Nâng cao hiệu suất các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xylose thành xylitol

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI
NGUYỄN HUY THANH
NÂNG CAO HIỆU SUẤT CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ
NĂNG CHUYỂN HOÁ XYLOSE THÀNH XYLITOL
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999-2004)
Giáo viên hướng dẫn:
TS. Vũ Nguyên Thành
CN. Nguyễn Lệ Phi
Nơi thực hiện:
Bộ môn vi sinh Viện công nghiệp thực phẩm
Bộ môn vi sinh trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI, THÁNG 5-2004
â ĩ i N ' X
ă r - /
Kìlị 4
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
-TS. Vũ Nguyễn Thành
-CN. Nguyễn Lệ Phi
Là thầy cô giáo đã tận tịnh hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN. Dương Anh Tuấn, CN.
Đỗ Ngọc Quang đã cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong
công việc
Tôi xỉn cảm ơn cán bộ - Bộ môn vi sinh Viện Công nghiệp
Thực phẩm, thầy cô giáo - Bộ môn vi sinh Trường Đại học
Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành
đê tài
Cuối cùng cho tôi gửi lòi cảm ơn đến người thân, bạn bè đã
động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, tháng 5 năm 2004
Sinh viên
Nguyễn Huy Thanh
MỤC LỤC
Đặt vấn đề 2
Phần I. Tổng quan


3
1.1 Một vài nét về Hemicellulose và xylose

3
1.1.1 Hemicellulose 3
1.1.2 Xylose 4
1.2 Xylitol

.
5
12.1. Nguồn gốc, công thức cấu tạo 5
1.2.2 Trạng thái tự nhiên


6
1. 1.3 Tầm quan trọng của Xylitol 6
1. 1.4 Tình hình sản xuất xylitol

.
10
Phần n. Thực nghiệm và kết quả 16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cún

16
2.1.1. Nguyên vật liệu 16
2.1.2 Máy móc- thiết bị
16
2.1.3 Một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu

17
2.2. Phương pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Phương pháp quan sát hình thái tế bào 18
2.2.2. Phương pháp định lượng xylitol

18
2.2.3 Phương pháp lựa chọn chủng giống
20
2.2.5 Phương pháp chọn chủng chịu được nồng độ dịch thuỷ phân cao 21
2.2.6 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện lên men

21
2.3. Kết quả và bàn luận 22
2.3.1 Quan sát hình thái tế bào
22
2.3.2 Định lượng xylitol bằng phương pháp enzyme 24
2.3.3. Tìm một số điều kiện len men xylitol thích hợp

30
Phần m. Kết luận và đề xuất
37
Tài liệu tham khảo 38
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, cùng với sự phát triển đời sống vật chất và xã hội của con người
là sự gia tăng của một số bệnh như: bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch và
một số bệnh ở trẻ em .Vì vậy việc tìm kiếm những hoạt chất để phục vụ và
nâng cao sức khoẻ cho con người đã và đang đươc đầu tư và nghiên cứu với
quy mô lớn. Vào năm 1891, nhà hoá học người Đức Emil Fisher là người
đầu tiên phát hiện ra xylitol trong các loại hoa quả. Ban đầu công dụng chủ
yếu của xylitol chỉ là một chất làm ngọt thay thế đường. Sau chiến tranh thế
giới lần thứ II xylitol đã được biết đến như một hoạt chất dùng để cải thiện
rối loạn glucid ở bệnh nhân đái tháo đường, làm giảm tỷ lệ sâu răng ở trẻ
em, làm chất ngọt, bổ dưỡng được đưa vào trong các sản phẩm công nghiệp
thực phẩm và đồ uống.
Có nhiều phương pháp để sản xuất xylitol trong đó con đường tổng hợp
hóa học được tìm ra đầu tiên và hiện đang là phương pháp chủ yếu trên thế
giới. Nhưng quá trình sản xuất này bao gồm nhiều công đoạn phức tạp và
giá thành sản phẩm cao. Trong hoàn cảnh đó, việc tìm ra một phương pháp
sản xuất mới đơn giản và hiệu quả là cần thiết. Phương pháp lên men xylitol
từ xylose nhờ vi sinh vật hiện đang là một phương pháp hứa hẹn nhiều tiềm
năng và thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu.
Với mục đích tận dụng các nguồn nguyên liệu là chất thải nông nghiệp
(rơm, bã mía, lõi ngô ) để phục vụ cho sản xuất xylitol cũng như góp phần
tìm ra một phương pháp sản xuất xylitol bằng con đường lên men nhờ vi
sinh vật, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nâng cao hiệu suất các
chủng nấm men có khả năng chuyến hóa xylose thành xylitol" với các
mục tiêu:
> Phát triển phương pháp xác định xylitol dựa trên phản ứng enzyme
> Tìm các điều kiện lên men thích hợp để sản xuất xylitol
2
Phần I
TỔNG QUAN

1.1 Một vài nét về Hemicellulose và xylose
1.1.1 Hemỉcellulose
Hemicellulose là một hỗn hợp gồm các polysaccharid có nhiều trong
trong thân cây. Bảng 1 chỉ ra hàm lượng của hemicellulose trong các loại
cây:
Bảngl: Hàm lượng hemicellulose trong một số nguyên liệu điển hình
Loại
Cellulose
(% tổng số)
Hemicellulose
% tổng số
%carbonhydrat
Thân ngô khô
39-41 30
43
Cỏ khô
36-41
32 45
Cây gỗ ngắn ngày
34-46 2 0
34
Sợi gỗ
18 2 1
33
Sericea ỉespeedeza
34-42
2 0 34
Quá trình thuỷ phân hemicellulose tạo ra cả đường hexose và pentose:
mannose, galactose, xylose và arabinose.Các hợp chất khác, mà chủ yếu là
acid acetic cũng được tạo ra trong quá trình thuỷ phân và có khả năng ức chế

quá trình phát triển của vi sinh vật. Các sản phẩm phụ bao gồm chủ yếu là
lignin. Hàm lượng đường được tạo ra trong quá trình thủy phân
hemicellulose phụ thuộc vào nguyên liệu, điều kiện phát triển và bảo quản
nguyên liệu. Bảng 2 trình bày thành phần của hemicellulose của các nguyên
liệu điển hình.
3
Bảng 2: Thành phần Hemicellulose trong sinh khối (% trọng lượng)
Loai
Thành phần Hemicellulose (%)
Galactan Xylan
Arabinan Mannan
Thân ngô khô
1 ,0 - 1 , 2
19-23
1,8-3,4 0,3-0,7
cỏkhô (Switchgass)
1 ,0 - 1 , 1
23-2 5
3,0-3,4
0 , 1 - 0 , 8
Sericea lespedeza
1 ,6 - 1 , 8
10-14
1 ,3 - 1 , 6
2,0 - 2,5
Cây gỗ ngắn ngày 0 ,7 - 1 , 2 13-17 0 ,4 - 1 , 1 0 ,9- 1,3
Sợi ngô 3,8 25 18 NR
Chú thích : NR - K lông được công bố
Hemicellulose là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm. Việc tận dụng
nguồn nguyên liệu này sẽ mang đến những ý nghĩa về mặt kinh tế và môi

trường.
1.1.2 Xylose
Xylose là một đường pentose có công thức như sau:
yHO
H— ý — OH
HO— c — H
H— j: — OH
CH2OH
Xylose có thể biến đổi thành xylitol bằng hai cách:
+ Khử hoá nhờ xũc tác raney nikel.
+ Trong tế bào vi sinh vật xylose bị khử thành xylitol nhờ enzyme xylose
reductase với coenzyme là NADH hoặc NADPH.
4
1.2 Xylitol
1 2.1. Nguồn gốc, công thức cấu tạo
Xylitol là một polyol có 5 carbon. Công thức cấu tạo như sau:
c h 2oh
H— ỳ — OH
HO— c — H
„ Ĩ
H— c — OH
CH2OH
Công thức phân tử: C5 H]2 05.
Khối lượng phân tử: 152,15.
Nguồn 2ốc\ r 1 I I Xylitol có nguồn gốc tự nhiên, có mặt với lượng nhỏ trong
một số hoa quả va rau xanh (Bảng 3), và được tạo ra trong cơ thể với hàm
lượng thấp.
Bảng 3: Hàm lượng của xylitol trong một số loại rau quả
Rau, quả
Xylitol (mg/lOOg sản phẩm khô)

Chuối
21
Mâm xôi
268
Dâu tây
362
Mận
935
Cà rốt
865
Rau diếp quăn
258
Xà lách
131
Cải hoa
3000
Bí ngô
96,5
Su hào
94
Cà
180
Tỏi tây
53
Nấm trắng
128
5
1.2.2 Trạng thái tự nhiên và tính chất hóa lý
**** Trạng thái tự nhiên
Xylitol là chất bột kết tinh, màu trắng, không mùi, có vị ngọt như đường.

Thu nhiệt khi tan trong nước nên tạo cảm giác mát cho người sử dụng.
♦♦♦ Tính chất lý hóa [1 1 ]
Tính chất lý hoá của Xylitol được nêu trong Bảng 4:
Bảng 4 :Một số tính chất lý hoá của xylitol
Tính chất
Xylitol
Độ tan (ở 20°C)
169 g/lOOg H20
pH trong nước (lg/100 ml).
5 - 7
Nhiệt độ sôi (ở 1 atm)
216°c
Nhiệt độ nóng chảy
92°c đến 96°c
Độ nhớt ở 20°c
Dung dịch 10% 1,23 cP
Dung dịch 40% 4,18 cP
Dung dịch 50% 8,04 cP
Dung dịch 60% 20,63 cP
Nhiệt năng tan
-34.8 cal/g
Giá trị calo
4.06 cal/g
1. 2.3 Tầm quan trọng của Xylitol
♦> Trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm
Xylitol là một đường polyol gồm năm carbon có vị ngọt. Giá trị calo mà
xylitol cung cấp thấp hơn so với saccharose nhưng tương đương với glucose.
Không những thế, xylitol tạo cảm giác mát lạnh trong miệng do có đặc điểm
thu nhiệt khi hoà tan. Đặc tính này làm xylitol rất hấp dẫn trong một số sản
phẩm thực phẩm, đặc biêt là đồ uống. Vì vậy xylitol được sử dụng để thay

thế glucose và saccharose trong các loại kẹo, socola, đồ uống mát, đồ uống
6
bổ dưỡng, thuốc ho, kem đánh răng, kẹo cao su Đặc biệt, xylitol có hàm
lượng năng lượng thấp nên được dùng để thay thế các loài đường khác trong
chế độ dinh dưỡng của các bệnh nhân mắc bệnh béo phì.
Trong ngành mỹ phẩm, xylitol có tính chất giữ ẩm cho da mà không làm
hại đến da, vì vậy xylitol được đưa vào kem dưỡng da, kem chống nắng, sữa
rửa mặt
♦♦* Trong ngành Y- Dược
Trong những năm gần đây xylitol ngày càng được nghiên cứu và ứng
dụng rộng rãi trong ngành Y, Dược. Hiện nay, xylitol đã được sử dụng trong
điều trị một số bệnh như: bệnh sâu răng, bệnh đái tháo đường, bệnh viêm tai
giữa ở trẻ em
Xy/ữo/ với bênh sâu răng và các bênh rang miêns:
Xylitol có tác dụng trực tiếp lên các vi khuẩn gây sâu răng, chủ yếu là
Streptococcus mutants. Thông thường các vi khuẩn này sử dụng lượng
đường tiết ra trong quá trình tiêu hoá thức ăn tại miệng của cơ thể. Chúng sử
dụng lượng đường này để sinh trưởng, phát triển. Quá trình đồng hoá các
nguồn đường của chúng tạo ra các sản phẩm phụ là acid (đặc biệt là acid
lactic) , các acid này được tiết ra môi trường ngoại bào. Chính môi trường
acid này lại tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của s. mutants và của
các vi sinh vật gây sâu răng khác. Đồng thời, các acid được tiết ra đó chính
là yếu tố gây sâu răng, acid tạo phức chelate hoà tan canxi và phospho cấu
thành men răng, phá huỷ các liên kết phân tử giữa chúng và tạo các lỗ hổng
ăn sâu vào trong răng. Thông thường, chúng ta sử dụng florua để khắc phục
hiện tượng này, ĩlorua có tác dụng trong việc bảo vệ răng chống acid nhưng
lại không có tác dụng đến bản chất của quá trình gây sâu răng, đó là vi
khuẩn.
Xylitol tác dụng đến quá trình này theo cách khác với ílorua, xylitol làm
thay đổi khu hệ vi sinh vật trong miệng theo hướng duy trì các vi sinh vật

7
không có hại cho răng. s. mutants hấp thụ xylitol vào trong tế bào nhưng nó
lại không có khả năng đồng hoá xylitol do đó chúng không lấy được năng
lượng cùng với việc pH của môi trường không thay đổi theo hướng acid hoá
nên các sinh vật này không có khả năng phân chia. Ngược lại các vi sinh vật
không có hại đối với răng lại gặp điều kiện thuận lợi của chúng và bắt đầu
phân chia. Mặc tổng số dù vi sinh vật trong miệng không thay đổi nhưng
khu hệ vi sinh vật của miệng đã thay đổi theo hướng không có hại cho răng
và theo cách đó xylitol giúp ngăn ngừa sâu răng. Những ngiên cứu gần đây
thấy rằng xylitol có thể làm giảm tỷ lệ mắc bệnh sâu răng tới 83%. Trong
khi đó saccharose không có tác dụng này.
Từ những kết quả nghiên cứu trên, người ta dần dần đưa xylitol vào các
sản phẩm để phòng chống sâu răng và các bệnh răng miệng như: kem đánh
răng, kẹo cao su, nước súc miệng
Xvỉitoỉ với bênh đái tháo đường [41
Xylitol là một chất trung gian bình thường trong chuyển hóa glucid và
được chuyển hóa trong cơ thể qua con đường pentose và acid uronic. Lượng
xylitol từ bên ngoài đưa vào cơ thể được chuyển hóa không phụ thuộc vào
insulin và không làm tăng lượng đường trong máu, xylitol có hiệu lực cung
cấp năng lượng cho cơ thể kể cả trong trường hợp rối loạn chuyển hóa
glucid. Ngoài ra, xylitol còn có tác dụng chống gây ceton huyết rất mạnh.
Do đó xylitol được dùng làm chất làm ngọt trong thực phẩm cho những
người mắc bệnh đái tháo đường. Không những thế, xylitol còn cải thiện các
rối loạn chuyển hóa glucid và cung cấp năng lượng cho cơ thể.
8
Một số chế phẩm có chứa xylitol dùng cho bệnh đái tháo đường:
Klinit (Nhật Bản)
Dung dịch tiêm truyền xylitol đóng:
- Lọ 500 ml dung dịch 5 và 10 %
- Ống tiêm 20 ml dung dịch 10, 20 và 50 %.

Xvlitol với bênh viêm tai gịữa ở_trẻ_ em 151
Một tác dụng khác của xylitol là giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm
tai giữa ở trẻ em. Có tới một nửa số trẻ sơ sinh năm thứ nhất mắc phải bệnh
này và có tới 30% trẻ hơn ba tuổi mắc bệnh ít nhất một lần. Trẻ mắc bệnh
này thường có triệu chứng cáu kỉnh, biếng ăn, sốt, hôn mê. Một số triệu
chứng ít gặp hơn đó là hiện tượng trớ, nôn và đi ngoài. Di chứng nguy hiểm
là trẻ có thể bị giảm và mất thính lực.
Streptococcus pneumonie là vi sinh vật
chủ yếu gây nên bệnh này sau đó là phải kể đến Hemophilus influenza. Các
vi sinh vật ít phổ biến khác bao gồm Escheria coli, Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginossa và Proteus. Thông thường trẻ mắc bệnh người ta
thường sử dụng các kháng sinh để điều trị như ampicillin, amoxicillin,
erythromycin , hỗn hợp trimethoprim và sulfamethoxazole (Bactrim ).Khi sử
dụng các kháng sinh này ngoài việc gây tác dụng phụ vơi trẻ em còn có
nguy cơ gặp phải vấn đế kháng kháng sinh do một số vi khuẩn có khả năng
sinh enzyme [3 -lactamase.
Các nghiên cứu gần đây ở trẻ nhỏ cho thấy xylitol có vai trò trong việc
ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm tai giữa ở trẻ em. Xylitol có tác dụng ức chế
sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh, điển hình là Streptococcus
pneumonie. Việc sử dụng xylitol không chỉ tránh được vấn đề kháng kháng
sinh mà còn tránh được các phản ứng phụ thường gặp phải khi sử dụng
kháng sinh như phát ban, tiêu chảy, tưa lưỡi do Candida.
Ngoài những ứng dụng điển hình trên, một sổ tài liệu còn cho rằng
xylitol có vai trò trong việc ngăn chặn sự phát triển của Helicobacter pylori,
9
tác nhân gây bệnh viêm loét dạ dày. Xylitol cũng được chứng minh là có vai
trò ngăn ngừa bệnh loãng xương ở người già và phụ nữ thông qua quá trình
tăng cường hấp thu calci ở thành ruột.
1.1.4 Tình hình sản xuất xylitol
♦♦♦ Sản xuất xylitol bằng phương pháp tổng hợp hóa học [8 ], [9], [11], [12]

Sản xuất xylitol bằng phương pháp tổng hợp hóa học dựa trên sự thủy
phân D- xylose hoặc hemicellulose bằng acid sulíuric trong nồi hấp áp lực ở
nhiệt độ 135°c, trong 2 -5 giờ. Xylitol và các carbon hydrat khác được khử
hóa thành polyol trong đó khoảng 60% là xylitol. Ngoài xylitol còn có các
loại đường khác như: arabinose, mannose, galactose, glucose
Sơ đồ sản xuất của xylitol:
(C5H80 4)„ +H2ơ "••13.5 U n(C,H|„05)
-h 20
->n(C5H120 5)
'O
o
'Ọ
a-Xylan
+ h 20
ọ H+, 135°, 40 atm
H-
HO-
H-
CHO
c-

OH
c

H
— OH
CH2OH
b- Xylose
-h2
<ị:h20h

H

r

OH
HO'
H-
e

H
-OH
V
c h 2oh
c- X y lito l
Trong patent cấp năm 1976 (US Patent # 3980719) Sud-Chemie AG,
Munich, CHLB Đức đã miêu tả quá trình tổng hợp xylitol bằng cách thuỷ
10
phân hemicellulose tạo dung dịch chứa xylose và acid acetic. Dung dịch sau
đó được xử lý bằng chất hấp phụ để loại bỏ protein, tannin và pectin. Dung
dịch sau khi làm sạch được cô đặc trong chân không tạo syrup quánh và hầu
như không chứa nước nên cũng loại bỏ được toàn bộ acid acetic. Syrup sau
đó được hoà trong nước và pH giữ ở mức 6 ,5-7,5. Dung dịch chứa xylose
được hydro hoá bằng cách sử dụng xúc tác raney nickel. Xylitol tạo thành
được thu hồi sau phản ứng.
Một patent khác (US patent #4008285), đăng ký từ Phần Lan năm 1997
miêu tả phương pháp sản xuất xylitol ở quy mô thương mại bằng cách thuỷ
phân các nguyên liệu chứa nhiều hemicellulose bằng acid. Quá trình này
khác với quá trình trên trong bước xử lý dịch thuỷ phân. Các muối vô cơ, các
chất bẩn hữu cơ và các chất mầu loại bằng bằng nhựa trao đổi ion và than
hoạt tính. Dung dịch sau đó được chạy bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion thu

được các phân đoạn xylose có độ tinh khiết cao. Sản phẩm sau đó được
hydro hoá với sự có mặt của xúc tác và một lần nữa được tinh khiết bằng sắc
ký trao đổi ion để thu hồi xylitol.
Ngoài ra, xylitol còn có thể được sản xuất theo một số cách sau đây:
+ Sản xuất xylitol từ bã mía
Viện nghiên cứu Đường Đài Loan đã nghiên cứu khả năng ứng dụng
thương mại quá trình sản xuất xylitol từ bã mía. Trong quá trình sản xuất, bã
mía được loại bỏ ruột xốp và nghiền nhỏ tới kích thước dưới l,5cm. Bã được
rửa kỹ để loại bỏ chất khoáng và làm khô tới độ ẩm 1 0 %, hàm lượng tro
duới 1 %. Acid HC1 được chứng minh là ưu việt hơn acid H2 S04 trong thuỷ
phân. Hỗn hợp bã mía và HC1 được khuấy trong bể khuấy sau đó được
chuyển bằng vít nạp tới nồi hấp quay. Hỗn hợp được thuỷ phân và gia nhiệt
bằng hơi ở 100 - 125°c trong thời gian 40 - 75 phút. Bước xử lý này nhằm
thuỷ phân hemicellulose trong mẫu thành xylose.
11
Đầu ra của nồi hơi (hỗn hợp acid và bã mía) được thuỷ phân tiếp trên
băng sàng. Nước nóng (100°C) được phun để rửa bã. Dịch rửa được thu hồi
bằng khay đáy nhọn đặt dưới băng sàng. Dịch chứa 17 - 20% xylose được
sử dụng để hydro hoá thành xylitol. Bã sau thuỷ phân được loại nước bằng
máy ép vít quay và được sử dụng làm giấy.
+ Sản xuất xylitol từ acid xylonic:
Heikkila năm 1999 đã đề xuất ra một phương pháp sản xuất xylitol từ
acid xylonic. Acid xylonic được khử hóa trong nồi hấp áp lực 3 giờ ở nhiệt
độ 110°c và áp suất 13 kPa với sự có mặt của ruthenium và carbon. Thành
phần của dịch trước và sau khử hóa được ghi trong bảng 5
Bảng 5. Thành phần của dịch trước và sau khử hóa từ acid xylonic
Thành phần
Trước khi khử
(% trên sản phẩm khô)
Sau khi khử

(% trên sản phẩm khô)
Acid xylonic
94,2 8,3
Xylitol
0 75,9
Arasitol
0
6 , 6
Xylose
1 , 1
0
Dịch sau khi khử sẽ được lọc và thu được dung dịch chứa 92,2% xylitol.
Xylitol được kết tinh và được tách ra bằng cách li tâm 4500 vòng/phút trong
5 phút.
+Sản xuất xylitol từ acid gluconic:
Acid gluconic có nhiều trong vỏ quả hạnh. Acid gluconic được
decarboxyl hóa bằng natrihypoclorid trong 45 phút ở 55°c để tạo thành
arabinose. Arabinose dưới tác dụng của raney nickel sẽ bị khử thành
arabitol. Arabitol được đồng phân hóa thành xylitol ở pH = 9 và nhiệt độ
170°c. Xylitol được tách ra bằng phương pháp sắc ký cột. Hiệu suất của quá
trình đạt cao nhất là 77%.
12
+ sắc ký tinh chế xylitol.
Dịch thủy phân được cho vào cột sắc ký. Sau khi chạy thu được dịch chứa
khoảng 34% xylitol. Người ta quay vòng dịch sắc kí cho đến khi thu được
dịch chứa khoảng 50 đến 75% xylitol và không nhiều hơn 5% xylose.
Xylitol được kết tinh từ dịch đậm đặc ở nhiệt độ 5 °c trong hơn 2 giờ. Người
ta tiếp tục quá trình như trên cho đến khi dịch thủy phân không chứa nhiều
hơn 0 ,1 % xylose.
♦♦♦ sản xuất xylitol bằng phơngpháp vi sinh [6 ], [7], [11], [13]

Cũng tương tự như phương pháp tổng hợp hóa học, xylitol được sản xuất
từ nguyên liệu là xylose nhờ enzyme D - xylose reductase. Trong tế bào vi
sinh vật, quá trình chuyển hóa xylose thành xylitol diễn ra theo sơ đồ sau:
Chú thích: XR : D - xylose reductase
Một số sinh vật có chứa enzyme D - xylose reductase nên có thể
chuyển xylose thành xylitol như: các loại nấm sợi, một số nấm men:
Candida pelliculosa, c. boidinic, c. guilliermondii, c. tropicalis. Ngoài ra,
các chủng Saccharomyces, Debaryomyces, Trichosporon, Cryptococcus,
Kloeckera, Torulopsis, Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces,
Ambrosiozyma và Torula cũng đang được nghiên cứu để sản xuất xylitol.
Một số loại vi khuẩn cũng có thể sản xuất ra xylitol như: Enterobacter
liquỷaciens, Corynebacterium sp., Mycobacterium smegmatis. Con đường
sản xuất xylitol nhờ các vi sinh vật đang được nghiên cứu để thay thế
phương pháp tổng hợp hóa học vì nó tận dụng được các nguồn nguyên liệu
rẻ tiền và không qua nhiều công đoạn.
NADP+ xylitol
1f NADH+H
D-xylulose
13
Các yếu tốảnh hưởng đến sinh tổng ỈÌƠD xỵUtol
+ Ảnh hưởng của xylose và glucose đến sự chuyển hóa xylose thành xylitol
^ Ảnh hưởng của nồng độ xylose:
Năm 1992, Horitsu đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ D - xylose
trong môi trường nuôi cấy Candida tropicalis. Nồng độ D - xylose biến đổi
từ 100 g/1 đến 300 g/1 và nhận thấy rằng để đạt xylitol cao nhất thì nồng độ
D- xylitol là 172 g/1.
Năm 1998, Rose cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ D - xylose
ban đầu đến sự sinh tổng hợp xylitol của chủng Candida guilliermondii FTI
20037 thì nhận thấy rằng nồng độ D - xylose tốt nhất là 15 - 60 g/1.'
^ Ảnh hưởng của glucose:

Glucose không có ảnh hưởng rõ ràng đến sinh tổng hợp xylitol.
Ảnh hưởng của các điều kiện khác đến sản xuất xylitol:
Thí nghiệm được nghiên cứu trên chủng Candida guilliermondii FTI
20037. Người ta thấy rằng: tuổi của giống, số lượng tế bào đưa vào nuôi cấy
và thành phần của dịch thủy phân ảnh hưởng đáng kể đến sự sản xuất
xylitol.
Số lượng tế bào đưa vào nuôi cấy và tuổi của giống lần lượt dao động
trong khoảng 0,1 g/1 - 6,0 g/1 và 16 - 48h. Để đạt được xylitol cao nhất thì
số lượng tế bào đưa vào nuôi cấy là 3 g/1 và độ tuổi của giống là 24h. Khi
đó, năng suất mà xylitol đạt được là 0,74 g/g.
Tinh chếxỵỊữol từ dịch ịên men
Để tinh chế xylitol từ dịch lên men có các phương pháp sau: dùng nhựa
trao đổi ion, dùng than hoạt tính và phương pháp sắc ký cột.
^ Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion
Xylitol có ái lực cao với nhựa trao đổi cation và có ái lực kém với nhựa
trao đổi anion. Người ta dùng cả nhựa trao đổi cation và anion để tinh chế
14
xylitol từ dịch lên men. Nhưng do xylitol bị dính chặt vào bề mặt của nhựa
trao đổi ion nên còn khoảng 40-55% xylitol không được tinh chế.
^ Phương pháp dùng than hoạt tính
Dịch lên men được xử lý bằng than hoạt tính với nồng độ 200g/l ở 80°c,
pH = 6 và trong thời gian 60 phút. Màu sắc, protein có trong dịch thủy phân
và khoảng 20% xylitol sẽ bị than hoạt tính hấp phụ. Dịch sau khi xử lý được
lọc và kết tinh xylitol. Tuy nhiên, do dịch nhớt nên khả năng kết tinh của
xylitol rất khó. Phải để trong 6 tuần ở -15°c thì xylitol mới có thể kết tinh.
^ Phương pháp dùng sắc ký cột : Đã được đề cập trong phần sản xuất hoá
học.
Nhìn chung quá trình sản xuất xylitol ở thời điểm hiện tại vẫn chủ yếu
dựa vào phương pháp hoá học với sự tham gia của hai quá trình đó là thuỷ
phân xylan (là một thành phần của hemicellulose) sau đó hydro hoá xylose

bằng phản ứng sử dụng xúc tác là Raney-nickel. Điều kiện của phản ứng
hydro hoá đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao. Xu thế hiện nay là thay thế phản
ứng này bằng xúc tác sinh học. Quá trình này đã được thử nghiệm thành
công ở Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ, Phần Lan. Rất nhiều loại nấm men có
thể khử xylose thành xylitol với hiệu xuất khác nhau. Chủng nấm men có
khả năng chuyển hoá cao nhất hiện nay có thể đạt hiệu suất chuyển hoá là
80% và ở nồng độ 200g/l. Phương pháp chuyển hoá xylose thành xylitol nhờ
vi sinh vật cũng là phương pháp được nghiên cứu trong đề tài này.
15
Phần II
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Hóa chất:
Xylitol (Đức); NAD (Nhật); Xylose (Đức); INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4-
nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride - Nhật); Amoni sulíat (Trung
Quốc); PMS (Phenazine methosulphat - Nhật); Cao nấm men (Difco);
Acetonitril (Merk).
Các chủng nấm men được lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp
Thực phẩm.
Chủng nấm men
Tên la tinh
NRRLY 12968
Candida tropicalis
NRRLY 17677
c. maltosa
KFP 214
c. maltosa
KFP 222
c. maltosa

KFP 252
Debaryomyces hansenỉi
KFP 177
Debarỵomỵces hansenii
Bã mía được lấy từ huyện Đông Anh, Hà Nội.
2.1.2 Máy móc- thiết bị
Tủ lạnh
Box cấy
Nồi hấp
n p ? _
Tủ sấy
Tủ nuôi cấy
Máy đo quang phổ
Máy so mầu microtiter plate
Máy HPLC
Tomy SS-325 (Nhật Bản)
Sanyo (Nhật Bản)
Sanyo (Nhật Bản)
Sanyo (Nhật Bản)
Bioblock Scientiíic (Pháp)
Shimadzu u v - 1650 PC (Nhật Bản)
Anthos 2010
Thermo Finnigan (Italia)
16
Kính hiển vi Nikon Eclipse E600 (Nhật Bản)
Máy đo PH Metter Toledo
Máy ly tâm Heracus Sepatech (Đức)
Máy lắc IKA s - 260 (Nhật Bản)
Máy lắc ổn nhiệt Thermomixer Comíort (Đức)
Lò vi sóng LG (Hàn Quốc)

Đĩa peptri, micro pipette các loại, ống íalcon, ống eppendorí, đĩa microtiter
plate, đầu côn các loại.
2.1.3 Một sô môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường nhân giống cấp 1 ( MT 1 ị:
Cao nấm men 5g
Minerals (1)
Trace elements (2)
(NH4 )2 S04 5g
Dịch thuỷ phân 4 % đường khử
Nước cất Vừa đủ 1 lít
Môi trường lên men [ MT 2);
Cao nấm men 5g
Minerals (1)
Trace elements (2)
(NH4 )2 S04 5g
Dịch thuỷ phân ở các nồng độ nghiên cứu
Nước cất vừa đủ 1 lít
Môi trườns nuôi cấy đểtách ẹnzỵme c MT_3}:
Cao nấm men 3g
K2 HP04 3g
MgS04 .7H20 lg
D - xylose 30g
H20 vừa đủ lOOml
Môi trường chon chủng [ MT_ 4}:
Cao nấm men 5g
Minerals (1)
17
Trace elements (2)
(NH4 )2 S04 5g
D - xylose 75g

H20 vừa đủ 1 lít
(1) Minerals (Dung dịch muối khoáng):
KH2 P04 850 mg
K2 HP04 150 mg
MgS04 .7H20 500 mg
NaCl 100 mg
CaCl2 100 mg
(2) Trace elements (Các yếu tố vi lượng)
H3 BO3 500 //g
CuS04 .5H20 400 ụg
KI 100//g
FeCl3 .6H20 200 jU g
MnS04 .4H20 400 JLI g
Na2 Mo04 .2H20 200 //g
ZnS04 .7H20 400 Mg
2.2. Phương pháp nghiên cứu [1], [2], [3]
2.2.1. Phương pháp quan sát hình thái tê bào
Nấm men được nuôi cấy trên môi trường malt - glucose 2 °Bx trong vòng 7
ngày sau đó làm tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x40 và
xioo. Ảnh tế bào được chụp bằng phần mềm video capture thông qua
camera kỹ thuật số sau đó được xử lý bằng phần mềm photoshop.
2.2.2. Phương pháp định lượng xylitol.
Xylitol được định lượng bằng phương pháp enzyme và phương pháp sắc ký.
18
Phương. ẼằẾR ẹnzỵmei
Nguyên lý: Xylitol trong dung dịch được xác định thông qua các phản ứng
sau:
Xylitol + NAD+ < ỵnH > D - Xylulose + NADH + H+
NADH + INT + H+ ms' >NAD+ + Formazan
Enzyme xilitol dehydrogenase (XDH) được tách chiết từ chủng nấm men

Candida tropicalis NRRLY 12968. sản phẩm tạo thành (formazan) có mầu
đỏ và được đo ở bước sóng 620nm bằng máy so mầu Anthos 2010. Nồng độ
xylitol trong dung dịch tỷ lệ thuận với mật độ quang của formazan. Nồng độ
xylitol được xác định thông qua việc xây dựng đường chuẩn từ các dung
dịch xylitol đã biết trước nồng độ.
Phương pháp sắc ký HPLC ri /, 1 31
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân
tích hoá lý dùng để phân tách các thành phần của một hỗn hợp dựa vào ái
lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không
hoà tan vào nhau. Đó là pha tĩnh và pha động. Pha động là chất lỏng và pha
tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân
hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được
biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng
dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ.
Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký là tổng các tương tác:
19
Trong đó: F, - Lực giữ chất phân tích; F2 - Lực kéo chất ra khỏi cột; F3 - Lực
lưu giữ pha động của pha tĩnh
Trong ba lực tương tác này thì F| và F2 là hai yếu tố quyết định, F3 chỉ là
yếu tố ảnh hưởng. Như vậy các chất khác nhau thì sẽ có Fị, F2 khác nhau,
kết quả là các chất di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau. Sau khi ra khỏi
cột các chất được phát hiện bằng detector và chuyển qua bộ phận xử lý kết
quả. Tín hiệu phân tích định tính là thời gian lưu chất đó trên cột hay vị trí
của pic trên sắc ký đồ. Tín hiệu phân tích định lượng là diện tích pic (hay
chiều cao pic) thu được, phụ thuộc vào nồng độ của chất trong dung dịch
đem đo HPLC.
Để xác định xylitol chúng tôi sử dụng sắc ký HPLC như sau:
2.2.3 Phương pháp lựa chọn chủng giông
Các chủng giống được nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một (MT 1)
trong 2 ngày, sau đó ly tâm lấy tế bào và chuyển vào môi trường chọn chủng

(MT 4). Các chủng này được nuôi cấy lắc 120 vòng/ phút ở 28 °c trong 5
ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm loại bỏ tế bào và dùng để định lượng
xylitol.
2.2.4 Phương pháp xác định sinh trưởng tế bào
Tế bào sau một thời gian nuôi cấy nhất định được đem ly tâm, loại bỏ môi
trường nuôi cấy. Phần tế bào còn lại được rửa bằng nước cất và đem đo OD ở
bước sóng 620 nm.
Pha động:
Pha tĩnh :
CH3 CN/H 20 =3/1
Cột Hypersil - APS2 ( Silicagel được gắn
thêm nhóm -NH2) 150cm X 4.6cm
Bơm mẫu tự động : 20 //1
Tốc độ dòng : lml / 1 phút
Detector: Surveyor MSQ
20
2.2.5 Phương pháp chọn chủng chịu được nồng độ dịch thuỷ phân cao
Các môi trường nuôi cấy có nồng độ dịch thủy phân khác nhau được chuẩn
bị. Các chủng được nuôi cấy thích nghi với môi trường có nồng độ dịch thủy
phân từ thấp đến cao. Theo dõi sự phát triển của chủng giống bằng cách lấy
mẫu và quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi quang học. Sau một thời gian
nuôi cấy, lựa chọn chủng chịu được nồng độ dịch thủy phân cao và giữ trên
môi trường có nồng độ dịch thủy phân tương ứng
2.2.6 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện lên men
Chuẩn bị môi trường lên men ở các điều kiện khác nhau, sau đó đem nuôi
cấy lắc 150 vòng/ phút ở nhiệt độ 28 °c, mẫu được lấy theo thời gian, ly tâm
lấy dịch để định lượng xylitol, phân tế bào còn lại được đo OD ở 620 nm để
đánh giá khả năng phát triển của tế bào.
21
2.3. Kết quả và bàn luận

2.3.1 Quan sát hình thái tế bào
Ú Ă -
J
„ }
- „ ì _ í ỹ
, \ v r w
r y -
■JT -Jh.
Ệ /
2ữ
*
% #
_
ị ■;*%
r \ N O '
■ w r \
V
. - * r 7 . / /
ặ 7
jf
^ qp
° o
s
% 8 ‘ằ %•
> o
qệ
v ầ p
r Q í * ) * * « * « « «
0 ^
W / V — '

)
o
r ' r ~ )
^
1 0 ° -
” b & °
í ?
r J n o
® % c
I
o ỉ f c
r ) © ể
0 ©
Hình 1. Hình thái của một số nấm men được sử dụng trong đề tài. la ,lb -
KFP 177; lc, ld - KFP 214; le, lf - KFP 222. Thanh chèn trong các hình a,
c, e tương úng với 10 ịim , thanh chèn trong các hình b, d, f tương ứng vói 4
|im.
22
o
ọ ° l,s _
/ N Ọ
'i o (9
o o > V.'
0

0 3
o{
0 o
ì

o
r>
ề o
o
0-0
Q O
S J "3
/ r \
/í?
Hình 2. Hình thái của một số nấm men được sử dụng trong đề tài. 2g, 2h -
NRRLY 12968; 2i , 2k - NRRLY 17677; 2m , 2n - KFP 252. Thanh chèn
trong hình g, i, m tương ứng với 10 HIĨ1 , thanh chèn trong hình h, k, n tương
ứng với 4 ịom.
23