Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa tại thành phố đồng hới trong dung môi n hexan và clorofom

1
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là thành quả kiến thức cũng như kĩ năng mà em thu
được sau 4 năm ngồi trên ghế giảng đường đại học. Thành quả này không thể chỉ
riêng một mình em có thể làm được, đó là nhờ công ơn dạy dỗ, những kinh
nghiệm quý báu mà thầy cô đã truyền đạt lại cho em trong những năm học qua,
cũng như sự quan tâm, ủng hộ của gia đình và bạn bè. Để hoàn thành khóa luận
này em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, rèn luyện ở Trường Đại học Quảng Bình,
nhất là những thầy cô giáo ở tổ bộ môn Hóa, Khoa Khoa học tự nhiên. Đặc biệt
em chân thành cảm ơn cô giáo hướng dẫn Thạc sĩ Lý Thị Thu Hoài đã tận tình
hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Mặc dù đã có nhiều cố gắng
để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất song do điều kiện thực tế cũng như
hạn chế về mặt kiến thức và kinh nghiệm nên bản thân em có thể có những sai sót
mà bản thân không thấy được, rất mong sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và
các bạn để khóa luận có thể hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Đồng Hới, tháng 6 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Tuyết Trinh

2
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC i
MỞ ĐẦU 1
1. Lí do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 1
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1
4. Giả thuyết khoa học 1
5. Nhiệm vụ nghiên cứu 2
6. Các phương pháp nghiên cứu 2
7. Bố cục khóa luận 2
NỘI DUNG 3
Chương 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Giới thiệu về cây hoa sữa 3
i) Sơ lược nguồn gốc cây hoa sữa trong giới thực vật 3
ii) Cây hoa sữa 4
1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây hoa sữa 6
1.3. Hợp chất Ancaloit 6
i) Khái niệm 6
ii) Thành phần nguyên tố và cấu tạo của Ancaloit 7
iii) Phân loại Ancaloit 7
iv) Tính chất chung của Ancaloit 8
v) Sự tạo thành Ancaloit trong cây 9
vi) Thuốc thử Ancaloit 9
1.4. Flavonoit 10
i) Đại cương về flavonoit 10

ii) Hợp chất flavonoit có trong cây hoa sữa 12
1.5. Phương pháp tách một số hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa 12
i) Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 12
ii) Phương pháp chiết 13
iii) Phương pháp sắc ký 17
iv) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 20

3
Chươ ng 2: NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 22
2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất 22
2.1.1. Nguyên liệu chính 22
2.1.2. Thu mẫu hoa và phương pháp xử lý 22
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 22
2.2. Quy trình nghiên cứu 22
2.2.1. Tách, chiết tinh dầu 22
2.2.2. Tách, chiết bằng dung môi hữu cơ 24
2.2.3. Tách, chiết bằng dung dịch axit 26
2.2.4. Pha thuốc thử 27
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Hàm lượng tinh dầu 28
3.2. Thành phần trong dịch chiết nước, chiết bằng dung dịch axit 28
3.2.1. Dịch chiết nước 28
3.2.2. Dịch chiết dung dịch axit 29
3.3. Thành phần Ancaloit trong dịch chiết n-hexan 30
3.3.1. Hàm lượng 30
3.3.2. Trạng thái vật lý 31
3.3.3. Phản ứng với thuốc thử 31
3.4. Thành phần trong dịch chiết clorofom 32
3.4.1. Hàm lượng 32
3.4.2. Trạng thái vật lý 32

3.4.3. Phản ứng với thuốc thử 33
3.5. Kết quả khảo sát điều kiện chiết Ancaloit 34
3.5.1. Kết quả lựa chọn thuốc thử 34
3.5.2. Kết quả lựa chọn dung môi chiết 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
1. Kết luận 36
2. Kiến nghị 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO 37


4
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1: Các loại pha động và pha tĩnh thường được sử dụng
trong kỹ thuật sắc ký 18
Bảng 2: Tóm tắt các cấu hình sắc ký khác nhau 19
Bảng 3: Kết quả khi thử sản phẩm chiết với thuốc thử 34

DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Cây hoa sữa ở thành phố Đồng Hới 4
Hình 2: Hoa sữa 5
Hình 3: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 13
Hình 4: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước Hoa sữa trong phòng thí nghiệm 23
Hình 5: Chiết n-hexan 25
Hình 6: Thuốc thử nhận biết Ancaloit 27
Hình 7: Kết quả thử thuốc thử của dịch nước khi chiết trong dung môi hữu cơ 28
Hình 8: Hòa tan cao etanol vào nước cất, thử thuốc thử 29
Hình 9: Cao etanol hòa tan trong dung dịch HCl 5% 30
Hình 10: Dịch chiết n-hexan 31
Hình 11: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Wagner 31

Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer 32
Hình 13: Dịch chiết clorofom 33
Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer 33




5







MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài
Hoa sữa là cây khá phổ biến ở Việt Nam. Cây thường được trồng lấy bóng
mát ở nhiều địa phương. Từ xa xưa ông cha ta đã biết dùng vỏ cây hoa sữa làm
thuốc chữa bệnh. Các nghiên cứu gần đây chủ yếu là nghiên cứu về thành phần
của vỏ cây hoa sữa và cho thấy vỏ của chúng chứa Ancaloit có tác dụng dược lý.
Một bộ phận khác của cây là hoa thì lại được ít nghiên cứu đề cập đến. Hoa sữa là
loài hoa có mùi thơm nồng nên nghiên cứu xác định thành phần có trong hoa có
thể làm phong phú thêm nguồn hương liệu phục vụ công nghiệp sản xuất. Mặt
khác, ngoài vỏ cây có tác dụng dược lý thì hoa cũng có thể chứa thành phần tương
tự, xác định được thành phần đó làm phong phú thêm nguồn dược liệu phục vụ
trong y học. Ở địa bàn thành phố Đồng Hới là nơi có nhiều hoa sữa, làm nguồn
nguyên liệu phong phú phục vụ cho quá trình nghiên cứu và ứng dụng.
Việc thực hiện nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết hoa sữa trong dung

môi n-hexan và clorofom là hướng nghiên cứu tách chiết mới các hợp chất thiên
nhiên. Vì vậy, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa
sữa tại thành phố Đồng Hới trong dung môi n-Hexan và Clorofom”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Xác định thành phần hoá học các hợp chất trong dịch chiết hoa sữa bằng
dung môi n-Hexan và Clorofom.
- Xây dựng qui trình chiết tách Ancaloit trong hoa sữa.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Cây hoa sữa, được chọn một cách ngẫu nhiên trên địa bàn thành phố Đồng Hới.
- Hoa của cây hoa sữa lấy trong khoảng thời gian tháng 11/2014 - 01/2015.
4. Giả thuyết khoa học

6
- Hoa sữa là cây thuộc họ trúc đào, là cây có hàm lượng Ancaloit lớn trong tự
nhiên. Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy thành phần vỏ cây chứa Ancaloit, mà
trong thực vật Ancaloit không chỉ tập trung ở một bộ phận mà phân bố ở nhiều bộ
phân khác của cây. Hoa của cây hoa sữa có thể chứa thành phần Ancaloit.
- Hoa sữa đã được sử dụng nhiều trong y dược, vì vậy nó có hợp chất có tác
dụng dược lý.
- Đề tài này xác định thành phần có trong dịch chiết hoa sữa để biết rõ những
hợp chất có trong dịch chiết n-Hexan và Clorofom.
5. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xây dựng hệ thống lý thuyết về tách chiết các hợp chất trong các dung môi
làm cơ sở cho thực nghiệm.
- Tìm hiểu đối tượng cần nghiên cứu là hoa sữa.
- Lập kế hoạch, quy trình nghiên cứu thành phần dịch chiết hoa sữa trong
dung môi n-hexan và clorofom.
- Tổ chức thực hiện kiểm chứng lại giả thuyết đã nêu.
6. Các phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu lý thuyết

- Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
+ Phương pháp chọn mẫu
+ Chiết bằng các dung môi n-hexan và clorofom
+ Xác định thành phần các hợp chất trong dịch chiết từ vỏ hoa sữa
trong dung môi chiết bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS.
7. Bố cục khóa luận
Đề tài có cấu trúc gồm có 3 phần:
- Phần mở đầu
- Phần nội dung
+ Chương 1: Tổng quan
+ Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm
+ Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
- Phần kết luận và kiến nghị


7
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây hoa sữa
1.1.1. Sơ lược nguồn gốc cây hoa sữa trong giới thực vật
Hoa sữa, hay còn gọi là mò cua, mù cua (danh pháp khoa học Alstonia
scholaris (L.) R.Br) là một loài thực vật nhiệt đới thuộc chi Hoa sữa, họ Trúc đào,
bộ Hoa vặn (Contortae) hay bộ Long đởm (Gentianales).
Họ Trúc đào - Apocynaceae, là cây gỗ hay cây nhỏ, nhiều bộ phận của cây có
nhựa mủ trắng. Lá thường mọc đối hoặc mọc vòng, đôi khi mọc cách, không có lá
kèm. Hoa đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hay cụm hoa xim. Hoa trừ
bộ nhụy gồm 2 lá noãn (đôi khi 3-5). Hoa đều, tràng hợp hình ống, thường có
phần phụ dạng vảy hoặc lông ở bên ống tràng, các thùy tràng xếp vặn. Số nhị bằng
số cánh hoa, chỉ dính vào ống tràng, bao phấn hình mũi tên, trung đới có thể mang
phần phụ là lông dài, hạt phấn rời nhau. Bầu trên, thường rời hoặc phân thùy, 1

vòi và 1 đầu nhụy. Đầu nhụy thường loe rộng, hình nón cụt và các bao phấn
thường dính vào đó. Trong mỗi lá noãn hoặc trong mỗi ô của bầu có từ 2 đến
nhiều noãn đảo. Quả thường gồm 2 đại, có khi quả hạch. Hạt có cánh hay chùm
lông tơ, dễ phát tán. Phôi nhỏ và có nội nhủ. [1]
Trúc đào là một họ lớn, có tới gần 200 chi và 2000 loài, phân bố rộng rãi ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta tìm thấy khoảng 50 chi và 170 loài, thường mọc
trên các đồi hoặc rừng thưa, có một số loài cây trồng. Chất nhựa mủ ở trong cây họ
Trúc đào thường có tính độc (như ở các chi Nerium, Strophanthus), có vị đắng, y học
dùng làm thuốc. Ở một số ít cây, chất nhựa mủ này lại có tính đàn hồi như cao su.
Trong cây, sợi libe rất vững chắc, do đó có thể dùng lấy sợi.
Một số cây quen thuộc trong họ Trúc đào như:
- Dây huỳnh (Allamanda cathartica L.): Cây bụi leo lá mọc vòng 4 chiếc
một, hoa to, màu vàng. Cây trồng làm cảnh.
- Trúc đào (Nerium odrorum L.): Cây nhỏ, lá mọc vòng 3 chiếc một, màu lục
thẩm, dai cứng. Hoa thường có cánh kép, màu đỏ hồng hay trắng. Lá có chất độc,
chứa neriolin, có thể dùng để chữa bệnh tim. Cây trồng làm cảnh.
- Đại (Plumeria rubra L. var. acutifolia (Ait.) Woods.): Cây nhỡ, cành khỏe,
lá lớn mọc cách, để lại những vết sẹo sau khi rụng. Hoa khá lớn, ngoài màu trắng,
trong vàng, thơm. Một vài bộ phận cây được dùng làm thuốc: vỏ thân và vỏ rể có

8
tác dụng tẩy mạnh, hoa dùng chữa ho, lá dã đắp chữa sai khớp, bong gân, mụn
nhọt, nhựa dùng như vỏ thân nhưng liều thấp hơn, còn dùng chữa chai chân và vết
loét. Cây thường được trồng ở đình chùa làm cảnh.
- Thông thiên (Thevetia peruviana (Pers.) K.Schum.): Cây nhỡ, lá mọc cách
màu lục bóng. Hoa màu vàng, hình chuông. Quả màu lục. Cây trồng làm cảnh.
Hạt chứa dầu và một số heterozit trong đó có chất thevetin được dùng chế thuốc
chữa bệnh tim. Có nơi dùng hạt dã nát làm thuốc trừ sâu. Tuy nhiên, việc dùng
thuốc chế từ cây này phải hết sức thận trọng vì rất độc.
Ở đồi và rừng thưa ta hay gặp các loài như:

- Sừng trâu (Strophantus divaricatus (Lour.) Hook. Et Arn.): Cây nhỏ, cao độ
3 - 4m, lá xanh bóng, hoa màu vàng nhạt, quả khô gồm 2 đại dính nhau ở gốc,
nom như chiếc sừng trâu. Cây độc, hạt dùng chế thuốc chữa bệnh tim.
- Thừng mức hay lồng mức (Wrightia annamensis Dub. et Eberh.): Cây gỗ
nhỡ, hoa màu trắng hay vàng nhạt, mọc thành xim. Gỗ trắng, thớ mịn và nhẹ, dùng
làm guốc và khắc dấu. Cây mọc nhiều ở rừng thưa và tái sinh khỏe ở các đồi
hoang các tỉnh miền Bắc, miền Trung. [1]
1.1.2. Cây hoa sữa
Hoa sữa hay mò cua (Alstonia scholaris (L.) R.Br.): Cây to cao khoảng 10 -
20m, vỏ nứt nẻ màu xám. Cành mọc vòng. Lá mọc vòng 5 - 8 cái, tập trung ở đầu
cành; phiến lá dày, hình bầu dục.


Hình 1: Cây hoa sữa ở thành phố Đồng Hới
Hoa nhỏ, màu trắng đục, mọc thành xim tán ở nách lá, mùi thơm hắc, nhất là
về đêm. Quả gồm hai đại dài và hẹp, chứa nhiều hạt. Hạt có mào lông ở hai đầu.

9

Hình 2: Hoa sữa
Loài cổ nhiệt đới, mọc hoang và cũng được trồng khắp ở nước ta. Cây ưa
sáng, sinh trưởng nhanh thường mọc ở ven rừng và ở những nơi ẩm như ven sông,
ven suối. Tái sinh bằng chồi mạnh. Có thể trồng bằng cây con hay bằng cành, ra
hoa vào tháng 10 - 11 và có quả chính tháng 1 - 2 hàng năm.
Gỗ có thể làm gỗ dán và các đồ dùng thông thường. Thường được trồng làm
cảnh, trồng ven đường phố và quanh các công trình công cộng để lấy bóng mát.
Vỏ thân chứa nhiều Ancaloit (0,16 - 0,27%), được dùng nhiều làm thuốc.
Thường dùng làm thuốc bỗ chữa thiếu máu, kinh nguyệt không đều, sốt rét cấp và
mạn tính, đau bụng, ỉa chảy, kiết lỵ, viêm khớp có sưng nóng đỏ đau, bệnh ngoài
da, lở ngứa. Vỏ cây sắc đặc dùng ngậm chữa sâu răng. Ở nước ta, vỏ cây hoa sữa

được dùng làm dược liệu chế rượu bổ Dikatina.
Ở Ấn Độ, vỏ được dùng trị sốt rét và cũng dùng trị ỉa chảy, kiết lỵ, và trị rắn
cắn; dịch cây đáp các vết loét. Ở Thái Lan, vỏ cây dùng trị lỵ, trị cảm và viêm phế
quản. Ở Trung Quốc, vỏ và lá dùng trị ho gà, viêm khí quản mạn tính, suyễn khan,
sốt rét, cảm mạo phát sốt, sưng amygdal, viêm gan cấp tính, phong thấp, đòn ngã,
gãy xương, mụn nhọt sưng đỏ. [5]




10
1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây hoa sữa
Hoa sữa là một loài khá phổ biến ở Ấn Độ, vùng Nam Á, Đông Nam Á
vì vậy nhà khoa học trong và ngoài nước đã có các bài báo cáo, nghiên cứu về
nó. Các nhà hóa học nghiên cứu về cây hoa sữa chủ yếu là nghiên cứu xác định
thành phần hóa học trong các bộ phận của cây. Nhiều đề tài chủ yếu nghiên cứu
về thành phần trong vỏ cây, lá. Một số nhà khoa học đã phân lập được một số
chất có trong đó. Những nghiên cứu đó đã chỉ ra rằng trong thành phần hóa học
của cây, các bộ phận trong cây có chứa Ancaloit. Hoa sữa được biết đến là thực
vật giàu Ancaloit và có giá trị trong điều trị bệnh. Trong thành phần hóa học có
ở các loài cây thì Ancaloit đóng vai trò quan trọng đến việc phát triển các loài
thuốc mới, vì Ancaloit có một loạt cấu trúc hóa học và đã được xác định là
quyết định đến tính chất dược lý của cây đó. Hầu như tất cả các bộ phận của
cây như vỏ, rễ, lá, hoa, quả đều được phát hiện có chứa Ancaloit. Từ các bộ
phận của cây hoa sữa, các nhà khoa học ở nhiều nước khác nhau trên thế giới
đã phân lập các chất Ancaloit như sau: picirinine; scholaricine; echitamine;
clorua echitamine; rhazine; nareline; dihydrocondylocarpine; 19,20-Z-
vallesamine; 19,20-E-vallesamine; alschmine và isoalschomine; mataranine A
và B.
Ngoài ra trong thành phần hóa học của hoa sữa còn có một số thành phần

khác như: linalol; cis và trans oxit linalol; α – tecpineol; tecpinen-4-ol được tìm
thấy trong hoa sữa. Một số hợp chất như: iridois; coumarin; flavonid;
leucoanthocyanis; đường khử; phenolics đơn giản, steroids, saponin và tanin cũng
được tìm thấy. [6], [7]

1.3. Hợp chất Ancaloit
1.3.1. Khái niệm
Ancaloit là những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ, thường
gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài động vật.
Trên thực tế có rất nhiều loại thực vật có Ancaloit nhưng ở mức độ vết hoặc
tỉ lệ phần vạn. Để giới hạn với thực tiễn, một cây được xem là có Ancaloit phải
chứa ít nhất 0,05% Ancaloit so với mẫu cây khô. Đặc biệt của Ancaloit là có tác
dụng hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thần
kinh. Với một lượng nhỏ, có Ancaloit là chất độc gây chết người, nhưng có khi lại
là thần dược trị bệnh đặc hiệu. [2]


11
1.3.2. Thành phần nguyên tố và cấu tạo của Ancaloit
a. Thành phần nguyên tố của Ancaloit
Có 3 loại Ancaloit:
- Loại chứa 3 nguyên tố: C, H, N.
- Loại chứa 4 nguyên tố: C, H, N, O hoặc C, H, N, S.
- Loại chứa 5 nguyên tố: C, H, N, O, S loại này có độc tính rất cao trong các
loài nấm độc. [2]
b. Cấu tạo của Ancaloit
- Các Ancaloit thường có cấu tạo khác nhau, nhưng thường có nhân chứa dị
vòng có nitơ như:

- Các Ancaloit trong cùng một cây hoặc cùng một họ thực vật thường có

công thức cấu tạo gần giống nhau.
- Các Ancaloit trong cây thường kết hợp với các axit như axit oxalic, axit
tacric, axit lactic, axit malic để tạo thành dạng muối.
- Thành phần của các Ancaloit trong cây phụ thuộc nhiều vào từng vùng, khí
hậu, địa lí, các mùa và các năm. Ancaloit thường chứa trong môt số bộ phận như:
lá, hạt, rễ, vỏ [4]
1.3.3. Phân loại Ancaloit
Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho
số lượng Ancaloit rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các Ancaloit được chia
chia thành ba loại:
- Ancaloit thật: Là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ,
thường có chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ
amino axit, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối
của một axit hữu cơ, ngoại trừ: colchicin, axit aristolochic, Ancaloit tứ cấp. Các
Ancaloit loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của
chúng hơn là theo dị vòng hoàn.
- ProtoAncaloit: Được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả
mescalin và N, N-đimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng

12
hợp từ các amino axit, trong đó nguyên tở nitơ không ở trong vòng dị hoàn.
- Giả Ancaloit: là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino axit, bao
gồm hai nhóm hợp chất lớn là Ancaloit steroid và Ancaloit terpenoid.
Hầu hết các Ancaloit hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng người
ta cũng thấy Ancaloit trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật Chỉ
một đặc điểm chung thường gặp là tên của các Ancaloit thường tận cùng bằng chữ
“ine”. [4]

1.3.4. Tính chất chung của Ancaloit
a. Trạng thái

Đa số Ancaloit không màu, ở trạng thái kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác
định hoặc có khoảng nhiệt độ phân hủy. Một vài Ancaloit ở dạng nhựa vô định
hình, một vài Ancaloit ở dạng lỏng (nicotin, coniin) và một vài Ancaloit có màu
(berberin màu vàng, betanidin màu đỏ). [4]

b. Tính bazơ mạnh
- Ancaloit là những hợp chất có tính bazơ yếu, do có sự có mặt của các
nguyên tử nitơ. Tính bazơ của các Ancaloit cũng khác nhau tùy thùy theo sự
hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên
nguyên tử nitơ.
- Các Ancaloit thường có tính bazơ mạnh có thể làm xanh quỳ tím.
- Các Ancaloit có thể tạo muối với các axit.
- Một số Ancaloit có thể làm kết tủa Fe(OH)
3
, Al(OH)
3
trong dung dịch.
- Một số Ancaloit có tính bazơ mạnh đẩy được các bazơ trung bình ra khỏi
muối của chúng. [2]
c. Tính tan
- Các Ancaloit tính bazơ yếu thì phải cần môi trường axit mạnh để tạo thành
muối, tan trong nước.
- Các Ancaloit ở dạng bazơ tự do hầu như không tan trong nước, nhưng
thường tan tốt trong các dung môi hữu cơ như clorofom, dietyl eter, alcol bậc
thấp. Các muối của Ancaloit thì tan trong nước, ancol và hầu như không tan trong
dung môi hữu cơ như clorofom, dietyl eter, benzen. Các protoancaloit và giả
Ancaloit thường dễ tan trong nước. [4]

13
d. Tác dụng của ánh sáng
Một số Ancaloit không bền ở ngoài ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại; có một số
bị thái hóa khi chiếu tia sáng có bước sóng nhất định. [2]

e. Hoạt tinh sinh lí cao
Các Ancaloit có tác dụng vào hệ thần kinh rất mạnh và có tác dụng lý hóa đối
với cơ thể người và động vật. Con người đã sử dụng các Ancaloit với liều lượng
nhỏ để chữa bệnh hay giải khát như cacao, cà phê, Nhiều Ancaloit là chất gây
nghiện cực kỳ nguy hiểm đối với con người như thuốc phiện, heroin
Các Ancaloit có chứa S thường cố độc tính rất mạnh, người ta thấy các
Ancaloit này trong các loài nấm độc. [4]

1.3.5. Sự tạo thành Ancaloit trong cây
Trước đây người ta cho rằng nhân cơ bản của các Ancaloit hay thuộc chất
chất của đường kết hợp với amoniac để có nitơ mà sinh ra. Ngày nay bằng các
phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta chứng
minh được Ancaloit tạo ra từ các axit amin. Qua định tính và định lượng Ancaloit
trong các bộ phận khác nhau của cây người ta thấy nơi tạo ra Ancaloit không phải
luôn luôn là nơi tích tụ Ancaloit. Nhiều Ancaloit được tạo ra ở rễ lại vận chuyển
lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng
được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt. [8]

1.3.6. Thuốc thử Ancaloit
Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa với Ancaloit, nhưng
các thuốc thử này có thể cho kết quả dương tính với các hợp chất như: coumarin,
polyphenol, purin, amino axit, protein, axit triterpen, hợp chất có chứa nitơ
Có ba thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Wagner, ngoài ra còn có
một số thuốc thử khác để phát hiện các loại Ancaloit đăc thù. [4]

a. Thuốc thử Mayer
Hòa tan 1,36 g HgCl
2
trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10 ml
nước cất. Hỗn hợp hai dung dịch và thêm nước cho đủ 100ml.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit, nếu
có Ancaloit sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành
sẽ hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi AcOH, etanol có sẵn
trong dung dịch thử.


14
b. Thuốc thử Dragendorff
Hòa tan 8,0 g nitrat bismuth Bi(NO
3
)
3
.H
2
O trong 25 ml HNO
3
30% (d
= 1.18). Hòa tan 28 g KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung
dịch, để yên trong tủ lạnh 5
o
C cho tủa màu nâu sậm và tan trở lại, lọc và thêm
nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam đỏ được chứa trong chai màu nâu để che
ánh sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu được vài tuần.
Dung dịch dùng để định tính sự hiện diện của Ancaloit bằng ống nghiệm
hoặc để làm dung dịch phun xịt lên bản mỏng.

- Để định tính bằng ống nghiệm: Dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit đựng
trong ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragandorff vào ống nghiệm nếu có
Ancaloit sẽ xuất hiện kết tủa màu cam nâu. (Tủa Ancaloit có thể được thu hồi
bằng cách xử lý vơi Na
2
CO
3
và chiết với dietyl eter).
Thuốc thử không phản ứng với hợp chất amino axit, nhưng có thể cho kết
quả dương tính với hợp chất có nhóm cacbonyl tiếp cách như pyron,
cinamadehyd
- Để phun xịt lên tấm bản mỏng: Pha dung dịch phun xịt: trong một bình
phun xịt, cho vào lần lượt theo thứ tự: 20ml nước; 5ml HCl 6N; 2 ml dung dịch
thuốc thử Dragendorff ở trên và 5 ml NaOH 6 N. Dung dịch nếu trữ trong tủ lạnh
có thể để lâu 10 ngày. Sử dụng dung dịch này phun xịt lên bản mỏng, nếu có
Ancaloit sẽ cho vết màu cam đỏ.
c. Thuốc thử Wagner
Hòa tan 1,27 g I
2
và 2 g KI trong 20 ml nước cất. Thêm nước cho đủ 100 ml.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit, nếu có
Ancaloit sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
d. Thuốc thử Iodoplatinat (dung dịch để phun xịt lên bản mỏng, phát hiện
Ancaloit có nitơ trong vòng dị hoàn)
Dung dịch clorua platin 10% (3ml) và 97 ml nước. KI 6 g và 94 ml nước.
Hỗn hợp hai dung dịch này này lại, trữ dung dịch trong chai lọ màu nâu.
1.4. Flavonoit
1.4.1. Đại cương về flavonoit
Flavonoit là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều
rau, quả, hoa Phần lớn các flavonoit có màu vàng (do từ flavus là màu vàng);

tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím đỏ, không màu cũng xếp vào nhóm này vì

15
về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản.
Flavonoit có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen
A và B nối nhau qua một dây có 3 cacbon, nên thường được gọi là C
6
– C
3
– C
6
.
Cách đánh số tùy theo dây C
3
đóng hay hở. Nếu dây C
3
đóng, thì đánh số bắt đầu
từ dị vòng với dị nguyên tố oxigen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng
B đánh số phụ. Nếu dây C
3
hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên
vòng A.


Thường flavonoit có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên
nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoit có thể hiện diện ở dạng tự do
hoặc dạng glycosid. Các đường thường gặp nhất là đường D-glucose, kế đó là D-
galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và aixt uronic.
Chalcon hiện diện ít trong tự nhiên, flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp;
flavon và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Do có nhiều nhóm –OH

phenol nên các flavonoit có thể liên kết với nhau để tạo thành phức tạp hơn hoặc
tạo với các hợp chất khác có trong cây thí dụ kết hợp với đường để tạo thành
glycosid
Các thuốc thử để định tính sự hiện của flavonoit: Có nhiều phương pháp để
phát hiện flavonoit.
- Phân biệt sơ bộ bằng hơi amoniac: Dưới ánh đèn tử ngoại UV
365
và sự hiện
diện của hơi amoniac, các flavonoit sẽ thay đổi màu sắc. Cao chiết cây được chấm
hai chấm riêng biệt lên trên cung cùng một tấm sắc ký lớp mỏng, giải ly. Cắt bản
mỏng ra làm đôi: một bản để tự nhiên, còn một bản đặt trong bình kính bão hòa
bằng hơi bão hòa bằng amoniac và tiếp theo phun xịt bản bởi dung dịch 1%
KOH/etanol. Lần lượt quan sát màu sắc của các vết trên 2 bản: dưới ánh sáng
thường và dưới ánh đèn tở ngoại 365nm. Sự khác nhau về màu tùy theo hợp chất
flavonoit.
- Tác dụng với H
2
SO
4
đậm đặc: Hòa tan hợp chất flavonoit vào H
2
SO
4
đậm
đặc; flavon và flavovol cho màu vàng đậm đến màu vàng cam và có phát huỳnh

16
quang đặc biệt. Chalcol, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ. Flavanon cho
màu từ cam đến đỏ.
- Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/etanol: Nhỏ dung dịch NaOH vào một

dung dịch flavonoit hòa tan trong etanol, sẽ có màu vàng đến màu cam đỏ. Nếu là
flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu
vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏ đến tím.
- Tác dụng với dung dịch 1% AlCl
3
/ etanol: Tùy theo số lượng, vị trí của các
nhóm hydroxy - OH, hợp chất flavonoid có màu khác nhau từ xanh lục đến xanh đen.
- Tác dụng với dung dịch axetat chì (có tính kiềm) pha bão hòa trong nước:
Phun xịt dung dịch lên bản mỏng, sấy bản 110
o
C trong 10 phút.
- Phản ứng Cyanidin của Wilstatter: Phản ứng khử bột Mg trong HCl/etanol
trên các dẫn xuất flavonoit. Cách thực hiện như sau: Chuẩn bị hai ống nghiệm,
cho vào mỗi ống 2ml cao chiết hòa tan trong metanol, ống 1 làm đối chứng. Với
ống số 2: cho thêm 1ml ancol tert-butyl hoặc ancol isoamyl; 0.5ml HCl đậm đặc;
3 - 5 hạt magie kim loại. Đun nhẹ trong vài phút, sẽ xuất hiện màu ở lớp ancol
phía trên. Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon
dung dịch trong 2 ống sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có isoflavon,
isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu (kết quả âm tính). Nếu sử dụng bột
Zn thay thế cho bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu đỏ xậm, còn flavanon cho
màu hồng nhạt hoặc không màu. [4]
1.4.2. Hợp chất flavonoid có trong cây hoa sữa
Nghiên cứu trước đây cho thấy có 8 loại flavonoid trong cây hoa sữa gồm:
kaempferol, quercetin, isorhamnetin, kaempferol-3-0-beta-D-galactopyranoside,
quercetin-3-0-beta-D-galactopyranoside, isorhamnetin-3-0-beta-D-galactopy-
ranoside,kaempferol-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(2-1)-0beta-D-galac-topyranoside,
quercetin-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(21)-0-beta-D-galac-topyranoside. [3]
1.5. Phương pháp tách một số hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa
1.5.1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Áp suất hơi bão hòa của hỗn hợp chất lỏng tan vào nhau được xác định theo

áp suất hơi của các cấu tử riêng theo định luật Raun:
P = P
A
+ P
B

Áp suất hơi của hỗn hợp, nếu không tạo thành hỗn hợp đẳng phí, nằm giữa
áp suất hơi của các cấu tử riêng, còn nhiệt độ sôi của hỗn hợp nằm giữa nhiệt độ

17
sôi của hai cấu tử. Ngược lại, nếu hai chất thực tế không hòa tan vào nhau thì
chúng không ảnh hưởng gì tới áp suất hơi bão hòa của hỗn hợp.
Áp suất hơi bão hòa P được xác định bằng tổng áp suất hơi của từng cấu tử
riêng, nên áp suất hơi của hỗn hợp lớn hơn áp suất hơi của từng cấu tử, còn nhiệt
độ sôi luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng cấu tử.
Trường hợp quan trọng nhất là chưng cất lôi cuốn hơi nước (hơi nước lôi
cuốn cùng với chất hữu cơ). Chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng để tách biệt hỗn
hợp chất, trong đó có một chất dễ bay hơi với nước, để tinh chế chất khỏi chất phụ
dạng nhựa, để phân tích hoàn toàn chất dễ bay hơi mà không chưng cất được dưới
áp suất thường. Chưng cất lôi cuốn hơi nước có thể tiến hành dưới áp suất thường
hay trong chân không. Phương pháp này dùng để tách, chiết các hợp chất terpen,
dễ bay hơi có trong hoa sữa.
Dụng cụ để cất lôi cuốn hơi nước gồm một bộ phận: bình cầu để tạo hơi
nước, bình chứa hỗn hợp chất hữu cơ, bình cầu hứng, ống sinh hàn nước, ống bảo
hiểm, ống nối. [2]


Hình 3: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước
1.5.2. Phương pháp chiết
Phương pháp chiết là phương pháp thu lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để

tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành cấu tử riêng. Có thể
chiết từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn. Phương pháp để chiết các Ancaloit
trong hoa sữa là sử dụng chiết chất lỏng.

18
Chiết từ dung dịch là quá trình chuyển từ chất lỏng này sang chất lỏng khác.
Sự chuyển đó là tuân theo định luật phân bố chất tan giữa 2 tướng theo định luật
phân bố của Nertz:
K = C
A
/ C
B
Trong đó: K - là hằng số phân bố
C
A
, C
B
- là nồng độ chất tan trong dung môi A và B
Chiết thực hiện được khi hệ số K khác 1
Chiết chất hữu cơ từ dung dịch (phần lớn là từ nước) là lắc dung dịch với
dung môi thích hợp không trộn lẫn với dung môi cũ (thường là nước) và có khả
năng hòa tan tốt chất hữu cơ hơn dung môi cũ.
Dung môi phải chọn là dung môi có khả năng hòa tan lớn chất hơn dung môi
cũ, dễ tách ra khi tinh chế lại thành chất tinh khiết không trộn lẫn vào dung môi
cũ, có sự khác nhau về tỉ khối so với dung môi cũ; ít có khả năng tạo nhũ tương, ít
nguy hiểm. Nếu chất tan xấu trong nước thì chỉ cần chiết một lần, ngược lại thì
phải chiết nhiều lần, có khi phải dùng phương pháp chiết liên tục. Sau khi thu
được dung dịch chiết, làm khô bằng chất làm khô rồi tinh chế bằng các phương
pháp tinh chế thường. [2]

Để tách chiết Ancaloit trong cây người ta thường dùng hai phương pháp chủ
yếu là chiết tách bằng dung môi hữu cơ và chiết tách bằng dung dịch nước axit.
a. Chiết với dung dịch axit:
* Nguyên tắc tổng quát: Bột cây được tận chiết với metanol, dung môi rất tốt
có thể chiết hết tất cả các Ancaloit ở dạng baz tự do, Ancaloit dạng tứ cấp N
+
,
dạng N-oxit (N
+
→O), dạng glycosid, Ancaloit loại phân cực mạnh.
* Ưu và nhược điểm của phương pháp:
Khi sử dụng dung môi metanol hoặc etanol, sẽ chiết hết tất cả, nên sẽ khó
khăn trong qua trình tách riêng các Ancaloit và các hợp chất hữu cơ.
Phương pháp này không chiết tốt các Ancaloit có tính bazơ yếu, vì cần môi
trường axit mạnh mới có thể tạo thành muối, tan trong nước. [4]




* Quy trình thực hiện:


19

b. Chiết bằng dung môi hữu cơ
* Nguyên tắc tổng quát: Bột cây được tẩm với dung dịch kiềm để chuyển đổi
các Ancaloit ở dạng muối trở thành dạng bazơ tự do; kế tiếp bột cây này được
chiết với một trong các loại dung môi hữu cơ như: benzen, dietyl eter, clorofom,
etyl axetat
* Ưu nhược điểm của phương pháp
Do tẩm với dung dịch kiềm để biến các muối (N
+
) thành dạng Ancaloit bazơ
tự do, rồi chiết với clorofom nên phương pháp này không chiết được với những
dạng N-oxit (N
+
→O); dạng N
+
tứ cấp. Thêm nữa, việc sử dụng dung môi có tính
phân cực trung bình như clorofom sẽ không chiết tốt các Ancaloit glycosid, các
Ancaloit loại phân cực mạnh.
Muốn khắc phục, trước khi chiết tách cần sử dụng bột kẽm Zn/HCl để khử
dạng N-oxit thành dạng N tự do hoặc thủy giải Ancaloit glycosid bằng dung dịch
axit; hoặc đổi dung môi clorofom bằng loại dung môi khác có tính phân cực mạnh
hơn.
Việc lựa chọn nồng độ kiềm cho giai đoạn này cần phải nghiên cứu kỹ. Việc tẩm
bột cây bằng kiềm với nồng độ mạnh/ yếu khác nhau có thể có những ảnh hưởng. Đối
với Ancaloit có tính baz tương đối mạnh, nếu dùng dung dịch kiềm yếu để kiềm hóa
thì có thể không đẩy được Ancaloit ra khỏi muối của nó. Đối với Ancaloit chứa nhóm

chức ester, amid nếu dùng kiềm nồng độ quá mạnh có thể cắt đứt nối này. Đối với

20
Ancaloit có nhóm –OH phenol như morphin, nếu dùng kiềm mạnh như NaOH, sẽ tạo
muối phenolat không tan trong dung môi hữu cơ như clorofom. [4]

* Quy trình thực hiện

1.5.3. Phương pháp sắc ký

21
a. Sơ lược về sắc ký
Ngày nay phương pháp tốt nhất để phân lập các hợp chất hữu cơ là sắc ký.
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra
riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp
chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha
tĩnh). Sắc ký là kỹ thuật phân tích hiệu quả với độ phân giải cao, có thể giúp khảo
sát một mẫu chất có trọng lượng vài miligam và đôi khi chỉ vài microgam; có thể
phân tích một hỗn hợp mẫu chất phức tạp; có thể phân tích định lượng.
Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt được kết quả tốt hay không tùy
vào hệ số phân chia (partition coefficient). Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt
vào một hệ thống gồm có hai pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ
phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ này thay đổi tùy vào các
tính chất động học của các tính chất động học của hợp chất và của hai pha.
Hệ số phân chia được biểu diễn như sau:

Cũng tương tự, một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt
vào một hệ thống gồm có hai pha, mỗi loại hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối
với hai pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/yếu khác nhau, nhờ vậy, ký thuật sắc ký
có thể tách riêng các loại hợp chất. [4]

Người ta phân biệt nhiều loại kỹ thuật sắc ký khác nhau dựa vào bản chất của
hai pha sử dụng hoặc vào bản chất của các hiện tượng xảy ra trong quá trình tách

các chất. Có nhiều cách phân loại sắc ký [4], chủ yếu là những cách phân loại sau:
* Phân loại sắc ký theo bản chất của hai pha sử dụng
Tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh và pha động, người ta phân biệt một số ký
thuật sắc ký khác nhau.
- Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh tách riêng các hợp chất
trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp thu của nó.
- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí.

22
Bảng 1: Các loại pha động và pha tĩnh thường được sử dụng trong kỹ thuật
sắc ký
Pha động Pha tĩnh Tên gọi của kỹ thuật sắc ký
Chất lỏng Chất rắn Sắc ký lỏng – rắn (Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng)
Chất khí Chất rắn Sắc ký khí – rắn (gọi chung là sắc khí)
Chất lỏng Chất lỏng
Sắc ký lỏng – lỏng (Sắc ký HPLC với cột nhồi pha
đảo C-18)
Chất khí Chất lỏng Sắc ký khí – lỏng (gọi chung là sắc khí)
* Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình
tách chất
- Sắc ký phân chia (Partition chromatography): Sự tách riêng các chất của
một hỗn hợp dựa vào việc mỗi hỗn hợp của hỗn hợp đó sẽ có hệ số phân chia khác
nhau giữa pha tĩnh với pha động. Hệ số phân chia tùy thuôc vào khả năng hòa tan
của hỗn hợp chất vào mỗi pha, vào tính chất phân cực của: mỗi hợp chất, pha tĩnh,
pha động. Nếu pha tĩnh tương đối phân cực, các hợp chất có tính phân cực mạnh
sẽ bị nó giữ lại mạnh hơn so với các hợp chất kém phân cực, hệ quả là các hợp
chất kém phân cực sẽ di chuyển ngang pha tĩnh nhanh hơn và ra khỏi cột sớm hơn
so với các hợp chất phân cực. Trong trường hợp ngược lại , nếu pha tĩnh kém phân
cực, các chất phân cực sẽ ra khỏi cột trước các chất kém phân cực. Trong hệ thống
này, tính phân cực của pha động cũng giữ một vai trò quan trọng.

- Sắc ký hấp thu (Adsorption chromatography): Trong sắc ký hấp thu, các
chất của hỗn hợp (thay vì hòa tan vào pha tĩnh lỏng như trong trường hợp của sắc
ký phân chia) sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của chất pha tĩnh. Các hợp chất
khác nhau sẽ có mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh, hệ quả là trong quá trình
pha động di chuyển, chúng sẽ tách xa nhau ra. Sự hấp thu xảy ra là do sự tương
tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực; do sự tương tác giữa những phân tử có
mang các nhóm phân cực đối với pha tĩnh rắn là chất phân cực; do nối hydrogen,
nối Van der Waal
- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography): Sự tách riêng các chất
của một hỗn hợp dựa vào việc hợp chất nào của hỗn hợp có mang điện tích ngược
dấu với điện tích của hạt nhựa (pha tĩnh), bị hạt nhựa bắt giữa lại trong cột. Hợp
chất mang nhiều điện tích gắn mạnh vào pha tĩnh, hợp chất mang ít điện tích gắn
yếu và không mang điện tích không gắn, và ra khỏi cột trước.

23
- Sắc ký lọc gel (Size exclusion chromatography; Gel fiitration chromatography):
Sự tách riêng các hợp chất của một hỗn hợp dựa vào những phần tử có kích thước
nhỏ có thể dễ dàng chui vào những lỗ trống đó và bị giữ lâu trong cột, còn những
phân tử có kích thước lớn, không thể lọt vào lỗ trống, bị giải ly ra khỏi cột. Việc
tách chất dựa vào trọng lượng phân tử của các hợp chất. Các phân tử được giải ly
ra khỏi cột theo thứ tự trọng lượng phân tử giảm dần: phân tử có trọng lượng phân
tử lớn sẽ ra khỏi cột trước , phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ sẽ ra sau.
* Phân loại sắc ký theo cấu hình
Phân loại sắc ký theo cấu hình có nghĩa là cho biết pha tĩnh được chứa trong
thiết bị ra sao và với thiết bị như thế, pha động đi ngang qua pha tĩnh như thế nào,
xét theo trạng thái vật lý hoặc cho biết làm sao pha động có thể di chuyển được
(nhờ vào trọng lực, mao dẫn, hoặc lực khác). Về tổng quát có hai loại cấu hình:
phương pháp phẳng (planar method) và phương pháp cột (column mothod).
Trong những loại phương pháp phẳng: pha tĩnh được tráng thành một lớp
thật mỏng lên trên một tấm phẳng. Khi sắc ký, tấm này được dựng đứng và pha

động di chuyển ngang qua bề mặt của tấm này, có thể theo chiều từ trên xuống
dưới hoặc từ dưới lên trên.
Trong những loại phương pháp cột: pha tính đươc nén trong một trụ hình
tròn và pha động di chuyển xuyên ngang qua trụ đó, có thể nhờ trọng lực hoặc nhờ
một bơm có áp suất lớn hoặc nhờ áp lực của chất khí.
Bảng 2: Tóm tắt các cấu hình sắc ký khác nhau
Hình học Cấu hình sắc ký
Chiều di chuyển của
pha động
Loại sắc ký
Phẳng Giấy
Đi lên; đi xuống; từ
tâm lan tỏa tròn
Phân chia
Phẳng Lớp mỏng
Đi lên; đi xuống; từ
tâm lan tỏa tròn
Hấp thu, phân chia,
trao đổi ion, lọc gel
Cột Cột hở Đi xuống
Hấp thu, phân chia,
trao đổi ion, lọc gel
Cột Sắc ký khí (GC) Nhờ vào ngoại lực Hấp thu, phân chia
Cột HPLC Nhờ vào ngoại lực
Hấp thu, phân chia,
trao đổi ion, lọc gel


24
1.5.4. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS)

Kỹ thuật sắc ký khí được sử dụng để phân tích một lượng rất lớn những loại
hợp chất hữu cơ khác nhau, các hợp chất đó có thể là chất khí hoặc chất lỏng, đôi
khi là chất rắn. Tuy nhiên, đối với các loại hợp chất không bền nhiệt, kém bay hơi
(trọng lượng phân tử lớn hơn 300 amu) hoặc loại hợp chất ion, ký thuật sắc ký
không thể phân tích mẫu trực tiếp ngay được, mà cần phải biến đổi các hợp chất
nói trên thành các dẫn xuất có tính bay hơi, mới có thể phân tích bằng sắc ký.
Trong sắc ký khí, pha động là một chất khí thường được gọi là khí mang. Khí
này xuất phát từ một bình khí nén thành một dòng khí có thể điều chỉnh lưu lương
bởi những van khóa, để đi vào một cột có chứa pha tĩnh. Tại cột này, các thành
phần khác nhau của hỗn mẫu khảo sát sẽ được tách riêng ra. Mẫu chất khảo sát
hoặc các hợp chất chuẩn được chích vào dòng khí mang tại một vị trí ở đầu cột pha
tĩnh, rồi đi ngang qua pha tĩnh được tách thành những hợp chất riêng rẽ rồi ra khỏi
cột. Các hợp chất khác nhau của hỗn hợp mẫu chất ban đầu được bô phận phát hiện
ghi nhận (bằng các tín hiệu điện tử) và giao diện của máy biến đổi tín hiệu đó thành
các mũi xuất hiện trên sắc ký đồ. Máy in sẽ in sắc ký đồ ra trên giấy.
Một trong những phương tiện hữu ích giúp các nhà hóa học xác định cấu trúc
hóa học của hợp chất cần khảo sát là máy sắc ký ghép khối phổ, thường được gọi
tắt là GC - MS. Dòng khí thoát ra khỏi máy sắc ký khí được cho đi ngang qua một
khóa để vào một ống, nơi có một lỗ phân tử (molecular leak) và được dẫn đến
buồng ion hóa của máy khối phổ. Người ta có thể có một khối phổ đồ của mỗi cấu
phần chứa trong hỗn hợp đã được chích vào máy sắc ký lúc ban đầu.
Hệ máy GC - MS có thể khảo sát một đơn chất hoặc một hỗn hợp. Trước
tiên, máy sẽ tách mẫu, phân tích mẫu, kế đó, bộ phận máy tính của máy khối phổ
so sánh các dữ kiện vừa thu được với các số liệu phổ chuẩn đang chứa sẵn trong
thư viện của máy, đề nghị cấu trúc hóa học của chất (đơn chất hoặc hỗn hợp) khảo
sát. Máy in ra một bảng danh sách những hợp chất có khả năng giống với chất
khảo sát, mỗi hợp chất đề nghị này đều có ghi kèm theo độ tương hợp
(compatibility). Độ tương hợp càng lớn, trên 90%, cấu trúc của hợp chất khảo sát
càng có khả năng mà máy đề nghị.
Để có thể khẳng định hơn về cấu trúc hóa học của hợp chất khảo sát, cần có

thêm các loại phổ khác như: IR, RMN Máy đo khối phổ ghép vào máy sắc ký
khí phải tương đối chặt chẻ và có hiệu suất cao.

25
Ưu điểm: Việc kết hợp hai loại máy sắc ký khí và máy khối phổ có các thuận
lợi
- Tính bay hơi: Cả hai loại máy đều có thể phân tích tất cả các hợp chất khí,
lỏng, rắn nếu các hợp chất này có đặc tính áp suất hơi lớn.
- Đô nhạy: Máy khối phổ có độ nhạy cao, nên có thể phân tích những hợp
chất đi ra từ một cột sắc ký khí.
- Nhiệt độ: cột sắc ký khí và hệ thống nhận mẫu của máy khối phổ có thể
hoạt động ở khoảng nhiệt độ giống nhau. Máy sắc ký khí hoạt động trong khoảng
nhiệt độ từ nhiệt đô phòng đến 300
o
C, tùy vào tính chất của mẫu phân tích và tùy
vào pha tính của cột sắc ký.
- Thời gian quét: Máy khối phổ có vận tốc quét rất nhanh, đủ để ghi nhận hết
các tín hiệu đi ra từ một cột sắc ký khí.
Nhược điểm:
- Áp suất: Mỗi máy hoạt động trong một điều kiện áp suất rất khác nhau, nên
sự kết hợp hai máy với nhau là trở ngại lớn nhất. Máy sắc ký khí có áp suất tại đầu
ra là 1atm, từ đây hợp chất khảo sát được dẫn vào buồng ion hóa của máy khối
phổ có áp suất 10
-6
torr (1 torr = 1mmHg), vì thế giữa hai máy phải có một giao
diện. Giao diện này phải chịu được một sự giảm áp suất rất lớn mà không được
làm hao mất nhiều mẫu khảo sát, cũng như phải tách loại bỏ bớt ít nhất 90% khí
mang ra khỏi mẫu khảo sát, với mục đích làm mẫu đậm đặc càng nhiều càng tốt
trước khi mẫu được cho đi vào buồng ion hóa của máy khối phổ.
- Loại cột sắc ký khí: Chỉ có một số loại cột sắc ký có thể sử dụng trong máy

GC – MS. Các cột loại polymer hữu cơ sẽ bị đứt mảnh khi nhiệt độ gia tăng, mảnh
nhỏ này sẽ đi vào khối phổ làm xuất hiện trên khối phổ đồ những mũi rất đặc
trưng, có thể gây nhầm lẫn là các mảnh ion của mẫu khảo sát.
- Giá thành của máy cao
- Cần điều chế dẫn xuất cho mẫu khảo sát: Nhiều loại hợp chất khảo sát, do
tính tính chất không thể bay hơi, nên cần phải được biến đổi thành các dẫn xuất
bay hơi được, trước khi thực hiện sắc ký. [4]