra.
Hoạt tính của rChIFN được thử nghiệm trong điều kiện in vivo và được
đánh giá là có hiệu quả trong việc chống lại virus gây viêm phế quản ở gia
cầm. ChIFN-α ức chế sự nhân lên của virus trong tế bào thận gà ở liều tác
động 100 IU/ml/con với tỷ lệ 50%. Mặc khác, nghiên cứu cho rằng ChIFN-α
có thể bảo vệ được tế bào bằng cách tiêm tĩnh mạch hoặc cho uống ChIFN-α
trước 1 ngày gây nhiễm virus và mỗi 5 ngày sau đó (Pie et al., 2001). Cùng
thời điểm, nghiên cứu của Jarosinski et al. nhận định ChIFN-α làm giảm đáng
kể sự nhân lên của virus Marek khi cho gà uống ChIFN-α với liều 2.000

IU/ml.
Năm 2008, Song et al. nghiên cứu tạo ra rChIFN-α biểu hiện trong rau
diếp. Sản phẩm ban đầu cho thấy tính khả quan trong hoạt tính sinh học qua
thử nghiệm ức chế bệnh tích tế bào và sự nhân lên của virus gây viêm miệng
cho mụn nước trên tế bào CEF. Kết quả cho thấy rChIFN-α có khả năng cảm
ứng hoạt tính kháng virus của tế bào.
Trong một nghiên cứu mới đây, Jiang et al. (2011) đã so sánh khả năng
bảo vệ tế bào của rChIFN-α trên tế bào sơ phôi sơ cấp của gà, vịt và gà tây
trước khi gây nhiễm với virus H1N1 và virus H5N9. Với việc xử lí trước với
1.000 UI/ml rChIFN-α trong 18 giờ, rChIFN-α đã làm giảm đáng kể sự nhân
lên của virus trong 2 loại tế bào xơ phôi của gà và gà tây, mức độ giảm ít hơn
ở tế bào phôi vịt. Cụ thể là sự tăng sinh của virus giảm xấp xỉ 200 lần trên tế
bào gà và gà tây, khoảng 30 lần trên tế bào vịt sau 48 giờ gây nhiễm. Các số
liệu này được chứng tỏ rằng rChIFN-α có thể làm giảm sự nhân lên của virus
và có hoạt tính sinh học trên các loài gia cầm khác.
2.4.2 Nghiên cứu trong nước
Năm 2000, Việt Nam phối hợp với các nhà khoa học Ucraina đã sản xuất
thử thành công IFN-α tại viện vaccine Nha Trang theo công nghệ dùng phage
của E. coli làm vector, do đó việc chiết IFN dễ dàng hơn (Phạm Văn Ty,
2005).
Viện vaccine Nha Trang bắt đầu nghiên cứu sản xuất thuốc nhỏ mũi làm
từ interferon để phòng chống bệnh cúm, các bệnh truyền nhiễm đường hô hấp
do virus vào năm 2003. Hiện nay, ở nước ta lưu hành nhiều loại thuốc sản xuất
từ interferon với tên biệt dược như: Alpha feron (JeJang- Hàn Quốc),
Superferon (Viện vaccine Việt Nam),…
12

Cho đến năm 2010, Nguyễn Ngọc Ẩn et al. đã thử hoạt tính kháng virus
in vitro của rChIFN-α trên vỏ bào tử Bacillus subtilis. Kết quả thử nghiệm cho
thấy rChIFN-α có khả năng kháng IBDV và NDV tùy thuộc vào liều. Hoạt

tính kháng virus thề hiện sự ức chế tạo ổ hoại tử trên môi trường tế bào CEF.
Nghiên cứu hiệu quả phòng bệnh của bào tử Bacillus subtilis biểu hiện
interferon alpha trong phòng bệnh Gumboro cho gà được thực hiện trên giống
gà 3 tuần tuổi. Kết quả cho thấy ChIFNα- B. subtilis có khả năng phòng bệnh
Gumboro với tỷ lệ bảo hộ là 77,08% cao hơn so với tỷ lệ bảo hộ bởi ChIFN-α
là 66,67% và so với đối chứng B. subtilis (12,50%). Nghiên cứu chứng minh
ChIFNα- B. subtilis có tiềm năng trong việc phòng bệnh Gumboro trên gà (Hồ
Thị Việt Thu, 2012).
2.5 Bệnh viêm gan vịt do virus
Bệnh viêm gan vịt do virus là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh
do nhiều loại virus. Có 3 type virus gây bệnh: type 1, type 2 và type 3, trong
đó type 1 là phổ biến nhất. Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con mới nở đến 6 tuần
tuổi với bệnh tích đặc trưng là gan sưng, nhạt màu, xuất huyết.
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.5.1.1 Tình hình ngoài nước
Năm 1945, Levine và Hofstad lần đầu tiên phát hiện một ổ dịch bệnh
trên vịt con, vịt chết nhanh sau khi có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc
trưng là gan sưng to và có các điểm xuất huyết. Tuy nhiên, mầm bệnh chưa
được phân lập. Đến mùa xuân năm 1949, Levine và Fabricant đã theo dõi một
bệnh trên đàn vịt Bắc Kinh trắng tại Long Island và New York, Mỹ. Bệnh lây
lan rất nhanh với tỉ lệ chết lên đến 95% đối với những trại mắc bệnh nặng và
giảm dần đến khi tỷ lệ mắc bệnh chỉ còn 15%. Theo thống kê, tổng số vịt chết
lên đến 750.000 con (Woolcock and Fabricant, 1997).
Cho đến năm 1968, bệnh viêm gan vịt do virus type 1 có mặt hầu hết ở
các nước trên thế giới, trong đó có một số nước châu Á như Trung Quốc, Hàn
Quốc,…Trong cùng năm, Toth đã quan sát thấy bệnh viêm gan ở đàn vịt con
đã được miễn dịch đối với bệnh viêm gan do virus type 1. Ông đã phân lập
được loại virus đó khác với type 1 và type 2 và đặt tên cho loại virus đó là
virus viêm gan vịt type 3. Bệnh do loại virus này chỉ xảy ra ở Mỹ (Woolcock
and Fabricant, 1997).

Hiện nay, virus viêm gan vịt type 1 được phân loại gồm 3 genotype:
genotype 1 (DHAV-1), genotype 2 (DHAV-2) và genotype 3 (DHAV -3)
(OIE, 2010). Trong đó phổ biến nhất là DHAV-1. DHAV-3 được công bố lần