Luận án tiến sĩ vật lý Chế tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu y sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN VẬT LÝ



PHẠM MINH TÂN


CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT
QUANG CỦA HẠT NANO SILICA
CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM
ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH






LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ

HÀ NỘI, NĂM 2015







BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN VẬT LÝ


PHẠM MINH TÂN



CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT
QUANG CỦA HẠT NANO SILICA
CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM
ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH

CHUYÊN NGÀNH: VẬT LÝ CHẤT RẮN
MÃ SỐ: 62 44 01 04

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TRẦN HỒNG NHUNG
2. PGS.TS. TỐNG KIM THUẦN



HÀ NỘI, NĂM 2015





LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất của mình tới
PSG.TS. Trần Hồng Nhung và PGS.TS. Tống Kim Thuần, những người thầy luôn
tận tụy hết lòng hướng dẫn tôi, tạo mọi điều kiện giúp đỡ trong thời gian tôi học tập
và nghiên cứu ở Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Hồng Nhung đã
luôn giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần, tạo mọi điều kiện cho tôi có cơ hội học
tập, trao đổi kinh nghiệm nghiên cứu ở trong và ngoài nước.
Tôi xin chân thành cảm ơn: TS. Nghiêm Thị Hà Liên, TS. Vũ Thị Thùy
Dương, CN. Trần Anh Đức, ThS. Nguyễn Thị Vân, ThS. Trần Thu Trang, ThS.
Nguyễn Thị Thùy, PGS.TS. Đỗ Quang Hòa, TS. Vũ Dương, TS. Phạm Long và các
bạn đồng nghiệp trong nhóm NanoBiophotonics đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá
trình làm thực nghiệm và các trao đổi khoa học trong suốt quãng thời gian tôi học
tập, nghiên cứu ở Viện.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Photonics – Viện
Vật lý, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Vật lý và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình làm luận án. Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn
GS.TS. Viện trưởng Nguyễn Đại Hưng và TS. Nguyễn Thanh Bình đã tạo điều kiện

để tôi có thể hoàn thành được luận án của mình. Tôi xin cảm ơn NCS. Nguyễn Đình
Hoàng, ThS. Nguyễn Thị Thanh Bảo đã giúp đỡ tôi thực hiện các phép đo quang
học, phép đo thời gian sống và các phép đo tương quan huỳnh quang.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, PGS.TS. Lê Quang
Huấn, ThS. Trần Thanh Thủy, ThS. Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự đã giúp đỡ tôi
trong các thí nghiệm đánh dấu sinh học.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo và bạn đồng
nghiệp trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. Đặc biệt, xin chân thành
cảm ơn các thầy cô và bạn đồng nghiệp trong Phòng Đào tạo, các thầy cô, các bạn
đồng nghiệp và các em sinh viên Khoa Vật lý và Công nghệ, trường Đại học Khoa
học, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện về thời gian, vật chất và động viên
tôi để tôi có thể hoàn thành được luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô, chú,
anh, chị và các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm Điện tử học Lượng tử, Viện Vật lý.
Cuối cùng, tôi xin dành những lời cảm ơn sâu nặng nhất đến những người
thân thương trong gia đình tôi: Bố, mẹ, vợ, con, các anh chị em và các cháu đã dành
cho tôi những tình cảm, động viên, chia sẻ cho tôi rất nhiều trong những năm tháng
làm việc vất vả này.
Phạm Minh Tân





LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn của PSG.TS. Trần Hồng Nhung và PGS.TS. Tống Kim Thuần. Các kết quả, số
liệu trong luận án là trung thực và chưa công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Phạm Minh Tân

Luận án được hoàn thành bởi kinh phí của đề tài NAFOSTED
Mã số: 103.06.101.09
Và đề tài cấp Nhà nước
Mã số: 01/2/2011/HĐ-NCCBUD







MỤC LỤC
Tiêu đề Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN……………………… …… i
DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………… ……iii
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ………………………………… …v
MỞ ĐẦU

1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN

10
1.1. Chất màu hữu cơ

10

1.1.1. Cấu trúc hóa học

10
1.1.2. Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học

11
1.1.3. Quang phổ của chất màu

13
1.1.4. Độ ổn định quang học của các tâm màu hữu cơ

15
1.1.5. Hiện tượng dập tắt vì nồng độ

16
1.1.6. Ảnh hưởng của môi trường

17
1.1.6.1. Ảnh hưởng của dung môi

17
1.1.6.2. Sự kết tụ các phân tử màu

18
1.2. Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ

18
1.2.1. Các hạt nano silica và latex

18

1.2.2. Các hạt nano silica/ormosil

19
1.2.3. Phương pháp chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ

20
1.2.3.1. Phương pháp Stober

20
1.2.3.2. Các phương pháp micelle

21
1.2.4. Các đặc trưng hóa lý

22




1.2.4.1. Vật liệu nền

22
1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang

23
1.2.4.3. Thế Zeta

24
1.2.5. Các hạt nano silica hợp sinh

26
1.2.5.1. Yêu cầu của các hạt nano silica hợp sinh

26
1.2.5.2. Sự gắn kết của hạt nano silica với phân tử sinh học

27
1.2.6. Ứng dụng các hạt nano silica trong y – sinh học

31
1.2.6.1. Phép thử miễn dịch (silica nanoparticles – based immunoassays)

31
1.2.6.2. Tăng độ nhạy trong phân tích và hiện ảnh sinh học
.
31
1.1.6.3. Đầu dò DNA siêu nhạy

32
1.1.6.4. Phân tích đa kênh

32
1.1.6.5. Hiện ảnh tế bào ung thư và chẩn đoán ung thư sớm
.
33
1.1.6.6. Máy đếm dòng tế bào (flow cytometer)

34
1.2.6.7. Vận chuyển thuốc

35
1.3. Các đối tượng sinh học

36
1.3.1. Protein

36
1.3.2. Albumin - protein bovine serum albumin (BSA)

36
1.3.3. Strepavidin
(SA)

37
1.3.4. Kháng thể

37
1.3.5. Kháng nguyên

38
1.3.6. Vi khuẩn
Escherichia coli (E. coli)

39
1.3.7. Phản
ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể)

39
1.3.7.1. Khái niệm

39




1.3.7.2. Cơ chế kết hợp kháng nguyên và kháng thể

39
1.4. Kết luận chương 1

40
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

41
2.1. Các thí nghiệm chế tạo

41
2.1.1. Chế tạo các hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tâm màu RB bằng
phương pháp micelle thuận

41
2.1.1.1. Chế tạo và chức năng hóa hạt nano silica chứa tâm màu RB

41
2.1.1.2. Bọc hạt nano silica bằng protein

46
2.1.1.3. Chế tạo mẫu cho nghiên cứu tính chất quang lý

49
2.1.2. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
micelle đảo

50
2.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ FITC đến khả năng phản ứng với
APTES

50
2.1.2.2. Chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC

51
2.1.3. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
Stober

53
2.1.3.1. Chế tạo hạt nano silica chứa FITC. Khảo sát ảnh hưởng của lượng
xúc tác lên kích thước hạt

53
2.1.3.2. Chức năng hóa bề mặt hạt nano silica chứa FITC

54
2.2. Các phương pháp nghiên cứu thông số vật liệu

55
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái và kích thước hạt

55
2.2.1.1. Hiển vi điện tử quét (SEM)

56
2.2.1.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

56
2.2.2. Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS)
xác định độ đơn phân tán, đường kính thủy động học và thế Zeta

56
2.2.3. Phương pháp phổ huỳnh quang tương quan (Fluorescence Correlation
Spectroscopy – FCS) xác định kích thước hạt và hệ số khuếch tán

57
2.2.4. Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại xác định cấu trúc hóa học

59
2.2.5. Các phương pháp nghiên cứu tính chất quang lý

63




2.2.5.1. Phương pháp phổ hấp thụ

63
2.2.5.2. Phương pháp phổ huỳnh quang
.
64
2.2.5.3.

Hiệu suất lượng tử

65
2.2.5.4.
Thời gian sống phát quang

67
2.2.6. Phương pháp và thiết bị sử dụng trong ứng dụng sinh học

68
2.2.6.1. Kính hiển vi quang học

68
2.2.6.2. Thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy

70
2.3. Kết luận chương 2

71
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ

73
3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề
mặt theo phương pháp micelle thuận

73
3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt

73
3.1.2. Cấu trúc hóa học

74
3.1.3. Đường kính thủy động học

77
3.1.4. Các đặc trưng quang học

80
3.1.4.1. Hấp thụ và huỳnh quang

80
3.1.4.2. Hiệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang

81
3.2. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương
pháp micelle thuận

85
3.2.1. Đường kính thủy động học và thế Zeta (ζ)

86
3.2.2. Các đặc trưng quang lý phụ thuộc vào kích thước hạt nano

88
3.2.2.1. Tính chất quang

88
3.2.2.2.
Độ phân cực huỳnh quang

92
3.2.3.3. Kết quả đo kích thước hạt và hệ số khuếch tán bằng phương pháp
FCS

93
3.3. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA)

95
3.3.1. Hình dạng, kích thước

95




3.3.2. Tính chất quang

96
3.4. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein streptavidin (SA)

98
3.4.1. Hình dạng, kích thước

98
3.4.2. Tính chất quang

98
3.4.2.1. Phổ huỳnh quang trong nước

98

3.4.2.2. Phổ huỳnh quang hạt nano silica bọc protein trong PBS

99
3.5. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo

100
3.5.1. Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với
APTES

100
3.5.2. Tính chất quang

102
3.6. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober

104
3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác lên kích thước hạt

104
3.6.2. Tính chất quang

105
3.6.3. Chức năng hóa

107
3.6.3.1. Kết quả chức năng hóa hạt nano bằng nhóm chức NH
2


107

3.6.3.2. Kết quả dập tắt nhóm OH trên bề mặt hạt

108
3.6.3.3. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH

110
3.7. Kết luận chương 3

112
CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU
SINH HỌC

114
4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y – sinh

114
4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi
khuẩn E. coli
O157:H7 bằng phương pháp miễn
dịch huỳnh quang

114
4.1.1.1. Chế tạo phức hệ
SiO
2
RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7

114
4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO
2

RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E. coli

O157 :H7

114
4.1.1.3. Hiện ảnh tế bào

114
4.1.1.4. Xây dựng phương pháp phổ quang học để xác định số lượng vi khuẩn

115





4.1.2. Phát hiện tế bào ung thư vú

115
4.1.2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất

115
4.1.2.2. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa RB - kháng thể
HER2
(SiO
2
RB@HER2)

115
4.1.2.3. Nuôi cấy tế bào

115
4.1.2.4.
Sử dụng phức hệ SiO
2
RB@HER2 để nhận biết tế bào ung thư vú KPL4

116
4.1.2.5. Thí nghiệm đếm tế bào trong dòng chảy

116
4.1.3. Phát hiện tế bào ung thư vú BT-474

116
4.1.3.1. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa FITC – kháng thể
HER2
(SiO
2
FITC@HER2)

116
2.1.3.2. Nhận biết tế bào BT-474bằng phức hệ SiO
2
FITC@HER2

116
4.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli
O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch
huỳnh quang

117
4.2.1. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang

117
4.2.2. Xây dựng phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định định lượng vi
khuẩn E. coli O157:H7

119
4.3. Nhận biết tế bào ung thư vú

121
4.3.1. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang

121
4.3.2. Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào

124
4.4. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng hạt nano silica chứa tâm màu FITC

127
4.5. Kết luận chương 4

127
KẾT LUẬN

129
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC SỬ DỤNG TRONG LUẬN
ÁN

131

TÀI LIỆU THAM KHẢO

133



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN

Ký hiệu Giải nghĩa
φ
Kích thước hạt (đường kính)
τ
Thời gian sống huỳnh quang
∆λ
HQ
Độ bán rộng phổ huỳnh quang
∆λ
HT
Độ bán rộng phổ hấp thụ
λ
HQ
Đỉnh phổ huỳnh quang
λ
HT
Đỉnh phổ hấp thụ
APTES Aminopropyltriethoxysilane
AOT Aerosol-OT
BSA Bovine serum albumin
C Nồng độ (mol/l)
COOH Nhóm carboxyl

CTMES Chlorotrimethylsilane
DLS Dynamic Light Scattering
DMSO Dimethyl Sulfoxide
DNA Deoxyribonucleic acid
DTOH Dập tắt OH
E. coli Escherichia coli
EDC Ethylene dichloride
FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
FITC Fluorescein Isothiocyanate
HĐBM Hoạt động bề mặt
HSLT Hiệu suất lượng tử
I
HQ
Cường độ huỳnh quang
I
HT
Cường độ hấp thụ
KT Kháng thể



LSCM Laser Scanning Confocal Microscope
MES axit 2-(N-morpholino)etansulfonic
MTEOS Methyl triethosyxilane
NP Nano particles – các hạt nano
NH
2
Nhóm amine
OH Nhóm hydroxyl
Ormosil Organically modifiled silicate

PEG polyethylene glycol
PdI Polydispertion Index
PDT Photodynamic Therapy
Precursor Tiền chất
PTTMEOS 3-(trimethoxysilyl)-1 propanthiol
Q Hiệu suất lượng tử
R Bán kính
R6G Rhodamine 6G
RB Rhodamine B
SA Streptavidin
SEM Scanning Electron Microscope
SH Nhóm thiol
SiFITC Hạt nano silica chứa FITC
SiRB Hạt nano silica chứa RB
TCSPC Time-correlated single photon counting
TEM Transmission electron microscopy
TEOS Tetraethyl orthosilicate
TGSPQ Thời gian sống phát quang





DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Độ ổn định của huyền phù theo thế Zeta 25
Bảng 2.1. Thí nghiệm xác định lượng BSA đủ để bọc hạt 47
Bảng 2.2. Dãy mẫu thay đổi nhóm chức năng 49
Bảng 2.3. Dãy mẫu thay đổi kích thước hạt 49
Bảng 2.4. Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương
pháp micelle đảo

52
Bảng 2.5. Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương
pháp Stober với lượng NH
4
OH thay đổi

54
Bảng 3.1. Tổng hợp các đặc trưng của chất màu RB trong nước và trong hạt
nano silica với các nhóm chức khác nhau

79
Bảng 3.2. Các thông số về kích thước theo các phương pháp đo khác nhau
83
Bảng 3.3. Các thông số của các mẫu hạt nano silica kích thước khác nhau
87
Bảng 3.4. Tổng hợp các đặc trưng của chất màu RB trong nước và trong hạt
nano silica với kích thước khác nhau

91
Bảng 3.5. Độ phân cực huỳnh quang của RB trong nước, trong ethanol và các
hạt nano kích thước khác nhau
93
Bảng 3.6. Tổng hợp kích thước và hệ số khuếch tán của hạt đo bằng các
phương pháp khác nhau

95
Bảng 3.7. Kết quả đo DLS của các mẫu với hợp chất FITC@APTES với
lượng ethanol pha loãng khác nhau

101
Bảng 3.8. Kết quả đo DLS và TEM của các mẫu hạt nano silica chứa FITC
với các kích thước khác nhau chế tạo bằng phương pháp Stober

105



Bảng 3.9. Các thông số của phổ hấp thụ và huỳnh quang
107
Bảng 3.10. Kết quả đo DLS và thế Zeta của các hạt nano silica có nhóm chức
NH
2
được chế tạo bằng phương pháp Stober

108
Bảng 3.11. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm
chức NH
2


108
Bảng 3.12. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica được dập tắt
nhóm OH trên bề mặt

109
Bảng 3.13. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm
chức COOH

111

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử màu RB và R6G
10
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của chất màu FITC
11
Hình 1.3. Cấu trúc mức năng lượng và chuyển dời quang học của phân tử
màu 12
Hình 1.4. Phổ hấp thụ và huỳnh quang của RB
13
Hình 1.5. Sự phụ thuộc của hiệu suất huỳnh quang vào nồng độ
16
Hình 1.6. Các cách phổ biến kết hợp tâm màu vào các hạt nano silica và latex

19
Hình 1.7. Sự phát xạ huỳnh quang của các hạt nano silica chứa các loại tâm
màu khác nhau 19
Hình 1.8. Các hệ micelle: Hệ micelle thuận (a) và Hệ micelle đảo (b)
21
Hình 1.9. Ảnh SEM của các mẫu hạt silica đơn phân tán với các kích thước
khác nhau 22
Hình 1.10. Tính chất của RuBpy pha trong hạt nano silica
24
Hình 1.11. Biểu diễn thế Zeta của một hạt
25
Hình 1.12. Các cách thường tiếp hợp phân tử sinh học với hạt nano
28
Hình 1.13. Các cách gắn kết đồng hóa trị thông thường giữa phân tử sinh
học và hạt nano 29
Hình 1.14. Mô tả cách gắn kết đặc hiệu của hạt nano silica với vi khuẩn lao
Mycobacterium 29
Hình 1.15. Hình ảnh các vi khuẩn E. coli
31
Hình 1.16. Mô tả thí nghiệm đánh dấu DNA xem kẽ dựa vào gắn kết sinh học
với hạt nano silica 32
Hình 1.17. Giản đồ phân tích đa kênh bằng hạt nano silica chứa hai loại tâm
màu với tỷ lệ nồng độ hai tâm màu khác nhau 33
Hình 1.18. Nguyên tắc hoạt động của máy đếm dòng tế bào (flow cytometry)
35
Hình 1.19. Cấu trúc của một phân tử kháng thể
38

Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của các chất precursor và hoạt động bề mặt
42
Hình 2.2. Sơ đồ chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu RB có các nhóm chức
NH
2
, NH
2
+OH 43
Hình 2.3. Sơ đồ phản ứng loại bỏ nhóm OH trên bề mặt hạt NH
2
+OH
44
Hình 2.4. Sơ đồ chế tạo hạt nano silica có các nhóm chức –OH và –SH
44
Hình 2.5. Phương trình phản ứng tạo nhóm –SH trên bề mặt hạt nano
45
Hình 2.6. Cấu trúc phân tử SH – PEG – COOH
45
Hình 2.7. Sơ đồ minh họa quá trình bọc BSA lên hạt nano silica
46
Hình 2.8. Phương trình phản ứng tạo liên kết amide
48
Hình 2.9. Mô hình quá trình bọc SA bằng cách trực tiếp (a) và gián tiếp (b) .
48
Hình 2.10. Cấu trúc hóa học của TEOS (a), FITC (b)
50
Hình 2.11. Phản ứng giữa FITC và APTES
51
Hình 2.12. Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
micelle đảo 52

Hình 2.13. Phản ứng đồng trùng hợp của FITC@APTES với TEOS để tạo
liên kết hóa trị của chất màu trong hạt silica 52
Hình 2.14. Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
Stober 53
Hình 2.15. Phản ứng tạo nhóm chức NH
2
trên bề mặt hạt nano
54
Hình 2.16. Cấu trúc hóa học của Disodium 3-
[dihydroxy(oxido)silyl]propanoate (a) và phản ứng tạo nhóm chứ
c COOH
trên bề mặt hạt nano (b) 55
Hình 2.17. Các trạng thái năng lượng của phân tử hai nguyên tử
59
Hình 2.18. Phổ hấp thụ của RB và R6G
65
Hình 2.19. Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời
gian 68
Hình 2.20. Sơ đồ nguyên lý hệ đếm Flow cell
71
Hình 3.1. Ảnh TEM của hạt nano SiO
2
-NH
2
&OH (a), SiO
2
-NH
2
(b), SiO
2

-
COOH (c), SiO
2
-OH (d) và SiO
2
-SH (e)……………………………………………. 74
Hình 3.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO
2
-NH
2
&OH
74



Hình 3.3. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO
2
-NH
2

75
Hình 3.4. Phổ hấp thụ hồng ngoại của HS-PEG-COOH……………………
76
Hình 3.5. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO
2
-COOH
76
Hình 3.6. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO
2
-OH………………

77
Hình 3.7. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO
2
-SH………………
77
Hình 3.8. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica
với các nhóm chức khác nhau 80
Hình 3.9. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt
nano silica với các nhóm chức khác nhau 80
Hình 3.10. Mối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và
Γ
r
/
Γ
nr

(b)………………………………………………………………………………………… 82
Hình 3.11. Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có nhóm chức khác
nhau………………………………………………………………………………………
84
Hình 3.12. Phân bố kích thước hạt theo cường độ của phương pháp DLS:
SiO
2
-NH
2
&OH (a), SiO
2
-NH
2
(b), SiO

2
-COOH (c), SiO
2
-SH (d)……………… 85
Hình 3.13. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica
với các kích thước khác nhau 88
Hình 3.14. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt
nano silica với các kích thước khác nhau 88
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nền silica lên cường độ huỳnh quang và HSLT các
mẫu 90
Hình 3.16. Mối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và
Γ
r
/
Γ
nr

(b)……………………………………………………………………………………… 92
Hình 3.17. Cường độ huỳnh quang theo các hướng của chất màu RB trong
nước (a), dung môi ethanol (b) và trong các hạt nano kích thước khác nhau
(c, d, e, f)………………………………………………………………………………
92
Hình 3.18. Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có kích thước khác
nhau………………………………………………………………………………………

94
Hình 3.19. Kích thước các mẫu theo các phương pháp đo khác nhau………….
95
Hình 3.20. a) Ảnh SEM của các hạt nano silica SiOH
2

-OH trước khi bọc BSA
96



b) Ảnh TEM của các hạt nano silica SiOH
2
-OH sau khi bọc BSA….
Hình 3.21. a) Phổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO
2
-OH@BSA trong nước
b) Phổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO
2
-OH@BSA trong PBS………… 96
Hình 3.22. a) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO
2
-OH@BSA trong nước
b) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO
2
-OH@BSA trong PBS…… 97
Hình 3.23. a) Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong nước
b) Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong PBS 97
Hình 3.24. Ảnh SEM của SiO
2
-OH@SA@BSA
98
Hình 3.25. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của SiO
2
-OH
bọc SA trong nước…………………………………………………………………… 99

Hình 3.26. a) Phổ huỳnh quang của SiO
2
-OH bọc SA trong PBS
b) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO
2
-OH bọc SA trong PBS… 99
Hình 3.27. Phổ hấp thụ (a), hấp thụ chuẩn hóa (b) của chất màu FITC tự do
và FITC@APTES. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ của FITC@APTES vào lượng
ethanol (c)……………………………………………………………………………….
101
Hình 3.28. Ảnh TEM của các hạt nano SiO
2
@FITC với FITC@APTES pha
trong môi trường ethanol bão hòa (a) và pha loãng 10 lần (b)…………………
102
Hình 3.29. Phổ hấp thụ chuẩn hóa của phân tử FITC tự do, hợp chất
FITC@APTES trong ethanol và FITC trong các hạt nano silica……………….
103
Hình 3.30. Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và
trong các hạt nano silica………………………………………………………………
103
Hình 3.31. Phổ huỳnh quang của hợp chất FITC@APTES với lượng ethanol
khác nhau……………………………………………………………………………….
103
Hình 3.32. Ảnh TEM của các hạt nano SiO
2
@FITC theo phương pháp
Stober

104

Hình 3.33. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của hợp chất
FITC@APTES trong ethanol và trong các hạt nano silica với các kích thước
khác nhau………………………………………………………………………………
106



Hình 3.34. Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và
trong các hạt nano silica với các kích thước khác nhau………………………….
106
Hình 3.35. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu
trong môi trường Tris………………………………………………………………….
110
Hình 3.36. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu
hạt nano có nhóm chức năng COOH với lượng DDOS khác nhau……………
112
Hình 4.1. Hình ảnh các tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7………………………
118
Hình 4.2. Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn đánh dấu bằng hạt nano
silica pha RB với các nồng độ vi khuẩn khác nhau………………………………
119
Hình 4.3. a) Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn E. coli O157:H7 với
nồng độ khác nhau đánh dấu bằng hạt nano silica chứa tâm màu RB
b) Đường cường độ huỳnh quang theo số lượng vi khuẩn (đường màu đỏ) và
đường fit (màu xanh, Y = 0,008.X)…………………………………………………
120
Hình 4.4. So sánh hai phương pháp phát hiện vi khuẩn: phương pháp đếm
khuẩn lạc (trái) và phương pháp phổ huỳnh quang (phải)……………………….
121
Hình 4.5. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiRB@HER2

(A) và với SiRB@BSA B)
122
Hình 4.6. Ảnh huỳnh quang tế bào HeLa sống ủ với phức hệ SiRB@HER2 (A)
và với SiRB@BSA (B)
122
Hình 4.7. Ảnh huỳnh quang tế bào KLP4 cố định ủ với phức hệ SiRB@HER.
123
Hình 4.8. Ảnh huỳnh quang kết hợp tế bào KPL4 và Hela cố định ủ với phức
hệ SiRB@HER2, nhuộm kháng thể 2-M488………………………………
123
Hình 4.9. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ với phức hệ SiRB@HER2 ở 4
khoảng thời gian khác nhau…………………………………………………………
124
Hình 4.10. Đối chứng tế bào HeLa:KPL4= 1:1…………………………………
125
Hình 4.11. Đối chứng tế bào HeLa:KPL4= 1:1…………………………………
125



Hình 4.12. Đối chứng tế bào HeLa:KPL4 = 5:1………………………………….
126
Hình 4.13. Ảnh truyền qua (a) và huỳnh quang (b) của tế bào BT-474 sau khi
gắn kết với phức hệ SiFITC@HER2
127

1

MỞ ĐẦU
Vật liệu phát huỳnh quang ứng dụng trong sinh học có sự tăng trưởng vượt
bậc trong 20 năm trở lại đây do phép phân tích sử dụng huỳnh quang có độ nhạy
cao, không phá hủy mẫu và không độc [162]. Các phương pháp, thiết bị đo huỳnh
quang hiện nay được sử dụng trong giám sát môi trường, hóa học lâm sàng, sàng lọc
DNA và các phép phân tích gen bằng lai hóa huỳnh quang tại chỗ… Sự phát triển
này có phần đóng góp của ngành hóa học chế tạo các chất đánh dấu huỳnh quang
gồm các chất màu hữu cơ và các protein tự phát quang.
Số lượng các phân tử chất màu sử dụng trong các nghiên cứu y – sinh lên
tới hàng trăm loại [134]. Tuy có rất nhiều ưu điểm nhưng các chất màu hữu cơ có
nhược điểm là độ bền quang kém, dễ bị phân hủy dưới ánh sáng kích thích (hiện
tượng tẩy quang), dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường. Phổ hấp thụ của các chất màu
hẹp nên đối với mỗi loại chất màu đòi hỏi một nguồn laser kích thích phù hợp, vì
vậy các kính hiển vi huỳnh quang hiện đại thường được trang bị tới 3 – 4 laser khác
nhau và các phép phân tích đa kênh sẽ khó thực hiện với các chất màu. Ngoài ra, sự
phát triển của sinh học phân tử đòi hỏi nghiên cứu các quá trình sinh học diễn ra ở
mức phân tử, nội tế bào trong khoảng thời gian dài. Vì vậy độ bền quang kém của
phân tử màu hữu cơ là một trở ngại cho những nghiên cứu này. Đặc biệt đối với
việc hiện ảnh cắt lớp 3D thì trở ngại lớn nhất là sự phân hủy quang của các chất
phát quang trong quá trình thực hiện cắt lớp liên tiếp theo trục z; sự phân hủy quang
này làm ảnh hưởng tới việc dựng ảnh cấu trúc 3D. Do đó việc tìm kiếm các loại
chất đánh dấu sinh học mới vẫn là vấn đề thời sự trong các nghiên cứu của khoa học
vật liệu trên thế giới.
Trong những năm vừa qua có những cải tiến lớn trong các chất đánh dấu
sinh học bằng sự ra đời của các chất đánh dấu trên cơ sở vật liệu nano với các ưu
điểm nổi trội so với các chất đánh dấu cổ điển như: độ bền quang, độ tương phản
cao và bền trong môi trường sinh học. Các ưu điểm đó của các chất đánh dấu nano
tạo ra khả năng phát hiện các đích sinh học với độ nhạy cao trong các điều kiện
khác nhau: từ chẩn đoán in vitro cho tới hiện ảnh in vivo
[45,52,82,110,141,145,150,153,155,157]. Có thể liệt kê một số loại hạt nano thường

dùng trong các phân tích sinh học như: các chấm lượng tử [17,30,66,101,104,158],
các hạt kim loại (vàng và bạc) [18,28,61,147], các hạt từ [100], các hạt đất hiếm họ
Lantan [144,161], các hạt nano chứa chất màu và một số vật liệu nano khác
[34,84,113,124,160]. Mỗi loại hạt nano có các ưu điểm vượt trội riêng của mình và
thích ứng với các ứng dụng khác nhau trong lĩnh vực phân tích sinh học. Bên cạnh
2



đó, một hướng nghiên cứu phát triển mạnh hiện nay là chế tạo vật liệu đa chức
năng. Phối hợp các vật liệu đơn: hạt từ, kim loại, silica và polymer sẽ cho các hạt
nano cấu trúc lõi/vỏ đa lớp, đa chức năng sử dụng trong cả chẩn đoán và cả điều trị:
vừa dẫn đường và mang thuốc, vừa phát hiện, vừa làm giàu, vừa diệt tế bào
[70,81,137].
Hạt nano silica chứa tâm màu là các hạt SiO
2
xốp kích thước nano chứa
được một số lượng lớn phân tử màu hữu cơ trong một hạt silica đơn. Nền silica lại
ổn định về cấu trúc, không độc, có khả năng tương thích sinh học cao. Sử dụng các
phương pháp và quy trình thích hợp, một số lượng lớn chất màu có thể đưa vào
trong một hạt nano silica đơn (từ hàng chục tới hàng nghìn phân tử màu) [38]. Do
đó, các hạt nano silica chứa chất màu có độ chói và khuếch đại tín hiệu quang cao
gấp nhiều lần so với phân tử màu đơn lẻ [70,97,99,117]. Độ chói của tín hiệu huỳnh
quang của các hạt nano silica có thể được điều khiển bằng số phân tử chất màu
trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh
quang. Nếu lựa chọn các ứng dụng phân tích sinh học thích hợp, các hạt nano silica
có thể tạo ra những cải thiện đáng kể trong độ nhạy phân tích. Hơn nữa, do bị cầm
giữ trong nền silica, các chất màu được bảo vệ khỏi các ảnh hưởng của môi trường.
Mặt khác, do nền silica chứa rất ít oxy tự do nên phân hủy quang cũng được giảm
thiểu [93,154]. Độ bền quang cao cho phép các hạt nano silica được sử dụng trong

các ứng dụng đòi hỏi cường độ kích thích mạnh trong thời gian dài. Hơn nữa, các
hạt silica với nhóm –OH trên bề mặt có thể tham gia phản ứng hoá học để tạo các
nhóm chức có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử sinh học như là amin (-
NH
2
), carboxyl (-COOH) hay thiol (-SH) [87,88,93,100,112,115]. Bằng cách điều
chỉnh các thông số chế tạo, có thể điều khiển kích thước hạt; số lượng tâm màu
trong hạt cũng như loại tâm màu đưa vào, do đó người ta có thể tạo ra một nhóm
lớn các hạt phát quang với các tính chất quang đa dạng dùng trong đánh dấu. Bản
thân silica là chất thân thiện với môi trường sinh học, do đó chúng có thể là các hạt
đa chức năng: vừa phát hiện và vừa mang thuốc trị bệnh
[26,52,55,57,62,63,81,84,92,106]. Vì vậy, các hạt silica nằm trong thế hệ các chất
đánh dấu sinh học mới, hứa hẹn được sử dụng rộng rãi trong các phân tích và đánh
dấu sinh học.
Các hạt nano silica chứa các phân tử màu (tâm màu) hữu cơ thường được
chế tạo bằng 3 phương pháp: Stober, micelle thuận và micelle đảo. Điểm cốt lõi của
việc chế tạo là tạo các phản ứng sol-gel của các alkoxit silic trong các trung tâm
phản ứng kích thước nano có chứa tâm màu, từ đó hình thành các mạng nền SiO
2

3



xốp kích thước nano với các tâm màu nằm trong các lỗ xốp hoặc được gắn với
mạng nền bằng liên kết đồng hóa trị. Kích thước của hạt phụ thuộc vào kích thước
của trung tâm phản ứng. Có hai cách để kết hợp tâm màu với nền silica. Cách thứ
nhất sử dụng liên kết cộng hóa trị của phân tử màu với mạng nền silica
[80,135,136], cách thứ hai là bẫy các phân tử chất màu vào trong mạng nền silica
(bằng tương tác tĩnh điện, Van der Waals…) [159]. Tùy thuộc vào tính chất của tâm

màu: phân cực hay không phân cực, tan trong nước hay trong dung môi…, người ta
sẽ lựa chọn một trong ba phương pháp nêu trên để chế tạo các hạt nano silica chứa
tâm màu. Phương pháp lựa chọn phải đáp ứng các yêu cầu: i) giữ được các tâm màu
trong mạng nền silica không bị thất thoát ra ngoài môi trường; ii) tính chất phát
quang của tâm màu không bị ảnh hưởng nhiều bởi quá trình chế tạo [68,70].
Phương pháp micelle thuận thường dùng để chế tạo các hạt nano silica chứa
tâm màu kỵ nước, không phân cực; phương pháp micelle đảo thường dùng để chế
tạo các hạt nano silica chứa tâm màu ưa nước, tâm màu phân cực. Ưu điểm của hai
phương pháp mày là tạo được các hạt nano silica kích thước nhỏ, rất đơn phân tán
và tâm màu được phân bố đều trong các lỗ xốp của nền nên giảm thiểu được hiện
tượng dập tắt huỳnh quang do va chạm. Có thể đưa được một lượng lớn tâm màu
vào trong một hạt nano [1,24,25,50,54,60,85,133]. Nhược điểm của các phương
pháp này là chế tạo phức tạp do phải sử dụng các chất hoạt động bề mặt để tạo các
trung tâm phản ứng, do đó cần phải có khâu rửa hoạt động bề mặt sau khi chế tạo để
sử dụng được các hạt silica. Sử dụng các phương pháp micelle có thể chế tạo được
các hạt silica kích thước 10–100 nm [1,24,25,50,54,60,85,133]. So với các phương
pháp micelle thì phương pháp Stober đơn giản hơn vì không sử dụng hoạt động bề
mặt, tuy nhiên các hạt chế tạo bằng phương pháp này thường có kích thước lớn hơn
50–2000 nm [24,25,50,60,81,133,141,146].
Van Blaaderen và cộng sự [135] lần đầu tiên đã đưa chất màu fluorescein
isothiocyanate (FITC) vào trong hạt nano silica. Họ liên kết phân tử chất màu với
precursor APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) bằng liên kết đồng hóa trị, sau đó
sử dụng phương pháp Stober cho quá trình thủy phân và đồng ngưng tụ của liên kết
chất màu – APTES với TEOS (triethoxysilane) để tạo hạt nano silica. Sử dụng
phương pháp Stober, các loại tâm màu khác nhau như: fluorescein isothiocyanate,
Oregon green, rhodamine B (RB), rhodamine 6G (R6G), tetramethylrhodamine,
Texas red, 6-carboxyl-X-rhodamine, and cyanine Cy5, Ru(bpy), Nile Red… đã
được đưa vào trong hạt nano silica.
4

Sử dụng phương pháp micelle đảo, Weihong Tan và cộng sự đã chế tạo
được các hạt nano silica chứa các tâm màu khác nhau như : Tris(2,2 0-
bipyridyl)dichlororuthenium(II) (RuBpy), tetramethylrhodamine (TMR), TMR-
dextran hay fluorescein-dextran [116,118,130,163]. Ngoài ra còn một số loại chất
màu khác cũng được sử dụng để đưa vào trong hạt nano như: methylene blue (MB)
[29], rhodamine 6G (R6G) [130], tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)
[75] và rhodamine bisothiocyanate (RBITC) [136]. Đối với các chất màu kỵ nước,
để người ta thường liên kết chúng với nhóm dextran – là nhóm ưa nước, sau đó đưa
các chất màu này vào trong hạt nano silica bằng phương pháp micelle đảo, ví dụ
như fluorescein, Alexa Fluor 647.
Sử dụng phương pháp micelle thuận, Qian và cộng sự [103] đã chế tạo các
hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ kị nước Nile Red, Prasad và cộng sự đã chế
tạo hạt nano ORMOSIL chứa chất màu rhodamine 6G và một số chất màu khác
[22,65].
Một trong các ứng dụng quan trọng nhất của các hạt nano trong y - sinh là
đánh dấu cả in vitro và in vivo tế bào ung thư [33,41-
43,54,56,58,69,71,86,90,94,105,107,114,117,142,143,148-152,164]. Nhóm của
Santra đã chế tạo được hạt nano silica kích thước 70 nm chứa chất màu FITC bằng
phương pháp micelle đảo, sau đó được biến đổi bề mặt để có thể thâm nhập vào
màng tế bào và mô [117]. Các hạt nano chế tạo được có hiệu quả cao trong việc
đánh dấu các tế bào ung thư phổi (A549). Kết quả cũng cho thấy, có thể sử dụng hạt
nano này để chấn đoán và điều trị trong não thông qua thí nghiệm thành công trong
não chuột. Ông và cộng sự đã sử dụng hạt nano silica pha tâm màu FITC để nhận
biết các tế bào ung thư như tế bào ung thư ở miệng [121], tế bào ung thư phổi
[76,119,122]. Weihong Tan và đồng nghiệp đã sử dụng hạt nano silica kích thước
60 nm chứa Rubpy đánh dấu các tế bào bạch cầu người [102,118,120]. Tương tự
như vậy, ông và cộng sự đã báo cáo một phương pháp để nhận biết các tế bào ung
thư gan HEPG sử dụng hạt nano silica pha chất màu FITC [46]. Zhao và cộng sự đã

chế tạo hạt nano silica chứa chất màu RuBpy và sử dụng để phát hiện vi khuẩn E.
coli O157:H7 [164]. Mới đây, các hạt nano silica chứa tâm màu phát hồng ngoại đã
được chế tạo thành công và ứng dụng để hiện ảnh dây thần kinh não chuột [68]. Xu
hướng nghiên cứu hiện nay là chế tạo các hạt nano silica đa thành phần: chứa các
tâm màu phát quang trong vùng hồng ngoại gần và thuốc, ưu tiên là thuốc chữa ung
thư để sử dụng trong các thí nghiệm in vivo: vừa theo dõi đường đi của thuốc, vừa
hiện ảnh khối u và vừa nhả thuốc để điều trị [35].