sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt từ chủng virus phân lập được trên địa bàn thành phố cần thơ

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
….  ….



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


Tên đề tài:
SẢN XUẤT KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS
VIÊM GAN VỊT TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN
LẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ
CẦN THƠ



Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU LÂM QUANG PHƯƠNG NAM
MSSV: 3102964
LỚP: THÚ Y – K36




Cần Thơ, 2014
ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
….  ….

Đề tài: Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt phân lập
được trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Do sinh viên Lâm Quang
Phương Nam thực hiện tại Cần Thơ từ tháng 06/2014 đến tháng 12/2014.


Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014 Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Duyệt bộ môn Duyệt giáo viên hướng dẫn




PGS.TS Hồ Thị Việt Thu




Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Duyệt khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những kết quả trình bày trong luận văn này chính là
nghiên cứu của bản thân tôi. Tất cả số liệu và kết quả hoàn toàn trung thực và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Tác giả luận văn




Lâm Quang Phương Nam

iv

LỜI CẢM TẠ

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người đã hết lòng dạy dỗ
nuôi nấng con nên người, luôn bên cạnh con trong những lúc gian khó nhất,
cùng con vượt qua biết bao nhiêu ghềnh thác trong cuộc đời mà con phải đối
mặt. Xin cảm ơn gia đình đã luôn là hậu phương vững chắc, là nguồn động lực
giúp con luôn phấn đấu không ngừng nghỉ.
Xin chân thành cảm ơn:
PGS.TS Hồ Thị Việt Thu đã hết lòng truyền đạt những kiến thức quý
báu, giúp đỡ và tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Quý thầy cô trường đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy, cô thuộc bộ
môn Thú Y và bộ môn Chăn Nuôi của khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng
Dụng trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt những năm theo học tại trường.
Anh Phạm Công Uẩn, anh Lê Trần Hoài Khanh, anh Nguyễn Minh Mẫn,
chị Huỳnh Ngọc Trang, chị Nguyễn Thị Minh Thuỳ đã hết lòng giúp đỡ và
cùng tôi chia sẽ những buồn vui, khó khăn trong suốt quá trình làm luận văn
này.
Các bạn trong và ngoài lớp Thú Y K36 đã giúp đỡ và động viên tôi trong
quá trình học tập cũng như trong cuộc sống.
Xin kính gửi đến quý thầy cô, người thân, anh chị em, bạn bè tôi lời chúc

sức khoẻ, thành công và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc.

Lâm Quang Phương Nam













v

MỤC LỤC Trang
TRANG PHỤ BÌA i
TRANG DUYỆT ii
LỜI CAM ĐOAN iii
LỜI CẢM TẠ iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH ix
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x
TÓM LƯỢC xii
CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Bệnh viêm gan vịt do virus 2
2.1.1 Lịch sử phân bố bệnh 2
2.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 2
2.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 3
2.1.4 Nguyên nhân gây bệnh 4
2.1.5 Đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt 5
2.1.5.1 Sức đề kháng 5
2.1.5.2 Biến dị của virus 5
2.1.6 Truyền nhiễm học 5
2.1.6.1 Loài mắc bệnh 5
2.1.6.2 Đường xâm nhập, cách lây lan và cơ chế sinh bệnh 6
2.1.7 Triệu chứng bệnh 6
2.1.8 Bệnh tích 7
2.1.8.1 Bệnh tích đại thể 7
2.1.8.2 Bệnh tích vi thể 7
2.1.9 Chuẩn đoán bệnh viêm gan vịt do virus 8
2.1.9.1 Dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh 8
2.1.9.2 Chuẩn đoán phân lập virus viêm gan vịt 8
2.1.9.3 Chuẩn đoán huyết thanh học 9
2.1.9.4 Chuẩn đoán phân biệt 10
2.1.9.5 Chuẩn đoán bằng phương pháp giám định phân tử 10
vi

2.1.10 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt 11
2.1.10.1 Miễn dịch thụ động 12
2.1.10.2 Miễn dịch chủ động 12
2.2 Kháng thể từ lòng đỏ trứng 12
2.2.1 Sự tấn công của virus 12
2.2.2 Vai trò của kháng thể 13
2.2.2.1 Liên kết với kháng nguyên 13

2.2.2.2 Hoạt hoá tế bào miễn dịch 13
2.2.3 Kháng thể IgY của gà 13
2.2.3.1 Sơ lược về IgY 13
2.2.3.2 Cấu trúc và chức năng 14
2.2.3.3 Đặc tính của IgY 15
2.2.3.4 Tính ưu việt của công nghệ sản xuất IgY trên gà 16
2.2.4 Phương pháp sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) bằng
cách gây miễn dịch cho gà mái 16
2.2.4.1 Những yếu tố ảnh hưởng tới sự sản xuất IgY 16
2.2.4.2 Hệ thống miễn dịch của gà 17
2.2.4.3 Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà 18
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1 Nội dung nghiên cứu 20
3.2 Phương tiện nghiên cứu 20
3.2.1 Thời gian 20
3.2.2 Địa điểm 20
3.2.3 Đối tượng nghiên cứu 20
3.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và sinh phẩm 20
3.3 Phương pháp nghiên cứu 21
3.3.1 Phân lập virus và định danh virus viêm gan vịt trên địa bàn
thành phố Cần Thơ 21
3.3.1.1 Phương pháp chọn và xử lý mẫu 21
3.3.1.2 Phương pháp giám định virus bằng RT-PCR 21
3.3.1.3 Phương pháp phân lập virus trên phôi vịt 23
3.3.2 Thí nghiệm chuẩn độ virus viêm gan vịt trên phôi bằng phương
pháp xác định liều gây chết 50% (ELD
50
)

24

vii

3.3.3 Sản xuất kháng thể viêm gan vịt do virus 25
3.3.3.1 Gây miễn dịch trên gà thí nghiệm 26
3.3.3.2 Thu hoạch trứng, lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể. 28
3.3.3.3 Phương pháp tách chiết và tinh sạchkháng thể từ lòng
đỏ trứng 29
3.3.4 Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong máu và trứng 31
3.3.5 Xử lý số liệu 33
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 34
4.1 Kết quả phân lập và giám định virus viêm gan vịt trên địa bàn
thành phố Cần Thơ 34
4.1.1 Kết quả giám định virus viêm gan vịt bằng phương pháp
RT-PCR 34
4.1.2 Kết quả phân lập virus viêm gan vit 35
4.2 Kết quả xác định liều gây chết 50% phôi vịt thí nghiệm 37
4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà 37
4.4 Sự truyền kháng thể trong máu vào trứng gà sau khi gây miễn dịch
với liều 10
4
ELD
50
42
4.5 Tỉ lệ đẻ của gà qua các tuần theo dõi 43
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
PHỤ LỤC 1 51
PHỤ LỤC 2 52
PHỤ LỤC 3 54

viii

DANH MỤC BẢNG












Bảng

Tên bảng Trang
3.1 Thành phần hoá chất sử dụng trong phản ứng RT-PCR chuyển
RNA thành cDNA
22

3.2 Thành phần của phản ứng PCR 22
3.3 Các trình tự mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR 23
3.4 Bố trí thí nghiệm tính liều ELD
50
của dịch virus viêm gan vịt trên
phôi
24
3.5 Quy trình tiêm thuốc và phòng bệnh cho gà đẻ 26
3.6 Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch cho gà 27
3.7 Quy trình tiêm kháng nguyên và lấy máu 28
4.1 Tỉ lệ phôi chết theo thời gian 35
4.2 Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt 35
4.3 Tỉ lệ phôi vịt chết ở các nồng độ virus 37
4.4 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch
với liều 10
4
ELD
50
qua mỗi tuần
37
4.5 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch
với liều 10
6
ELD
50
qua mỗi tuần
39
4.6 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch
với liều 10
8

ELD
50
qua mỗi tuần
40
4.7 Hiệu quả truyền kháng thể trong máu và trứng gà sau khi gây
miễn dịch với liều 10
4
ELD
50

42
4.8 Theo dõi tỉ lệ đẻ của gà qua các tuần thí nghiệm 43
ix

DANH MỤC HÌNH

Hình

Tên hình Trang
2.1 Vịt chết với tư thế đặc trưng (opisthotonus) 8
2.2 Gan, thận sưng, xuất huyết 8
2.3 Cấu trúc IgG của thỏ và IgY của gia cầm 15
2.4 Sự truyền kháng thể qua trứng 18
2.5 Phương pháp thẩm tích để loại muối 19
4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1,5% 34
4.2 Gan phôi xuất huyết 36
4.3 Da phôi xuất huyết, phôi phù đầu 36
4.4 Phôi phù nề, tích nước 36
4.5 A) Phôi bình thường
B) Phôi còi cọc
36
4.6 Biểu đồ kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều
virus 10
4
ELD
50

38
4.7 Biểu đồ kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều
virus 10
6
ELD
50

39
4.8 Biểu đồ kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều

virus 10
8
ELD
50

40
x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nguyên văn Nghĩa tiếng việt
AS Amoniumsulphate Muối amoniumsulphate
BHI Brain heart infusion Canh thang nước tim não
cDNA Complement deoxyribo nucleic
acid
Chuỗi deoxyribo nucleic acid bổ
sung
CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào
DHV-1 Duck hepatitis virus type 1 Virus viêm gan vịt type 1
DHV-2 Duck hepatitis virus type 2 Virus viêm gan vịt type 2
DHV-3 Duck hepatitis virus type 3 Virus viêm gan vịt type 3
DNA Deoxyribo nucleic acid Deoxyribo nucleic acid
DPBS Dulbecco phosphate buffered
saline
Muối đệm phosphate
DEF Duck embryo fibroblast Tế bào xơ phôi vịt
EDTA Ethylen dimine tetra acetic acid Ethylen dimine tetra acetic acid
ELD

50
Embryo lethal dose 50% Liều gây chết phôi 50%
Fab Fragment antigen binding Tiểu phần liên kết kháng
nguyên

Fc Fragment crystal Tiểu phần có khả năng kết tinh
IgY Egg yolk immunoglobulin Kháng thể lòng đỏ
IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch lớp G
IgA Immunoglobulin A Globulin miễn dịch lớp A
IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch lớp M
LD
50
Lethal dose 50% Liều gây chết 50%
MTTT Môi trường tăng trưởng
MTDT Môi trường duy trì
MEM Modified eagles medium Môi trường cần thiết tối thiểu
mRNA Messenger ribonucleic acid Ribonucleic acid thông tin
OIE Office iternationaldes eizooties Tổ chức thú y thế giới
PCR Polymerase cain raction Phản ứng khuếch đại gen
xi

PBS Phosphat buffered saline Phosphat buffered saline
RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic
RT-PCR Reverse transcription –
polymerase chain reaction
Kỹ thuật khuếch đại gen, phiên
mã ngược
SPF Specific-pathogen-free Không có mầm bệnh đặc hiệu
TCID
50

Tissue culture infective dose
50%
Liều gây chết 50% tế bào


























xii

TÓM LƯỢC
Đề tài “Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt từ chủng virus
phân lập được trên địa bàn thành phố Cần Thơ” được tiến hành từ tháng
06/2014 đến tháng 12/2014, nhằm phân lập, định danh virus viêm gan vịt trên
địa bàn thành phố Cần Thơ để làm nguồn giống điều chế kháng thể phòng, trị
bệnh viêm gan vịt. Bằng cách thu thập mẫu bệnh phẩm của 8 đàn vịt có biểu
hiện triệu chứng đặc trưng của bệnh, sau đó đưa mẫu về phòng thí nghiệm tiến
hành phân lập virus trên phôi vịt 12 ngày tuổi và cấy truyền virus trên môi
trường tế bào để thu dịch virus tiến hành định danh chủng virus viêm gan vịt
xuất hiện trên địa bàn thành phố Cần Thơ bằng phương pháp RT-PCR. Dịch
virus phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm sẽ được dùng làm kháng nguyên
gây miễn dịch cho gà mái đẻ để sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt
từ lòng đỏ trứng gà. Qua thời gian tiến hành nghiên cứu tôi đã ghi nhận được
các kết quả như sau:
Mẫu bệnh phẩm được xử lý, sau đó tiến hành phân lập virus trên phôi vịt
12 ngày tuổi, xác định được thời gian gây chết phôi của chủng virus viêm gan
vịt ở thanh phố cần thơ là từ 24-72 giờ, tập trung chủ yếu ở 25-48 giờ sau khi
tiêm virus, phôi chết với những bệnh tích đặc trưng như gan xuất huyết, xuất
huyết toàn thân, phôi còi cọc, phù đầu, phù nề bụng. Trong đó tần suất xuất
hiện bệnh tích phôi xuất huyết là cao nhất (95%), và thấp nhất là phù nề bụng
(65%). Dựa vào thời gian gây chết phôi và các bệnh tích trên phôi có thể kết
luận virus phân lập được là virus viêm gan vịt type 1. Dịch virus thu được sau
khi cấy truyền trên môi trường tế bào được tiến hành định danh bằng phương
pháp RT-PCR cho kết quả trong 8 mẫu thử RT-PCR có một mẫu dương tính là
virus viêm gan vịt type 1, subtype DHAV-3.
Qua thí nghiệm có thể kết luận việc gây miễn dịch cho hiệu quả cao với
liều 10
4
ELD

50
và

nhắc lại 2 lần (cách nhau 1 tuần). Kết quả hiệu giá kháng thể
trung bình trong lòng đỏ trứng qua các tuần theo dõi cao tương đương so với
trong máu, và tỉ lệ đẻ của gà trong suốt quá trình thí nghiệm thay đổi không có
ý nghĩa thống kê. Cho thấy việc truyền kháng thể từ máu sang trứng trên gà
mái đẻ có hiệu suất cao, và kháng nguyên virus viêm gan vịt là an toàn và
không ảnh hưởng đến tỉ lệ đẻ khi sử dụng gây miễn dịch cho gà mái đẻ.

1

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Chăn nuôi vịt từ lâu được xem là một nghề truyền thống của người dân ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long, đã góp phần to lớn vào sự phát triển chung của
ngành chăn nuôi cả nước và dần dần trở thành ngành sản xuất hàng hoá quan
trọng, góp phần to lớn vào công cuộc xoá đói giảm nghèo cho nông dân. Để
đẩy mạnh chăn nuôi vịt, hàng năm chúng ta đã tiến hành nhập nội nhiều giống
vịt cao sản và nhân chúng ra diện rộng, các giống này có ưu điểm cho năng
suất cao nhưng sức đề kháng với bệnh kém hơn nhiều so với các giống vịt nội
địa. Cùng với hình thức chăn nuôi vịt chạy đồng truyền thống của người dân
Đồng Bằng Sông Cửu Long, vịt được chăn thả trên đồng phải chống chịu trực
tiếp với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường và sự đe doạ thường xuyên
của các dịch bệnh nguy hiểm như cúm gia cầm, dịch tả vịt, viêm gan vịt do
virus đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi vịt ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long nói chung cũng như trên địa bàn thành phố Cần Thơ nói riêng.
Trong đó đáng kể nhất là bệnh viêm gan vịt do virus.
Bệnh viêm gan vịt do virus là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan
mạnh, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Xuân Bình, 2002),
bệnh gây chết nhanh vịt con từ 1-7 ngày tuổi và tỷ lệ chết có thể lên đến

100%. Trong vài năm gần đây đã xảy ra nhiều trận dịch với những triệu chứng
và bệnh tích nghi ngờ là do bệnh viêm gan do virus, gây tổn thất rất lớn cho
những người chăn nuôi vịt, do người chăn nuôi không hiểu rõ căn nguyên,
đồng thời do bệnh này chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, kháng sinh không thể
điều trị được bệnh và vaccine phòng bệnh cho hiệu quả không cao. Do không
tương đồng với những chủng virus tại địa phương vì bệnh này có thể gây ra
bởi những virus viêm gan vịt thuộc type 1, type 2 và type 3 có đặc tính kháng
nguyên rất khác nhau, đồng thời virus có tính biến dị cao (Shalapy, 1978). Do
đó việc nghiên cứu bệnh là yêu cầu cần thiết nhằm xác định những type gây
bệnh tại địa phương, cụ thể là trên địa bàn thành phố Cần Thơ, sau đó phân lập
các chủng gây bệnh này để làm nguồn giống điều chế kháng thể phòng bệnh
có hiệu quả là yêu cầu cần thiết bảo vệ đàn vịt, đảm bảo phát triển chăn nuôi
bền vững.
Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của nhà trường, Khoa Nông
Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, với sự hướng dẫn của PGS.TS. Hồ Thị Việt
Thu chúng tôi tiến hành đề tài “Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan
vịt từ chủng virus phân lập được trên địa bàn thành phố Cần Thơ”. Với
mục tiêu:
- Phân lập, định danh virus viêm gan vịt tại địa phương để làm nguồn
giống điều chế kháng thể phòng, trị bệnh viêm gan vịt.
- Sản xuất kháng thể từ những chủng virus viêm gan vịt phân lập được
trên địa bàn thành phố Cần Thơ.



2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck virus hepatitis – DVH)
2.1.1 Lịch sử phân bố bệnh

Năm 1945 ở Mỹ, Levine và Hofstad quan sát thấy một bệnh lạ xảy ra trên
đàn vịt con một tuần tuổi, vịt chết nhanh sau khi có biểu hiện triệu chứng, vịt
chết có bệnh tích tập trung ở gan, gan sưng to và có xuất huyết lốm đốm. Năm
1949 tại Long Island, Mỹ, Levine và Fabricant lại quan sát thấy một bệnh
tương tự xảy ra trên đàn vịt con trắng Bắc Kinh, đầu tiên là vịt 2-3 tuần tuổi,
sau đó bệnh lây lan ra rất nhanh và gây thiệt hại nghiêm trọng với tỷ lệ chết
lên đến 70-95%. Đến năm 1950, bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà,
Levine và Fabricant đã chính thức phân lập được virus viêm gan vịt type 1.
Từ năm 1953-1958, bệnh tiếp tục xảy ra trên một vùng khác của Mỹ và
sau đó được phát hiện ở nhiều quốc gia khác trên thế giới như: Anh, Ai Cập,
Ý, Hà Lan, Nga.
Năm 1965 tại Norflok (Anh), việc tiêm phòng vaccin viêm gan vịt type 1
đã được thực hiện, tuy nhiên bệnh viêm gan trên vịt vẫn xảy ra. Sau đó bằng
phương pháp bảo hộ chéo trên vịt con, Asplin đã phân lập được virus viêm
gan vịt type 2. Một thời gian sau trên đàn vịt không thấy xuất hiện bệnh viêm
gan nữa, cho đến năm 1983-1984 thì bệnh lại xuất hiện trên 3 đàn vịt ở
Norflok, Anh với tỷ lệ chết lên đến 50% trên đàn vịt 6-14 ngày tuổi và 30%
trên đàn vịt 3-6 tuần tuổi (Asplin, 1965).
Năm 1969 tại Long Island, Mỹ, bệnh viêm gan vịt đã xảy ra trên đàn vịt
đã tiêm phòng vaccine viêm gan vịt type 1. Bệnh xảy ra nhẹ hơn, với tỷ lệ chết
trên vịt con hiếm khi trên 30% (Toth, 1969). Năm 1979, Haider và Calnek đã
phân lập được chủng virus gây bệnh và đặt tên là virus viêm gan vịt type 3.
Cho đến nay, theo tổ chức thú y Thế giới OIE (2010), bệnh viêm gan vịt
do virus viêm gan type 1 xảy ra khắp nơi trên Thế giới, còn bệnh viêm gan vịt
gây ra bởi virus viêm gan vịt type 2 chỉ xảy ra ở nước Anh và type 3 chỉ mới
được công bố ở Mỹ.
2.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Viêm gan vịt do virus đã được Park xác nhận lần đầu tiên tại Hàn Quốc
bằng kính hiển vi điện tử trong huyết thanh và gan vịt bệnh trên hai trang trại
gần thành phố Kwangju từ năm 1985. Vịt dưới 15 ngày tuổi có tỷ lệ tử vong

40-65%. Bệnh đặc trưng là chết đột ngột, xuất hiện chứng co giật đầu thân về
phái sau (opisthotonos) và tổn thương gan.
Năm 2006, Kim et al., đã tiến hành phân tích virus viêm gan vịt type 1 ở
mức độ phân tử và kết quả cho thấy virus viêm gan vịt type 1 có quan hệ gần
gũi với chi parechovirus thuộc họ picornaviridae.
Ding C et al., (2007), phân tích phân tử của virus viêm gan vịt type 1 và
cho thấy kết luận rằng DHV-1 thuộc về một chi mới của gia đình
picornaviridae có thể tạo thành một chi riêng biệt liên quan chặt chẽ nhất với
chi parechovirus.
3

Kim et al., (2007), đã phát hiện một hệ gen mới và genotype mới khi
phân tích và so sánh với các chủng virus viêm gan vịt type 1 đã có.
Wang et al., (2008), tiến hành so sánh trình tự nucleotide của VP1, VP0 ,
VP3 , và 3D của bảy chủng virus viêm gan vịt (DHV) serotype 1 (DHV - 1) ở
Trung Quốc từ năm 2001 đến năm 2007 và một chủng DHV -1 đã được xác
định với trình tự DHV trước đây có sẵn trong GenBank. Kết quả cho thấy có
sự phát sinh loài dựa trên phân tích mã vùng gen VP1, đồng thời có sự bão tồn
gen VP0, VP3 và 3D giữa các loài khác nhau.
Kim et al., (2009), nghiên cứu chế tạo vaccine nhược độc viêm gan vịt từ
chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype 3 phân lập được bằng cách tiêm
truyền 100 lần qua phôi gà sạch bệnh. Kết quả cho thấy, virus viêm gan vịt
nhược độc an toàn cho vịt 1 ngày tuổi và có hiệu quả bảo hộ tốt.
2.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 1978, đã có những ghi nhận về bệnh viêm gan vịt xuất hiện tại Việt
Nam nhưng vẫn chưa phân lập được mầm bệnh (Trần Minh Châu et al., 1985).
Năm 1983, Trần Minh Châu et al., đã phân lập được virus viêm gan vịt
cường độc tại một ổ dịch ở Phú Xuyên-Hà Tây. Kết quả phân lập trên phổi vịt
12 ngày tuổi được ghi nhận như sau: virus gây chết phôi 100%, thời gian chết
phôi từ 48-96 giờ, phôi có bệnh tích xuất huyết. Qua nuôi cấy trên phôi gà,

chủng virus này yếu đi, không gây bệnh cho vịt con (Trần Minh Châu et al.,
1985). Năm 1985, các tác giả Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng đã xây dựng qui
trình sản xuất vacxin từ 3 chủng virus vaccine viêm gan vịt nhược độc: TN
(Hungary), E52 (Pháp) và VN (Việt Nam). Theo tác giả thì cả 3 chủng virus
vaccine đều an toàn và có hiệu lực sử dụng khi miễn dịch cho vịt con rồi thử
thách với cường độc thì bảo hộ được 70-100% vịt con (Trần Minh Châu et al.,
1989).
Năm 1984, Lê Thanh Hòa et al., đã nghiên cứu đặc tính sinh học của
virus vaccine viêm gan vịt nhược độc chủng TN của Asplin và ứng dụng quy
trình sản xuất vaccine của Hungary vào Việt Nam. Theo báo cáo của tác giả,
vaccine đạt các chỉ tiêu an toàn và có hiệu lực khi sử dụng.
Nguyễn Văn Cảm et al., (2001), đã nghiên cứu về những biến đổi bệnh
lý viêm gan vịt do virus với mục đích đưa ra một phương pháp chẩn đoán
chính xác bệnh. Kết quả được báo cáo như sau: bệnh tích điển hình về đại thể
chủ yếu là gan viêm, xuất huyết, hoại tử chiếm tỷ lệ 79,66-100%, bệnh tích vi
thể điển hình ở gan có tế bào viêm dạng đơn nhân, xuất huyết, hoại tử, tăng
sinh ống dẫn mật với tỷ lệ là 100%.
Nguyễn Đức Lưu et al., (2002), đã nghiên cứu ứng dụng của kháng thể
kháng virus viêm gan vịt để phòng trị bệnh. Vào tháng 8 năm 2001 Công ty
Han-Vet đã chế tạo được sản phẩm kháng thể viêm gan vịt.
Nguyễn Phục Hưng (2004), nghiên cứu bệnh viêm gan do virus trên các
đàn vịt nuôi ở 10 huyện thuộc 4 tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Hà Tây, Bắc Ninh
cho biết tỷ lệ vịt chết rất cao 45,23% ở vịt 1-7 ngày tuổi, 34,4% ở vịt 8-21
ngày tuổi, 18,9% ở vịt 22-42 ngày tuổi.
4

Nguyễn Phục Hưng (2004), đã nghiên cứu chế tạo vaccine nhược độc
viêm gan vịt được chế từ chủng DH-EG-2000 trên phôi gà đạt được các tiêu
chuẩn về an toàn, thuần khiết và có hiệu lực phòng bệnh cao và có thể sử dụng
vaccine để tiêm thẳng vào ổ dịch đang xảy ra. Năm 2007, Bùi Thanh Khiết đã

nghiên cứu qui trình sản xuất vaccine viêm gan vịt từ chủng virus vaccine
nhược độc trên và ứng dụng phòng bệnh-can thiệp vào thực tế sản xuất.
Nguyễn Thị Diễm Quỳnh (2008), nghiên cứu giải mã vùng gen VP1 của
các chủng virus dùng làm vaccine viêm gan vịt tại Việt Nam. Kết quả cho
thấy: chủng vaccine Ai Cập có thể có nguồn gốc từ Trung Quốc, còn chủng
vaccine của các công ty mặc dù vẫn nằm trong nhánh các chủng của Trung
Quốc nhưng có quan hệ xa hơn so với chủng vaccine Ai Cập, và có thể có
nguồn gốc từ một chủng cổ điển ở Hàn Quốc.
Đoàn Thị Thanh Hương et al., (2009), nghiên cứu đặc tính phân tử của
virus vaccine viêm gan vịt bằng việc khảo sát chuỗi gen kháng nguyên VP1
của virus.
Năm 2010, Đoàn Thị Thanh Hương et al., đã phát hiện được virus viêm
gan vịt thuộc genotype 3 (DHAV-3) bằng phương pháp giám định phân tử từ
một ổ dịch ở Đồng Nai. Đến năm 2011, nhóm tác giả trên đã giải mã được
toàn bộ hệ gen của virus viêm gan vịt và xác định được vị trí phân loại của
virus.
Ở nước ta tuy có nhiều biện pháp phòng bệnh nhưng hiệu quả phòng
bệnh chưa vẫn cao, hiệu quả sử dụng vaccine nhược độc và vô hoạt còn nhiều
bất cập. Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng tới hiệu quả của việc phòng
bệnh bằng vaccine có thể là những loại vaccine này đơn chủng lại chứa phần
kháng nguyên của các chủng nước ngoài nên không phù hợp lắm với những
chủng virus ở Việt Nam. Do vậy, để có những loại vaccine hiệu quả cao, phù
hợp với những chủng virus ở nước ta thì cần phải có những nghiên cứu về sinh
học phân tử hệ gen của virus viêm gan vịt ở Việt Nam, phân lập các chủng gây
bệnh để làm nguồn giống điều chế kháng thể phòng bệnh có hiệu quả là yêu
cầu cần thiết bảo vệ đàn vịt, đảm bảo phát triển chăn nuôi bền vững.
2.1.4 Nguyên nhân gây bệnh
Nguyên nhân gây bệnh của các thể bệnh viêm gan do virus trên vịt khác
nhau.
Viêm gan do virus trên vịt type 1 là RNA virus thuộc họ picornaviridae,

kích thước 20-40 nm, không ngưng kết hồng cầu. Virus đề kháng với ether và
chloroform, chịu đựng được sự thay đổi nhiệt độ và các yếu tố môi trường.
Các chủng virus thuộc type này có độc lực cao, gây bệnh nặng với các dấu
hiệu đặc trưng là tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong cao, toàn bộ đàn vịt mắc
bệnh có thể chết trong 3-4 ngày.
Type 2 do Asplin phân lập vào năm 1965, đó là một astrovirus. Virus
type 2 thường gây bệnh trên vịt từ 10 ngày tuổi đến 6 tuần tuổi, virus type 2
chủ yếu được ghi nhận ở châu Âu.
5

Type 3 do Toth phân lập năm 1969, là một picornavirus nhưng không có
mối quan hệ với virus viêm gan vịt type 1.
Type 3 có độc lực thấp nên vịt bị bệnh thường có tỷ lệ chết không quá
30%.
2.1.5 Đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt
Virus gây viêm gan vịt là những hạt virus rất nhỏ, có thể xuyên qua
màng lọc Reckefeld và Seitz EK, có hình cầu, là loại virus không có vỏ ngoài
kích thước từ 20-40nm với capside gồm 32 capsomere và là một RNA virus.
Không có trung hòa chéo giữa virus viêm gan vịt với huyết thanh kháng
virus viêm gan của người và của chó.
Virus không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của gà, vịt, cừu, ngựa,
chuột lang, thỏ lợn,… Virus không ngưng kết hồng cầu khỉ khi thí nghiệm ở
pH 6.8-7 và ở nhiệt độ 4
o
C, 24
o
C, 37
o
C.
2.1.5.1 Sức đề kháng

Phần lớn virus vô hoạt ở nhiệt độ 56
o
C trong vòng 30 phút. Trong tự
nhiên với điều kiện tự nhiên kém, virus có thể tồn tại trong 10 tuần. Trong
phân virus sống được 37 ngày. Ở nhiệt độ 37
o
C virus tồn tại được 21 ngày, ở
4
o
C virus sống được 2 năm, nhiệt độ -20
o
C virus sống được 9 năm.
Virus có sức đề kháng cao với ether, chloroform, đề kháng tương đối với
sức nóng, virus có khả năng tồn tại lâu bên ngoài môi trường. Virus có khả
năng kháng trypsin, methanol 30% hay amonium sulphate, tế bào chứa virus
có thể tồn tại trong môi trường pH = 3 khoảng 9 giờ. Virus không bị vô hoạt
bởi lysol 2%, formalin 0,1%, creolin 15%, naphthalysol, xylonaphtha hay
anhydrous sodium carbonat 20%.
Virus hoàn toàn vô hoạt trong formaldehyde 1% hay sút ăn da 1% trong
2 giờ ở nhiệt độ 15-20
0
C; chloramin 3% trong thời gian 5 giờ; formalin 0,2%
trong 2 giờ. Theo Haider (1980) ở điều kiện có 5% phenol virus bị vô hoạt
hoàn toàn.
2.1.5.2 Biến dị của virus
Theo Shalapy (1978) thì kháng nguyên của virus viêm gan vịt type 1
không ổn định, dễ biến dị. Các type virus viêm gan vịt biến dị đã được phân
lập ở Ấn Độ, Ai Cập và đã được chứng minh bằng các phương pháp huyết
thanh học. Vịt được bảo hộ bởi kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1
không đủ bảo hộ khi tiến hành công cường độc bằng các chủng virus viêm gan

vịt biến dị (Sandhu, 1988).
2.1.6 Truyền nhiễm học
2.1.6.1 Loài mắc bệnh
Theo Nguyễn Xuân Bình (1995), bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan
vịt type 1 gây ra chỉ xảy ra trên vịt con, với tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến
100%, tỷ lệ chết tùy theo lứa tuổi: vịt dưới 1 tuần tuổi tỷ lệ chết đến 95%, 1-3
tuần tuổi tỷ lệ chết 50%, đối với vịt 4-5 tuần tuổi tỷ lệ chết không đáng kể.
6

Theo OIE (2010), virus viêm gan vịt type 1 gây bệnh chủ yếu trên vịt con
dưới 6 tuần tuổi, nhạy cảm nhất là vịt dưới 3 tuần tuổi. Vịt trưởng thành không
có biểu hiện lâm sàng, cũng như giảm sản lượng trứng khi bị nhiễm virus.
Ngoài ra, virus có thể gây bệnh cho ngan, ngỗng. Vịt trưởng thành và các
loài gia cầm khác không mắc bệnh. Một số loài vịt hoang dã khác như le le, vịt
trời là những loài vật mang trùng, những loài vật này khi di cư có thể mang
virus đi xa hàng km, chúng bài thải virus theo phân vào nguồn nước và làm
lan truyền bệnh (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
2.1.6.2 Đường xâm nhập, cách lây lan và cơ chế sinh bệnh
Trong tự nhiên bệnh thường lây qua thức ăn, nước uống và chất bài tiết
của vịt. Virus viêm gan vịt có sức đề kháng khá mạnh với ngoại cảnh nên các
yếu tố lây truyền gián tiếp như con người, dụng cụ chăn nuôi, máy ấp bị nhiễm
trùng trở thành nhân tố truyền bệnh nguy hiểm.
Trong ổ dịch lưu hành, vịt bệnh, vịt khỏi bệnh mang trùng là nguyên
nhân trực tiếp làm dịch phát sinh. Thời gian mang trùng của vịt rất dài, vịt
khỏi bệnh và vịt đã nhiễm virus có thể mang virus từ 8-10 tuần, có khi lâu
hơn.
Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hóa, hô hấp hoặc
qua vết thương rồi vào máu. Virus theo máu đến các cơ quan, phủ tạng và tập
trung nhiều nhất ở gan. Dưới tác động của virus quá trình trao đổi chất ở gan
bị rối loạn, lượng glycogen trong gan giảm thấp, lượng lipid tăng cao do quá

trình trao đổi cholesterol bị đình trệ, do đó vịt con thiếu năng lượng, sức đề
kháng giảm sút. Virus tiếp tục phát triển phá hoại tế bào gan và tế bào nội mô
huyết quản tạo nên bệnh tích xuất huyết đặc trưng và hoại tử gan. Tổ chức gan
bị thoái hóa, gan không giải độc được và con vật bị chết do ngộ độc (Hồ Thị
Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Trong đàn vịt bệnh, virus viêm gan vịt type 1 lây lan rất nhanh từ vịt
bệnh sang vịt khoẻ, tỷ lệ nhiễm có thể lên đến 100%. Tuy nhiên theo Asplin
(1958), virus không truyền lây qua trứng, vịt con được ấp nở từ những đàn vịt
mẹ nhiễm virus viêm gan vịt type 1 vẫn phát triển bình thường.
Theo Asplin (1961), virus có thể lây lan đến các nơi xa hơn do loài chim
hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác. Ngoài ra,
chuột cống nâu cũng có thể là nguồn vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt type 1.
Virus xâm nhập vào cơ thể, tồn tại trong cơ thể 35 ngày, và sau đó được bài
thải ra bên ngoài trong khoảng thời gian 18-22 ngày sau khi nhiễm. Trong
huyết thanh của chuột nhiễm virus có kháng thể và kháng thể tồn tại từ 12-24
ngày (Demakov, 1975).
2.1.7 Triệu chứng bệnh
Đối với bệnh do virus viêm gan vịt type 1 gây ra, bệnh diễn biến rất đột
ngột, thời gian nung bệnh từ 2-4 ngày, bệnh lây lan rất nhanh, vịt không theo
kịp bầy đàn, ít vận động, buồn ngủ, bỏ ăn, sã cánh, một số bị tiêu chảy, sau
một vài giờ niêm mạc miệng xanh tím, vịt bị co giật, nằm la liệt, nghiêng sườn
hoặc nằm ngửa, chân duỗi thẳng, đầu ngẹo sang sườn hoặc bên lưng (triệu
7

chứng đặc trưng gọi là opisthotonus). Sau đó vịt co giật rồi chết nhanh có khi
chỉ 2-3 giờ kể từ khi phát bệnh. Cũng có trường hợp vịt chết mà không có triệu
chứng rõ rệt, tỷ lệ chết rất cao, có thể lên đến 100% đối với các đàn vịt con
dưới một tuần tuổi (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Đối với bệnh viêm gan vịt do virus type 2 gây ra, quan sát thấy vịt chết
trong vòng 1-2 giờ sau khi có biểu hiện triệu chứng đàu tiên: vịt khát nước,

chảy nước mắt, tăng tiết urat, vịt chết do co giật cấp tính, vịt bị nhiễm bệnh
thường chết với tỷ lệ 10-50%, vịt trưởng thành không mắc bệnh.
Bệnh do virus viêm gan vịt type 3 gây ra chỉ xảy ra trên vịt con. Triệu
chứng bệnh giống như do virus viêm gan vịt type 1 gây ra, tỷ lệ mắc bệnh và
tỷ lệ chết hiếm khi vượt quá 30%.
2.1.8 Bệnh tích
2.1.8.1 Bệnh tích đại thể
Vịt chết thường có tư thế đặc biệt (opisthotonus) và bệnh tích tập trung ở
gan: gan viêm, xuất huyết, sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ.
Trên bề mặt gan có hiện tượng xuất huyết lan rộng, không có ranh giới.
Các nốt xuất huyết bằng đầu đinh ghim, màu đỏ, đôi khi nhỏ li ti tràn lan khắp
bề mặt gan, các nốt xuất huyết cũng có thể được quan sát ở cả mặt dưới của
gan. Bên cạnh những điểm xuất huyết còn thấy những đám tụ máu nhỏ, hoặc
những đám màu vàng nhạt do tổ chức gan bị thoái hoá.
Ngoài các bệnh tích ở gan còn có các bệnh tích khác thường gặp là: cơ
tim nhợt nhạt, màng bao tim và túi khí bị viêm, thận tụ huyết nhẹ, lách hơi
sưng.
Trong trường hợp kế phát salmonella thì lách sưng to. Gan có thêm
những điểm hoại tử lấm tấm màu vàng xám (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức
Hiền, 2012).
2.1.8.2 Bệnh tích vi thể
Các biến đổi bệnh tích vi thể rất phức tạp. Những biến đổi trong thể cấp
tính bao gồm thay đổi đầu tiên là hoại tử tế bào gan, ống dẫn mật tăng sinh dãn
rộng, đồng thời tăng sinh các tế bào viêm và xuất huyết xảy ra với các mức độ
khác nhau. Theo Farbricant (1957), thì các vịt con không chết có sự tái sinh
các tế bào nhu mô gan.
Sau khi tiêm virus viêm gan vịt type 1 vào xoang niệu mô của phôi vịt từ
10-14 ngày tuổi, khoảng 24-72 giờ sau thì phôi chết. Phôi chết có biểu hiện
xuất huyết dưới da, gan xuất huyết có nhiều điểm hoại tử.
Gây nhiễm virus viêm gan vịt type 1 cho vịt ở 6 tuần tuổi bằng đường

nhỏ mũi hoặc tiêm vào thời điểm 14-24 giờ, kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử
cho thấy: glycogen giảm, trong tế bào có tiểu thể hình cầu đường kính 100-
300nm. Khi vịt bị nhiễm bệnh ở thể cấp tính, 24 giờ sau khi nhiễm virus, tế
bào gan thoái hoá, hoại tử, trong tế bào có các tiểu thể virus. Sau khi nhiễm
virus, tế bào lách sẽ có sự biến đổi sau 6 giờ, bị hoại tử sau 24 giờ, thoái hoá
nhân, tương bào và không tìm thấy tiểu thể virus. Không tìm thấy tiểu thể
8

virus trong tế bào gan vịt bệnh, đây là một đặc điểm khác biệt đối với bệnh
dịch tả vịt.
Vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt type 2, xuất hiện các bệnh tích đặc trưng
ở gan: các tế bào gan hoại tử tràn lan, tế bào ống mật tăng sinh trên một phạm
vi rộng.
2.1.9 Chẩn đoán bệnh viêm gan vịt do virus
2.1.9.1 Dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh
Vịt con chết nhanh, co giật, lúc chết đầu ngoẹo ra sau, hai chân duỗi
thẳng được coi là dấu hiệu đặc biệt của bệnh viêm gan vịt do virus.
Dựa vào bệnh tích đặc trưng: gan sưng to, xuất huyết lốm đốm trên gan.
Tuy nhiên có thể dựa vào triệu chứng và bệnh tích để biết được là bệnh viêm
gan do virus nhưng chưa thể phân biệt được bệnh do type virus nào gây ra. Và
để phân biệt được type virus thì cần phải tiến hành các biện pháp chẩn đoán
phòng thí nghiệm.



Hình 2.1 Vịt chết với tư thế Hình 2.2 Gan, thận sưng,
đặc trưng (opisthotonus) xuất huyết
2.1.9.2 Chẩn đoán phân lập virus viêm gan vịt
Phương pháp phân lập virus có kết quả hữu hiệu và có thể biết được type
virus đang gây bệnh. Người ta có thể phân lập virus bằng nhiều cách khác

nhau.
Bệnh phẩm chủ yếu được dùng để chẩn đoán bệnh là gan vịt. Nghiền
bệnh phẩm với dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) tỷ lệ 1/5, xử lý
chloroform 5% trong vòng 10-15 phút ở nhiệt độ phòng để diệt tạp khuẩn. Sau
đó tiến hành phân lập virus viêm gan vịt.
- Nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1:
+ Dùng phôi vịt 10-14 ngày tuổi, sau khi tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào
xoang niệu mô, virus sẽ giết chết phôi trong khoảng 24-72 giờ với bệnh tích
xuất huyết dưới da toàn thân, gan phôi xuất huyết, phôi phù tích nước, kích
thước phôi nhỏ hơn bình thường.
9

+ Dùng phôi gà 8-10 ngày tuổi tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào xoang
niệu mô, sau 8-10 ngày phôi chết. Phôi chết này có bệnh tích còi cọc, da xuất
huyết, phù phôi, gan sưng đỏ hoặc hơi vàng.
+ Dùng vịt con 1-7 ngày tuổi, tiêm huyễn dịch virus dưới da hoặc tiêm
bắp. Sau khi tiêm khoảng 18-48 giờ, thường dưới 24 giờ vịt có biểu hiện triệu
chứng lâm sàn và chết với bệnh tích đặc trưng của virus viêm gan vịt type 1, tỉ
lệ chết 90-100%.
+ Dùng môi trường tế bào một lớp gan phôi vịt sau khi cấy huyễn dịch
bệnh phẩm, virus sẽ gây hoại tử tê bào: tế bào co tròn, hoại tử, tạo vệt tan có
đường kính gần bằng 1mm.
- Nuôi cấy virus viêm gan vịt type 2:
+ Dùng phôi vịt 10-14 ngày tuổi, gây nhiễm qua xoang niệu mô, trên môi
trường này, virus nhân lên hạn chế, sau 6-10 ngày mới phát hiện được sự
nhiễm virus của phôi: phôi còi cọc hoại tử gan, gan phôi có màu xanh. Virus
thuộc type này không nhân lên được trong môi trường tế bào một lớp của vịt,
gà.
+ Dùng vịt con 1-7 ngày tuổi, tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào dưới da
hoặc tiêm bắp. Sau khi tiêm 2-4 ngày vịt chết, tỷ lệ chết 20%.

- Nuôi cấy virus viêm gan vịt type 3:
+ Dùng phôi vịt 10 ngày tuổi, tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào màng
nhung niệu, virus nhân lên yếu. Sau khi tiêm 7-10 ngày phôi mới chết. Phôi
còi cọc, phù phôi, xuất huyết dưới da, màng nhung niệu khô dày, gan, thận,
lách sưng to.
+ Viêm gan vịt type 3 không nhân lên trên phôi gà. Nuôi cấy virus trên
môi trường tế bào phôi gà không thành công nhưng có thể phát hiện virus
trong tế bào gan phôi vịt, thận phôi vịt bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang
trực tiếp.
+ Dùng vịt 1-7 ngày tuổi, tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào bắp thịt, vịt
không chết trong 24 giờ sau khi tiêm, 2-4 ngày sau vịt mới chết, tỷ lệ chết thấp
khoảng 20%.
2.1.9.3 Chẩn đoán huyết thanh học
Dùng phản ứng trung hoà virus với mục đích: định type virus, đánh giá
phản ứng miễn dịch của cơ thể đối với vaccine dùng trong điều tra dịch tễ học.
Nguyên lý cơ bản của phương pháp này: trên đối tượng nuôi cấy (phôi,
động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho
các đối tượng trên. Còn khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng
thì chúng sẽ bị trung hoà, không nhân lên được và không gây bệnh tích
(Nguyễn Như Thanh, 1996).
Phản ứng trung hoà được dùng để định type virus viêm gan vịt type 1
(woolcock, 1998), dùng vịt con 1-7 ngày tuổi, mỗi con tiêm 1-2ml huyết thanh
miễn dịch hoặc kháng thể đặc hiệu chế từ lòng đỏ trứng vào dưới da. Sau 24
10

giờ tiến hành tiêm virus cường độc với liều 10
3
LD
50
. Kết quả 80-100% vịt đối

chứng chết, 80-100% vịt thí nghiệm sống.
Phản ứng trung hoà còn được sử dụng để chẩn đoán virus viêm gan vịt
type 2, type 3 (OIE, 2000).
Ngoài ra còn dùng phản ứng bảo hộ chéo để phân biệt virus viêm gan vịt
type 1, type 2, type 3: tiêm huyết thanh miễn dịch viêm gan vịt type 1, type 2
cho vịt 2-4 ngày tuổi. Sau 3 ngày công cường độc phân lập được virus
(Gough, 1985).
2.1.9.4 Chẩn đoán phân biệt
Chẩn đoán phân biệt là phương pháp dựa vào dịch tễ học, triệu chứng
lâm sàng và bệnh tích của bệnh để phân biệt với các bệnh khác. Cần phải chẩn
đoán phân biệt viêm gan vịt do virus với các bệnh sau:
- Bệnh dịch tả vịt (duck plaque): vịt mắc bệnh viêm gan do virus
thường dễ nhầm với bệnh dịch tả vịt, vì vậy trước tiên cần phân biệt hai bệnh
này. Bệnh dịch tả vịt thường xảy ra ở mọi lứa tuổi với các triệu chứng điển
hình như: sưng đầu, liệt chân, liệt cánh, đặc biệt là có hiện tượng đi ngoài phân
trắng. Mổ khám thấy đường ruột có hiện tượng viêm xuất huyết.
- Bệnh phó thương hàn vịt (duck salmonellosis): Vịt mắc bệnh phó
thương hàn (do salmonella) thường có biểu hiện: vịt gầy, đi ngoài phân trắng,
vịt giảm đẻ, vỏ trứng mỏng và dễ vở. Quan sát bệnh tích thấy: chưa tiêu hết
lòng đỏ trứng ở vịt con; gan, thận, lách sưng và xung huyết; ở vịt lớn thường
bị viêm buồng trứng, dịch hoàn, trứng non teo và dị hình. Vi khuẩn
Salmonella có thể nuôi cấy phân lập được trong phòng thí nghiệm trên các môi
trường thạch thông thường và bệnh này có thể điều trị bằng kháng sinh.
- Chứng nhiễm độc aflatoxin: Chứng nhiễm độc aflatoxin có bệnh tích
gần giống với bệnh viêm gan do virus trên vịt nhưng đặc biệt không có hiện
tượng lây lan trong đàn. Bệnh tích chủ yếu là: xoang bụng và xoang bao tim
tích nước, gan sưng có màu nhợt nhạt, thận và lách xuất huyết. Kiểm tra tổ
chức học thấy tổ chức nhu mô gan và thận bị phá huỷ nghiêm trọng.
2.1.9.5 Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp giám định phân tử
a) Kỹ thuật PCR

Đây là phương pháp tổng hợp DNA trong ống nghiệm (in vitro) do Karry
Mullis phát hiện năm 1986 và hoàn thiện năm 1987.
PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của
quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzyme DNA-
polymerase chịu nhiệt, hai đoạn ngắn DNA sợi đơn làm mồi, và dùng các
DNA sợi đơn của chuỗi DNA xoắn kép làm khuôn mẫu (cả hai sợi đơn của
chuỗi DNA có thể được sử dụng làm khuôn, tùy thuộc vào việc thiết kế mồi),
để tổng hợp nên số lượng lớn các đoạn DNA mới giống hệt đoạn DNA ban
đầu.
Phản ứng PCR được tiến hành qua ba bước điều chỉnh nhiệt độ cho một
chu kỳ (còn gọi là chu kỳ nhiệt của phản ứng) (Lê Thanh Hòa, 2006).
11

- Bước 1: bung liên kết của DNA (denaturation) thực hiện ở nhiệt độ từ
90
0
C đến 98
0
C (thường là 94
0
C) trong vài giây đến vài phút, làm gãy các liên
kết hydro của chuỗi xoắn kép DNA tạo ra các sợi DNA đơn.
- Bước 2: mồi bám (annealing) hay còn gọi là ủ với mồi, ngay sau giai
đoạn bung liên kết nhiệt độ được hạ xuống 37-68
0
C, các đoạn mồi
(oligopeptide-có độ dài từ 6-30 nucleotide) bám với các trình tự bổ sung tương
ứng trên đoạn DNA sợi đơn làm khuôn được tạo ra ở trên điểm khởi đầu sao
chép.
- Bước 3: tổng hợp hay con gọi là kéo dài (extension), nhiệt độ được

nâng lên 68-72
0
C (thường là 72
0
C) trong vài chục giây đến vài chục phút, để
tổng hợp các sợi DNA bổ sung-sản phẩm PCR dưới xúc tác của enzyme
DNA-polymerase.
Sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên các sợi
DNA mới, các sợi này được dùng để làm khuôn cho các chu kỳ tiếp theo, đến
chu kỳ cuối cùng nhiệt độ được duy trì ở 72
0
C/5-10 phút, để cho tất các các
đoạn DNA mới được tổng hợp xoắn lại hoàn toàn tạo nên sản phẩm PCR.
Cuối cùng duy trì ở nhiệt độ 4
0
C để bảo quản sản phẩm. Kết quả, sau n
chu kỳ của phản ứng, đoạn DNA ban đầu được “nhân lên” với số lượng rất
lớn, theo lý thuyết sẽ có 2
n
bản sao các phản ứng DNA mạch kép nằm ở giữa
hai đoạn mồi. Ví dụ: sau 30 chu kỳ số lượng sản phẩm PCR sẽ là: 2
30
=
1.073.741.824 bản sao của một đoạn DNA ban đầu (Lê Thanh Hòa, 2006).
b) Kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (phản ứng PCR ngược) là phản ứng nhân lên (khuếch
đại) một đoạn giới hạn của khuôn RNA, bao gồm 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: tổng hợp đoạn cDNA (DNA bổ sung) từ sợi RNA làm
khuôn nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase enzyme), còn gọi là
giai đoạn chuyển mã ngược (RT - reverse trancription).

- Giai đoạn 2: thực hiện phản ứng PCR từ khuôn cDNA sản phẩm của
giai đoạn chuyển ngược theo chu kỳ nhiệt.
Tùy theo mục đích của việc thực hiện phản ứng RT-PCR, có thể sử dụng
RT-PCR một bước (kết hợp cả hai giai đoạn trong một chuỗi phản ứng liên
tục) hay hai bước (thực hiện hai giai đoạn phản ứng riêng biệt).
2.1.10 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt
Khi đưa virus vào cơ thể, kháng thể chưa hình thành ngay lập tức mà
phải cần thời gian, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong
vaccine và sự xâm nhập của kháng nguyên vaccine lần đầu hay lần thứ 2,
3,…hàm lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất sau 2-3 tuần rồi giảm
dần và mất đi sau vài tháng hoặc vài năm.
Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể trước hết cơ thể bảo vệ
mình bằng cơ chế đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Tham gia vào cơ chế
này có vai trò của da, niêm mạc, dịch tiết của các tuyến, đặc biệt là có vai trò
của các tế bào làm nhiệm vụ thực bào. Sau đó, cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế
12

đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với hoạt động của các cơ quan, tế bào có thẩm
quyền miễn dịch, tạo kháng thể đặc hiệu để loại trừ kháng nguyên (Nguyễn Bá
Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004).
2.1.10.1 Miễn dịch thụ động
Ở gia cầm non hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện. Ngay từ
lúc mới sinh cơ thể chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại các tác nhân
gây bệnh một cách đặc hiệu. Trạng thái miễn dịch chỉ có được sau khi cơ thể
gia cầm mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể đặc hiệu cho con non qua lòng
đỏ trứng (Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004). Trong bệnh viêm gan
vịt, miễn dịch thụ động của vịt con được nhận từ mẹ đã được nghiên cứu
nhiều. Việc tiêm nhắc lại vaccine cho vịt mẹ sẽ tạo được kháng thể thụ động
tốt hơn cho vịt con. Theo Asplin (1958) dùng virus viêm gan vịt type 1 nhược
độc qua phôi gà, tiêm bắp cho vịt giống vào thời điểm 2-4 tuần trước khi lấy

trứng đem ấp sẽ tạo được miễn dịch thụ động cho vịt con. Ở vịt con hàm
lượng kháng thể thụ động sẽ giảm dần trong 2 tuần sau khi nở. Ở vịt mẹ hàm
lượng kháng thể phải đạt hiệu giá 1/64 trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ
động hoặc 1/32 trong phản ứng trung hòa mới có thể bảo hộ cho vịt con khỏi
mắc bệnh (Asplin, 1958).
2.1.10.2 Miễn dịch chủ động
Là loại miễn dịch thu được khi con vật bị mắc bệnh nhưng có đủ sức để
chống lại bệnh và khỏi bệnh hoặc là miễn dịch mà vịt có được sau khi tiêm
vaccine. Những vịt sống sót sau khi mắc bệnh đều có miễn dịch chắc chắn với
virus của type gây bệnh. Tạo miễn dịch chủ động cho đàn vịt bằng cách sử
dụng các loại vaccine nhược độc và vaccine vô hoạt. Vaccine sau khi vào cơ
thể sẽ đi đến các cơ quan miễn dịch như hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm
mạc kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc hiệu.
Trong kháng thể dịch thể chống virus viêm gan vịt type 1 thì kháng thể
7S nhiều hơn kháng thể 19S. Vịt được tiêm vaccine có thể tạo được miễn dịch
chủ động chống lại bệnh. Sử dụng vaccine nhược độc viêm gan vịt tiêm cho
vịt 2-3 ngày tuổi và tiêm nhắc lại bằng vaccine vô hoạt vào thời điểm 22 tuần
tuổi sẽ tạo được lượng lớn kháng thể trung hòa (Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị
Lan Hương, 2004).
2.2 Kháng thể từ lòng đỏ trứng
2.2.1 Sự tấn công của virus
Virus là loại vi sinh vật nhỏ nhất chỉ gồm có nhân DNA hoặc RNA với
vỏ bọc cho nên hoàn toàn phải sống bên trong tế bào vật chủ và nhờ bộ máy
sao chép của tế bào ấy mà sinh sôi nảy nở. Vỏ của chúng thường có những
chất ái tính với các receptor đặc hiệu sẵn có trên bề mặt tế bào.
Virus có những tính chất độc đáo riêng là chúng có thể xâm nhập vào mô
mà không gây ra một đáp ứng viêm, chúng có thể nhân lên trong tế bào suốt
đời sống cơ thể vật chủ mà không gây tổn thương tế bào, đôi khi chúng cản trở
một số chức năng đặc biệt của tế bào mà không gây biểu hiện bên ngoài, cũng
13

có virus gây tổn thương mô hoặc cản trở sự phát triển của tế bào và rồi biến
mất hoàn toàn khỏi cơ thể.
Sau khi vào bên trong tế bào, nhân của một số virus tích hợp với nhân
của tế bào vật chủ rồi có thể có hai phương thức hoạt động:
- Chúng bắt bộ máy sao chép sinh sản của tế bào vật chủ giúp chúng sinh
sôi nảy nở, sau đó phá vỡ tế bào này để lan sang tế bào khác và cứ như thế
bệnh nhiễm virus phát triển.
- Chúng nằm tiềm tàng trong nhân chờ cơ hội hoạt động sau này dưới
hình thức trên hay dưới hình thức gây chuyển biến tế bào vật chủ thành tế bào
ác tính. Đó là các hoạt động của một số virus sinh khối u (Trần Ngọc Bích và
Hồ Thị Việt Thu, 2012).
2.2.2 Vai trò của kháng thể
Trong hệ đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: liên kết
với kháng nguyên, kích hoạt bổ thể và huy động các tế bào miễn dịch
(Campbell et al., 1995).
2.2.2.1 Liên kết với kháng nguyên
Các kháng thể có khả năng nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một
kháng nguyên tương ứng nhờ các vùng biến thiên (campbell et al., 1995).
Kháng thể liên kết và trung hòa các độc tố, ngăn ngừa sự tương tác của
chúng với các thụ thể tế bào. Như vậy, các tế bào có thể tránh được các rối
loạn do các độc tố gây ra.
Tương tự như vậy, nhiều virus và vi khuẩn chỉ gây bệnh khi bám vào các
tế bào. Vi khuẩn sử dụng các phân tử bám dính là protein adhesin, còn virus sở
hữu các protein bám dính trên lớp vỏ của chúng. Các kháng thể kháng adhesin
và kháng protein vỏ virus sẽ ngăn chặn các vi sinh vật này gắn vào các tế bào
đích.
2.2.2.2 Hoạt hóa tế bào miễn dịch
Sau khi tương tác với kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có
thể cố định trên các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc). Những tương tác

này có tầm quan trọng đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch (Campbell et al.,
1995). Như vậy, các kháng thể gắn với một virus hoặc một vi khuẩn có thể
liên kết với đại thực bào và khởi động hiện tượng thực bào. Các tế bào lympho
NK (Natural Killer) có thể thực hiện chức năng giải độc tế bào và ly giải các
vi khuẩn bị gắn kết với các kháng thể.
2.2.3 Kháng thể IgY của gà
2.2.3.1 Sơ lược về IgY
IgY là một globulin miễn dịch được mô tả lần đầu tiên vào năm 1893 khi
Klemperer chủng ngừa gà để sản xuất kháng thể và phát hiện nồng độ kháng
thể trong lòng đỏ trứng gà cũng tương đương trong máu. Khi Klemperer phát
hiện globulin miễn dịch gà vào cuối năm 1900, ông đã đặt tên chúng là IgG.
Hơn 70 năm sau đó, Leslie và Clem đã đổi tên globulin miễn dịch này thành