khảo sát sự lưu hành của vi khuẩn e coli sinh beta lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện mỹ tú tỉnh sóc trăng

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y






HUỲNH NGỌC HUYỀN









Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BÁC SĨ THÚ Y



KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA VI KHUẨN E. coli
SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN
GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC
HUYỆN MỸ TÚ TỈNH SÓC TRĂNG

Cần Thơ, 2014

i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y





Luận văn tốt nghiệp
Ngành BÁC SĨ THÚ Y

Tên đề tài








Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
HUỲNH NGỌC TRANG HUỲNH NGỌC HUYỀN
MSSV: 3103025
Lớp: CN10Y4A1 – K36



Cần Thơ, 2014

KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA VI KHUẨN E. coli
SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN
GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC
HUYỆN MỸ TÚ TỈNH SÓC TRĂNG

ii

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Khảo sát sự lƣu hành của vi khuẩn E. coli sinh beta lactamase phổ
rộng trên gà khỏe một số trại gà thuộc huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng”, do sinh
viên Huỳnh Ngọc Huyền thực hiện tại Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh
Học Ứng Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ. Từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014.


Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Bộ Môn Giảng viên hƣớng dẫn


Huỳnh Ngọc Trang


Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

iii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn trƣờng Đại học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh
Học Ứng Dụng, Bộ môn Thú y cùng tất cả thầy cô đã tận tâm dạy dỗ truyền đạt
những tri thức khoa học và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình rèn
luyện và học tập tại trƣờng.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Lê Minh và cô Huỳnh Ngọc Trang
đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn để tôi hoàn thành luận văn.
Cảm ơn các anh chị cao học đã nhiệt tình hỗ trợ giúp đỡ tôi trong học tập cũng nhƣ
trong suốt quá trình làm bài.
Xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất cả những ngƣời đã luôn bên tôi, giúp đỡ tôi hết
mình những lúc khó khăn để tôi hoàn thành tốt.
Một lần nữa xin chân thành cảm ơn tất cả mọi ngƣời.


iv

TÓM LƢỢC
Đề tài thực hiện nhằm khảo sát sự lưu hành của vi khuẩn Escherichia coli ESBL tại
huyện Mỹ Tú trên 4 loại mẫu của gà khỏe. Qua khảo sát trên 22 con gà khỏe gồm
11 gà thịt khỏe và 11 gà đẻ loại, mỗi gà phân tích 4 mẫu: phân, gan, thịt, phổi.

Phân lập Escherichia coli ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm
kháng sinh đồ. Kết quả: Tỉ lệ nhiễm Escherichia coli sinh ESBL trên gà khỏe khá
cao 68,18%. Trong đó Escherichia coli sinh ESBL trên gà thịt 81,82% và gà đẻ
36,36%. Tỉ lệ Escherichia coli sinh ESBL trên các cơ quan phân, gan, phổi lần lượt
là 59,1%, 9,1% và 13,64%, không phát hiện Escherichia coli sinh ESBL trên thịt.
Thử nghiệm kháng sinh đồ 46 chủng Escherichia coli sinh ESBL nhạy cảm với
amikacin 100%, fosfomycin 95,65% và doxycylin 84,78%. Đề kháng cao với
ampicillin 100%, cefuroxime 95,65%, cefaclor, gentamycin, streptomycin,
trimethoprim-sulfamethoxazole 97,83%, kanamycin 78,26%, ofloxacin 93,48%,
norfloxacin 91,3%. Các chủng Escherichia coli ESBL cùng lúc đề kháng từ 3 đến
11 loại kháng sinh là 100% (46/46) với 11 kiểu hình đa kháng. Trong đó kháng
cùng lúc 3 loại kháng sinh chiếm 2,17%, kháng 7 loại chiếm 6,52%, kháng 8 loại
17,39%, kháng 9 loại 30,44%, kháng 10 loại 32,61%, kháng 11 loại 10,87%.

v

MỤC LỤC
TRANG TỰA i
TRANG DUYỆT …ii
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM LƢỢC iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH SÁCH BẢNG viii
DANH SÁCH HÌNH ix
CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1. Vi khuẩn Escherichia coli 2
2.1.1 Đặc điểm hình thái 2
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 2
2.1.3 Đặc tính sinh hóa 3

2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh 4
2.2 Kháng sinh nhóm beta- lactam 5
2.2.1 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam 5
2.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam 5
2.2.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh 5
2.3 Men beta- lactamase phổ rộng 6
2.3.1 Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli sinh ESBL 6
2.3.2 Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn E. coli sinh ESBL 6
2.4. Những nghiên cứu vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên thế giới 8
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 11
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 11
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu 11
3.1.2 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 11
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 11
3.2.2 Phân lập vi khuẩn E. coli sinh ESBL 12
3.2.3 Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ 14
vi

3.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 15
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên gà ở huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc
Trăng. 16
4.2 Kết quả sự hiện diện E.coli sinh ESBL trên cơ quan phủ tạng và phân 17
4.3. Kết quả khảo sát tính nhạy cảm của vi khuẩn E. coli đối với một số loại
kháng sinh 19
4.4 Kết quả đa kháng của vi khuẩn E. coli sinh ESBL đối với một số loại kháng
sinh 21
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 23
5.1 Kết luận 23

5.2 Đề nghị 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO 24
PHỤ CHƢƠNG 27

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Chữ viết đầy đủ
CSLI
Clinical and Laboratory Standards Institute
E. coli
Escherichia coli
ESBL
Extended spectrum beta lactamase
EMB
Eosin Methylene Blue
IMViC
Indole, Methy Red, Voges prokauer, Citrate
LT
Heat Labile
MC
MacConkey Agar
MHA
Mueller – Hinton Agar
MR
Methyl Red
NA
Nutrient Agar
PBP

Penicillin – binding protein
ST
Heat Stable
VP
Voges ProsKauer











viii

DANH SÁCH BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
3.1
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
12
3.2
Tiêu chuẩn phân tích kết quả đƣờng kính vô khuẩn của kháng
sinh (CLSI, 2014)
15
4.1

Tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL trên gà khỏe ở huyện Mỹ Tú

16
4.2
Tỉ lệ dƣơng tính E. coli ESBL trên cơ quan gan, thịt, phổi và
mẫu phân
17
4.3
Tỉ lệ kháng của vi khuẩn E. coli ESBL
19
4.4
Tỉ lệ đa kháng và kiều kháng của vi khuẩn E. coli ESBL với
kháng sinh của vi khuẩn E. coli ESBL
21


ix

DANH SÁCH HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1
Vi khuẩn E. coli dƣới kính hiển vi (X=10µm)
2
2
Vi khuẩn E. coli trên môi trƣờng MC
12
3
Sinh hóa xác định E. coli

12
4
Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
13

1

CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi gà công
nghiệp nói riêng đang khẳng định vai trò hết sức quan trọng vào sự tăng trƣởng
chung của đất nƣớc, chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp. Chăn
nuôi gà công nghiệp không chỉ dừng lại ở tập quán sản xuất đơn thuần, mà ngày
càng đƣợc ngƣời chăn nuôi chú ý đầu tƣ, áp dụng tiến bộ khoa học vào sản xuất để
nâng cao năng suất, chất lƣợng.
Sóc Trăng là tỉnh có nhiều tiềm năng lợi thế về điều kiện tự nhiên, kinh tế phù hợp
để phát triển chăn nuôi gà công nghiệp. Theo kết quả điều tra chăn nuôi thời điểm
1/4/2013 toàn tỉnh có 4,06 triệu con gia cầm, trong đó, đàn gà hiện có 2,7 triệu con,
chiếm 68,28% tổng đàn gia cầm, tăng 6,66% so với cùng thời điểm năm trƣớc
(Hoàng Thọ, 2013). Tuy nhiên, việc phát triển nhanh chóng đồng thời cũng làm
tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh, ảnh hƣởng không nhỏ tới năng suất và hiệu quả
chăn nuôi. Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), hầu hết các loài gia cầm ở mọi lứa tuổi
đều mẫn cảm với vi khuẩn E. coli . Trong các bệnh nhiễm trùng trên gà thì E.coli là
bệnh phổ biến nhất, xảy ra ở mức độ ngày càng tăng và có thể trở thành một vấn
nạn trong ngành công nghiệp chăn nuôi gia cầm (Võ Thị Trà An, 2012).
Để đối phó với dịch bệnh do E. coli gây ra thì kháng sinh là lựa chọn hàng đầu và
đã đem lại nhiều thành công trong điều trị. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi kháng
sinh đã vô tình tạo ra áp lực chọn lọc để vi khuẩn E. coli có khả năng kháng lại một
số loại kháng sinh bằng cách sinh men beta- lactam. Những đối tƣợng vật nuôi có
áp lực sử dụng kháng sinh nhiều nhƣ gà thì vi khuẩn gây bệnh hiện diện trên gà
càng có khả năng kháng với kháng sinh cao hơn vi khuẩn hiện diện trên các loại vật

nuôi khác. Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị nhiễm
trùng, lây truyền qua nhiều thế hệ, hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh
nhƣng đề kháng kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để
truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác (Võ Thị Trà An, 2007). Hiện tƣợng
kháng thuốc của E. coli ở gia cầm là do kháng sinh đƣợc bổ sung thƣờng xuyên vào
thức ăn và nƣớc uống để phòng trị bệnh, cũng nhƣ việc sử dụng kháng sinh không
hợp lí trong chăn nuôi không theo khuyến cáo (Đỗ Võ Anh Khoa và Lƣu Hữu
Mãnh, 2012).
Mỹ Tú là một trong những huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng tập trung nhiều cơ sở chăn
nuôi gà công nghiệp qui mô lớn. Tuy nhiên chƣa có những nghiên cứu về tỉ lệ
E. coli sinh ESBL trên những trang trại gà của huyện, do đó “Khảo sát sự lƣu
hành của vi khuẩn E. coli sinh beta- lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một
số trại gà thuộc huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng” đƣợc thực hiện.
Mục tiêu đề tài:
- Xác định tỉ lệ E.coli ESBL dƣơng tính trên đàn gà khỏe nuôi công nghiệp tại
huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng.
- Thử tính nhạy cảm vi khuẩn E. coli sinh ESBL với một số loại kháng sinh.


2

CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1. Vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy
năm 1885 và đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa Đức.
Vi khuẩn E. coli thuộc chi Escherichia họ Anterobacteriaceae, họ vi khuẩn thƣờng
trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh
thƣờng trực đƣờng tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đƣờng ruột và ở các
cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997). Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), E. coli đƣợc thải
qua phân với số lƣợng lớn, hầu hết các loài gia cầm đều mẫn cảm với vi khuẩn

E. coli.
Theo P. J. Quinn et al. (1994), E. coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn
tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nƣớc, ngoài
tự nhiên.
Các loài E. coli hiện diện rộng rãi trong môi trƣờng bị ô nhiễm phân hay chất thải
hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trƣờng. Gần đây ngƣời ta còn chứng
minh đƣợc rằng E. coli cũng hiện diện ở những vùng nƣớc ấm, không bị ô nhiễm
chất hữu cơ. Các dòng E. coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đƣờng tiêu
hóa. (Trần Minh Tùng, 2010)
2.1.1 Đặc điểm hình thái
E. coli là trực khuẩn ngắn, Gram âm, có hình dạng đồng nhất và không hình thành
nha bào. Kích thƣớc trung bình từ 2 – 3µm x 0,6µm, phần lớn E. coli di động và có
lông roi quanh thân (Hồ Thị Việt Thu, 2012). Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể
bắt màu đều hoặc sẩm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn. Nếu cố định bằng axit
osmic rồi quan sát dƣới kính hiển vi thấy tế bào E. coli có nhân đó là một khối nằm
trong nguyên chất màu sáng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
Hình 1 Vi khuẩn E. coli dƣới kính hiển vi (X=10µm)



3

2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy
E. coli là trực khuẩn yếm khí và hiếu khí tùy tiện, có thể sống đƣợc ở nhiệt độ từ 5-
40
0
C, nhiệt độ thích hợp là 37
0
C, pH thích hợp là 7,2- 7,4 phát triển đƣợc ở pH 5,5-
8,0 (Lƣu Hữu Mãnh, 2010).

Theo Nguyễn Ngọc Hải, (2012) E. coli phát triển dễ dàng trên môi trƣờng nuôi cấy
thông thƣờng ở 37
0
C .Trên môi trƣờng MacConkey, Endo, EMB (Eosin Methylen
Blue) E. coli hình thành nên khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt với các vi khuẩn
khác.
Trên môi trƣờng MacConkey, vi khuẩn lên men đƣờng lactose và hình thành những
khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy. Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc
màu đỏ có ánh kim hoặc không có ánh kim trên môi trƣờng Endo, khuẩn lạc có màu
đen tím trên môi trƣờng EMB (Lê Văn Việt Mẫn, 2006).
Môi trƣờng Mueller-Hinton Agar là môi trƣờng trong, dùng cho thử nghiệm tính
nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trƣờng cũng thƣờng đƣợc dùng để thử
nghiệm sự thuỷ phân tinh bột.
Môi trƣờng NA (Nutrient Agar) thƣờng đƣợc dùng làm môi trƣờng lƣu giữ chủng.
sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ƣớt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đƣờng
kính từ 2 – 3 mm. Nuôi lâu khuẩn lạc gần nâu nhạt và phát triển rộng ra.
2.1.3 Đặc tính sinh hóa
E. coli có khả năng lên men đƣờng fructoz, glucose, levulo, galactoz, lactose,
mantose, mannitol, xylose, glycerol, rhamnose, sorbitol và arabinose. Hầu hết các
chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đƣờng lactose nhanh và sinh hơi, đây là một đặc
điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E. coli và Sallmonella. E. coli không lên men
dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin. E. coli không sinh
H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên nitrate thành
nitrite (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
Theo Nguyễn Ngọc Hải (2011) để khẳng định E. coli với vi khuẩn đƣờng ruột khác,
ngƣời ta thƣờng sử dụng thử nghiệm IMViC với các phản ứng:
Môi trƣờng Trypton Water dùng để kiểm tra tính sinh indole của vi khuẩn, môi
trƣờng có tryptophan, E. coli nhờ có tryptophan sẽ ly giải tryptophan thành indole
khi nhỏ thuốc thử Kowacs vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện vòng đỏ thì
phản ứng dƣơng tính và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng

đỏ thì indole âm tính.
Môi trƣờng VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi
khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trƣờng. Ngƣợc lại, vi khuẩn không có
khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đƣờng kim cấy, môi trƣờng xung
quanh trong. Sau khi nhỏ thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trƣờng có
vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngƣợc lại, nếu trên bề mặt
môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton.
Tùy loại enzyme vi khuẩn có đƣợc mà quá trình lên men glucose sẽ cho ra sản
phẩm cuối cùng khác nhau, một trong số đó là aceton sẽ tạo phức hợp màu đỏ với
naphthol và KOH.
4

Môi trƣờng MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đƣờng của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt
môi trƣờng ít giọt thuốc thử Methel Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ xuất
hiện trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại.
Môi trƣờng Simmon Citrat Agar dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay
nguồn cacbon của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, vi khuẩn cho kết quả dƣơng tính
khi màu của môi trƣờng chuyển từ xanh lục sang xanh dƣơng và âm tính khi môi
trƣờng vẫn giữ màu xanh lá cây. Trong môi trƣờng simmon nguồn cacbon duy nhất
là citrate, vi khuẩn sử dụng citrate sẽ kiềm hóa môi trƣờng làm môi trƣờng đổi từ
xanh lục sang xanh lơ. E .coli không có khả năng sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon
duy nhất, môi trƣờng không đổi màu.
2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh
E. coli bị diệt ở 55
0
C trong 1 giờ, 60
0
C trong 15 - 30 phút, các chất sát trùng nhƣ
acid phenic, formol có thể bị diệt trong 5 phút. Đề kháng với sự sấy khô, 95% E.
coli bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ (Lê Văn Tạo, 2006).

Cấu trúc kháng nguyên của E. coli gồm kháng nguyên thân O (somatic), kháng
nguyên lông H (flagellar), kháng nguyên vỏ K (capsular):
Kháng nguyên O (kháng nguyên thân) đƣợc phân bố trong vách tế bào bao gồm
hỗn hợp lipid – polysaccharide – protein, lipid xác định độc tính colitoxin,
polysaccharid xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính kháng
nguyên (Đoàn Ngọc Tuấn, 2006).
Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ bọc) kháng nguyên giáp mô K (capsular
antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô trƣớc khi xâm lấn đƣờng tiêu hóa hay
đƣờng tiết niệu.
Kháng nguyên H (kháng nguyên lông) cấu tạo bởi protein và có tính chất không
chịu nhiệt khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng
kết H. Có ý nghĩa trong xác định giống loài vi khuẩn (Đoàn Ngọc Tuấn, 2006).
Độc tố gồm có hai loại: nội độc tố và ngoại độc tố, ngoại độc tố gồm hai loại: loại
chịu nhiệt Stabile toxin (ST) và loại không chịu nhiệt Labile toxin (LT).
Nội độc tố: gồm 2 loại Enterotoxin LT: không bền với nhiệt độ, LT gây hoạt hoá
adennylcylase trong tế bào biểu mô ruột, làm tăng lƣợng AMP (adenosine
monophosphate) vòng, ức chế tái hấp thụ Na+, hậu quả cuối cùng là tiêu chảy mất
nƣớc. Enterotoxin ST: bền với nhiệt gồm STa và STb không có tính kháng nguyên.
ST tác động lên ruột bằng sự hoạt hoá emzyme guaylate cyclate làm tăng GMP
(guanosine monophosphate) vòng dẫn đến kích thích bài tiết nƣớc muối gây tiêu
chảy.
Tính gây bệnh của E. coli đƣợc chia thành 2 loại: Trong đƣờng ruột và ngoài đƣờng
ruột. Trong đƣờng ruột gồm có ETEC (Enterotoxigenic E. coli), EIEC
(Enteroinvasive E. coli), EPEC (Enteropathogenic E. coli), EHEC
(Enterohemorrhagic E. coli), EAEC (Enteroaggregative E. coli), DAEC (Diffusely
adhering E. coli). Ngoài đƣờng ruột gồm MAEC (Meningitidis-associated E. coli),
UPEC (Uropathogenic E. coli)
5

2.2 Kháng sinh nhóm beta- lactam

Tất cả các kháng sinh nhóm beta- lactam đều có vòng beta- lactam trong cấu trúc
phân tử. Vòng beta- lactam có cấu trúc không gian hóa học 4 cạnh gồm 3 nguyên tử
C và một nguyên tử N.
2.2.1 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam
Theo Huỳnh Kim Diệu (2012) kháng sinh beta-lactam gồm các nhóm: penam,
penem, cephem và monobactam và nhóm ức chế men beta-lactamase không có hoạt
tính kháng khuẩn dùng phối hợp với các beta-lactams để có tác động trên beta-
lactamase. Đặc điểm chung của nhóm này là có một vòng beta-lactam. Nhóm beta-
lactams đƣợc sử dụng rộng rãi vì có phổ kháng khuẩn đa dạng và ít độc tính.
Một số kháng sinh thuộc nhóm penicillin: benzyl penicillin, phenoxypenicillin,
ampicillin, amoxicillin.
Phân nhóm cephalosporins gồm có:
Cephalosporin I: cefalotin, cefazolin, cefaclor, cephalexin.
Cephalosporin II: cefamendol, cefuroxim, cefoxitin.
Cephalosporin III: cefotaxim, cefixim, ceftriaxone, cefpodoxim, ceftiazidim.
2.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam
Các kháng sinh nhóm beta- lactam ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng
cách can thiệp vào các enzyme transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên kết
của chuỗi peptidoglycan. Các enzyme này liên kết với 1 nhóm protein gọi là PBP
(penicillin – binding protein) nằm ở bên ngoài màng nguyên sinh chất. Nhƣ vậy,
điểm tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam chính là PBP. Mức độ mẫn cảm
của vi khuẩn với một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mức độ gắn kết với
PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào và khả năng kháng đƣợc các enzyme beta-
lactam. Beta- lactam không chỉ ức chế những kết nối cuối cùng của peptidoglycan
trong tiến trình tổng hợp thành vi khuẩn mà còn gây tiết lipoteichoic acid tạo phản
ứng tự ly giải của vi khuẩn do sự hƣ hỏng peptidoglycan.
Beta - lactam có tác động sát khuẩn phụ thuộc thời gian, nghĩa là phải đảm bảo rằng
trong thời gian trị liệu nồng độ kháng sinh trong huyết tƣơng hoặc mô bào đạt trên
MIC. Tuy nhiên, do beta- lactam chỉ tác động lên vi khuẩn trong giai đoạn tăng
trƣởng (giai đoạn tổng hợp thành), ở nồng độ quá cao trên mức nồng độ sát khuẩn

tốt nhất sẽ gây hiệu ứng Eagle (hiệu ứng ngƣợc), nghĩa là giảm khả năng sát khuẩn.
Đây là một khái niệm quan trọng để tránh sử dụng quá liều kháng sinh nhóm này
(Võ Thị Trà An, 2010).
2.2.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh
Theo Võ Thị Trà An, (2010) vi khuẩn kháng kháng sinh nhờ vào các cơ chế chủ yếu
sau: sản xuất enzym làm vô hoạt kháng sinh; tạo ra enzym thay thế enzym mà
kháng sinh tác động vào; đột biến hoặc sửa đổi ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết
của kháng sinh với điểm tiếp nhận; giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn,
đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào
6

giảm. Khi gen kháng thuốc của vi khuẩn nằm trên nhiễm sắc thể thì sẽ có khả năng
bảo tồn sự đề kháng. Ngƣợc lại khi yếu tố di truyền nằm trên plasmid nhất là
plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn
khác của cùng loài hay khác loài. Từ đó sự kháng kháng sinh tăng dần lên trong
quần thể vi khuẩn.
2.3 Men beta- lactamase phổ rộng
Men beta- lactamase phổ rộng (ESBL) đƣợc tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại
Đức, thƣờng gặp trong các chủng vi khuẩn đƣờng ruột đặc biệt là E. coli, khi các
chủng vi khuẩn sinh ESBL thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều các
kháng sinh, đặc biệt là nhóm cephaslosporin. Đây là trở ngại thực sự trong điều trị
nhiễm trùng trực khuẩn Gram âm (Nguyễn Tuấn Minh, 2008).
Men beta- lactamase có thể đƣợc phân loại dựa vào khả năng thủy phân các cơ chất
thuộc kháng sinh beta- lactam và mức độ bị ức chế bởi acid clavulanic, nhƣng các
đột biến đơn giản có thể làm thay đổi sự phân loại này. Ví dụ TEM -1 là một
penicillinase đơn giản và hoạt động của chúng có thể bị ức chế bởi acid clavulanic
và tazobactam. Tuy nhiên, do đột biến điểm các enzyme TEM có phổ hoạt động
rộng hơn dẫn đến sự đề kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3. Sự bất hoạt của
aztreonam, ceftazidime, cefotaxime hoặc ceftriaxone đƣợc xem là chỉ thị cho sự
hiện diện của các men beta-lactamase có phổ rộng (Võ Thị Trà An, 2010).

2.3.1 Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli sinh ESBL
Theo Nguyễn Sâm (2012) các vi khuẩn sinh ESBL thƣờng đề kháng cao với nhiều
nhóm kháng sinh, các nguyên nhân chính đang đƣợc ghi nhận đó là :
Các ESBL thƣờng đƣợc mã hóa qua trung gian plasmide các gen đề kháng kháng
sinh thƣờng liên kết theo nhóm, dẫn đến gen đề kháng cùng bị đột biến với các
kháng sinh nhóm khác. Khi đã đề kháng kháng sinh do ESBL sẽ có sự thay thế
kháng sinh điều trị mới dẫn tới tăng đột biến cảm ứng tạo gen đề kháng kháng sinh
các nhóm kháng sinh thay thế nhiều hơn các vi khuẩn thông thƣờng. Vi khuẩn sinh
ESBL còn có khả năng đề kháng chéo với các nhóm kháng sinh khác.
Nhƣ vậy, nhìn từ lịch sử phát hiện cũng nhƣ các đặc điểm phân loại và cơ chế đề
kháng kháng sinh thì bản chất của vi khuẩn sinh ESBL sẽ có những đặc điểm sau.
Gen mã hóa ESBL nằm trên plasmide do đột biến từ các gen beta- lactam cổ điển
nhƣ TEM-1, SHV-1. ESBL sinh ra do đột biến cảm ứng từ việc sử dụng các
cephalosporin phổ rộng thế hệ thứ 3. Vi khuẩn sinh ESBL kháng hầu hết kháng sinh
beta- lactam kể cả cephalosporin thế hệ 3, 4 và aztreonam. Kháng chéo kèm với các
kháng sinh nhóm aminoglycosides, fluoroquinolones và nhiều kháng sinh khác. Tuy
nhiên, còn nhạy cảm với các beta- lactam kết hợp chất ức chế, nhạy cảm
carbapenem, cephamicins, temocillin các nhóm kháng sinh có cấu trúc tƣơng
tự nhau.
2.3.2 Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn E. coli sinh ESBL
Theo Phạm Hùng Vân (2009), Tạ Văn Ngọc Đức (2007) đƣợc trích dẫn bởi Hà Vũ
Minh Trang (2012), nguyên tắc chung để phát hiện vi khuẩn sinh men beta-
7

lactamase dựa trên chất ức chế men beta lactamase. Một acid clavulanic kết hợp với
một oxymino- cephalosphorin nhƣ ceftazidime, cefotaxim.
Phương pháp xét nghiệm đĩa kết hợp (Combination Disk Test- CDT)
Phƣơng pháp này dựa trên sự so sánh đƣờng kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh
oxymino- cephalosphorin khi không có và có kết hợp với acid clavulanic. Hội đồng
quốc gia về các tiêu chuẩn cận lâm sàng đề nghị dùng cả 2 loại kháng sinh

cefotazim và ceftazidime cho xét nghiệm này. Thêm 10µg acid clavulanic vào đĩa
kháng sinh oxymino- cephalosphorin, nếu có sự gia tăng lớn hơn 5mm đƣờng kính
vòng vô khuẩn so với đĩa kháng sinh oxymino-cephalosphorin không có acid
clavulanic thì xét nghiệm dƣơng tính, xác nhận có sự sinh men ESBL của vi khuẩn.
Ngoài ra theo Nguyễn Sâm (2009), một số phƣơng pháp khác nhƣ phƣơng pháp
ChromID ESBL agar, phƣơng pháp E – test, phƣơng pháp Vitek ESBL test, phƣơng
pháp Micro scan panels .
ChromID ESBL agar
Môi trƣờng chứa kháng sinh cefpodoxime và chất màu. Chất màu đƣợc thêm
vào để dễ dàng phát hiện các phản ứng do enzyme của vi khuẩn nếu có trong môi
trƣờng. Vì vậy có thể đồng thời vừa định danh vi khuẩn vừa phát hiện vi khuẩn
đề kháng. Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime và có khả
năng phát triển trên môi trƣờng ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có
màu sắc khác nhau, đặc trƣng cho một số loài vi khuẩn.
Ƣu điểm: dễ dàng tiến hành, giá thành rẻ dễ triển khai ở tất cả các cơ sở vi sinh lâm
sàng có nuôi cấy vi khuẩn đặc biệt nhanh chóng sàng lọc các vi khuẩn
đƣờng ruột sinh ESBL đồng thời định danh sơ bộ đƣợc một số loài vi
khuẩn nhƣ E. coli và K. pneumoniae.
Hạn chế: một số vi khuẩn kháng kháng sinh cefpodoxime không phải do sinh
ESBL mà theo cơ chế khác hoặc sinh cephalosporinase, penicillinase có thể mọc
trên môi trƣờng này. Một số vi khuẩn màu sắc khuẩn lạc không điển hình, không
màu hoặc nhiều loài vi khuẩn có thể có màu sắc khuẩn lạc giống nhau. Vi khuẩn
sinh ESBL chậm hoặc yếu có thể không mọc trên môi truờng này sau 18 - 48h nuôi
cấy.
Phương pháp đĩa đôi (double disk diffusion test)
Các ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporin phổ rộng nhƣng bị ức chế bởi
acid clavulanic, dẫn đến xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh
giấy kháng sinh AMC và mở rộng vùng ức chế giao thoa giữa AMC với
CAZ và CTX .
Ƣu điểm: phƣơng pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, độ nhạy và đặc hiệu cao > 95% .

Nhƣợc điểm: khó lựa chọn đƣợc khoảng cách tối ƣu giữa 2 khoanh giấy ở
từng vi khuẩn, âm tính giả với các ESBL hoạt tính thấp, không phát hiện đƣợc các
vi khuẩn P.aeruginosa và một số vi khuẩn có ESBL giảm ức chế acid
clavulanic thƣờng gặp nhƣ ESBL type OXA

8

Băng giấy E- test ESBL
ESBL bị ức chế bởi acid clavulanic nên E. coli sinh ESBL sẽ có vùng ức chế
vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp acid clavulanic, phần còn lại không
có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi khuẩn nhỏ
hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh ức chế hoặc chỉ bị
ức chế ở nồng độ kháng sinh cao. Vi khuẩn sinh ESBL (+) sẽ có vùng ức chế hình
ellip, hoặc phần kết thúc nồng độ MIC biến mất tạo thành bóng ellip hoặc
vòng bị biến dạng của hình ellip và nồng độ MIC phía kháng sinh không kết hợp
clavulanic acid tăng gấp ≥ 8 lần phần còn lại .
Ƣu điểm: dễ tiến hành, có độ nhạy và đặc hiệu cao tới 100%, đây cũng là phƣơng
pháp chính xác nhất hiện nay đƣợc dùng để khẳng định ESBL (+).
Nhƣợc điểm: giá thành cao nên khó tiến hành rộng rãi. Trong một số trƣờng
hợp phƣơng pháp này cho kết quả không xác định do các trƣờng hợp IRT enzyme
(inhibitor resistant TEM) hoặc AmpC enzymes hoặc vi khuẩn kháng beta-lactam
theo cơ chế khác.
Vitek ESBL Card
Phƣơng pháp này dùng card MIC có chứa cephalosporin nồng độ bắt đầu từ
0,5µg/ml trộn với acid clavulanic nồng độ 4µg/ml. Kết quả nếu vi khuẩn có
ESBL sẽ cho MIC cephalosporin ≥ 8µg/ml, phƣơng pháp này có độ nhạy và
đặc hiệu không cao lắm (khoảng 90%).
Micro scan panels
Tấm panel nhựa có 4 giếng chứa môi trƣờng kháng sinh cephalosporin và
cephalosporin/acid clavulanic, cấy vi khuẩn vào các giếng để tủ ấm 18-24h đọc kết

quả, nếu ESBL (+) vi khuẩn sẽ không mọc ở giếng có cephalosporin kết hợp
clavulanic acid.
2.4. Những nghiên cứu vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên thế giới
Một nghiên cứu của Duru Carissa et al, 2013 đƣợc thực hiện tại Owerri, Nigeria,
nhằm xác định sự hiện diện của E. coli sinh ESBL từ các trang trại chăn nuôi gia
cầm bằng phƣơng pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn đối
với kháng sinh. Kết quả có 22,2% E. coli ESBL từ 45 E. coli dƣơng tính phân lập
từ 159 mẫu phân của gà tây, gà giò và gà địa phƣơng. Các E. coli ESBL phân lập từ
E. coli hoàn toàn nhạy cảm với imipenem, nhƣng kháng với cefepime, ceftriaxone,
nalidixic acid, cefotaxime, ceftazidime, ampicillin, sulphamethoxazole-
trimethoprim và ticarcillin.
Annemieke Smet et al, 2008, nghiên cứu sự đa dạng của ESBL và Class C beta-
lactame phân lập trên ổ nhớp gà từ các trại gà thịt tại Belgian. Trong 489 mẫu có
295 mẫu dƣơng tính với E. coli, trong đó có 45% (133/295) E. coli ESBL. Ngoài ra,
kết quả còn cho thấy các chủng vi khuẩn E. coli ESBL kháng với: gentamycine
7,5%, kanamycine 4%, streptomycine 30,2%, trimethoprim 64,4%, tetracyline
48,1%. Kiểm tra sự đa kháng: 4% kháng trên 8 loại kháng sinh, 76% kháng từ 1-2
kháng sinh và 5% kháng với 1 kháng sinh bổ sung.
9

Kola et al, 2012 nghiên cứu tỷ lệ beta-lactamase ở vi khuẩn đƣờng ruột trong thịt gà
Đức. Nghiên cứu thực hiện trên 399 mẫu thịt gà lấy từ siêu thị, bốn cửa hàng thực
phẩm và cửa hàng bán thịt ở Berlin và Greifswald. Kết quả tổng cộng có 185 chủng
ESBL phân lập đƣợc từ 175 mẫu. Phần lớn các chủng E. coli sinh ESBL và 73,0%
các E. coli ESBL kháng với tetracycline, 35,7% với trimoxazole và 7,6% với
ciprofloxacin.
Nghiên cứu của Felix Reich et al, 2010 tại Đức, nghiên cứu phân tích trên 70 mẫu
thân thịt và 51 mẫu manh tràng gà cho kết quả tƣơng ứng 88,6% và 72,5% E. coli
sinh ESBL.
Nghiên cứu khác tại Bỉ của Garcia-Graells et al. (2013), thực hiện trên 396 mẫu thịt

gia cầm để xác định tỉ lệ E. coli dƣơng tính với ESBL. Kết quả 94,2% (374/396)
dƣơng tính với E. coli và 42% (156/374) đề kháng với cefotaxime. 273 chủng E.
coli từ 156 mẫu thịt có E. coli dƣơng tính đƣợc xác định sự hiện diện E. coli sinh
ESBL bằng phƣơng pháp đĩa đôi kết quả có 80,6% (220/273) dƣơng tính với ESBL,
18,3%(50/273) thuộc kiểu hình AmpC .
Nghiên cứu của Ilse Overdevest et al, 2009 tại Hà Lan về gen E. coli ESBL trên
ngƣời và gà. Khảo sát trên 262 mẫu thịt tƣơi bao gồm 3 nhóm thịt chính: gà, bò,
lợn, trong đó có 89 mẫu thịt gà, 85 mẫu thịt bò, 57 mẫu thịt heo. Qua phân tích 89
mẫu thịt gà thì có 68 (76,8%) mẫu chứa E. coli ESBL. Kết quả giải trình tự gen mã
hóa men beta- lactamase phổ rộng trên ngƣời và gà có sự tƣơng đồng.
Nghiên cứu của Yuan et al, 2008 tại Hà Nam, Trung Quốc. Thực hiện trên 51 mẫu
bệnh phẩm gan gà lấy từ 14 trang trại. Kết quả 60,8% (31/51) E. coli sinh ESBL.
Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ kháng với các loại kháng sinh: gentamycine
87,1%, amikacin 80,6%.
Nghiên cứu của Leverstein- van Hall et al, 2011 trên 98 mẫu thịt gà bán lẻ tại 12
cửa hàng ở Utrecht, Hà Lan năm 2010 và 516 mẫu bệnh phẩm ngƣời từ 31 phòng
thí nghiệm thu thập đƣợc trong khoảng thời gian 3 tháng trong năm 2009. Kết quả
có 94% mẫu thịt gà chứa E.coli ESBL và có 39% thuộc các kiểu gen đƣợc tìm thấy
ở ngƣời. Những phát hiện này cho thấy việc truyền các gen E. coli sinh ESBL từ gia
cầm sang ngƣời rất có thể thông qua chuổi thức ăn.
Theo nghiên cứu của Gundogan et al, 2013, phân lập 75 mẫu từ thịt bê, đùi gà, sữa
tƣơi, phô mai và kem mỗi loại 15 mẫu ở Thổ Nhĩ Kì. Kết quả 45 mẫu dƣơng tính
với E. coli, trong đó 100% (15) mẫu đùi gà dƣơng tính với E. coli, 9 mẫu thịt bê, 7
mẫu sữa tƣơi, 11 mẫu phô mai và 3 mẫu kem nhiễm E. coli. Trong 45 mẫu E. coli
phân lập có 20 (44,4%) dƣơng tính với E. coli ESBL . Trong số 20 E. coli ESBL có
10 (50%) là từ thịt đùi gà, 5 (25%) là từ thịt bê băm nhỏ, 2 (10%) từ phô mai, 2
(10%) từ sữa và 1 (5%) là từ các mẫu kem. Tỉ lệ E. coli ESBL phân lập trên đùi gà
nói riêng là 66,67%(10/15).
E. coli phân lập kháng với ampicillin (100%), tetracycline (77,8%), cefotaxime
(33,3%), ciprofloxacin (31,1%), aztroenam (28,9%), ceftazidime (8,9%),

ceftriaxone (8,9%), amoxcillin/acid clavulanic (6,7%), gentamicin (6,7%) và
amikacin (4,4%).
10

Ba mƣơi (66,7%) E. coli phân lập kháng với một hoặc hai kháng sinh, và khả năng
kháng ba đến mƣời bốn kháng sinh là 37,8% .
Stefan Börjesson et al.(2013) 44% (44/100) các mẫu thịt gà ở thụy điển phát hiện
E. coli ESBL ở Thụy Điển, gà hiếm khi điều trị bằng thuốc kháng sinh và không sử
dụng các cephalosporin trong năm 2010 nhƣng đáng ngạc nhiên khi 34% gà Thụy
Điển đã đƣợc xác định là mang E. coli ESBL năm 2010. E. coli phân lập từ thịt gà
nhập khẩu từ Đan Mạch và Phần Lan là tƣơng đồng nhau và liên quan chặt chẽ đến
phân lập từ Thụy Điển. Điều đó cho thấy sự xuất hiện của E. coli sinh ESBL trong
gà Thụy Điển là do lây truyền dọc từ nhập khẩu con giống.
Delphine Girlich et al. (2007), trong 112 mẫu manh tràng gia cầm khỏe mạnh tại cơ
sở giết mổ của bảy huyện ở Pháp vào năm 2005, trong đó có 10,7% (12/112) mẫu
dƣơng tính với E. coli ESBL.
Cindy et al. (2013) đã nghiên cứu về sự hiện diện của E. coli ESBL/ AmpC trên gà
thịt và thịt gà. Mẫu bệnh phẩm ổ nhớp gà 1 ngày tuổi, 18 và 31 tuần tuổi, gà thịt từ
giống gà GPS và mẫu gạt môi trƣờng đƣợc kiểm tra. Kết quả tất cả các mẫu kiểm
tra đều dƣơng tính với E. coli ESBL. Nghiên cứu đƣa ra đề nghị để giảm thiểu tỉ lệ
E. coli sinh ESBL/ AmpC nên tập trung vào việc ngăn chặn truyền ngang và truyền
dọc, đặc biệt là chuồng trại chăn nuôi.

11

CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 8-2014 đến tháng 12-2014.
Địa điểm lấy mẫu: tại 2 trại gà của huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng
Địa điểm xét nghiệm: tại Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng
Dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ
Đối tƣợng xét nghiệm: gà thịt xuất chuồng và gà đẻ.
3.1.2 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm
Dụng cụ lấy mẫu: Bình tam giác, cốc, ống đong hình trụ 50, 100, 500 ml,
pipetman, ống nghiệm, hộp đĩa petri, que cấy vòng, đèn cồn, kéo cắt, khay kim loại,
bơm, chai nấu môi trƣờng.
Cân phân tích, nồi hấp autoclave, microwave, tủ sấy,tủ cấy an toàn sinh học, tủ ấm
37°C,tủ lạnh và một số dụng cụ khác.
Hóa chất: Cồn, nƣớc cất, Nutrient Agar (Merck KgaA, Germany), MacConkey
Agar (Merck KgaA, Germany), Nutrient Broth (Merck KgaA, Germany), Voges
Proskauer (Merck KgaA, Germany), Simmons Citrate Agar (Merck KgaA,
Germany), Methyl Red (Merck KgaA, Germany), Trypton Water (Merck KgaA,

Germany), MHA (Merck KgaA, Germany).
Kháng sinh sử dụng
Ceftazidime 30µg , ceftazidime 30µg/clavulanic acid 10µg, cefotaxime 30µg,
cefotaxime 30µg/clavulanic acid 10µg, ampicilline 10µg, cefuroxime 30µg,
cefaclor 30µg, gentamycine 10µg, streptomycine 10µg, kanamycin 30µg, amikacin
30µg, tetracyline 30µg, doxycyline 30µg, norfloxacin 10µg, fosfomycin 200µg,
trimethoprim 5µg, ofloxacin 5µg của Nam Khoa.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Đề tài khảo sát 22 con gà khỏe tại 2 trại gà tại huyện Mỹ Tú, trong đó có 11 gà đẻ
và 11 gà thịt. Mỗi gà lấy 4 loại mẫu gồm gan, thịt, phổi và phân.
Mẫu phân gà đƣợc lấy trực tiếp từ lỗ huyệt. Dùng bông thấm cồn 70
o
sát trùng xung
quanh hậu môn, đƣa que tăm bông khô, vô trùng vào trong lỗ huyệt, lấy nhẹ phân
sau đó cho tăm bông vào trong ống nghiệm chứa môi trƣờng Cary-Blair để bảo
quản mẫu, ghi kí hiệu mẫu và trữ lạnh để vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Mẫu phủ tạng gồm: gan, thịt, phổi trƣớc khi lấy mẫu sát trùng vị trí lấy mẫu bằng
cồn 70
0
dùng kéo vô trùng cắt nhẹ bề mặt phủ tạng tại vị trí đã vô trùng, dùng kẹp
vô trùng lấy một ít mô bên trong cho vào túi nylon vô trùng, ghi kí hiệu mẫu trữ
lạnh để vận chuyển về phòng thí nghiệm.

12

3.2.2 Phân lập vi khuẩn E. coli sinh ESBL
Phƣơng pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn E. coli ESBL đƣợc thực hiện bằng
phƣơng pháp đĩa kết hợp, so sánh đƣờng kính vòng vô khuẩn với đƣờng kính vòng
ức chế chuẩn theo CLSI, (2014).

Mẫu đƣợc cấy lên môi trƣờng MC có bổ sung kháng sinh ceftazidime 2mg/l, sau đó
đem ủ ở 37
0
C trong 24 giờ. Sau 24 giờ vi khuẩn mọc trên môi trƣờng MC, chọn các
khuẩn lạc to, tròn, màu hồng đậm, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2-3mm điển
hình cấy sang môi trƣờng NA ủ 37
0
C trong 24 giờ. Sau đó kiểm tra đặc tính sinh
hóa của E. coli gồm các thử nghiệm sau.
Hình 2 Vi khuẩn E. coli trên Hình 3 Sinh hóa xác định E. coli
môi trƣờng MC
Bảng 3.1. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
Thử nghiệm
Môi trƣờng
Kết quả

Indole
Canh Tryptone
Dƣơng tính
Methyl Red
MR – VP
Dƣơng tính
Voges prokauer
MR – VP
Âm tính
Citrate
Simmon Citrate Agar
Âm tính
Thử nghiệm Indol: cấy vi khuẩn vào môi trƣờng canh trypton, ủ 24 giờ ở 37
0

C, nhỏ
vài giọt thuốc thử Kovac’s vào canh khuẩn. Phản ứng dƣơng tính khi có vòng đỏ
xuất hiện trên bề mặt, phản ứng âm tính khi không có vòng đỏ này.
Thử nghiệm Methyl Red: nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl red vào canh khuẩn trong
môi trƣờng MR-VP, lắc đều. Phản ứng dƣơng tính khi canh khuẩn chuyển sang màu
đỏ, phản ứng âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu.
13

Thử nghiệm Voges prokauer: cho 0,2 – 0,3ml KOH 40% vào canh khuẩn MR-VP,
lắc mạnh. Sau đó cho 0,2ml thuốc thử α – naphthol 5%, lắc mạnh. Quan sát trong 1
giờ, phản ứng dƣơng tính khi canh chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính khi canh
khuẩn không chuyển màu.

Mẫu

MC bổ sung kháng sinh ceftazidime 2mg/l

Cấy lên môi trƣờng NA

Thử nghiệm sinh hóa

Indol(+) MR(+) VP(-) Critrate(-)

Khẳng định E. coli


Cấy vi khuẩn lên môi trƣờng MHA, đặt
kháng sinh ceftazidim, ceftazidim +clavulanic acid,
cefotaxim, cefotaxim + clavulanic acid


Khẳng định E. coli ESBL nếu đƣờng kính vòng vô khuẩn
ceftazidim/ clavulanic acid – ceftazidim hoặc

cefotaxim/ clavulanic acid – cefotaxim ≥5mm

Hình 3 Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli ESBL

37
0
C/24 giờ
37
0
C/24 giờ
Tạo huyễn dịch vi khuẩn
(nồng độ 10
8
vi khuẩn/ml)
37
0
C/18 - 20 giờ
14


Thử nghiệm Citrate: Quan sát trên môi trƣờng simmon citrate agar, phản ứng dƣơng
tính khi môi trƣờng có xuất hiện sinh khối và chuyển sang màu xanh da trời. Phản
ứng âm tính khi môi trƣờng không có sinh khối và không có chuyển màu.
Sau khi khẳng định là vi khuẩn E. coli ta dùng que cấy lấy 1 ít khuẩn lạc cho vào
9ml ống nƣớc muối sinh lý vô trùng và trộn đều. Độ đục của huyễn dịch vi khuẩn
đƣợc so sánh với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5 nếu huyễn dịch vi khuẩn không có
cùng độ đục với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách
cho thêm nƣớc muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn, dùng tăm bông thấm huyễn
dịch cấy đều lên mặt thạch MHA , sau đó đặt vào tủ ấm 15 phút trƣớc khi đặt kháng
sinh. Ta dùng kẹp đầu nhọn vô trùng đặt từng đĩa kháng sinh ceftazidime 30 µg,

ceftazidime 30 µg + acid clavulanic 10 µg, cefotaxime 30 µg, cefotaxime 30 µg
+acid clavulanic 10 µg lên mặt thạch sau đó ủ ở 37
0
C trong 18 – 20 giờ. Sau khi ủ
ấm lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo đƣờng kính vô khuẩn nếu đƣờng kính vòng
vô khuẩn của đĩa kháng sinh có acid clavulanic trừ đi đĩa kháng sinh không có acid
clavilanic lớn hơn hoặc bằng 5mm thì khẳng định là E. coli ESBL và ghi nhận kết
quả.
3.2.3 Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ
Kỹ thuật làm kháng sinh đồ: tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh đƣợc
kiểm tra bằng phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán của Kirby-Bauer (1966) sau khi ủ
16-18 giờ vi khuẩn sẽ mọc thành từng khóm mịn tiếp hợp nhau và vòng vô khuẩn là
một vòng tròn đồng nhất. Đơn vị thƣớc đo vòng vô khuẩn là mm. Kết luận mức độ
kháng của vi khuẩn theo CLSI (2014) ở ba mức: nhạy – trung gian – kháng.
Mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm trƣớc 1 ngày cần đƣợc cấy vào môi trƣờng thạch
NA. Ủ các đĩa thạch NA qua đêm ở 37
0
C. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc hòa
tan vào 9 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex.
Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ đƣợc so sánh với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5
dƣới nền giấy trắng có kẻ các vạch đen.
Dùng tăm bông vô trùng cấy đều huyễn dịch vi khuẩn lên mặt thạch MHA. Để khô
mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trƣớc khi đặt kháng
sinh.
Có thể sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa
thạch hoặc dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa thạch, ủ
ấm ở 37
0
C trong vòng 18-20 giờ.
So sánh kích thƣớc vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn,

sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm nhƣ là: nhạy cảm ,
trung bình và kháng .



15


Bảng 3.2 tiêu chuẩn phân tích kết quả đƣờng kính vô khuẩn của kháng sinh
(CLSI, 2014)

Đĩa kháng sinh

Hàm lƣợng
(µg)
Đƣờng kính(mm)
Nhạy
Trung gian
Kháng
≥

≤
Ampicillin (Am)
10
17
14 - 16
13
Cefuroxime (Cfx)
30
18

15 - 17
14
Cefaclor (Cf)
30
18
15 - 17
14
Gentamycin (Gm)
10
15
13 - 14
12
Amikacin (Ak)
30
17
15 - 16
14
Kanamycin (Km)
30
18
14 - 17
13
Tetracyline (Tc)
30
15
12 - 14
11
Doxycyline (Dc)
30
14

11 - 13
10
Norfloxacin (Nor)
10
17
13 - 16
12
Ofloxacin (Of)
5
16
13 - 15
12
Trimethoprim-
sulfamethoxazole (SXT)
1,25/23,75
16
11 - 15
10
Streptomycin (Str)
10
15
12 - 14
11
Fosfomycin (Fo)
200
16
13 - 15
12
3.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý kết quả bằng phần mềm Exel 2010 và phân tích thống kê bằng

phƣơng pháp Chi – quare test Minitab 16.