hiệu quả kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y



TRẦN NGUYỄN TUẤN PHƯƠNG


HIỆU QUẢ KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS
VIÊM GAN VỊT TYPE 1 ĐƯỢC TẠO TỪ
LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ TRONG
ĐIỀU KIỆN IN VITRO


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y





Cần Thơ, 2014
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

HIỆU QUẢ KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS
VIÊM GAN VỊT TYPE 1 ĐƯỢC TẠO TỪ
LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ TRONG
ĐIỀU KIỆN IN VITRO



GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU TRẦN NGUYỄN TUẤN PHƯƠNG






Cần Thơ, 2014

i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Thử nghiệm hiệu quả bảo nguyên bào sợi vịt của kháng thể
kháng virus viêm gan vịt type 1 tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện In
vitro’’ do sinh viên Trần Nguyễn Tuấn Phương thực hiện tại phòng thí
nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng,
Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014.


Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014

Duyệt của bộ môn Duyệt của giáo viên hướng dẫn



PGS.TS. HỒ THỊ VIỆT THU



Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014
Duyệt của Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng













ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số
liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn


Trần Nguyễn Tuấn Phương

iii
LỜI CẢM TẠ
Con xin kính gửi lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng nhất đến Cha Mẹ -
đấng sinh thành đã nuôi dưỡng, dạy dỗ, động viên khuyến khích con trong
suốt quá trình học tập và làm người.
Qua thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại Học Cần Thơ, cũng
như trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp đại học, tôi đã
được quý Thầy Cô tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức kinh
nghiệm quý báo về chuyên ngành Thú Y mà tôi đang theo học.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
- Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn này.
- Quý Thầy Cô Bộ môn Thú Y và Chăn Nuôi đã tận tâm giảng dạy và truyền
đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên ngành quý báu.
- Anh Lê Trần Hoài Khanh đã hết lòng chỉ dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi trong thời gian làm việc tại phòng thí nghiệm.
- Chị Nguyễn Thị Anh Thư và Chị Huỳnh Thể Vân đã giúp đỡ khi tôi làm đề
tài trong phòng thí nghiệm virus học.

iv

TÓM LƯỢC
Đề tài “Hiệu quả kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ
lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in vitro”. Được tiến hành tại phòng thí
nghiệm virus học, Bộ Môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng,
Trường Đại học Cần Thơ trong thời gian từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014.
Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát độc tính tế bào và khả năng bảo vệ
lớp nguyên bào sợi vịt (Duck Embryo Fibroblast (DEF)) của dich kháng thể
được tạo từ lòng đỏ trứng gà (IgY) đối với virus viêm gan vịt type 1 (Duck
hepatitis virus type 1 (DHV-1)). Hiệu quả bảo vệ nguyên bào sợi vịt của IgY
được xác định qua các thời điểm khác nhau. Qua đó, các độ pha loãng của IgY
theo bậc 10 đưa vào tế bào trước 12 giờ, 24 giờ và sau 12 giờ, 24 giờ gây
nhiễm tế bào với DHV-1 liều 500 TCID
50
. Các số liệu và hình ảnh được ghi
nhận và phân tích qua hai phương pháp là khảo sát sự thay đổi hình thái lớp
nguyên bào sợi vịt dưới kính hiển vi soi ngược và so sánh các giá trị từ
phương pháp đo mật độ quang.
Kết quả thử nghiệm cho thấy dịch IgY không gây độc cho tế bào DEF ở
liều thấp hơn 1,688

mg/ml. Hiệu quả bảo vệ tế bào DEF của IgY biến thiên
theo phương thức phụ thuộc liều thử nghiệm nằm trong khoảng hàm lượng
IgY từ 1,688 mg/ml đến 1,688.10
-1
mg/ml. Ngoài ra, dịch IgY cho hiệu quả
bảo vệ tế bào DEF in vitro tốt nhất nếu đưa IgY vào môi trường tế bào trước
12 giờ gây nhiễm với DHV-1.
Kết quả đề tài cung cấp các số liệu thử nghiệm để làm cơ sở cho các
nghiên cứu tiếp theo về kháng thể IgY trong điều kiện in vitro.

v
MỤC LỤC
Trang
TRANG DUYỆT LUẬN VĂN i
LỜI CAM ĐOAN ii
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM LƯỢC iv
MỤC LỤC v
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH HÌNH viii
DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ ix
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x
Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1. Virus viêm gan vịt 2
2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus 2
2.1.2. Sức đề kháng của virus viêm gan vịt 2
2.1.3. Cơ chế sinh bệnh của virus viêm gan vịt type 1 3
2.1.4. Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1 3
2.1.5. Nuôi cấy tế bào xơ phôi vịt 3
2.2. Kháng thể IgY của gà 3
2.2.1. Sơ lược về IgY 3
2.2.2. Cấu trúc và chức năng 4
2.2.3. Đặc tính của IgY 4
2.3. Vai trò của kháng thể 5
2.3.1. Liên kết với kháng nguyên 5
2.3.2. Hoạt hóa tế bào miễn dịch 5
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 6
3.1.1. Thời gian 6

3.1.2. Địa điểm 6
3.2. Vật liệu và hóa chất 6
3.2.1. Đối tượng thí nghiệm 6
3.2.2. Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 6

vi
3.2.3. Các hóa chất và môi trường 7
3.3. Nội dung nghiên cứu 7
3.4. Phương pháp nghiên cứu 8
3.4.1. Chuẩn bị lớp đơn tế bào DEF 9
3.4.2. Chuẩn độ và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy 10
3.4.3. Xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF 12
3.4.4. Khảo sát hoạt tính bảo vệ nguyên bào sợi vịt của IgY qua các
thời điểm bổ sung sinh phẩm khác nhau 14
3.5. Phương pháp xử lý số liệu 15
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16
4.1. Chuẩn độ virus, xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy
của virus gây bệnh viêm gan vịt type 1 16
4.2. Kết quả xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY đối với
tế bào DEF 17
4.3. Hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của kháng thể IgY kháng DHV-1
trong điều kiện in vitro 20
4.3.1. Kết quả xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của dịch kháng thể
IgY khi đưa sinh phẩm vào lúc 12 giờ sau khi gây nhiễm DHV-1 21
4.3.2. Kết quả xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của dịch kháng thể
IgY khi đưa sinh phẩm vào lúc 24 giờ sau khi gây nhiễm DHV-1 23
4.3.3. Kết quả xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của dịch kháng thể
IgY khi đưa sinh phẩm vào lúc 12 giờ trước khi gây nhiễm DHV-1 25
4.3.4. Kết quả xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của dịch kháng thể
IgY khi đưa sinh phẩm vào lúc 24 giờ trước khi gây nhiễm DHV-1 27

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29
5.1. Kết luận 29
5.2. Đề nghị 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO 30
PHỤ LỤC 1 CHUẨN BỊ HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG 33
PHỤ LỤC 2 CÁC KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM 34
PHỤ LỤC 3 SỐ LIỆU VÀ XỬ LÝ THỐNG KÊ 35

vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
Bảng 4.1
Tỷ lệ xuất hiện CPE do DHC-1 gây ra theo nồng
độ virus trên lớp đơn tế bào DEF
16
Bảng 4.2

Giá trị OD
620
và tỷ lệ tế bào sống trung bình
trong thí nghiệm xác định liều an toàn của dịch
IgY
19
Bảng 4.3
Giá trị OD
620
và tỷ lệ tế bào sống trung bình khi
đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF sau 12 giờ
gây nhiễm với DHV-1
21

Bảng 4.4
Giá trị OD
620
và tỷ lệ tế bào sống trung bình khi
đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF sau 24 giờ
gây nhiễm với DHV-1
23
Bảng 4.5
Giá trị OD
620
và tỷ lệ tế bào sống trung bình khi
đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF trước 12 giờ
gây nhiễm với DHV-1
25
Bảng 4.6

Giá trị OD
620
và tỷ lệ tế bào sống trung bình khi
đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF trước 24 giờ
gây nhiễm với DHV-1
27

viii
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tên hình Trang
Hình 3.1
Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID
50
/ 0,1 ml 10

Hình 4.1
Hình ảnh tế bào DEF dưới tác động gây độc của
IgY ở những nồng độ khác nhau
18
Hình 4.2
Hình ảnh tế bào DEF dưới tác dụng bảo vệ bởi
IgY ở những nồng độ khác nhau đối với virus
DHV-1 khi gây nhiễm ở 12 giờ trước khi sử
dụng IgY (100X)
22
Hình 4.3
Hình ảnh tế bào DEF dưới tác dụng bảo vệ bởi
IgY ở những nồng độ khác nhau đối với virus
DHV-1 khi gây nhiễm ở 24 giờ trước khi sử
dụng IgY (100X)
24
Hình 4.4
Hình ảnh tế bào DEF dưới tác dụng bảo vệ bởi
IgY ở những nồng độ khác nhau bổ sung thời
điểm 12 giờ trước khi gây nhiễm virus DHV-1
(100X)
26
Hình 4.5
Mật độ quang trên đĩa nuôi cấy sau khi nhuộm
MTT, kháng thể IgY được đưa vào môi tường tế
bào DEF trước 24 giờ gây nhiễm DHV-1
28

ix
DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Sơ đồ Tên sơ đồ và biểu đồ Trang
Sơ đồ 3.1
Quá trình khảo sát xác định hoạt tính kháng
DHV-1 in vitro của dịch kháng thể IgY
8
Sơ đồ 3.2
Qui trình tạo lớp đơn tế bào DEF 9
Sơ đồ 3.3
Qui trình chuẩn độ virus gây bệnh viêm gan vịt
type 1 trên môi trường tế bào DEF
11
Sơ đồ 3.4
Qui trình xác định liều an toàn của dịch IgY đối
với tế bào DEF
13
Sơ đồ 3.5
Qui trình khảo sát hoạt tính bảo vệ tế bào DEF
của IgY qua các thời điểm khác nhau
15
Biểu đồ 4.1
Tỷ lệ tế bào sống trung bình của tế bào DEF với
các nồng độ kháng thể IgY khác nhau
19

x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Nguyên chữ Nghĩa tiếng Việt
CC
50
50% Cytotoxic concentration

Nồng độ gây độc 50% tế bào
CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào
D’MEM Dulbeco - Modified Eagle
Medium
Môi trường cải tiến của
Dulbeco
DEF Duck embryo fibroblast Nguyên bào sợi vịt
DHV Duck hepatitis virus Virus gây bệnh viêm gan vịt
DHV-1 Duck hepatitis virus type 1 Virus gây bệnh viêm gan vit
type 1
DMSO Dimethyl sulfoxide
DNA Deoxyribonucleic Axit
DPBS Dulbecco phosphate
buffered saline
Dung dịch muối đệm
phosphate Dulbecco
E’MEM Eagle Minimum Essential
Medium
Môi trường nuôi cấy tế bào
EDTA Ethylendiamin Tetra Acetic
Acid

Fab Fragment antigen binding Tiểu phần liên kết kháng
nguyên
FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai
Fc Fragment crystal Tiểu phần có khả năng kết
tinh
IgA Immunoglobulin A Globulin miễn dịch lớp A
IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch lớp G

IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch lớp M
IgY Egg yolk immunoglobulin Kháng thể lòng đỏ
IU

International unit Đơn vị quốc tế
MEM Minimum Essential Medium Môi trường cần thiết tối thiểu

MTT 3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-
2,5-diphenyl tetrazolium
bromide
Thuốc nhuộm MTT
NK Natural killer cell Tế bào diệt tự nhiên
OD620 Optical density 620nm Mật độ quang đo được ở
bước sóng 620nm

xi
PD Proportional distance Khoảng cách tỷ lệ
RNA Ribonucleic acid
SE Standard error Sai số chuẩn
SPF Specific-pathogen-free Đàn không có mầm bệnh
TCID
50
Tissue culture infective dose
50 %
Liều gây nhiễm 50% tế bào
nuôi cấy
Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

CTV Cộng tác viên
ĐC (-) Đối chứng âm Môi trường tế bào DEF chỉ

cho MTDT vào
ĐC (+) Đối chứng dương Môi trường tế bào DEF cho
DHV-1 với liều 500 TCID
50

MTDT Môi trường duy trì
MTPL Môi trường pha loãng
MTTT Môi trường tăng trưởng


1
Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm gan vịt do virus là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh
gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Xuân Bình, 2002). Bệnh
chủ yếu xảy ra ở vịt con 1-3 tuần tuổi với tỷ lệ chết cao từ 50-90%, có khi tới
100%. Bệnh cũng có thể gặp ở vịt mới nở hoặc vịt 5-6 tuần tuổi (Hồ Thị Việt
Thu và ctv, 2012). Virus viêm gan vịt hiện có 3 type: 1, 2 và 3. Trong đó,
virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1) có độc lực cao, gây bệnh nặng và tỷ lệ tử
vong rất lớn. Cho đến nay bệnh vẫn gia tăng, lưu hành ở nhiều địa phương trên
khắp cả nước, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người chăn nuôi. Bệnh
không thể điều trị bằng kháng sinh.
Kháng thể lòng đỏ (IgY) là một globulin miễn dịch được sản xuất từ
các tế bào plasmocyte. Kháng thể IgY có trọng lượng phân tử là 180 kilo-
dalton. Hiện nay trên thế giới bên cạnh các nghiên cứu tạo kháng thể gà chống
các tác nhân nhiễm trùng và ứng dụng thành công trong điều trị bệnh thú y ở
các loài như heo, bò, chó, gà đã có một số nơi nghiên cứu chế tạo kháng thể gà
kháng các tác nhân gây tiêu chảy ở người trong đó có Rotavirus và E.coli tiêu
chảy.
Ưu điểm của kháng thể đặc hiệu là liên kết với đúng kháng nguyên đó,

không gây tồn dư như kháng sinh gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người
khi sử dụng các sản phầm của con vật đó. Kháng thể sản xuất từ lòng đỏ sẽ thu
được nhiều kháng thể hơn so với sản xuất kháng thể từ huyết thanh, vì gà có
thể khai thác trong thời gian dài. Động vật có vú không thể khai thác huyết
thanh thường xuyên được. Sản lượng trứng gà lại cao 300 trứng/ năm mà mỗi
trứng cho hàm lượng IgY ít nhất là 100 mg/ trứng
Xuất phát từ nhu cầu tìm một phương thức trị bệnh viêm gan vịt type 1
đem lại hiệu quả cao. Chúng tôi tiến hành đề tài “Hiệu quả kháng thể kháng
virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in
vitro”
Mục tiêu đề tài
Xác định được hiệu quả bảo vệ tế bào nguyên bào sợi vịt (DEF) của
kháng thể IgY kháng virus viêm gan vịt type 1 tại các thời điểm bổ sung sinh
phẩm khác nhau. Thử nghiệm xác định hiệu quả bảo vệ tế bào DEF của kháng
thể IgY làm cơ sở cho thử nghiệm xác định hiệu quả bảo vệ vịt con thí nghiệm
của sinh phẩm này đối với bệnh viêm gan vịt do virus.




2
Chương 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1. VIRUS VIÊM GAN VỊT
2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus
Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DHV) là bệnh
truyền nhiễm cấp tính do một RNA virus rất nhỏ, xuyên qua được màng lọc
Beckfeld và Seitz (Levine and Fabricant, 1950). Theo Reuss (1959) dưới kính
hiển vi điện tử virus viêm gan vịt là những hạt tròn bề mặt xù xì, không có vỏ
bọc, kích thước 20-40 nm, có 32 capxomer.

Virus viêm gan vịt có 3 type khác nhau: type 1 (DHV-1), 2, 3. Các type
2 và 3 được công nhận tồn tại riêng biệt và nó gây bệnh cho vịt con đã miễn
dịch với type 1 (Nguyễn Đức Lưu, 2002).
Virus viêm gan vịt type 1: là một RNA virus không có vỏ bao được xếp
loại là một Piconavirus, có kích thước khoảng 20-40nm, Richer et al quan sát
virus dưới kính hiển vi điện tử kích thước DHV-1 khoảng 30nm (Woolcook
and Fabricant, 1997). Virus không gây ngưng kết hồng cầu gà, vịt, ngựa,
chuột, rắn, heo (Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Virus viêm gan vịt type 2: là một Astrovirus và có đường kính khoảng
28-30nm khi quan sát với kính hiển vi điện tử. Virus viêm gan vịt type 2 cũng
được so sánh với Astrovirus phân lập từ gà và gà tây bởi những nghiên cứu về
sự gây nhiễm và bảo vệ chéo cho thấy sự khác biệt kháng nguyên rõ ràng
(Nguyễn Đức Hiền, 2012).
Virus viêm gan vịt type 3: là RNA virus, có đường kính 30nm, virus
được phân loại là Piconavirus nhưng không liên quan đến type 1 vì không có
kháng nguyên chung qua kiểm tra bằng kỹ thuật trung hòa virus và kháng thể
quỳnh quang (Nguyễn Đức Hiền, 2012).
2.1.2. Sức đề kháng của virus viêm gan vịt
Virus viêm gan vịt có sức đề kháng cao, không bị bất hoạt khi xử lý
bằng ether hoặc fluorocarbon, chloroform, trypsin và methanol 30% hoặc
ammonium sulfate (Woolcock and Fabricant, 1997).
Virus có thể tồn tại ở pH= 3 đến 9 giờ. DHV tương đối ổn định ở nhiệt
độ dưới 40-45
0
C nhưng dễ bất hoạt ở nhiệt độ cao hơn (Davis, 1987). Với
nhiệt độ 50
0
C virus chết sau 1 giờ, ở 60
0
C virus chịu đựng được 30 phút. Ở

37
0
C virus tồn tại 48 giờ, 4
0
C trong 2 năm, -20
0
C có thể tồn tại tới 9 năm.
Trong chuồng trại ẩm ướt, trong phân vịt thì virus có thể tồn tại tới 10
tuần. Các chất sát trùng phải pha ở nồng độ cao và xử lý trong thời gian dài
mới tiêu diệt được virus (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007).




3
2.1.3. Cơ chế sinh bệnh của virus viêm gan vịt type 1
Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hóa, đường hô
hấp hoặc qua vết thương rồi vào máu. Virus theo máu đến các phủ tạng và tập
trung nhiều ở gan. Dưới tác động của virus quá trình trao đổi chất bị rối loạn,
lượng glycogen ở gan giảm thấp, lượng lipit tăng do quá trình chuyển hóa mở
bị đình trệ. Do đó, vịt con bị bệnh thiếu năng lượng và sức đề kháng bị giảm
sút.
Virus phát triển trong gan và trực tiếp phá hoại tế bào gan và các tế bào
nội mô huyết quản gây nên xuất huyết đặc hiệu. Virus nhân lên trong gan, tại
các tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kupffer. Tổ chức gan bị phá
hoại, gan không giải độc được và con vịt chết do ngộ độc (Phạm Sỹ Lăng và
ctv, 2005).
2.1.4. Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1
Nuôi cấy trên môi trường trứng
Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10-14 ngày

tuổi, 24-72 giờ sau khi gây nhiễm, phôi chết với bệnh tích: phôi còi cọc, xuất
huyết dưới da đặc biệt ở vùng đầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu đỏ
hoặc hơi vàng, có thể có điểm hoại tử. Ở những phôi chết muộn nước xoang
niệu mô có màu xanh nhạt, bệnh tích rõ hơn.
2.1.5. Nuôi cấy tế bào xơ phôi vịt
Có thể nuôi cấy DHV trong môi trường tế bào xơ phôi gà, xơ phôi vịt
và thận phôi vịt. Virus gây bệnh tích tế bào, thể hiện ở một số đặc điểm: nhân
tế bào co tròn, nguyên sinh chất đông đặc, tế bào tan vỡ hoàn toàn (Nguyễn Bá
Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007).
Theo Maiboroda (1972), sự xuất hiện CPE đầu tiên là các tế bào co tròn
sau 8 giờ gây nhiễm DHV.
Trên tế bào xơ phôi vịt và thận phôi vịt khi gây nhiễm DHV sự thay đổi
bệnh lý cũng được quan sát bởi Hwang (1965). Bệnh tích đặc trưng bởi sự
thoái hóa và hoại tử của lớp tế bào đơn. Các bệnh lý thường thấy rõ từ 24-36
giờ sau khi gây nhiễm (Fitzgerald et al, 1963).
Theo Hwang (1966), tế bào gan lấy từ phôi vịt 20 ngày tuổi và mật dộ
nuôi cấy là 5.10
5
tế bào/ml là phù hợp. Sự nhân giống DHV trên nuôi cấy tế
bào thận phôi vịt đã được kiểm tra trong một nghiên cứu cho phù hợp trong hệ
thống in vitro, trong đó DHV cho hiệu giá cao kèm với sự thay đổi bệnh lý tế
bào quan sát được trong chuẩn độ virus và kháng huyết thanh.
2.2. KHÁNG THỂ IgY CỦA GÀ
2.2.1. Sơ lược về IgY
Ở loài chim đã tìm thấy 3 loại kháng thể: IgA, IgM và IgY. IgA và IgM
thì tương tự như IgA và IgM của loài hữu nhũ, riêng IgY là globulin miễn dịch
chính có trong huyết thanh và lòng đỏ trứng. IgY hình thành khoảng 75% tổng

4
số globulin miễn dịch. Hàm lượng huyết thanh IgY, IgA, IgM lần lượt là 5,0 ;

1,25 và 0,61 mg/ml (Leslie et al., 1973).
2.2.2. Cấu trúc và chức năng
Cấu trúc của IgY nói chung cũng giống như cấu trúc của IgG ở động
vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light
chain) liên kết với nhau bằng cầu nối disulfit (-S-S-). Trọng lượng phân tử của
IgY là 180 kilo-dalton (KDa), lớn hơn so với IgG của động vật có vú (159
kDa).
Tương tự như các kháng thể khác, IgY có khả năng trung hoà các vi
sinh vật và độc tố của vi sinh vật. Trong máu và trong dịch gian bào của gà,
IgY đóng vai trò tương tự như IgG của động vật có vú. IgY tham gia hoạt
động opsonin hoá kháng nguyên, IgY gây ngưng tập kháng nguyên hữu hình,
kết tủa kháng nguyên hoà tan.
2.2.3. Đặc tính của IgY
Đặc tính sinh hóa
Điểm đẳng điện của IgY thấp hơn IgG (Polson et al., 1980) trong dãy
5,7-7,6 còn IgG nằm giữa 6,1–8,5. trong khi đó chuỗi Fc (phần kỵ nước nhất
của phân tử kháng thể) cũa IgY thì lớn hơn của IgG, phân tử IgY kỵ nước hơn
IgG.
Tính bền của IgY
Bền với pH: hoạt tính IgY giảm ở pH= 3,5 hoặc thấp hơn và hầu như
hoàn toàn mất ở pH= 3 (Shimizu et al., 1988). Hoạt tính IgY nhanh chóng
giảm ở pH thấp đòi hỏi những thay đổi thích ứng và sự tồn tại trên phần Fab
bao gồm vị trí gắn kháng nguyên. Ở điều kiện kiềm tính, hoạt tính của IgY
không thay đổi ngay cả khi pH tăng đến 11. Dù vậy nó vẫn bị giảm ở pH= 12
hay cao hơn (Shimizu et al., 1988).
Bền với sự phân giải protein: IgY có tính đề kháng với trypsine hay
chymotrysine tiêu hóa nhưng hơi nhạy cảm với pepsine tiêu hóa. Hatta (1993)
chỉ định rằng hầu hết hoạt tính IgY bị mất theo đường tiêu hóa với pepsine,
nhưng hoạt tính được duy trì mức 39% và 41% khi ủ với trysine và
chymotrypsine sau 8h.

Bền với nhiệt và áp suất: IgY được dùng ấm ở các mức nhiệt khác nhau
cho các giai đoạn khác nhau về thời gian. Hoạt tính gắn kết của IgY với kháng
nguyên giảm với sự tăng nhiệt và thời gian làm nóng. Theo Shimizu (1988) và
Hatta (1993) IgY bền với nhiệt độ 60-70
0
C. Hoạt tính IgY giảm do sự làm
nóng trong 15 phút ở 70
0
C hay cao hơn; IgY biến tính nhiều khi làm nóng ở
nhiệt độ trên 75
0
C (Chang et al., 1999). IgY có tính bền với áp suất được ghi
nhận qua sự không phát hiện ra sự bất hoạt của IgY bởi áp suất 4000kg/cm
2

(Shimizu et al., 1988).
Bền với lạnh và khí khô: lạnh và đông khô là quá trình nhiệt thấp
thường được xem như ít bị hủy hoại.

5
Hiện nay trên thế giới bên cạnh các nghiên cứu tạo kháng thể gà chống
các tác nhân nhiễm trùng và ứng dụng thành công trong điều trị bệnh thú y ở
các loài như lợn, bò, chó, gà đã có một số nơi nghiên cứu chế tạo kháng thể gà
kháng các tác nhân gây tiêu chảy ở người trong đó có rotavirus và E.coli tiêu
chảy.
2.3. Vai trò của kháng thể
Trong đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: liên kết với
kháng nguyên, kích hoạt bổ thể và huy động các tế bào miễn dịch.
2.3.1. Liên kết với kháng nguyên
Các kháng thể có khả năng nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một

kháng nguyên tương ứng nhờ các vùng biến thiên.
Một thí dụ để miêu tả lợi ích của kháng thể là trong phản ứng chống
độc tố vi khuẩn. Kháng thể liên kết và trung hòa các độc tố, ngăn ngừa sự
tương tác của chúng với các thụ thể tế bào. Như vậy, các tế bào có thể tránh
được các rối loạn do các độc tố gây ra.
Tương tự như vậy, nhiều virus và vi khuẩn chỉ gây bệnh khi bám vào
các tế bào. Vi khuẩn sử dụng các phân tử protein bám dính là protein adhesin,
còn virus sở hữu các protein bám dính trên lớp vỏ của chúng. Các kháng thể
kháng adhesin và kháng protein vỏ virus sẽ ngăn chặn các vi sinh vật này gắn
vào các tế bào đích.
2.3.2. Hoạt hóa tế bào miễn dịch
Sau khi tương tác với kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể
có thể cố định trên các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc). Những tương
tác này có tầm quan trọng đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch. Các kháng thể
gắn với một virus hoặc một vi khuẩn có thể liên kết với đại thực bào và khởi
động hiện tượng thực bào. Các tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer) có thể thực
hiện chức năng giải độc tế bào và ly giải các vi khuẩn bị gắn kết với các kháng
thể.

6
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
3.1.1. Thời gian
Từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014.
3.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh
Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT
3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Nguyên bào sợi vịt được tạo từ phôi vịt 9-11 ngày tuổi (trứng được mua
từ đàn vịt không tiêm vaccine viêm gan vịt và được xác định không chứa
kháng thể kháng virus viêm gan vịt qua phản ứng trung hòa huyết thanh).
Virus viêm gan vịt type 1 được phân lập tại Vĩnh Long (chủng virus
này được giám định là type 1, subtype 3 –DHAV-3 tại Viện Công nghệ sinh
học, Trường Đại học Cần Thơ).
Kháng thể IgY kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ
trứng gà 27 mg/ml. Kháng thể được ly trích và tinh sạch bằng phương pháp
thẩm tích qua màng bán thấm, tại Viện Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học
Cần Thơ.
3.2.2. Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ
Kéo, phểu lọc thủy tinh, vải gạc, đĩa petri đường kính 9-10 cm
Becher , ống đong các loại, ống ly tâm falcon loại 15 ml
Các tube nhỏ (eppendorf). Đầu lọc 0,22 µm; 0,45 µm (Milipore filter)
Ống nghiệm, cá từ. Pipette 1 ml, 2ml, 5 ml, pipetteman, micropipette,
pipette-aid
Đầu cone 100 µm, 1ml. Đĩa nuôi cấy microplate 96 giếng (Nunc A/S,
Denmark)
Buồng đếm Neubauer (Marienfeld, Germany)
Thiết bị
Máy ảnh kỹ thuật số Samsung, máy ấp trứng, máy hấp autoclave
Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench SANYO Electric Biomedical Co.,
Ltd)
Cân phân tích, tủ sấy (Memmert GmbH + Co.KG), tủ ấm CO
2

(SANYO Electric Biomedical Co., Ltd)

7

Đầu đọc ELISA (Multiskan, ThermoLabsystems, Japan)
Tủ lạnh -20
0
C, -80
0
C, -4
0
C, kính hiển vi soi ngược (Olympus, Tokyo,
Japan)
Máy ly tâm lạnh (Hermle Labortechnik GmbH, Germany)
Máy khuấy từ (Corning, USA), máy lắc (Vortex, VELP Scientifica s.r.l,
Italy)
3.2.3. Các hóa chất và môi trường
Nước cất hấp vô trùng, nước muối sinh lý
Huyết thanh bào thai bò (FBS-foetal bovine serum) đã bất hoạt ở 56
0
C,
30 phút (Gibco BRL., Grand Land, NY, USA)
Isopropanol (Merk), Trypsin – EDTA 0,05% 1X (Gibco, Invitrogen,
Canada)
Đệm DPBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd)
Thuốc nhuộm MTT (Invitrogen, USA)
Môi trường MEM (Gibco, Invitrogen, NY, USA)
Penicillin và streptomycin, kháng nấm amphotericin-B, glutamine,
NaHCO
3
7%
Môi trường tăng trưởng (MTTT): Môi trường EMEM +10% FBS +
Glutamine 3% + NaHCO
3

7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml
Streptomycin + Amphotericin-B 2,5 µg/ml.
Môi trường duy trì (MTDT): Môi trường EMEM + 5% FBS +
Glutamine 3% + NaHCO
3
7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml
Streptomycin + Amphotericin-B 2,5 µg/ml.
Môi trường pha loãng (MTPL): Môi trường EMEM + Glutamine 3% +
NaHCO
3
7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin +
Amphotericin-B 2,5 µg/ml.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nuôi cấy và tạo lớp đơn tế bào DEF từ phôi vịt 9-11 ngày tuổi.
Chuẩn độ virus và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của
virus viêm gan vịt type 1 (Tissue culture infective dose 50 % (TCID
50
)).
Xác định tính độc tế bào của kháng thể IgY gà biểu hiện trên môi trường
tế bào DEF.
Khảo sát hoạt tính bảo vệ nguyên bào sợi vịt của kháng thể IgY kháng
DHV-1 qua các thời điểm khác nhau.




8
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quá trình khảo sát được tiến hành theo sơ đồ

Sơ đồ 3.1 Quá trình khảo sát xác định hoạt tính kháng DHV-1 in vitro của
dịch kháng thể IgY

Xác định liều
an toàn đối với
tế bào DEF
của dịch IgY
thử nghiệm
Nuôi cấy và tạo nguồn DHV-1, xác
định chỉ số TCID
50
/0,1 ml
Nuôi c
ấ
y và t
ạ
o l
ớ
p đơn t
ế
bào DEF

Khảo sát hoạt tính bảo vệ tế bào DEF in
vitro của dịch kháng thể IgY qua các thời
điểm cấp khác nhau


9
3.4.1 Chuẩn bị lớp đơn tế bào DEF

Sơ đồ 3.2 Qui trình tạo lớp đơn tế bào DEF
Xử lý, tách mô từ phôi
vịt

Tách tế bào bằng phương pháp
trypsin hóa
Rửa bằng đệm DPBS
Trứng vịt có phôi 9-11 ngày tuổi
Khuấy từ cặn thêm 15 phút
Ly tâm huyễn dịch tế bào
Khuấy từ 30 phút
Xem và đánh giá trạng
thái tế bào dưới kính
hiển vi soi ngược
Ly tâm với đệm DPBS
Tế bào sơ cấp
Pha loãng tế bào
Ly tâm với môi trường tăng
trưởng
Lọc qua vải gạc
Đếm số lượng tế bào
Phân phối vào đĩa
microplate với nồng độ
thích h
ợ
p

Ủ trong tủ ấm
37
0
C, 5% CO
2

Tế bào DEF một

lớp
Theo dõi t
ế
bào


10
3.4.2. Chuẩn độ và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy
Mục tiêu: Tạo dịch DHV-1 có tính thích ứng và hoạt lực tốt trên môi
trường tế bào DEF, sau đó xác định chỉ số TCID
50
/0,1 ml của dịch virus để
dùng cho các thử nghiệm sau.
Nguyên tắc chuẩn độ virus: Dựa trên đặc tính gây bệnh tích tế bào của
virus. Việc chuẩn độ virus được xác định qua chỉ số TCID
50
/0,1 ml, là sự pha
loãng virus tới nồng độ thấp nhất tạo bệnh tích cho 50% giếng tế bào nuôi cấy.
Bố trí thí nghiệm: Qui trình chuẩn độ virus được tiến hành theo phương
pháp của Hussain & Rasool (2005) trên môi trường DEF. Pha loãng dịch virus
theo bậc 10 từ độ pha loãng 10
-1
đến 10
-11
trên đĩa 96 giếng, 8 giếng cho mỗi
độ pha loãng. Các giếng đối chứng chỉ chứa tế bào lớp đơn và môi trường duy
trì (MTDT). Chỉ số TCID
50
/0,1 ml được tính theo công thức của Reed &
Muench (1938).

Hình 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID
50
/ 0,1 ml










10
-
1

10

-
2

10
-
7

10
-
8

10
-
9

10
-
1
0

10
-
1
1

ĐCTB

10
-
5

10
-
4

10
-
3

1
0
-
6

-
6

11

Sơ đồ 3.3 Qui trình chuẩn độ virus gây bệnh viêm gan vịt type 1 trên môi
trường tế bào DEF
Với 2 nồng độ pha loãng cho tỷ lệ trên 50% và dưới 50% giếng có
CPE, ta tiến hành xác định chỉ số TCID
50
/0,1 ml theo phương pháp của Reed
& Muench (1938).
- Khoảng cách tỷ lệ (PD- proportional distance)



- Độ pha loãng cho CPE 50% = 10
[lg (độ pha loãng cho CPE < 50%) +PD.logf]

- Liều gây nhiễm cho 50% tế bào nuôi cấy
- logf = 1
TCID
50
/0,1 ml =

Đĩa với các giếng đã có lớp tế bào DEF
Hút cạn môi trường, rửa 1 lần với đệm

DPBS

Pha loãng dịch virus với tỷ
lệ 1:10 MTPL, phân phối
vào các tube nhỏ. Đặt các
tube này trên đá lạnh
Cho 100 µl mỗi nồng độ pha loãng virus vào các giếng, bắt
đầu từ độ pha loãng cao nhất. Đối chứng là MTPL

Phủ dịch virus lên bề mặt tế bào và ủ trong 1 giờ ở 37
0
C, 5%
C
O
2

Hút bỏ dịch virus, cho 100 µl MTDT vào tất cả các giếng
Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào DEF của dịch virus
CPE ổn định
50% -(Tỷ lệ giếng có CPE < 50%)
(Tỷ lệ giếng có CPE ≥ 50%) – (Tỷ lệ giếng có CPE <50%)

PD =

Độ pha loãng cho CPE 50%
1
1

12
3.4.3. Xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF

Mục tiêu: Xác định tác động của dịch IgY lên khả năng sống của tế bào
DEF và qua đó chọn nồng thích hợp sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Cơ chế nhuộm MTT: MTT là loại thuốc nhuộm được dùng trong xác
định độc tố tế bào của một tác nhân nghiên cứu hoặc đánh giá sự phát triển của
tế bào nuôi cấy (Mosmann. 1983). Khi cho vào môi trường tế bào, MTT có
màu vàng sẽ chuyển thành tinh thể formazan đỏ tía dưới tác dụng của enzyme
dehydrogenase của ty thể trong tế bào sống. Do đó, lượng tinh thể sinh ra sẽ
phụ thuộc mật độ tế bào sống có trong môi trường. Tinh thể muối này không
hòa tan được trong dung dịch có nước và được giữ lại trong tế bào. Những tinh
thể có thể hòa tan được trong isopropanol có tính acid hoặc Dimethyl
sulfoxide (DMSO) cho dung dịch đỏ tía mà sau đó được đánh giá bằng
phương pháp đo bước sóng. Giá trị OD thu được tỷ lệ thuận với lượng tinh thể
hình thành trong tế bào sống, qua đó đánh giá được mức tăng trưởng của tế
bào cũng như tác động gây chết tế bào của tác nhân nghiên cứu.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng với 10
nồng độ dịch IgY được pha loãng theo bậc 2, nồng độ ban dầu tương ứng 27/2
mg/ml. Mỗi nồng độ lặp lại 8 lần. Đối chứng tế bào là môi trường tế bào DEF
không cho dịch IgY chỉ cho MTDT. Tính độc của dịch IgY tỷ lệ nghịch với
khả năng sống của tế bào, được xác định qua phương pháp nhuộm MTT và đo
OD
620
kết hợp việc quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi soi ngược.
Chỉ tiêu theo dõi
- Hình thái thảm tế bào DEF khi quan sát dưới kính hiển vi soi ngược:
có hay không CPE và mức độ CPE nếu có.
- Giá trị OD
620
đo được ở mỗi giếng.
- Tỷ lệ tế bào sống trung bình.
Tiến hành: Việc xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF

được tiến hành theo phương pháp của Meager (2002) như sơ đồ sau