Định lượng sabutamol, guaifenesin, bromhexin hydroclorid trong viên nén ascorin (ấn độ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

p m
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN HỮU VÃN
ĐỊNH LƯỢNG SABUTAMOL, GUAIFENESIN,
BROMHEXIN HYDROCLORID TRONG VIÊN NÉN
ASCORIN (ẤN Độ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẢNG CAO
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2001- 2006)
Người hướng dẫn: Th.s Đặng Trần Phương Hồng
PGS.TS Trần Tử An
Nơi thực hiện: Phòng vật lý- Viện kiểm nghiệm
Trường Đại học Dược Hà Nội
íầ
Hà nội, 5-2006
m
%
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Vật lý- Viện kiểm
nghiệm. Trong quá trình thực hiện khoá luận này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn
tận tình của các thầy, cô hướng dãn, các giảng viên của bộ môn Hoá phân tích và
độc chất, và các cán bộ của phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế.
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- PGS-TS Trần Tử An - Chủ nhiệm bộ môn Hoá phân tích và độc chất -
Trường đại học Dược Hà Nội.
- Th.s Đặng Trần Phương Hồng - Trưởng phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm-
Bộ Y tế.
Đã trực tiếp giúp đỡ tôi những tài liệu và hướng dẫn những kỹ năng cần thiết
để tôi thực hiện khoá luận này.
Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá phân tích
và độc chất- Trường đại học Dược Hà Nội, các cán bộ của phòng Vật lý- Viện

kiểm nghiệm đã giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận.
Tôi xin cám ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu, Phòng đào tạo nhà trường tạo
điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện khoá luận này.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi
trong học tập, cũng như trong quá trình thực hiện khoá luận.
Hà nội, tháng 5-2006
Sinh viên
Nguyễn Hữu Văn
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề 1
Phần 1- Tổng quan
2
1.1. Salbutamol 2
1.2. Bromhexin hydroclorid 3
1.3. Guaifenesin 4
1.4. Phương pháp HPLC 5
1.4.1. Khái quát chung 5
1.4.2. Nguyên tắc cấu tạ o 5
1.4.3. Các đại lượng đặc trưng 7
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC 9
1.4.5. Pha động trong HPLC 10
1.4.6. Nguyên tắc lựa chọn pha động và pha tĩnh 11
1.4.7. Cách tính kết quả 12
1.5. Một số quy trình định lượng ba hoạt chất trên
trong các chế phẩm đa thành phần 13
Phần 2- thực nghiệm và kết quả 15
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 15
2.1.1. Hoá chất- Dụng cụ 15
2.1.2. Đối tượng- Nội dung- Phương pháp nghiên cứu

15
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét

18
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 18
2.2.2. Thẩm định chương trình sắc ký 24
2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

24
2 2 2 2 . Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp

25
2.2.2.3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp
28
2.2.2.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp

31
2.3. So sánh hiệu quả của phưcỉng pháp tìm được với một số phương
pháp định lượng đã được chấp nhận 37
2.4. Bàn luận về kết quả 42
Phần 3: Kết luân 43
CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
BH
: Bromhexin hydroclorid
GU :
Guaifenesin
HPLC :
Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
SA

Salbutamol
SA.S
Salbutamol sulfat
STT
Số thứ tự
TB
Trung bình
USP
Dược điển Mỹ
ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu chăm sóc sức
khoẻ ngày càng tăng. Do vậy, thuốc đa thành phần ngày càng trở nên phổ biến,
nhằm kết hợp tác dụng điều trị và thuận tiện hơn cho người sử dụng.
Tuy nhiên, trong các dược điển hiện hành của nhiều nước chủ yếu chỉ có các
chuyên luận cho các thuốc chứa một thành phần. Chính vì vậy, việc nghiên cứu
xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng thuốc có nhiều thành phần là rất cần
thiết.
Ascorin, một chế phẩm của hãng GLENMARK PHARMA (Ấn độ), là thuốc
đa thành phần có công thức :
Salbiitamol sulphat tương đương với salbutamol 2 mg
Bromhexin hydroclorid 8 mg
Guaifenesin 100 mg
Thuốc này đang được chuẩn bị nhập vào Việt Nam, công tác quản lý chất
lượng đòi hỏi một phương pháp định lượng đơn giản, nhanh, phù hợp với điều
kiện của phòng thí nghiệm ở các trung tâm kiểm nghiệm. Chính vì vậy chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định lượng salbutamol, guaifenesin, bromhexin
hydroclorìd trong viên nén Ascorin (Ấn độ) bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao ” với mục tiêu cụ thể sau:
- Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định tính và định lượng ba
thành phần hoạt chất trong mẫu thuốc Ascorin thử nghiệm bằng phương pháp

HPLC.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. SALBUTAMOL.
1.1.1. Công thức cấu tạo : [ 1]
- Tên khác : Albuterol, Ventolin, Sultamol, Proventil.
- Tên khoa học ; 1- (4’ - hydroxyl- 3’ - hydroxyl methyl- phenyl) - 2-
tertbuthyl amino ethanol.
Hoạt chất được sử dụng trong phương pháp định lượng là
salbutamol sulfat.
1.1.2. Tính chất ( dạng muôi sulfat) [15]:
- Bột kết tinh trắng, không mùi, vị hơi đắng.
- Tan trong nước, ít tan hơn trong cồn, cloroform, ether.
- Hấp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ ở 276 nm.
1.1.3. Một sô phương pháp định lượng:
- Phương pháp HPLC.
Bảng 1: Điều kiện định lượng SA bằng HPLC
Cột Pha động (tỷ lệ)
Detector
ƯV(nm)
Tốc độ dòng
(ml/phút)
Tài liệu
CN
(200 X 5 mm,
5 ụm)
Nước- amoni acetat-
isopropanol,
(65 : 30 : 5)
276
1,0

[15]
c 18
(150x 4,6 mm)
(natri-l-hexan sulfonat
1,13 g và acid acetic 12
ml trong 1200 ml
nước): methanol (60 :
40)
276
1,5
[19]
RP 18
(250x5mm,
10 ụm)
natri dihydrophosphat
pH 3,1 ±0,05 :
methanol, (85 : 15).
276
[18]
Bảng 2: Điều kiện định lượng SA bằng phương pháp đo quang
Mẫu trắng
Bước sóng
(nm)
Aì%
^ ì
cm
Tài liệu
Nước cất
276 59
[5]

1.2. BROMHEXIN HYDROCLORID.
1.2.1. Công thức cấu tạo [17]:
C1
Tên khoa học : 2- amino- 3,5 - dibromo benzyl methyl cyclohexyl amin
hydroclorid.
1.2.2. Tính chất [17]:
- Trắng hay hầu như trắng.
- Tan trong ethanol 95% và trong methanol, tan nhẹ trong cloroíorm, rất ít
tan trong nước.
1.2.3. Một sô phương pháp định lượng :
Bảng 3: Điều kiện định lượng BH bằng phương pháp đo quang
Mẫu trắng
Bước sóng
(nm)
Al%
^ I cm
Tài liệu
acid acetic
317
87
[17]
ethanol 249
270
[18]
1.3. GUAIFENESIN.
1.3.1. Công thức hoá học [19]:
0
- Tên khoa học: 3- ( 2 -methoxy phenoxyl) - 1,2 propadiol.
1.3.2. Tính chất [19]:
- Bột trắng hoặc gần như trắng, không mùi.

- Tan trong ethanol 95%, cloroíorm, ít tan trong nước, ether.
1.3.3. Một sô phương pháp định lượng:
Bảng 4: Điều kiện định lượng GU bằng HPLC
Cột Pha động Detector
ƯVịnm)
Tốc độ dòng
(mUphút)
Tài liệu
RP18
(250 X 4,6 mm,
10 |Jm)
Nước- Methanol
(55 : 45) 276 2,0
[19]
1.4. PHƯƠNG PHÁP HPLC.
1.4.1. Khái quát chung :
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách dựa vào ái lực
khác nhau của các chất với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau.
Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao,
còn pha tĩnh là một chất lỏng được bao trên một chất mang rắn, hoặc một chất
mang rắn đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Pha động cùng với mẫu
thử được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo
pha động qua cột với tốc độ khác nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận
biết bởi bộ phận phát hiện gọi là detector.
1.4.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC [3]:
Hệ thống kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính:
- Bình chứa dung môi: Bình thường làm bằng thuỷ tinh,
- Bơm cao áp: Bơm này có chức năng bơm dung môi vào cột để thực hiện
quá trình tách. Bơm này được điều chỉnh áp suất để tạo ra được những tốc độ ổn
định nhất của các chất cho phù hợp với quá trình sắc ký.

- Van bơm mẫu : Van này để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những
lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Các van này có thể
tích thay đổi, thường là 20, 50, 100 pl.
1
Hình 1: Sơ đồ nguyên tắc chung cho các máy sắc HPLC
(ỉ - Bình chứa pha động; 2- Bơm; 3- Tiêm mẫu; 4- Cột;
5- Detector; 6- Ghi tín hiệu.)
- Cột tách : Là cột chứa pha tĩnh quyết định hiệu quả của sự tách một hỗn
hợp mẫu. Cột tách có nhiều kích cỡ khác nhau, và thường có chiều dài từ 10- 25
cm, đường kính trong từ 2- 5 mm.
- Hệ thống phát hiện chất phân tích (detector): Dựa theo tính chất của các
chất cần phân tích mà người ta sử dụng các detetor khác nhau, ví dụ như :
^ Detector hấp thụ UV- VIS.
Detetor huỳnh quang.
Detector điện hoá (đo dòng, độ dẫn, điện lượng).
^ Detetor chiết xuất.
^ Detetor độ dẫn nhiệt.
Trong các loại trên thì detector hấp thụ UV- VIS được dùng phổ biến hcfn
cả.
- Hệ thống thu nhận và xử lý kết quả : ở đây có nhiều loại, nhưng phổ biến
hơn cả là máy tự ghi tín hiệu đo dưới dạng pic.
1.4.3. Các đại lượng đặc trưng [3]:
Các chất khi qua, muốn tách được hoàn toàn khỏi nhau cần phải dám bảo
được hai yếu tố:
- Các pic phải cách xa nhau, tức là có tốc độ di chuyển khác nhau rõ rệt.
- Pic sắc ký phải gọn (hẹp và cân đối), tức là không có sự doãng pic.
* Một sô đại lượng đặc trưng:
a. Thời gian lưu (t¡ị):
Thời gian lull là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu vào cột
sắc ký, tới detetor và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh

của pic).
Thời gian lưu đặc trưng cho tốc độ di chuyển của một chất. Thời gian lưu
càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng nhỏ.
b. Hệ sô chọn lọc (thừa số chọn lọc) ( a):
Hệ số chọn lọc đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất.
Công thức:
K u /v„ í/ị ß
a =
Trong đó; B được coi là chất bị lưu giữ mạnh hơn A
Kb,K^ là hệ số phân bố, k’ß, k’^ là thừa số dung lượng tương ứng
với chất B và A.
B ,t\ A là thời gian lưu hiệu chỉnh của B và A.
Để tách hai chất, cần có (X>1, thường dùng trong khoảng 1,05- 2,0. Nếu (X
quá lớn thì thời gian phân tích càng kéo dài.
signal
Component
Component
c. Độ phân giải (Rs):
Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
Công thức tính:
Rs =
^R,A
Ngoài ra, có thể tính Rs theo phương trình khác :
Rs =
4 n a - l k'
■X

X-
a k'
Giá trị Rg đạt các giá trị:

0,75 : Hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
1,0 : Hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.
1,5 : Hai pic tách nhau gần hoàn toàn, chỉ xen phủ nhau 0,3%-
d. Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H):
Cột sắc ký được coi như có N lớp mỏng, ở mỗi lớp sự phân bố chất tan vào hai
pha được coi là đạt đến một trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là
đĩa lý thuyết. H là chiều cao đĩa lý thuyết nên:
H = — (L: chiều dài cột).
N
Công thức tính N:
N = \6x
= 5,54x
w là chiều rộng đo ở đáy pic.
w 1 / 2 là chiều rộng đo ở nửa chiều cao của pic.
Cột có N lớn hay H nhỏ là cột có hiệu lực cao, khi đó độ doãng pic nhỏ.
e. Hệ số bất đối xứng T :
Hệ số bất đối cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công
thức :
T =
2a
Trong đó : Wx là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic.
a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến
mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC.
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân
tích. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, hạt thường là hình cầu và kích thước
rất nhỏ, đường kính hạt từ 3- 10 |Jm, diện tích bề mặt riêng từ 50- SOOmVg-
• Phân loại pha tĩnh .
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử. Tương

ứng với mỗi loại chất nhồi như thế người ta có một kỹ thuật sắc ký riêng HPLC.
• Điều kiện đối với một pha tĩnh :
- Phải trơ và bền với các điều kiện của môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những
điều kiện nhất định.
- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó.
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Hạt phải đồng nhất.
1.4.5. Pha động trong HPLC.
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi
cột tách, thực hiện quá trình tách sắc ký. Nó có thể chỉ là một dung môi hùha cơ
hay cũng có thể là hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo một tỷ lệ phù
hợp. Nó cũng có thể là dung dịch của các muối chứa các chất đệm , chất tạo phức
Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải riêng tạo được hiệu quả
tách tốt nhất.
• Pha động có thể ảnh hưỏìig đến :
- Độ chọn lọc của hệ pha.
- Thời gian lưu của chất tan.
- Hiệu lực của cột tách.
- Độ phân giải của các chất trong một pha tĩnh.
- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký.
10
• Điều kiện đối với một pha động :
- Phải trơ với pha tĩnh.
- Hoà tan được chất cần phân tích.
- Bền với thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phù hợp với detector dùng để phát hiện các chất phân tích.
- Có tính kinh tế, dễ kiếm, không quá đắt.

• Một sô điểm cần được xem xét đê chọn pha động cho phù hợp :
- Bản chất của dung môi để pha chế pha động.
- Thành phần các chất tạo ra pha động.
- Tốc độ dòng pha động.
- pH của pha động.
1.4.6. Nguyên tác lựa chọn pha động và pha tĩnh.
Nguyên tắc lựa chọn: Pha tĩnh thường được chọn có tính phân cực giống các
chất cần tách, và khác với pha động.
Trong HPLC, pha tĩnh được gắn hoá học (liên kết) với chất mang (hạt
silicagel) tạo nên hợp chất cơ- siloxan
CH,
/
CH,
tí
CH,
CH,
a-OH +
a - s i~
~.E -Si —
\
1 /
Oỉ,
éih
CWị
CH,
nhóm silanol Dẫn chất Dẫn chất
của silicagel clorosilan siloxan
Nếu gốc R- trong dẫn chất siloxan tạo thành là một nhóm ít phân cực như
octyl (Cg), octadecyl (Cịg) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol.
11

acetonitril, nước (ngoài các dung môi chính còn có các dung dịch đệm pH như
dung dịch đệm phosphat để ổn định cho quá trình sắc ký) thì ta có sắc kỷ pha
đảo. Hiện nay, người ta thường sử dụng loại cột alkyl hoá Cg, C|8 với các tên
thương phẩm khác nhau để định lượng trong trường hợp này.
Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin - (CH2 )n-NH2 hay alkylnitril -
(CH2 )n- CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc kỷ pha thuận. Cột
hay sử dụng trong trường hợp này là cột Si.
Trong hai loại sắc ký nêu trên thì sắc ký pha đảo được sử dụng phổ biến hơn
vì cho kết quả tách tốt với nhiều đối tượng phân tích.
Việc lựa chọn pha tĩnh và pha động phù hợp với chất phân tích có tính chất
quyết định đối với quá trình sắc ký. Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến chi phí khi
thực hiện sắc ký phân tích.
1.4.7. Cách tính kết quả.
- Phương pháp ngoại chuẩn: Dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử
trong cùng điều kiện. Kết quả mẫu thử được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết
trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.
- Phương pháp nội chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu
thử một lượng chất không đổi mà trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội
phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần
phân tích trong mẫu thử.
- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất
tương ứng các thành phần cần phân tích trong mẫu thử. Tiến hành sắc ký cả hai
dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn trong cùng một điều kiện sắc ký.
Kết quả được tính toán dựa vào sự tăng diện tích hoặc chiều cao pic.
- Phương pháp tính theo phần trăm diện tích pic: Hàm lượng phần trăm của
các chất cần phân tích trong mẫu thử được tính bằng phần trăm diện tích pic của
12
nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Phương pháp
này chỉ đúng khi đáp ứng hai yêu cầu:
Tất cả các chất trong mẫu đều được rửa giải và cho pic trên sắc đồ (trừ

thuốc thử và các chất dưới giới hạn phát hiện).
Đáp ứng của detetor như nhau đối với các chất.
1.5. MỘT SỐ QUY TRÌNH KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BA Dược CHẤT
TRÊN TRONG CÁC CHÊ PHẨM đ a t h à n h PHẦN:
1.5.1. Định lượng BH:
Bảng 5: Điều kiện định lượng BH bằng HPLC
Cột Pha động (tỷ lệ)
Detector
UV(nm)
Tốc độ dỏng
(ml/phút)
Tài liệu
RP18
(250 X 4,6 mm,
10 ụm)
Methanol- Natri
dihydrophosphat 10%,
pH=3,0 (điều chỉnh pH
bằng acid sulfuric đậm
đặc), (55 : 45)
214
1,5
[8]
Lichrosorb Si 60
(250 x4mm; 5
ụm)
Methanol- Đệm amoni
nitrat pH 9,5; (45 : 6)
298
1,0 [14]

13
1.5.2. Định lượng GU:
Bảng 6: Điều kiện định lượng GU bằng HPLC
Cột
Pha động (tỷ lệ) Detector
UV(nm)
Tốc độ dòng
(milphút)
Tài liệu
RP18
(250 X 4 mm,
5 pm)
Acetonitril- diamoni
hydrophosphat 5%o,
(55 : 45)
291
1,0
[10]
RP 18
(250 X 4 mm,
5 ụm)
Methanol- nước cất-
acid acetic,
(6 0 :4 0 : 1,5.)
272
0,8- 1,0
[6]
Si 60
(250 X 4 mm,
5 Mm)

Nước cất - Dung dịch
amonipeclorat 0,00 IM
trong methanol,
pH=6,7 (Điều chỉnh pH
bằng NaOH 0,1 N
trong methanol), (2:8)
254
0,8
[7]
* Kết luận:
Theo các nghiên cứu trước đây, các tác giả sử dụng cả hai loại sắc ký là pha
thuận (cột Si 60) và sắc ký pha đảo (cột RP 18). Như vậy, BH và GU có khả năng
thích hợp với cả hai loại sắc ký này.
Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành trên cả sắc ký pha thuận
và sắc ký pha đảo, dựa vào kết quả thu được chúng tôi chọn sắc ký pha đảo vì:
- Đáp ứng của hệ đối với sắc ký pha đảo tốt hơn sắc ký pha thuận.
- Loại cột c 18 thông dụng hơn cột Si và sẵn có ở phòng thí nghiệm.
14
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.
2.1.1. Hoá chất và dụng cụ.
2.1.1.1. Hoáchất.
- Chất chuẩn của viện kiểm nghiệm : salbutamol sulphat (hàm lượng 100%),
guaifenesin, bromhexin hydroclorid 99,9%.
- Methanol loại dùng cho HPLC.
- Triethylamin.
- Acid sulfuric đặc.
- Natri dihydrophosphat loại tinh khiết.
2.1.12. Dụng cụ :
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1100 với detector u v , cột Lichrosorb

RP 18 ( 250 x4 mm, 10 |Jm).
- Máy lắc siêu âm.
- Bộ lọc dung môi sử dụng hệ thống lọc chân không, với màng lọc 0,45 |Jm.
- Cân phân tích với độ chính xác 0,1 mg.
- Các dụng cụ chính xác như bình định mức có nút mài, pipet,
2.1.2. Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu.
2.1.2.1 .Đối tượng nghiên cứu :
Mẫu Ascorin do GLENDMARK PHARMA (Ấn độ) sản xuất, cung cấp cho
Viện Kiểm nghiệm để tiến thành thẩm định.
Công thức :
Salbutamol sulphat tương ứng với lượng sabutamoỉ 2 mg
15
Bromhexin hydroclorid 8 mg
Guaifenesin 100 mg
Mẫu sản xuất tháng 11/ 2004. Hạn dùng tháng 10/2006.
2.1.22. Nội dung và phương pháp nghiên cứu:
• Xây dựng chương trình sắc kỷ : Ơiương trình này được xây dụng nhằm mục
đích định tính và định lượng đồng thời SA, BH, và GU trong viên nén Ascorin.
Để xây dựng chương trình, chúng tôi khảo sát và lựa chọn các điều kiện :
- Lựa chọn thành phần pha động.
- Cột tách sử dụng.
- Tốc độ dòng.
- Với detector u v sẵn có, chọn bước sóng thích hợp phát hiện và định
lượng các chất.
• Thẩm định chương trình sắc ký đã xây dựng: Thẩm định chương trình sắc ký
theo các thông số:
- Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
- Độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất.
- Độ chính xác của phương pháp.
- Độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn.

Các kết quả thực nghiệm được xử lý thống kê để đánh giá.
2.12.3. Một số công thức tính thống kê xử lý kết quả [2], [9], [13];
- Loại bỏ những dữ liệu ngoại lai {Chuẩn Q):
Chuẩn này áp dụng cho N< 10.
Các dữ liệu thống kê được sắp xếp tăng dần: X), Xj, X3, , x„
16
Tính chuẩn Qtn để loại bỏ giá trị nghi ngờ hoặc
- X.,
Đánh giá ô,„= —
Đánh giá x^i,: Q,„ =
X — X
max •^min
Xọ Xị
X — X
max min
So sánh giá trị Q(n với Q tới hạn (Q“');
Qtn < Q* thì không loại giá trị nghi ngờ.
- Giá trị trung bình:
- Độ lệch chuẩn:
- Phương sai s^:
= - . Z ^ ,
n /=1
¿(x ,-x )^
j=Ị
___________
n - \
ì n -
Ẻ (^ ,-ĩF
A^-1
- Sai số chuẩn:

=
- Sai số tương đối:
5”
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(% ) = —. 100
17
' ^ 'ễ'' Ẽr ^ \
^ ỉĩí -J ^
^ ^ l „ '
V •
X
- Khoảng tin cậy : // X _
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT.
Vì chưa có tiêu chuẩn định lượng đồng thời cả ba thành phần trong viên nén
Ascorin, nên nhà sản xuất định lượng ba thành phần riêng biệt bằng phương pháp
đo quang. Nếu áp dụng theo dược điển chúng tôi cũng gặp một vấn đề tương tự,
vừa tốn kém hoá chất và mất nhiều thời gian. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành
xây dựng một chương trình sắc ký có thể định lượng đồng thời ba thành phần trên
trong viên nén Ascorin.
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký:
- Lựa chọn thành phần pha động:
Dựa trên hàm lượng của các chất trong chế phẩm thì thấy SA có hàm lượng
nhỏ nhất (2 mg), sau đó đến BH (8 mg) và lớn nhất là GU (100 mg). Vì vậy,
chúng tôi định hướng sẽ tìm hệ pha động ưu tiên SA.
Theo Dược điển Anh [15], SA.S được định lượng bằng HPLC trong điều kiện
pha động là nước cất- amoni acetat 0,05M- isopropanol với tỷ lệ 65: 30: 5, pha
động được điều chỉnh pH về 4,5 bằng acid acetic băng, sử dụng cột CN 250x
5mm, 5|Jm.
Nhận thấy cột CN là loại cột không thông dụng trong điều kiện sẵn có của
phòng thí nghiệm. Mặt khác, khi tiến hành định lượng bằng hệ này thì pic của SA
tốt, tuy nhiên không thấy xuất hiện pic của BH. Do vậy, chúng tôi chuyển hướng

sang những hệ ưu tiên pha động BH. Sau một số khảo sát, chúng tôi chọn được hệ
pha động Methanol - Natri dihydrophosphat 10%, pH=3, tỷ lệ 60: 40. Hệ này cho
pic của cả ba chất cần khảo sát, và các pic có độ phân giải khá tốt. Tuy nhiên, pic
18
của BH có hệ số bất đối lớn, pic bị kéo đuôi. Do vậy chúng tôi thêm triethylamin
(TEA), một chất có khả năng làm giảm bất đối xứng của pic. Hoà tan TEA trong
methanol với tỷ lệ tăng dần và ở tỷ lệ 1/300 cho pic của BH đạt độ cân xứng tốt,
T= 1,52.
Vậy, hệ pha động chọn được:
(Methanol- Triethylamin tỷ lệ 300:1)- Natri dihydrophosphat 10%, pH3,0;
tỷ lệ (60: 40).
- Lựa chọn loại cột: Theo tài liệu nghiên cứu tìm hệ dung môi pha động, tác
giả sử dụng cột Lichrosorb RP 18 (250x4 mm, 10|Jm). Cột này có khả năng tách
tốt hệ ba chất cần khảo sát, cột có hiệu lực cao với số đĩa lý thuyết trung bình
4023 và là loại cột thông dụng trong công tác kiểm nghiệm.
- Lựa chọn tốc độ dòng : Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký của dung dịch mẫu
chuẩn ở các tốc độ khác nhau là 1,0; 1,5; 2,0 ml/ phút thì thấy rằng tốc độ dòng ở
1,5 ml/ phút các pic được tách tốt, áp suất (231 bar) vừa phải và thời gian lưu
không quá dài (của SA là 1,47 phút, GU là 2,16 phút và của BH là 12,23 phút), ở
đây, nếu chỉ nhìn trên sắc đồ chuẩn thì ta sẽ thấy độ phân giải giữa BH và GU là
rất lớn. Tuy nhiên, trên sắc đồ chất thử xuất hiện một pic của tá dược gần sát phía
sau GU. Để pic này tách hoàn toàn khỏi GU thì độ phân giải giữa BH và GU phải
lớn, và tốc độ dòng 1,5 ml/ phút là hợp lý.
- Lựa chọn bước sóng thích hợp để phát hiện ba ch ấ t: Để xác định bước sóng
thích hợp để phát hiện ba chất, chúng tôi tiến hành quét phổ UV-VIS của các
dung dịch chuẩn riêng rẽ của ba chất trên dải sóng 200- 400 nm (hình 3, 4 và 5).
SA là chất có nồng độ định lượng thấp nhất trong cả ba chất nên lựa chọn ưu
tiên cho SA. Nhận thấy ở bước sóng 225 và 276 nm, độ hấp thụ của SA đạt cực
đại. Độ hấp thụ của SA ở 225 nm lớn hơn ở 276 nên chúng tôi chọn bước sóng
225 nm là bước sóng định lượng SA.

19
Khảo sát các bước sóng tiếp theo chúng tôi nhận thấy, ở bước sóng 250 nm là
cực đại hấp thụ của BH. Chúng tôi chọn bước sóng này để định lượng BH.
Vì GU có nồng độ lớn nhất nên chúng tôi lựa chọn bước sóng định lượng Gư
là một trong hai bước sóng trên, ở bước sóng 225 nm, diện tích pic của GU quá
lớn. ở bước sóng 250 nm, GU cho pic không quá lớn và tương xứng với pic của
BH nên chúng tôi chọn 250 nm là bước sóng định lượng GU.
Vậy các bước sóng được chọn là :
- 225 nm để định lượng SA.
- 250 nm để định lượng BH và GU.
O AD 1 , 1,485 (1 0 1 2 m A U . - ) of 0 7 A S C O Õ 3 .D
i
ị
\
Hình 3: Phổ hấp thụ u v - VIS của SA trong pha động
20