Định tính và định lượng đồng thời paracetamol và acid mefenamic trong viên nén bao phim pamesic bằng phương pháp HPLC

Bộ Y Tê
TRƯỜNG ĐAI HOC Dươc HÀ NÔI
m
BÙI THU HUÊ
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI
PARACETAMOL VÀ ACID MEFENAMIC TRONG VIÊN
NÉN BAO PHIM PAMESIC BANG ph ư ơ n g p h á p HPLC
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999-2Í
Ặ /ị.itS Ịrù ỉh ,
ỉ \ẵ
Người hướng dẫn: TS. Thái Phan Quỳnh
TS. Thái Duy Thìn
Nơi thực hiện: - Phòng Hoá Lý 1- Viện Kiểm nghiệm
- Bộ môn Hoá dược- Trường Đại học
Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: Tháng 10/2003 - 5/2004
Hà Nội - 5/2004
&
'ÍX.LC » 3 . . . /
réé-
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá lý 1 - Viện
kiểm nghiệm và bộ môn Hoá dược - Trường đại học Dược Hà Nội trong thời
gian từ tháng 10/2003 đến tháng 5/2004 . Trong quá trình thực hiện khoá luận
tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô hướng dẫn, các thầy cô
trong bộ môn Hoá dược và các cán bộ của phòng Hoá lý 1 - Viện kiểm
nghiệm.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đối với:
- TS . Thái Phan Quỳnh Như (Trưởng phòng Hoá lý 1-Viện kiểm
nghiệm)
- TS . Thái Duy Thìn (Phó chủ nhiệm bộ môn Hoá dược-Trường đại

học Dược Hà Nội)
đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá dược
và các cán bộ kỹ thuật của phòng Hoá lý 1 - VKN đã giúp đỡ tôi hoàn thành
tốt khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn thư viện trường đại học Dược Hà Nội đã cung
cấp những tài liệu có liên quan.
Hà nội, tháng 5/2004
Sinh viên
Bùi Thu Huê
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đ ề 1
Phần 1. Tổng quan
3
1.1. Paracetamol 3
1.2. Acid meíenamic 5
1.3. Kỹ thuật HPLC 6
1.3.1. Khái niệm cơ bản 6
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng 8
1.3.3. Hệ thống HPLC 11
1.3.4. Pha tĩnh 12
1.3.5. Pha động 13
1.3.6. Cách đánh giá pic 14
1.3.7. Cách tính kết quả 14
Phần 2. Thực nghiệm và kết quả 16
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 16
2.1.1. Hoá chất - Thiết bị 16
2.1.2. Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu 17
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 19

2.2.1 . Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 19
2.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 22
2.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 24
2.2.4. Khảo sát độ chính xác của phương pháp 28
2.2.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp 31
2.2.6. ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định tính và định
lượng đồng thời paracetamol và acid meíenamic trong hai mẫu
(mẫu 3 và mẫu 4) viên nén bao phim Pamesic

34
2.3. Bàn luận 37
Phần 3. Kết luận và đề xuất
39
1.Kết luận 39
2. Đề xuất 40
Tài liệu tham khảo 41
CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
AM
Acid meíenamic
cox
Cyclooxygenase
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
mcg
Microgam
NSAID
Thuốc chống viêm giảm đau phi steroid
PA
Paracetamol
PG Prostaglandin

STT Số thứ tự
TB Trung bình
THF T etrahy drofuran
VKN
Viện Kiểm Nghiệm
ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngày nay nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ ngày một tăng, cùng với
sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là trong lĩnh vực dược, các nhà
công nghiệp dược đang hướng tới mục tiêu nâng cao hiệu quả điều trị và giảm
bớt tác dụng không mong muốn của dược phẩm. Từ đó nhiều dược chất khác
nhau được phối hợp trong một dạng bào chế . Nhóm thuốc chống viêm - hạ
nhiệt - giảm đau dạng phối hợp đang được sản xuất, lưu hành và sử dụng ngày
một rộng rãi, với rất nhiều biệt dược khác nhau, trong đó phần lớn gồm
paracetamol phối hợp với một hoặc nhiều dược chất khác như: clorpheniramin
maleat, phenylpropanolamin hydroclorid, dextromethorphan hydrobromid,
quinin sulíat, cafẹin, codein Gần đây một sự kết hợp mới nhằm làm tăng
tác dụng giảm đau và bổ sung tác dụng chống viêm cho chế phẩm đã được sản
V/
xuất với công thức:
Paracetamol : 500 mg
Acid meíenamic : 250 mg
Biệt dược thuốc trong nước đầu tiên là viên nén bao phim Pamesic của công
ty dược và vật tư y tế Tiền Giang.
Trong các dược điển [1, 12, 15, 16, 17] chưa có chuyên luận cho dạng
thuốc có chứa hai thành phần này. Do độ tan của hai chất tương tự nhau :đều
có tính acid nên dễ tan trong kiềm, khó tan trong nước, không tan trong dung
môi hữu cơ như cloroform, ether, tan được trong ethanol; vì vậy rất khó chiết
tách để định lượng riêng biệt bằng đo quang hay chuẩn độ acid-kiềm, nitrit
Việc quản lý, kiểm tra chất lượng thuốc là một đòi hỏi tất yếu cho việc
đảm bảo chất lượng thuốc cũng như đảm bảo hiệu quả điều trị. Vì vậy phải có

một phương pháp kiểm nghiệm nhanh chóng, chính xác và thuận tiện, phù hợp
với điều kiện trang thiết bị hiện nay của đa số các phòng và trung tâm kiểm
nghiệm.
1
Trước yêu cầu đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định tính và
định lượng đồng thời paracetamol và acid mefenamic bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” với mục tiêu :
- Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời
paracetamol và aeid meíenamic .
- Góp phần xây dựng tiêu chuẩn viên nén bao phim Pamesic cho cơ sở sản
xuất.
2
Phầnl. TỔNG QUAN
1.1. PARACETAMOL [1, 4, 8,12, 13, 14, 15,16,17]
■ Công thức cấu tạo :
HO

( ( 3 ) )

NH

COCH3
C8H9N 02 (M= 156,16)
Tên khoa học : N - acetyl- para- amino phenol
hoặc: para- hydroxy - acetanilid
Tên khác : Acetaminophen
■ Tính chất:
- Tinh thể hoặc bột kết tinh trắng, không mùi, vị đắng nhẹ
- Nhiệt độ nóng chảy : 168 - 172°c
- Độ tan : ít tan trong nước lạnh (1/70), tan nhiều hơn trong

nước nóng, tan trong ethanol từ 1/7 đến 1/10. Rất ít tan trong cloroíorm,
hoàn toàn không tan trong ether. Tan hoàn toàn trong dung dịch kiềm do
tạo muối phenolat.
- Có khả năng hấp thụ quang, cực đại hấp thụ trong dung môi
methanol là 245 nm, trong môi trường kiềm là 257 nm.
■ Tác dụng dược lý : Paracetamol ức chế enzym tổng hợp prostaglandin,
nên làm giảm nhạy cảm với các chất trung gian gây đau, có tác dụng
giảm đau. Giảm tổng hợp PGEị, PGE2 làm tăng thải nhiệt và giảm sản
nhiệt, nên có tác dụng hạ sốt. Paracetamol không có tác dụng chống
viêm và chống ngưng kết tiểu cầu.
- Chỉ định : Hạ sốt do mọi nguyên nhân gây sốt (sốt do virus, sốt
xuất huyết .)• Giảm đau, sử dụng cho đau nhẹ, đau ngoại vi.
- Thận trọng : Quá liều paracetamol gây hoại tử tế bào gan. Không
uống rượu và các thuốc gây độc cho gan trong thời gian dùng thuốc.
3
- Liều dùng : Người lớn : 300 đến 500 mg/lần X 3 - 4 lần/ngày.
Tối đa : không quá 4 g /ngày
Trẻ em : 60 - 325 mg/lần x3 - 4 lần/ngày
■ Các dạng bào c h ế: Viên nén, viên nén phân tán, viên nén hoà tan, viên
nang, viên đạn, dung dịch uống, hỗn dịch uống, các dạng bào chế phối
hợp
Các phương pháp đã được áp dụng đ ể định lượng paracetamol
- Phương pháp đo quang [1, 12, 15, 16, 17]
Nguyên tắc : Paracetamol có khả năng hấp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ
của paracetamol trong dung môi methanol là 245 nm, trong môi trường
kiềm là 257 nm. Kết quả được tính toán dựa vào giá trị mật độ quang đo
được và độ hấp thụ riêng hoặc so sánh với chuẩn.
- Phương pháp chuẩn đô nitrit [8]
Nguyên tắc : Thuỷ phân paracetamol trong môi trường acid (HC1 10%)
và nhiệt độ tạo thành amin thơm bậc một. Chuẩn độ bằng dung dịch natri

nitrit (NaN02) trong môi trường acid tạo hợp chất diazoni (phản ứng diazo
hoá), nhận biết điểm kết thúc bằng chỉ thị tropeolin hoặc điện thế kế.
- Phương pháp chuẩn đỏ bàng ceri IV n, 12]
Nguyên tắc : Trong dung dịch acid, paracetamol sau khi thuỷ phân là
một chất khử, ceri IV là một chất oxy hoá sẽ bị khử (nhận thêm 1 electron)
chuyển thành ceri III, phát hiện điểm kết thúc bằng íerroin (phức chất sắt
của o-phenatrolin). sắt ở trong phức này có thể là sắt II hoặc sắt III, phức
chất sắt II có màu đỏ, phức chất sắt III có màu xanh. Tại điểm tương đương
khi bắt đầu thừa ceri IV, phức chất sắt II chuyển thành sắt III, làm dung
dịch đổi màu từ đỏ sang xanh.
- Phương pháo Kieldahl [8]
4
Nguyên tắc : Phân huỷ các hợp chất chứa nitơ bằng cách đun với
H2S04(đặc) với sự có mặt của kali hay natri sulphat. Khi đó nitơ bị vô cơ
hoá kết hợp với H2S04 thành (NH4)2S04. Thêm NaOH vào hỗn hợp phản
ứng rồi cất kéo NH3 giải phóng vào dung dịch chuẩn H2S04 0,1N dư.
Chuẩn độ H2S04 dư bằng NaOH 0,1N.
- Phương pháp HPLC [9, 10, 11, 17]
Nguyên tắc : Dựa vào sự phân bố khác nhau của paracetamol giữa pha tĩnh
và pha động, paracetamol sau khi đi qua cột tách sẽ được chuyển đến detector
và cho tín hiệu định lượng là diện tích hoặc chiều cao pic.
1.2. ACID MEFENAMIC [4, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17]
■ Công thức cấu tạo :
COOH CH^
C15H15N 02 (M = 241,29)
Tên khoa học : Acid 2 [ ( 2,3 - dimethyl phenyl) amino ]benzoic
Hoặc: Acid N - (2,3 - xylyl) anthranilic.
■ Tính chất:
- Bột kết tinh trắng đến trắng ngà, không mùi, để lại vị đắng nhẹ.
- Nhiệt độ nóng chảy : 230 - 231°c

- Độ tan : Rất khó tan trong nước, ít tan trong cloroíorm (1/25),
ít tan trong ether (1/80). Tan hoàn toàn trong dung dịch kiềm
- Có khả năng hấp thụ quang, cực đại hấp thụ ở môi trường acid
là 279 nm, ở môi trường kiềm là 285 nm.
■ Tác dụng dược lý : Tác dụng giảm đau , hạ sốt tương tự paracetamol.
Ngoài ra giống các NSAID khác, acid meíenamic còn có tác dụng
chống viêm tốt do nó ức chế enym c o x .
5
- Chỉ định : Chống viêm, giảm đau trong các bệnh về xương
khớp , đau sau phẫu thuật, chấn thương, các chứng đau nửa đầu, đau răng,
đau lưng, đau khi thấy kinh
- Chú ý khi sử dụng : Acid meíenamic có tác dụng phụ gây loét
đường tiêu hoá và kéo dài thời gian chảy máu
- Liều dùng: Người lớn: 250 - 500 mg/lầnx2- 3 lần/ngày, uống
sau khi ăn no, tối đa không quá 1,5 g/ngày. Hoặc đặt một viên đạn
(250mg) vào buổi tối.
Trẻ em trên 6 tháng tuổi: 6,5 mg/kg/ngày, chia 3 lần.
■ Các dạng bào ch ế: Viên nang , viên nén, viên đạn
Các phương pháp đã được áp dụng đ ể định lượng acid mefenamic:
- Phương pháp acid - base r 12, 16]
Nguyên tắc : Acid meíenamic được hoà tan trong dung môi ethanol
(ethanol trước đó đã được trung tính hoá), sau đó chuẩn độ bằng dung dịch
NaOH 0,1M với chỉ thị phenolphtalein.
- Phương pháp HPLC [17]
Nguyên tắc : Dựa vào sự phân bố khác nhau của acid meíenamic giữa
pha tĩnh và pha động, acid meíenamic sau khi đi qua cột tách sẽ được chuyển
đến detector và cho tín hiệu định lượng là diện tích hoặc chiều cao pic.
1.3. KỸ THUẬT HPLC [2, 6, 7,13,17]
1.3.1. Khái niệm cơ bản
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách hoá lý dựa vào

ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không
đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất lỏng chảy
qua cột với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn
đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các
6
nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xẩy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân bố, trao
đổi ion hoặc rây phân tử.
• Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:
Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và
loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là
chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc ký
phân bố hay sắc ký chiết, nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký rây
phân tử. Cùng với pha tĩnh, để rửa giải chất tan ra khỏi cột cần phải có một
pha động. Như vậy nếu ta nạp một mẫu phân tích gồm hỗn hợp các chất
A,B,C vào cột tách, sau khi bơm dung môi pha động qua cột, các quá trình sắc
ký sẽ xảy ra. Kết quả là các chất sẽ được tách khỏi nhau sau khi đi qua cột.
Quyết định hiệu quả sự tách ở đây là tổng hợp các tương tác:
- Giữa chất tan với pha tĩnh
- Giữa chất tan với pha động
- Giữa pha tĩnh với pha động
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước tiên
khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại. Các tương tác được mô tả như sau :
Sự lưu giữ của mỗi chất được quy định bởi 3 lực thành phần Fj, F2, F3, trong
đó Fị, F2 là quyết định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. F| là lực giữ
chất phân tích trên cột, còn F2 là lực kéo nó đi ra khỏi cột. Fj, F2 khác nhau
tuỳ thuộc vào bản chất sắc ký của pha tĩnh, bản chất và tính chất của chất phân
tích, bản chất, thành phần và tốc độ dòng pha động. Kết quả là lực lưu giữ của
7
chúng khác nhau, các chất đựơc tách khỏi nhau sau khi đi qua cột, được phát

hiện bằng detector và chuyển qua bộ phận xử lý kết quả.
Tín hiệu phân tích định tính của mỗi chất là thời gian lưu của chất đó hay vị
trí của pic tương ứng trên sắc ký đồ, tín hiệu phân tích định lượng là diện tích
hoặc chiều cao pic thu được, phụ thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung
dịch đem đo HPLC.
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng.
• Thời gian lun và thể tích lưu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại và cho pic trên sắc ký đồ.
ềigrưd
Hình 1: sắc ký đồ của hai chất và cấc thông sô đặc trưng.
Nếu gọi tR là thời gian lưu giữ của một chất
T h ì: t R = tR —10
Trong đó: t’R là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh).
t0 là thời gian chết (thời gian không lưu giữ).
8
Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn , thời gian lưu của mỗi chất là
hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tuỳ thuộc vào bản
chất, cấu tạo và tính chất của chất đó. VI vậy thời gian lưu là đại lượng định
tính các chất.
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể
thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột
trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu.
• Hê số phân bố
Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha
tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố
được tính theo công thức :
Trong đó cs, CM là nồng độ chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ở
thời điểm cân bằng.
• Thừa số dung lương

Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong
pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng
k'=Q- = K x ^
Qm vm
Trong đó Qs, Qm là lượng chất tan có trong pha tĩnh và pha động
vs, VM là thể tích pha tĩnh và pha động
Có thể tính k’ theo một công thức khác :
kiJjLllsL
to
• Hê số chon loc
9
Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có các giá trị k’ khác nhau, hệ số
chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký.
_ K-g _ & g _ tjịg — Íq _ f
^ , 4 k A ^ RA ^ o t 114
ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy a luôn lớn hơn
1, a càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Thường phân tích trong
điều kiện a trong khoảng 1,5 đến 2.
• Số đĩa lý thuyết và chiểu cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số : Số đĩa lý thuyết (N)
hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc kỷ được coi như có N tầng lý thuyết,
ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng
mới. Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H. Đĩa lý
thuyết được định nghĩa như là một khu vực của hệ thống phân tách mà trong
đó thiết lập một cân bằng nhiệt động học giữa nồng độ trung bình của chất tan
trong pha tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức :
= 16x
í t >

R
2
hoặc 5,54 X
ì
l W)
w
\ vv M 2 J
Trong đó w : Là chiều rộng pic ở đáy pic
Wì/2 : Là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức :
n - ế
N
Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký. Với một điều kiện sắc ký nhất định,
chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi
chất phân tích.
• Đố phân giải (Rq)
10
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong
một điều kiện sắc ký đã cho . Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính
theo 1 trong 3 công thức sau:
ằ-r'"* M c ‘i 8 4 " , : '" 1 hoặc
WA+WB WV2(A)+WV2(B) “ a l + k'B 4
• Phương trình Van-Deemter
Phương trình Van-Deemter mô tả ảnh hưởng của tốc độ động dòng pha động
và các thông số động học khác đến hiệu lực của cột sắc ký
/ / = A 4

b c xu
u
Trong đó H : Chiều cao đĩa lý thuyết

u : Tốc độ dòng pha động
A,B,C : Các hệ số thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc ký.
Trong đó: - A : Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy (eddy diffusion)
- B/u : Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán dọc của các phân tử
chất tan theo phương dòng chảy của pha động (longitadinal
diffussion).
- c : Mô tả ảnh hưởng của sự chuyển khối (mass transíer).
• Hê số đối xứng (T)
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức:
„ Wx
T = -Z-
2A
Trong đó Wx là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
A là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến
chân đường cong phía trước, ở tại 1/20 chiều cao pic.
1.3.3. Hệ thống HPLC
Theo thứ tự từ đầu đến cuối của hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính
sau :
11
• Bình chứa dung môi
• Bơm cao áp : đẩy pha động qua cột sắc ký
• Bộ phận tiêm mẫu : tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định
• Cột tách (pha tĩnh)
• Detector
• Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính
1.3.4. Pha tĩnh
• Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp
chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính
cỡ hạt từ 3 - 10 ụm, diện tích bề mặt hạt thường từ 50 - 500 m2/g-
• Phân loại

- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử.
Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong
kỹ thuật HPLC.
- Căn cứ theo trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai
loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất
lỏng ta có sắc ký lỏng-lỏng (LLC).
- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha
thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion.
- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành
hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài).
• Điều kiện đối với một pha tĩnh
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định
- Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó).
12
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
1.3.5. Pha động
• Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi
cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất linh động và
dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi
trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ nhất định. Nó cũng có thể là dung dịch các
muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có
các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.
• Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của
một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả
sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hưởng đến :
- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lưu giữ của chất tan
- Hiệu lực của cột tách
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh
- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký
• Điều kiện đối với một pha động
- Phải trơ đối với pha tĩnh
- Hoà tan được chất cần phân tích
- Bền vững theo thời gian
- Có độ tinh khiết cao
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
- Phù hợp với loại detetor dùng để phát hiện các chất phân tích
- Có tính kinh tế và không quá hiếm.
• Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động:
- Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động
13
- Thành phần các chất tạo ra pha động
- Tốc độ dòng pha động
- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp
ion)
1.3.6. Cách đánh giá pic
• Đánh giá diên tích pic : Diện tích pic của một chất tương ứng với tổng
lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích
phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5%) hoặc máy tích phân cơ
học (sai số khoảng 1,3%). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị
trôi đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm
đầu và điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt đối với
nồng độ trung bình, vừa và cao.
• Đánh giá chiều cao pic : Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic
(khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích
pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá sắc phổ. Phương pháp này chỉ áp dụng

khi các chỉ số k’ là hằng định
Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì việc xác định chiều cao pic
sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.3.7. Cách tính kết quả
• Phương pháp ngoai chuán : Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu
chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện. Kết quả của chất chưa biết được tính
toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.
• Phương pháp nôi chuán : Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu
thử một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian
lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. Nó được tách
hoàn toàn và có nồng độ gần bằng nồng độ của chất phân tích và có cấu trúc
hoá học tương tự.
14
• Phương pháp thêm chuẩn : Chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC
khi có vấn đề ảnh hưởng của các chất phụ (ví dụ : tá dược). Dung dịch mẫu
thử được thêm một lượng xác định chất chuẩn. Các pic thu được của cả hai
dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một
điều kiện sắc ký. Kết quả được tính toán dựa vào sự chênh lệch nồng độ
(lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích hoặc chiều cao pic.
• Phương pháp tính theo phán trăm diên tích pic : Nồng độ của mẫu thử được
tính toán dựa trên diện tích pic tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích pic chất thử
trên tổng diện tích toàn bộ pic có trong sắc ký đồ. Trong HPLC, phương pháp
này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau, nếu
không như nhau khi đó với mỗi chất cần có hệ số hiệu chỉnh.
15
Phần 2. THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1.1. Hoá chất - Thiết bị
a. Hoá chất
- Chuẩn paracetamol (chuẩn của Viện kiểm nghiệm, hàm lượng 100%)

- Chuẩn acid meíenamic (chuẩn của Viện kiểm nghiệm, hàm lượng
99,68%, độ ẩm 0,02%).
- Acetonitril loại dùng cho HPLC
- Tetrahydroíuran loại dùng cho HPLC
- Acid phosphoric loại tinh khiết phân tích
- Nước cất.
b. Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : HP 1100, gắn với máy vi tính và
máy in
- Cột Lichrosorb RP18 ( 250x4 mm, 5 /um )
- Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu với đường kính lỗ màng lọc
0,45 /um
- Máy lắc siêu âm
- Máy đo pH
- Cân phân tích chính xác 0,1 mg
- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức chính xác 50,0 ml; 25,0
ml; 20,0 ml; ống đong, pipet chính xác, pipet thường, cốc có mỏ
và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
16
2.1.2. Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu
a. Đôi tượng nghiên cứu
Viên nén bao phim Pamesic do Công ty Dược và Vật tư y tế Tiền Giang
sản xuất có công thức :
( Tá dược : Tinh bột mì, HPMC, titan dioxyd, vàng tatrazin, sunset yellow,
tal, magie stearat, cồn 95°)
b. Nội dung nghiên cứu
• Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời
paracetamol và acid meíenamic trong hỗn hợp thuốc đa thành phần. Để xây
dựng chương trình sắc ký thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn :
Kiểu sắc ký áp dụng

Cột tách sử dụng
Các điều kiện về pha động (thành phần, tỷ lệ, và tốc độ dòng) để cho kết
quả tách tốt nhất.
Bước sóng thích hợp phát hiện hai chất.
• Để đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng được chúng tôi tiến hành:
Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
- Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất
Khảo sát độ chính xác của phương pháp (tiến hành trên mẫu 1 và mẫu 2).
Paracetamol : 500 mg
Acid meíenamic : 250 mg
Tá dược vừa đủ 1 viên.
Mẫu 1 có số kiểm soát: SKS 011102
Mẫu 2 có số kiểm soát: SKS 021202
Mẫu 3 có số kiểm soát: SKS 050404
Mẫu 4 có số kiểm soát: SKS 070404
17
Khảo sát độ đúng bằng hai phương pháp : Phương pháp thêm chuẩn
(tiến hành trên mẫu 1) và phương pháp mẫu tự tạo.
ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng, định tính và định lượng đổng
thời paracetamol và acid meíenamic trên mẫu 3 và mẫu 4 của viên nén
Pamesic bằng phương pháp ngoại chuẩn.
Phương pháp nghiên cứu sử dụng trong khoá luận là phương pháp HPLC.
Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký cho phép tách hai chất
được tốt nhất, sau đó thông qua việc xử lý thống kê các kết quả khảo sát để
đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng.
d. Các đặc trưng thông kê để xử lý kết quả phân tích [5]
Các số liệu thực nghiệm thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê
thông qua các đặc trưng sau :
c. Phương pháp nghiên cứu
n

Giá trị trung bình x = —
n
Độ lệch chuẩn s = li

V n -ỉ
Phương sai s 2 = —
n - \
Sai số chuẩn s x = —f=
y/n
- Sai số tương đối £% = -JL-
Trong đó : X; là kết quả của lần xác định thứ i
n là số lần xác định
s x X ta X 100
18
ta là biến ngẫu nhiên tuân theo phân bố student ứng với giả thiết
số bậc tự do f (f = n-1) và mức ý nghĩa a.
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
• Qua tham khảo tài liệu và do tính chất ưu việt của sắc ký pha đảo, chúng
tôi lựa chọn : Kiểu sắc ký pha đảo đẳng dòng, sử dụng cột Lichrosorb RP18,
trong quá trình khảo sát các điều kiện về dung môi, tốc độ dòng và bước sóng
thích hợp để phát hiện hai chất.
• Lựa chọn dung môi pha động : Qua nghiên cứu tính chất hoá lý của hai
chất, trong quá trình thực nghiệm cùng với việc tham khảo một số tài liệu
chúng tôi đã lựa chọn được thành phần pha động như sau :
Acetonitril - nước - tetrahydroíuran (3:8:9), điều chỉnh hỗn hợp trên
đến pH 2,2 bằng acid phosphoric. Với thành phần dung môi pha động như
trên, hỗn hợp hai chất được tách hoàn toàn, độ chọn lọc tốt.
• Lựa chọn tốc độ dòng : Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký của dung dịch
mẫu chuẩn ở các tốc độ dòng khác nhau : 0,7 ; 0,9 ; 1,0 và 1,2 ml/phút. Kết

quả cho thấy với tốc độ dòng 1,0 ml/phút, 2 pic được tách tốt, áp suất cột vừa
phải và thời gian lưu không quá dài. Lựa chọn tốc độ dòng là 1,0 ml/phút.
• Lựa chọn bước sóng thích hợp phát hiện hai chất : Tiến hành quét phổ
hấp thụ của hai chất trên ở dải sóng từ 220 -> 350 nm (cả hai chất đều được
pha trong dung môi pha động với nồng độ của paracetamol khoảng 7,5 1-ig/ml
và của acid meíenamic khoảng 12 |j,g/ml). Lựa chọn bước sóng phát hiện trên
nguyên tắc ưu tiên cực đại hấp thụ của chất có hàm lượng thấp hơn hoặc có
độ hấp thụ riêng nhỏ hơn.
19
Abs
1 4 | x
1.3-1 \
'1 \
1.2-n
1.1 : •
10 ! (2)
0,9-1 \
0-8
0 7 \
0.6 I
0.5 Ị \
0.4 ỉ ■' \ \

02 I (1)

' \ .
0,1 1
0.0
ị
■

'
.



.
•1


.

_


;




—1 I

-

r~~

Ị 5 nm
250 300 350
Mephe/Pha tíongpara/Pha dong
Hình 2 : Phổ hấp thụ của paracetamol (1) và acid meỷenamic (2) trong
dung môi pha động
- Paracetamol có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 249 nm .
- Acid meíenamic có đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 279 nm .
Acid meíenamic có độ hấp thụ riêng nhỏ hơn đồng thời hàm lượng
của acid meíenamic trong chế phẩm cũng thấp hơn của paracetamol , nên
chúng tôi lựa chọn ưu tiên bước sóng phát hiện của hai chất ở cực đại hấp
thụ của acid meíenamic , kết hợp với các tài liệu tham khảo đồng thời
trong quá trình thực nghiệm chúng tôi thấy ở bước sóng 279 nm các tín
hiệu định lượng (diện tích pic) của hai chất có đáp ứng đủ lớn và thích hợp.
Chúng tôi đã lựa chọn bước sóng phát hiện hai chất ở 279 nm.
■ Tóm lạ i:
20