nghiên cứu, sàng lọc và cải tiến chủng vi khuẩn sinh fucoidanase và tối ưu môi trường sản xuất fucoidanase cao sản

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM




NGUYỄN TRỌNG CHUNG



NGHIÊN CỨU, SÀNG LỌC VÀ CẢI TIẾN CHỦNG VI KHUẨN
SINH FUCOIDANASE VÀ TỐI ƯU MÔI TRƯỜNG SẢN XUẤT
FUCOIDANASE CAO SẢN



CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01



Người hướng dẫn khoa học:
TS. VŨ VĂN HẠNH
TS. NGUYỄN XUÂN CẢNH




HÀ NỘI – 2015
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
- Luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi;
- Số liệu sử dụng trong luận văn được là trung thực;
- Thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc và có độ
chính xác cao nhất trong phạm vi hiểu biết của tôi.

Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2015
Học viên



Nguyễn Trọng Chung
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Văn Hạnh Trưởng phòng Các chức năng
sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS. Nguyễn Xuân
Cảnh Trưởng bộ môn vi sinh – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã định hướng nghiên
cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn và tạo điều kiện về vật tư, hóa chất và
thiết bị cho nghiên cứu để chúng tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các anh chị làm việc tại Phòng Các chất chức
năng sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã giúp đỡ tận tình và cho tôi được sống, học tập, làm việc trong môi trường hòa
đồng, thân thiện trong thời gian vừa qua.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức
chuyên ngành cũng như trong cuộc sống trong suốt thời gian học tập tại trường. Để hoàn
thành bài luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều
sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các cá nhân, tập thể trong và ngoài trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, tập thể lớp CH22CNSHB và tất cả bạn
bè đã luôn động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng tôi trong suốt thời
gian học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, tháng 7 năm 2015
Học viên thực hiện




Nguyễn Trọng Chung
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
Danh mục sơ đồ viii
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục đích của đề tài 2

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về rong biển 3
1.1.1. Giới thiệu chung của rong biển 3
1.1.2. Đặc điểm và sự phân bố của rong nâu trên thế giới 3
1.1.3. Đặc điểm và phân bố rong nâu Việt Nam 4
1.2. Tổng quan về enzyme 4
1.2.1. Khái niệm chung về enzyme 4
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme 5
1.2.3. Tính chất của enzyme 6
1.2.4. Một số nghiên cứu về fucoidanase trên đối tượng vi sinh vật 6
1.3. Đột biến và cải biến chủng 7
1.3.1. Giới thiệu về đột biến 7
1.3.2. Sự cải biến chủng trên thế giới 8
1.3.3. Sự cải biến chủng ở Việt Nam 8
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10
2.1. Vật liệu 10
2.2. Phương pháp nghiên cứu 10
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật 10
2.2.2. Phương pháp lên men vi sinh vật 10
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

2.2.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 11
2.2.4. Thử nghiệm họat tính enzyme cắt gắn mạch fucoidan 12
2.2.5.Cải biến chủng bằng phương pháp đột biến 13
2.2.6. Tối ưu môi trường sản xuất fucoidanase cao sản 14
2.2.7. Thu nhận và tinh sạch fucoidanase 16
2.2.8. Xác định tính chất lý hóa của fucoidanase 17
2.2.9. Phương pháp nhuộm Gram 18
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu 19

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn theo định hướng phân cắt mạch fucoidan 20
3.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn theo định hướng 21
3.3. Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase bằng kỹ thuật đột biến 23
3.3.1. Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase bằng NTG kết hợp UV 23
3.3.2. Cải biến chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase bởi NTG. 24
3.4. Tối ưu môi trường sinh tổng hợp fucoidanase cao sản 28
3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 28
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 29
3.4.3. Ảnh hưởng của pH môi trường 30
3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 31
3.5. Thu nhận và tinh sạch fucoidanase 35
3.6. Tính chất lý hóa của fucoidanase 38
3.6.1.Tính đặc hiệu cơ chất 38
3.6.2. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 40
3.6.3. Ảnh hưởng của ion kim loại 42
3.6.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 44
3.6.5. Ảnh hưởng của pH 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48
Kết luận 48
Kiến nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
PHỤ LỤC 55
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v

DANH MỤC VIẾT TẮT

NTG : N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine
UV : Tia cực tím

DNS : 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid
SDS : Sodium dodecyl sulfate
CMC : Carboxymethyl cellulose
EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid
ADN : Axit Deoxyribo Nucleic
ĐC : Đối chứng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vi

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

2.1 Các bước tiến hành thử nghiệm hoạt tính theo Miller 12

3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi sinh vật phân lập được 20

3.2a Hoạt tính fucoidanase ngoại bào từ các chủng vi sinh vật 22

3.2b Hoạt tính của fucoidanase nội bào từ các chủng vi sinh vật 22

3.3 Sàng lọc các dòng đột biến bởi NTG kết hợp UV 23

3.4 Hoạt tinh fucoidanase của các dòng đột biến bởi NTG 25

3.5 Tỷ lệ sống sót của chủng T13 sau khi xử lí đột bởi NTG, NTG kết hợp UV 26

3.6 Tính ổn định của các dòng đột biến qua các thế hệ 27

3.7 Ma trận thí nghiệm và các hàm đa biến 32

3.8 Kết quả định lượng protein 36

3.9 Hoạt tính fucoidanase của các phân đoạn 37


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

3.1 Hình thái các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp fucoidanase 21

3.2 Đường cong sống sót của chủng T13 sau khi đột biến bằng NTG và UV 24

3.3 Đường cong sống sót của chủng T13 sau khi đột biến bằng NTG 25

3.4 So sánh hoạt tính fucoidanase trước và sau đột biến 28

3.5 Ảnh hưởng của % cơ chất đến hoạt tính enzyme 28

3.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính enzyme 29

3.7 Ảnh hưởng cả pH môi trường đến hoạt tính fucoidanase 30

3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính enzyme 31

3.9 Tương tác giữa pH và nồng độ cơ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme 32

3.10 Tương tác giữa pH và thời gian tới hoạt tính enzyme 33

3.11 Tương tác giữa nhiệt độ và nồng độ cơ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme 33

3.12 Tương tác giữa thời gian và nồng độ cơ chất fucoidan tới fucoidanase 34

3.13 Hoạt tính fucoidanase trong môi trường cơ bản và tối ưu 35

3.14 Ảnh hưởng của các dung môi đến khả năng thu nhận enzyme 36

3.16 Tính đặc hiệu cơ chất của fucoidanase 39

3.17 Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme từ chủng tự nhiên và chủng đột biến 39

3.18 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 40

3.19 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính enzyme của hai chủng
tự nhiên và đột biến 41

3.20 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính fucoidanase 42

3.21 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme chủng đột biến và
chủng tự nhiên 44

3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme 45

3.23 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme có nguồn gốc từ chủng đột
biến và chủng tự nhiên 45

3.24 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme 46

3.25 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme có nguồn gốc từ chủng đột biến
và chủng tự nhiên 47


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

STT Tên sơ đồ Trang

2.1 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật 10

2.2 Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 11

2.3 Tối ưu nồng độ fucoidan 14

2.4 Tối ưu thời gian nuôi cấy 15

2.5 Tối ưu pH 15

2.6 Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy 16

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Nước ta có đường bờ biển dài hơn 3600 km, nằm trong khu vực khí hậu nhiệt
đới và cận nhiệt đới, phía Đông và phía Nam giáp biển với diện tích mặt nước biển
hơn 1000000 km
2
. Trong đó hệ thực vật biển, tảo biển chiếm một lượng sinh khối lớn
với khoảng 1000 loài, trong đó 639 loài đã xác định bao gồm: 151 loài rong lục, 269
loài rong đỏ, 143 loài rong nâu và 76 loài rong lam (Trần Hoài Thu,
2000)
.
Rong biển từ xưa đã được sử dụng làm thức ăn cho người và gia súc, một số
nước đã sử dụng rong biển vào mục đích chữa bệnh làm dược phẩm. Trong rong nâu có
rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như kháng khuẩn, chống khối u hay
tăng cường miễn dịch. Một trong những hợp chất có hoạt tính sinh học cao và quý giá
mà các nhà khoa học đã tìm thấy trong rong nâu đó là fucoidan (Trần Thị Luyến,
2003)
.
Fucoidan là một sulphat polysaccharide sinh học được chiết từ rong nâu, đặc
biệt được quan tâm nghiên cứu nhờ nhiều hoạt tính dược lý đặc biệt như chống đông
tụ, chống viêm nhiễm, điều tiết miễn dịch, ức chế sự phát triển ư bướu, kháng ung thư
và kháng virus kể cả virus HIV… và hơn nữa nguồn cung cấp chủ yếu là rong nâu tự
nhiên có trữ lượng lớn tại các vùng biển nước ta (Bilan 2007; Bùi Minh Lý 2006
)

Tuy nhiên mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của chúng vẫn chưa
được giải thích rõ ràng do cấu trúc phức tạp và không theo quy luật của fucoidan từ
các loài rong khác nhau mà nó được chiết ra. Trong mạch phân tử của chúng chứa chủ
yếu các gốc fucose được sulphat hóa ở các vị trí khác nhau và liên kết với nhau. Ngoài
ra trong phân tử còn có mặt một số đường đơn khác như: galactose, manose, xylose,
glucose và các mạch nhánh có chứa gốc fucosyl, galatosyl (Berteau O

2003)
Chính vì
vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố cấu trúc lên hoạt tính sinh học của
fucoidan là một thách thức không nhỏ đối với các nhà khoa học.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan như sử
dụng các tác nhân vật lý, hóa học tác động trực tiếp vào cấu trúc phân tử, nhưng dù ít
hay nhiều thì các phương pháp đó cũng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học quý giá của
fucoidan. Việc tìm ra enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan là bước ngoặt quan trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2

để giải quyết bài toán tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan.
Cho tới nay các nghiên cứu trong nước chưa có một công trình nào đề cập một
cách toàn diện polysaccharide từ rong nâu Việt Nam cũng như cải biến và nâng cao
hoạt tính enzyme phân lập từ các vi sinh vật biển (Bùi Minh Lý 2006; Phạm Đức
Thịnh 2007)
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu, sàng lọc và cải tiến chủng vi khuẩn sinh fucoidanase và tối ưu môi
trường sản xuất fucoidanase cao sản”
2. Mục đích của đề tài
Chọn lọc và cải biến chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp được fucoidanase
cao, tối ưu được môi trường lên men lỏng và xác định được một số tính chất của
enzyme này.
Nội dung thực hiện:
• Phân lập và sàng lọc vi khuẩn tổng hợp enzyme phân cắt mạch polysaccharide
rong nâu.
• Cải biến chủng sinh vật sinh enzyme bằng đột biến
• Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng sinh vật sinh enzyme cao nhất
• Tinh sạch và xác định một số tính chất của fucoidanase
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về rong biển
1.1.1. Giới thiệu chung của rong biển

Rong biển (marine algae) có vai trò quan trọng trong nguồn lợi sinh vật biển và
ngày càng được con người khai thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực
thực phẩm, công nghệ Mức sản xuất hàng năm trên trên thế giới xấp xỉ 4 triệu rong
tươi. Khoảng 80% của sản lượng này được sản xuất từ các nước châu Á thái Bình
Dương. Các nước sản xuất nhiều nhất hiện nay là Trung Quốc, Nhật Bản, Philippine…
(Daniel R et al., 2001; Deux J et al., 2002).
Rong biển là loài thực vật thủy sinh, chúng có thể đơn bào hay đa bào, sống
thành quần thể. Môi trường sống ở biển và các vùng nước lợ ven biển. Rong biển có
kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài
hang chục mét (Gonzalez, J. M., and Weiner, R. M, 2012)
Việt Nam có nguồn lợi rong biển rất đa dạng và phong phú. Theo các kết quả
nghiên cứu gần đây ở nước ta có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng biển miền
Bắc 310 loài (các nghiên cứu từ Quảng Bình trở ra), miền Nam 484 loài (Các nghiên
cứu từ Đà Nẵng trở vào), 156 loài tìm thấy ở cả hai miền (Lê Huyền Vy, 2010).
Rong biển cung cấp đầy đủ các khoáng chất đặc biết là các nguyên tố vi lượng,
các axit amin, các vitamin… (Holtkamp, A et al., 2009).
1.1.2. Đặc điểm và sự phân bố của rong nâu trên thế giới
Rong nâu là tên gọi chung của các loại rong thuộc ngành pheophyta, ngành này
gồm một lớp pheophycea, gồm 265 chi và khoảng 1500 – 2000 loài, phần lớn sống ở
biển, một số chi sống ở nước ngọt (Kloareg, B, 2010).
Rong nâu có cấu tạo nhiều tế bào dạng mạng giả, dạng phiến, dạng sợi hoặc
phân nhánh phức tạp hơn thành dạng cây có gốc, rễ, thân và lá. Rong sinh trưởng ở
đỉnh, ở thân và ở các lóng. Ngoài tự nhiên rong nâu sống bám vào các giá thể khác nhờ

bàn bám (Lang, S, 2004).
Rong nâu có chứa hàm lượng polysaccharide chiếm từ 40 – 80% khối lượng
khô, có giá trị và nhiều ứng dụng. Theo các nhà khoa học Nga, polysaccharide tồn tài
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

trong rong nâu được chia làm hai nhóm chính: nhóm tan trong acid alginic và nhóm
tan trong nước, fucoidan là một polysaccharide có hoạt tính sinh học quý giá và được
ứng dụng nhiều trong nhóm này (Lapshina, L. A et al., 2007)
Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada,
Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina,
Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha (Lee, J B et a., 2004b), .
Trong đó, bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ
Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt
(Phạm Đức Thịnh 2007).
1.1.3. Đặc điểm và phân bố rong nâu Việt Nam
Nước ta có khoảng 638 loài rong biển, gồm 229 loài Rhodophytai, 120 loài
Phseophyta, 150 loài Chorophyta, 76 loài Cyanobacteria, 14 loài Magnoliphyta. Hiện
nay có khoảng 60 loài tảo được sử dụng làm thực phẩm, y học dân gian và chế biến
các loại bánh kẹo (Lurtz, V., and Lang, S, 2005).
Ở Việt Nam đã phát hiện khoảng 50 loài rong nâu, gồm các loài
S.carpophyllum, S.crassifolium, S.duplicatum, S.glaucescens, S.mcclurei (Pomin, V. H
et al., 2005). Rong nâu tập trung ở vịnh Bắc bộ, biển miền Trung, miềm Nam và vịnh
Thái Lan. Sản lượng rong biển đạt hơn 15000 tấn khô/năm. Cuối thế kỷ XX, rong chủ
yếu được sử dụng làm phân bón trong nông nghiệp và xuất khẩu. Những năm gần đây,
ở nước ta mở ra hướng phát triển mới đó là chiết suất các hợp chất polysaccharide
dung trong nhiều ngành công nghiệp và dược phẩn (Bùi Minh Lý, 2006).
1.2. Tổng quan về enzyme
1.2.1. Khái niệm chung về enzyme
Định nghĩa

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, làm nhiệm vụ xúc tác đặc
hiệu cho các phản ứng đặc hiệu nhất định trong cơ thể sinh vật. Nếu thiếu enzyme thì
mọi quá trình chuyển hóa sẽ bị đình chỉ, sinh vật không thể tồn tại và phát triển bình
thường được (Phạm Thị Trân Châu,
2009
)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của
enzyme. Enzyme hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, khi tăng nhiệt độ quá
giới hạn( thường 60
0
C), phân tử protein trong enzyme bắt đầu biến tính, hoạt tính xúc
tác sẽ giảm nhanh, vận tốc phản ứng giảm theo.
Nhiệt độ mà tại đó V = Vmax gọi nhiệt độ tối ưu t
op
, Mỗi enzyme có một t
op
.
Trong phản ứng do enzyme xúc tác, chừng nào enzyme chưa bị biến tính thì vận tốc
phản ứng tăng lên gấp 2 khi nhiệt độ tăng 10
0
C.
Ở nhiệt độ thấp, hoạt tính enzyme giảm, ở 0
0
C hoạt tính enzyme không còn

đáng kể, khi tăng nhiệt độ lên thì hoạt tính enzyme tăng trở lại, vì vậy ứng dụng bảo
quản enzyme ở nhiệt độ lạnh( -20
0
C đến -30
0
C).
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme
Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường. Bất cứ sự thay đổi nhỏ nào của
pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất. Do đó pH tác dụng rất
lớn đến vận tốc phản ứng của enzyme.
Mỗi enzyme có một pH mà tại đó vận tốc phản ứng của enzyme đạt cực đại.
Người ta gọi đó là pH tối ưu của enzyme. Thông thường pH
op
của enzyme nằm ở vùng
acid yếu hay kiềm yếu hay trung tính. Đặc biệt có một số enzyme có pHop nằm ở vùng
rất acid như pepsin có pH
op
≈ 1.5 - 2.5 hoặc rất kiềm như tripsin ≈ 8 – 9.
Ảnh hưởng của sự oxy hóa và bức xạ
Một số enzyme trong cấu tạo có nhóm –SH, nhóm này rất quan trọng đối với
phản ứng của enzyme. Nó là nhóm định chức ở trung tâm hoạt động và giữ cho
enzyme có cấu hình thích hợp. Tuy nhiên –SH rất dễ bị oxy hóa bởi không khí tạo cầu
S-S làm cho cấu hình của enzyme không còn phù hợp nữa, enzyme mất hoạt tính
(Michel, G et al., 2003).
Enzyme còn bị ảnh hưởng bởi tia bức xạ, đặc biệt rất nhạy cảm với bức xạ có
độ dài sóng thấp (năng lượng cao). Tia UV ảnh hưởng đến hiệu ứng của DNA, ảnh
hưởng đến sự tổng hợp enzyme, dẫn đến hiệu ứng enzyme bị ảnh hưởng và vận tốc
phản ứng thay đổi.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6

1.2.3. Tính chất của enzyme
Tính chất lý hóa chung
- Enzyme có cấu tạo là protein do đó chúng có đầy đủ tính chất của protein: dễ
biến tính, dễ kết tủa, dễ mất hoạt tính sinh học…
- Enzyme không thẩm tích qua màng bán thấm.
- Enzyme không chịu được nhiệt độ cao, dễ biến tính bởi nhiệt độ cao và có thể
mất hoạt tính xúc tác.
- Tan trong nước, dung môi có cực khác, dung dịch muối loãng, glycerin.
- Khối lượng phân tử lớn.
1.2.4. Một số nghiên cứu về fucoidanase trên đối tượng vi sinh vật
Khi bị phân hủy rong biển sẽ trở thành thức ăn của các vi sinh vật mà hệ
enzyme của chúng có khả năng bẻ ngắn mạch polysaccharide về mono- và
oligosaccharide (Adhikari, U et al., 2006) Vì vậy mà những năm gần đây các nhà khoa
học trên thế giới bắt đầu nghiên cứu về vi sinh vật biển sinh enzyme phân cắt
fucoidan. Năm 2006 Bùi Minh Lý và cộng sự với đề tài “Nghiên cứu công nghệ và
thiết bị sản xuất Fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam” đã phân lập và tối ưu
được môi trường lên men chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fucoidanase tuy nhiên các kết
quả này vẫn chỉ ở mức quy mô phòng thí nghiệm, chưa được đưa ra thị trường ( Bùi
Minh Lý 2006).
Hiện nay có 2 loại enzyme tác động lên fucoidan là fucoidanase (EC3.2.1.44) và α-
L-fucoisidase (EC.3.2.1.51). Hoạt tính của α-L-fucoisidase được mô tả dễ dàng như là sự
giải phóng L-fucose khỏi đoạn cuối của một phân tử polysaccharide, thì việc xác định hoạt
tính của fucoidanase là không dễ dàng. Fucoidanase có thể bẻ gãy các liên kết glusosit bên
trong phân tử poylsaccharide làm giảm nhanh chóng trọng lượng phân tử (endo-
fucoidanase) hoặc ở phía rìa ngoài của phân tử để lấy đi một số phân tử oligosaccharide làm
cho trọng lượng phân tử giảm từ từ (exo-fucoidanase) (Rechter, S et al., 2006 Rondot, S
et al., 2001)
Các nhà khoa học Pháp và Nhật đã tìm ra một số loại fucoidanase từ một số loài

động vật thân mềm, các enzyme này có khả năng phân cắt fucoidan thành các đoạn
oligosaccharide (Sakurai, N et al., 2005). Trong vài thập niên trở lại đây có rất nhiều
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

nghiên cứu về fucoidanase phân lập từ vi sinh vật biển được công bố. Sakai T và cộng sự
(Sakai, T et al., 2003a; Sakai, T et al., 2003b) đã phân lập từ biển Nhật Bản vi khuẩn
Flavobateriacea có thể phân cắt nhiều loại fucoidan khác nhau được chiết từ các loài rong
Laminariales, Kiellmaniella crassifolia, Lessonia nigrescens và Undaria pinatifida.
Một trong những trở ngại trong việc làm sạch fucoidanase là chưa có phép thử
đơn giản nào để có thể nhận biết và định lượng loại enzyme này. Một số phương pháp
đã được sử dụng bao gồm, sự giảm độ nhớt, tăng đường khử (Sezer, a. D., and
Akbuga, J 2006), kết tủa với albumin, sắc ký rây phân tử. Do đó, cho đến nay mới chỉ
có 2 enzyme fucoidanase được làm sạch tới trạng thái đồng nhất.
1.3. Đột biến và cải biến chủng
1.3.1. Giới thiệu về đột biến
Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ phân tử
(ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một
hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền
cho các đời sau (Senni, K et al 2006).
Chúng có thể chỉ xảy ra đối với một tế bào đơn lẻ hoặc có thể được chuyền từ
một tế bào khác trong một sinh vật đa bào (tế bào soma đột biến), hoặc có thể được
truyền từ một thế hệ khác đột biến thông qua giao tử (mầm dòng đột biến). Đột biến có
thể được gây ra bởi các yếu tố tự nhiên từ môi trường, từ sự hoạt động hay không hoạt
động của enzyme sửa chữa, và từ những hóa chất (chất gây đột biến) hoặc các bức xạ
năng lượng cao (Mai Xuân Lương, 2009).
Tỷ lệ đột biến khác nhau giữa các loài sinh vật, giữa các gen, thời gian và địa
điểm. Nó có thể gây ra tác động đáng kể không chỉ đối với cá nhân mà còn cả sự tiến
hóa chung của các loài. Những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền
cho các thế hệ sau, góp phần thúc đẩy đa dạng sinh học (Phạm Thị Trân Châu, 2009).

Đối với các enzyme sử dụng trong công nghiệp phải được sản xuất với chi phí
thấp và có thể tái sử dụng và tái sản xuất. Để đạt được điều này, việc cải thiện thường
được thực hiện bằng kỹ thuật đột biến. Người ta có thể tạo đột biến bằng các chất gây
đột biến hóa học như N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), EMS… hoặc
bằng cách chiếu xạ vật lý như tia X, tia UV (Suppiramaniam et al., 2006)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

1.3.2. Sự cải biến chủng trên thế giới
Trước thập kỷ 70, công nghệ sinh học được hiểu là sự lên men công nghiệp vi
sinh vật để tạo thương phẩm. Trong những thập kỷ 60 và 70 công nghệ lên men đã
phát triển thành một ngành công nghiệp lớn. Giống vi sinh vật được xem là yếu tố
quyết định trong thành công của ngành công nghiệp lên men này. Phương pháp chọn
giống cổ điển được tiến hành trên các chủng phân lập từ tự nhiên và sau đó đột biến
bằng tia tử ngoại và bằng hoá chất.
Năm 2006, Urvantseva, A. M và cộng sự đã xử lý chủng nấm Fusarium
oxysporum bằng tia cực tím, chủng đột biến được xử lý với NTG đã làm tăng khả năng
tổng hợp Cellulose lên nhiều lần so với chủng tự nhiên (Urvantseva, A. M et al., 2006)
Năm 1998, Volpi N và cộng sự sử dụng xung điện và hóa chất NTG để cải biến
hai chủng nấm men Saccharomyces diastaticus (ATCC 28339) và Saccharomyces spp.
trong sản xuất cồn sinh học. Dòng đột biến chọn lọc NF30-9 lên men được ethanol
nồng độ cao hơn (Volpi, N., and Maccari, F, 1998)
Năm 2005, Chand và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm gây đột biến trên nấm sợi
bằng NTG kết hợp với ethidium bromide và UV hoặc NTG kết hợp với ethidium
bromide. Kết quả sang lọc đột biến được chủng có khả năng tổng hợp cellulose lên
nhiều lần so với chủng tự nhiên.(Chand, T, 2005)
1.3.3. Sự cải biến chủng ở Việt Nam
Năm 2009 , Hồ Tuyên và cộng sự đã sử dụng ba phương pháp gây đột biến gồm
chiếu tia cực tín (UV) vào bào tử, xử lý hóa chất gây đột biến NTG đối với tế bào trần
và các phân đoạn khuẩn ty nâng cao hoạt tính kháng sinh của Acremonium

chrysogenum. Biến chủng tối ưu thu được có hoạt tính kháng sinh tăng khoảng 75% so
với chủng ban đầu (Hồ Tuyên, 2009).
Năm 2010, tác giả Nguyễn Quỳnh Uyển và cộng sự đã sử dụng hóa chất gây
đột biến NTG để nâng cao hoạt độ phân giải protein của protease ngoại bào của vi
khuẩn Bacillus sp. Sau khi gây đột biến bằng NTG và sàng lọc, hai chủng vi khuẩn đột
biến có hoạt độ phân giải protein cao hơn 1,5 lần và 2 lần so với hoạt độ so của chủng
gốc đã thu được (Nguyễn Quỳnh Uyển, 2010).
Năm 2010, Vũ Văn Hạnh và các cộng sự đã xử lý chủng nấm sợi Aspergillus
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9

sp. bằng cách kết hợp tia Rontghen và hóa chất NTG để gây đột biến. Chủng nấm đột
biến chọn lọc có khả năng tổng hợp men phân hủy tinh bột sống, cellulose tăng lên rất
rõ rệt so với chủng tự nhiên (Vũ Văn Hạnh, 2009; Vũ Văn Hạnh, 2010) .
Năm 2012, Vũ Văn Hạnh và các cộng sự tiến hành thí nghiệm nâng cao độc lực
diệt rệp đào của chủng nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium bằng đột biến tia UV và
NTG nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Sàng lọc 42 dòng nấm đột biến, trong đó
hai thể đột biến UV (UV10.4 và UV60.3) và ba thể đột biến NTG (NTG30.2,
NTG50.2 và NTG60.2) diệt 100% rệp muội sau 4 đến 5 ngày phun. Độc lực của các
thể đột biến tăng từ 10 đến 20% so với kiểu dại.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

Chúng tôi tập trung nghiên cứu các chủng vi khuẩn có hoạt tính fucoidanase từ
nguồn rong nâu được lấy từ biển Nha Trang và ở Thanh Hóa. Ngoài ra chúng tôi còn
mở rộng phạm vi nghiên cứu tới các loài động vật biến như: Ngao, Sò Lông, Sò Huyết.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật
Từ các nguồn nước biển và rong biển đã thu thập ở trên. Chúng tôi tiến hành
phân lập các chủng vi sinh vật trong môi trường argar – nước biển có bổ sung thêm
nguồn cacbon và fucoidan thô được chiết suất từ rong biển.

S
ơ đồ 2.1:
Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật

2.2.2. Phương pháp lên men vi sinh vật
Chủng vi sinh vật được phân lập được tiến hành nuôi cấy lắc (200 vòng/ phút, ở
nhiệt độ 28-30
0
C, trong 24 giờ) trong môi trường muối khoáng có bổ sung fucoidan
sạch như là chất cảm ứng vi sinh vật sinh enzyme phân cắt fucoidan.
Sau 24h nuôi cấy lắc trong ống penicilin 2ml, tiến hành nuôi cấy chủng sang
bình tam giác 250 chứa 30ml môi trường trong 48 giờ để kiểm tra sự phát triển của
chủng trong điều kiện môi trường lớn hơn.
Nguồn phân lập vi sinh vật
Sò lông, Sò huy
ế
t

Rong bi
ển

Nghi
ền trong n
ư

ớ
c mu
ối sinh lý 0.9%

Ch
ọn khuẩn lạc thuần
trong
môi trư
ờng

phân l
ập

Ly tâm thu t
ế b
ào và gi
ữ giống trong glycerol 30%

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11

2.2.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật
Vi sinh vật được tuyển chọn sau khi lên men được đem ly tâm 10000
vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C. Phần dịch nổi được thu lại để thử hoạt tính enzyme
ngoại bào, phần sinh khối tế bào được hòa tan trong đệm acetate 0.01M, pH 5 rồi ly
tâm 10 phút (10000/phút) ở 4
0
C nhằm rữa sạch phần dịch ngoại bào còn sót lại. Sau

ly tâm phần sinh khối tế bào được hòa tan trong đệm acetate 0.01M, pH 5 với tỷ lệ
1:1 và được nghiền bằng máy siêu âm trong 5 phút ở 0
0
C. Tế bào sau khi bị phá vở
bằng song siêu âm được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C. Dịch trong ở
trên chứa enzyme được giữ lại và loại bỏ tủa chứa cặn tế bào rồi thử nghiệm hoạt
tính enzyme (dịch nội bào).


















Sơ đồ 2.2.
Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật

Môi trường lỏng
Ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút

Dịch nổi
Sinh khối tế bào
Thử hoạt tính
enzyme ngoại bào
Phá vở TB bằng sóng
siêu âm
Phần dịch nổi
Thử hoạt tính
enzyme nội bào
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12

2.2.4. Thử nghiệm họat tính enzyme cắt gắn mạch fucoidan
Dịch chiết enzyme thô nhận được sau khi lên men các chủng vi sinh vật đã tách
dòng ở 24 giờ, ly tâm ở 10.000vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn chứa tế bào,
dịch nổi được sử dụng như nguồn enzyme thô ngoại bào và được thử hoạt tính enzyme
theo phương pháp của Miller (Miller, G. L., 1959
)

Chuẩn bị hai ống: ống mẫu thử và ống đối chứng, mỗi ống có chứa 25µl dịch có
chứa fucoidanase. Ống mẫu thử có bổ sung thêm 25µl cơ chất fucoidan pha trong dung
dịch đệm, ống đối chứng thì bổ sung thêm đệm acetate 0.001M nhưng không có cơ
chất fucoidan. Sau đó hai ống được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 50
0
C, bước tiếp theo bổ
sung thêm vào hai ống 50µl DNS, đem đun sôi ở nhiệt độ 100

0
C trong 5 phút. Dưới
tác dụng của fucoidanase, fucoidan bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường
khử. Vì vậy sự gia tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác
dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Cuối cùng thêm 0.9ml nước cất vào hai ống và đo
lượng đường khử ở bước song 540nm.
Bảng 2.1. Các bước tiến hành thử nghiệm hoạt tính theo Miller
TT


Ống
mẫu(µl)

Ống đối
chứng(µl)

1.

Dung dịch chứa fucoidanase

25

25

2.

Cơ chất Fucoidan pha trong dung Citrate

25

0

3.

Dung dịch đệm Citrate

0

25

Đem ủ 50
0
C trong 30 phút

4.

DNS (µl)

50

50

5.

100
0
C (5 phút)

+

+

6.

Để nguội đến nhiệt độ phòng

+

+

7

Nước cất (ml)

0,9

0,9

8

Đo OD ở bước sóng 540nm


Một đơn vị hoạt tính fucoidanase (U) được định nghĩa là số µM sản phẩm
đường khử tạo thành trong 1 đơn vị thời gian.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

2.2.5.Cải biến chủng bằng phương pháp đột biến
2.2.5.1. Phương pháp đột biến bằng NTG kết hợp với UV

Cơ chế:
Tia UV có thể tạo ra đột biến giữa hai vòng pyrimidine để tạo nên hai liên kết
dimer giữa các nhóm cytosine gần nhau. Việc dimer cytosine có thể tạo ra adenine
thay vì guanine được bổ sung vào sợi mới. Quá trình sao chép ADN, thế dại chuyển
thành thể đột biến. Mặc dù các đột biến điểm dimer cytosine trên ADN có thể được
sữa chữa bởi hệ thống của tế bào nhưng không thể hết. Kết quả là cặp GC chuyển
thành AT sau khi chiếu UV (Mai Xuân Lương, 2009).
Phương pháp tiến hành
Chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lên men lỏng. Sau khoảng 48
giờ, hút 2ml dịch đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào và loại dịch
nổi, sau đó bổ sung thêm 0.5ml NTG (100 microgam/ml), đổ ra đĩa petri. Bật tia UV
(50W) khoảng cách từ nguồn tới đĩa là 20-30cm. Sau khoảng thời gian khác nhau từ
30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút ta lần lượt hút ra 100µl, sau đó ly tâm 10000v/p để
thu tế bào và loại hóa chất. Rửa tế bào 2 lần bằng nước cất, bổ sung thêm 200µl nước
muối sinh lý và cấy chải trên 3 đĩa petri. Sau 24 giờ nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên từ mỗi
đĩa 5 khuẩn lạc và tiến hành thử hoạt tính enzyme.
2.2.5.2. Đột biến bằng NTG
Phương pháp tiến hành
Chủng vi khuẩn T13 được nuôi cấy trong môi trường lên men lỏng trong bình
nón. Sau khoảng 48 giờ, hút 2ml dịch đem ly tâm 10 phút (10000 vòng/phút) thu tế
bào và loại dịch nổi, sau đó bổ sung thêm 0.5 ml NTG. Sau khoảng thời gian khác
nhau từ 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút. ta lần lượt hút ra 100 µl. Sau đó ly tâm
10000 vòng/ phút trong 10 phút để thu tế bào và loại hóa chất. Sau đó rửa tế bào 2
lần bằng nước cất, bổ sung thêm 200 µl nước muối sinh lý và cấy chải trên 3 đĩa
petri. Sau 24 giờ nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc và tiến hành thử
hoạt tính enzyme


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14

2.2.6. Tối ưu môi trường sản xuất fucoidanase cao sản
2.2.6.1. Tối ưu nồng độ fucoidan
Tiến hành tối ưu nồng độ fucoidan trong môi trường lên men với thành phần
môi trường: 5g pepton : 2g Cao nấm men, 0.05g MgSO
4
.7H
2
O, 0.2g K
2
HSO
4
, 500ml
nước biển, 500ml nước cất. Cố định ở pH = 7, thời gian nuôi cấy là 24 giờ và nhiệt độ
28
0
C, với nồng độ fucoidan từ 0 – 0,04%. Nuôi lắc chủng vi sinh vật với tốc độ lắc là
200 vòng/phút và xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp của Miller.

Sơ đồ 2.3: Tối ưu nồng độ fucoidan
2.2.6.2. Tối ưu thời gian nuôi cấy
Nuôi cấy lắc chủng vi sinh vật trong môi trường: 5g pepton, 2g Cao nấm men,
0.05g MgSO
4
.7H
2
O, 0.2g K
2
HSO
4
, pH = 7, 500ml nước biển, 500ml nước cất với tốc
độ lắc là 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28
0
C với các khoảng thời gian nuôi cấy thay đổi từ
12 – 72 giờ để đánh giá tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Sau các
khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau, tiến hành kiển tra hoạt tính fucoidanase. Tìm
khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp



0%

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng
OD

Xác định nồng độ fucoidan thích hợp

Nuôi cấy chủng vi khuẩn đã được chọn trong các nồng độ
fucoidan

0.02%

0.03%

0.04%

0.01%

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 15













Sơ đồ 2.4: Tối ưu thời gian nuôi cấy

2.2.6.3. Tối ưu pH
Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường: 5g pepton, 2g Cao nấm men,
0.05g MgSO
4

.7H
2
O, 0.2g K
2
HSO
4
, 500ml nước biển, 500ml nước cất, với môi trường
pH thay đổi từ 5 – 9 với tốc độ vòng lắc 200 vòng/phút ở 28
0
C trong 24 giờ. Kiểm tra
hoạt tính fucoidanase bằng phương pháp của Miller. Tìm thời gian nuôi cấy thích hợp










Sơ đồ 2.5. Tối ưu pH

12

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng
OD

Xác định khoảng thời gian thích hợp

Nuôi cấy chủng vi khuẩn đã được chọn trong các thời gian khác
nhau (giờ)
36

48

72

24

5

Xác định hoạt tính fucoidanase
Xác định khoảng pH thích hợp

Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong các môi trường có pH khác nhau

7

8
9

6

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 16

2.2.6.4. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy
Nuôi cấy lắc chủng vi sinh vật trong môi trường: 5g pepton, 2g Cao nấm men,
0.05g MgSO

4
.7H
2
O, 0.2g K
2
HSO
4
, pH = 7, 500ml nước biển, 500ml nước cất ở các
khoảng nhiệt độ nuôi cấy khác nhau từ 27 – 31
0
C với tốc độ vòng lắc 200 vòng/phút
trong 24 giờ để đánh giá tốc độ sinh trưởng và hoạt tính fucoidanase của vi sinh vật.
Sau các khoảng nhiệt độ nuôi cấy khác nhau, lấy dịch lên men kiển tra hoạt tính
fucoidanase. Tìm khoảng nhiệt độ nuôi cấy thích hợp.














Sơ đồ 2.6.
Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy

Để đánh giá mức độ tương tác của các yếu tố trên lên hoạt tính của fucoidanase,
chúng tôi ngoài việc sử dựng phường pháp tối ưu truyền thống còn kết hợp sử dụng
phương pháp tối ưu bề mặt, dựa vào phần mền thiết kế thí nghiệm Design Expert -9
2.2.7. Thu nhận và tinh sạch fucoidanase
Thu dịch enzyme thô: Sau khoảng thời gian nuôi cấy, ly tâm 12000 vòng/phút
trong 20 phút để thu dịch nổi và loại bỏ tế bào, kiểm tra lại hoạt tính và tiến hành bước
tủa bằng acetone với tỷ lệ 4:1.

27

Xác định hoạt tính enzyme và khả năng sinh trưởng
OD

Xác định khoảng nhiệt độ thích hợp

Nuôi cấy chủng vi khuẩn đã được chọn trong các khoảng nhiệt
độ khác nhau (
0
C )

29

30

31

28