khảo sát tồn lưu kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) và cá rô phi đỏ (oreochromis sp)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN





CAO THỊ KIỀU TIÊN


KHẢO SÁT TỒN LƢU KHÁNG SINH
SULFAMETHOXAZOLE VÀ TRIMETHOPRIM
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ
RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp)



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN



CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
Th.S TRẦN MINH PHÖ



2013

i

XÁC NHẬN
Luận văn tốt nghiệp với tên đề tài “Khảo sát tồn lƣu kháng sinh
Sulfamethoxazole và Trimethoprim trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus và cá rô phi đỏ (Oreochromis sp)” do sinh viên Cao Thị Kiều
Tiên thực hiện và báo cáo ngày 5 tháng 12 năm 2013 đã đƣợc hội đồng chấm
luận văn thông qua. Luận văn đã đƣợc chỉnh sửa theo sự hƣớng dẫn của Hội
đồng và của giáo viên hƣớng dẫn đề tài này.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Xác nhận của Hội đồng Sinh viên thực hiện



Cao Thị Kiều Tiên

ii

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này ngoài nỗ lực riêng
bản thân tôi còn nhận đƣợc không ít sự giúp đỡ và động viên từ phía rất nhiều
ngƣời. Nay tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Thầy Trần Minh Phú đã chỉ dẫn tận tình và truyền đạt những kiến thức
quý báo cho tôi trong suốt thời gian qua.
Quý thầy cô Bộ môn Dinh Dƣỡng và Chế Biến, khoa Thủy Sản, trƣờng
Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức chuyên môn trong suốt quá trình học
tập. Tạo các điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn.
Chị Huỳnh Thị Ngọc Liên, phó phòng kiểm nghiệm Trung tâm kiểm
nghiệm chất lƣợng nông lâm thủy sản Vùng 6 đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi
có cơ hội tìm hiểu học hỏi tại trung tâm.
Anh Cô Hồng Sơn nhân viên phòng kiểm nghiệm đã hƣớng dẫn tận tình
cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại trung tâm.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã quan tâm giúp đỡ và
động viên tôi trong suốt khoảng thời gian học tập vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Sinh viên thực hiện


Cao Thị Kiều Tiên

iii

TÓM TẮT
Đề tài: “Khảo sát tồn lƣu kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá rô phi đỏ
(Oreochromis sp)” đƣợc thực hiện nhằm tìm ra thời gian đào thải và mức tồn
lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole (SMX) và trimethoprim (TMP) trên đối
tƣợng cá tra và cá rô phi đỏ.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trên ba bể cá tra (500L)
và 3 bể cá rô phi đỏ (1000L). Mật độ cá tra là 100 con/m
3
, cá rô phi đỏ là 200
con/m
3
. Cá tra và cá rô phi đỏ đƣợc cho ăn thức ăn có trộn sản phẩm Trimesul
(20% sulfamethoxazole và 6% trimethoprim, Vemedim, Việt Nam) với liều
lƣợng 5g/kg thức ăn, cho ăn 5 ngày liên tục. Thu mẫu đƣợc tiến hành trƣớc khi
cho ăn thuốc, 1 ngày và 5 ngày sau khi cho ăn thuốc, 3, 7, và 15 ngày sau khi
ngừng cho ăn thuốc. Mẫu cá tra đƣợc thu mẫu cơ và da riêng, mẫu cá rô phi đỏ
đƣợc thu mẫu cơ và da chung. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng
sulfamethoxazole trong mẫu thức ăn là 674±10,1 mg/kg đạt 67,4% so với
nồng độ lý thuyết. Hàm lƣợng trimethoprim trong mẫu thức là 113±11,0
mg/kg đạt 37,8% so với nồng độ lý thuyết. Kết quả phân tích mẫu cá tra sau 5
ngày cho ăn kháng sinh, tồn lƣu của sulfamethoxazole và trimethoprim trong
cơ thịt cá và da cá tra đều tăng dần và đạt mức cao nhất trên da cá tra có hàm

lƣợng SMX là 726±60,4 µg/kg; TMP là 203±93 µg/kg, trên cơ cá tra có tồn
lƣu SMX là 577±180 µg/kg; TMP là 92,5±83,7 µg/kg, và trên cơ cá rô phi có
mức tồn lƣu SMX là 604±255 µg/kg và TMP là 137±52,5 µg/kg ở ngày thứ 5.
Kết quả khảo sát dƣ lƣợng SMX, TMP trên cá tra cho thấy tồn lƣu trên
da lâu hơn trên cơ. Tồn lƣu SMX trên da sau 7 ngày ngừng cho ăn thuốc là
144±44,5 µg/kg, tồn lƣu TMP là 30,1 ±15,7 µg/kg. Kết quả phân tích trên cơ
thịt cá tra sau 7 ngày ngừng cho ăn thuốc của SMX là 40,5±15,9 µg/kg, của
TMP là 14±5,19 µg/kg. Sau 15 ngày ngừng cho ăn thuốc tồn lƣu cả hai kháng
sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên da cá tra đều thấp hơn giới hạn
cho phép theo tiêu chuẩn của châu Âu và FDA của Mỹ (100 µg/kg đối với
sulfamethoxazole và 50 µg/kg đối với trimethoprim). Tồn lƣu trên cơ và da cá
rô phi có thời gian đào thải nhanh hơn đối với cá tra. Sau 3 ngày ngừng cho ăn
thuốc tồn lƣu của SMX và TMP thấp hơn giới hạn cho phép (SMX là
38,5±11,4µg/kg, TMP là 28,2±13,9µg/kg so với quy định của Châu Âu và
FDA, Mỹ (SMX là 100 µg/kg, TMP là 50 µg/kg).


iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
SMX Sulfamethoxazole
TMP Trimethoprim
SDZ Sulfadiazin
SAs Kháng sinh nhóm Sulfamid
OMP Ormethoprim
BNNPTNT Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn
HPLC High Performance Liquid Chromatography
UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography
LC – MS/ MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry
ppm Parts per million

ppb Parts per billion
LOD Limits of detection
LOQ Limits of quantification
µg Microgram
Kg Kilogram
µL Microliter
mL Mililiter
ACN Acetonitril
MeOH Methanol
PABA Para Amino Benzoic Acid
PSA Primary Secondary Amine








v

MỤC LỤC
Trang
XÁC NHẬN i
LỜI CẢM ƠN ii
TÓM TẮT iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH ix

CHƢƠNG 1 1
GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1
1.3 Nội dung nghiên cứu 1
1.4 Thời gian thực hiện 1
CHƢƠNG II 2
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Giới thiệu chung về kháng sinh 2
2.1.1 Định nghĩa 2
2.1.2 Nguyên nhân tồn lƣu kháng sinh trong thực phẩm 2
2.1.3 Tác hại của kháng sinh 2
2.2 Sơ lƣợc về Sulfamid (SAs) 2
2.2.1 Sơ lƣợc về nhóm Sulfamid (SAs) 2
2.2.2 Sulfamethoxazole (SMX) 3
2.3 Sơ lƣợc về Trimethoprim (TMP) 4
2.3.1 Công thức cấu tạo: C
14
H
18
N
4
O
3
4
2.3.2 Tính chất 5
2.3.3 Dƣợc lý và cơ chế tác dụng 5
2.4 Thuốc thú y thủy sản Trimesul của Vemedim 5
2.5 Tổng quan về cá tra 6
2.5.1 Phân loại 6

2.5.2 Phân bố 6
2.5.3 Hình thái sinh lý 7
2.5.4 Đặc điểm dinh dƣỡng 7
2.5.5 Đặc điểm sinh trƣởng 7
2.5.7 Thành phần dinh dƣỡng cá tra 8
2.6 Tổng quan về cá rô phi đỏ 8

vi

2.6.1 Phân loại 8
2.6.2 Đặc điểm dinh dƣỡng 9
2.6.4 Đặc điểm dinh dƣỡng 9
2.7 Các phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng Sulfamid và Trimethoprim 9
2.7.1 Phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng sulfamid theo TCN196:2004:
Sulfamid trong sản phẩm thuỷ sản – Phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc kí
lỏng hiệu năng cao HPLC. 9
2.7.2 Phƣơng pháp xác định đồng thời sulfadiazin và trimethoprim trên cá
vền biển bằng HPLC (Papapanagiotou et al., 2013). 10
2.7.3 Xác định một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc
gia cầm bàng phƣơng pháp sắc ký lỏng LC-MS/MS (Vũ Thị Trang, 2012).
11
CHƢƠNG 3 13
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 13
3.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm 13
3.1.2 Nguyên liệu 13
3.1.3 Thời gian 13
3.2 Vật liệu và phƣơng pháp 13
3.2.1 Vật liệu 13
3.2.2 Hóa chất 13

3.2.3 Phƣơng pháp phân tích 13
3.3 Thí nghiệm: Xác định thời gian tồn lƣu kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trên nguyên liệu cá tra và cá rô phi đỏ 16
3.3.1 Xác định thời gian tồn lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trong mẫu thức ăn thí nghiệm. 16
3.3.2 Xác định thời gian tồn lƣu kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trong nuôi cá tra 16
3.3 Xử lí số liệu 17
CHƢƠNG 4 18
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
4.1 Thí nghiệm xác định tồn lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trên cá tra 18
4.1.1 Yếu tố môi trƣờng 18
4.1.1.1 Nhiệt độ 18
4.1.1.2 pH 18
4.1.1.3 Oxy hòa tan 19
4.1.2 Tồn lƣu sulfamethoxazole và trimethoprim trong mẫu thức ăn. 19
4.1.3 Tồn lƣu sulfamethoxazole và trimethoprim trong da cá tra. 19

vii

21
4.1.4 Tồn lƣu sulfamethoxazole và trimethoprim trên cơ cá tra 21
4.2 Thí nghiệm xác định tồn lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trên rô phi đỏ 23
4.2.1 Yếu tố môi trƣờng 23
4.2.1.1 Nhiệt độ 23
4.2.1.2 pH 24
4.2.1.3 Oxy hòa tan 24
4.2.2 Tồn lƣu trên cá rô phi 25

CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 28
5.1 Kết luận 28
5.2 Đề xuất 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO 29
PHỤ LỤC 1 31
PHỤ LỤC 2 36
PHỤ LỤC 3 43
PHỤ LỤC 4 45
PHỤ LỤC 5 51
PHỤ LỤC 5 52
PHỤ LỤC 6 53













viii

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng cá tra trên 100g thành phẩm 8
Bảng 2.2 Chƣơng trình pha động 10

Bảng 2.2 Mức độ tồn lƣu của SDZ và TMP trong mẫu cá vền biển sau 7 ngày
ngừng cho ăn thức ăn chứa kháng sinh (ng/g) 11
Bảng 2.2 Điều kiện phân mảnh 11
Bảng 4.1: Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm trên cá tra 18
Bảng 4.2 pH trung bình trong quá trình thí nghiệm trên cá tra 18
Bảng 4.3 Lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc trong quá trình thí nghiệm trên cá tra
19
Bảng 4.4a Tồn lƣu SMX và TMP trên da cá tra trong 5 ngày cho ăn kháng
sinh 19
Bảng 4.4b Tồn lƣu SMX và TMP trên da cá tra sau 15 ngày ngừng cho ăn
kháng sinh 20
Bảng 4.5 Tồn lƣu SMX và TMP trên cơ cá tra trong 5 ngày liên tiếp cho ăn
thức ăn chứa kháng sinh 21
Bảng 4.6 Tồn lƣu SMX và TMP trên cơ cá tra sau 15 ngày ngừng cho ăn thuốc
22
Bảng 4.7 Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 23
Bảng 4.8 Giá trị pH trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 24
Bảng 4.9 Hàm lƣợng oxy hòa tan trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 24
Bảng 4.10 Tồn lƣu SMX và TMP trên cá rô phi trong thời gian cho ăn thức ăn
chứa kháng sinh 25
Bảng 4.11 Tồn lƣu SMX và TMP trên cá rô phi sau 15 ngày ngừng cho ăn
chứa kháng sinh 25

ix

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Công thức cấu tạo SMX 3
Hình 2.2 Công thức cấu tạo TMP 5
Hình 2.3 Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 6
Hình 2.4 Cá rô phi đỏ Oreochromis sp 8
Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thời gian thu mẫu 17
Hình 4.1 Đồ thị thể hiện dƣ lƣợng kháng sinh SMX và TMP trên da cá tra theo
thời gian. 21
Hình 4.2 Đồ thị thể hiện dƣ lƣợng kháng sinh SMX và TMP trên cơ cá tra theo
thời gian 22
Hình 4.3 Đồ thị thể hiện dƣ lƣợng kháng sinh SMX và TMP trên cơ cá rô phi
đỏ theo thời gian 26










Trang 1

CHƢƠNG 1

GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Năm 2012, tổng sản lƣợng thủy sản của cả nƣớc đạt 5.876 nghìn tấn,
tăng 8,8% so với kế hoạch (Bộ Nông Nghiệp, 2013). Sản lƣợng nuôi trồng
thủy sản đạt gần 1.759 nghìn tấn, tăng 3,1 % so với cùng kỳ năm trƣớc. Sản
lƣợng cá tra năm 2012 đạt 1,2 triệu tấn và kim ngạch xuất khẩu đạt 1,8 tỷ đô
la Mỹ (VASEP, 2013). Sự tồn lƣu kháng sinh trên sản phẩm thủy sản, đặc biệt
là cá tra đang ngày càng đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt.
Trong nuôi cá tra, một số loại kháng sinh đƣợc sử dụng nuôi phổ biến
nhƣ: Florfenicol, doxycycline, sulphonamide kết hợp với trimethoprim, (Phú
et al., 2012). Sulfamide là một nhóm kháng sinh có phổ tác dụng mạnh đối với
các vi khuẩn gây bệnh gram âm và dƣơng. Khi kết hợp với trimethoprim thì
khả năng kháng khuẩn này tăng cao và hạn chế độc tính của sulfamide đơn
thuần. Việc sử dụng hổn hợp kháng sinh này sẽ dẫn đến tồn lƣu trên cá tra.
Tuy nhiên chƣa có nghiên cứu về thời gian đào thải của hai loại kháng sinh
này trên cá tra và cá rô phi đỏ nuôi. Chính vì vậy việc thực hiện đề tài “Khảo
sát tồn lƣu kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên cá tra và cá rô
phi đỏ” là cần thiết.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Xác định thời gian tồn lƣu và dƣ lƣợng của kháng sinh
sulfamethoxazole và trimethoprim trong cá tra và cá rô phi đỏ.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Xác định thời gian tồn lƣu của kháng sinh sulfamethoxazole và
trimethoprim trong mẫu thức ăn, trong mẫu cơ cá tra, da cá tra và cơ cá rô phi
đỏ
1.4 Thời gian thực hiện
Từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013

Trang 2

CHƢƠNG II
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về kháng sinh
2.1.1 Định nghĩa
Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, đƣợc bán tổng hợp
hoặc tổng hợp hoá học.
2.1.2 Nguyên nhân tồn lƣu kháng sinh trong thực phẩm
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến việc tồn lƣu kháng sinh trong
thực phẩm, nhƣng chủ yếu là do các nguyên nhân sau:
 Có thể nhiễm vào thức ăn do thức ăn tiếp xúc môi trƣờng có
chứa kháng sinh.
 Do sử dụng thƣờng xuyên kháng sinh: mục đích kích thích tăng
trọng, phòng bệnh mùa dịch bệnh, chữa bệnh.
 Nhằm kéo dài thời gian bảo quản, tránh hƣ hỏng cho thực phẩm.
2.1.3 Tác hại của kháng sinh
Bất cứ kháng sinh nào dùng để chữa bệnh cho ngƣời và động vật, nếu
còn tồn dƣ một lƣợng dù nhỏ nhất cũng có thể gây ra sự kháng thuốc
của E. Coli (Escherichia coli). Khi E. Coli đã kháng thuốc thì có thể truyền
plasmid kháng thuốc của nó cho các loại vi khuẩn gây bệnh khác sống trong
đƣờng ruột. Một số tác hại chính của kháng sinh:
 Phản ứng mẫn cảm đối với ngƣời nhạy cảm với kháng sinh.
 Gây dị ứng sau khi tiêu thụ thực phẩm tồn lƣu kháng sinh.
 Tạo ra thể vi sinh vật kháng thuốc.
 Gây khó khăn cho công tác điều trị nhiễm khuẩn.
2.2 Sơ lƣợc về Sulfamid (SAs)
2.2.1 Sơ lƣợc về nhóm Sulfamid (SAs)
Ðây là nhóm kháng khuẩn có từ thập niên 1940. Bắt nguồn từ phân tử
Protonsil – một loại thuốc nhuộm azo, các sulfamid đƣợc tổng hợp là những

chuyển hóa chất của sulfanilamid do thay thế nhóm –NH
2
hoặc –SO
2
NH
2
. Là
dạng bột trắng rất ít tan trong nƣớc, tan nhanh hơn trong huyết thanh (Võ Văn
Ninh, 2007).
Nhóm kháng sinh Sulfamid gồm các loại chính sau: sulfadimidin,
sulfadimethoxin, sulfamerazin, sulfadiazine, sulfamethoxypyrimidin,
sulfapyridin. Giới hạn tồn lƣu cho phép trong thủy sản của SAs (các loại) là
100µg/kg theo quy định của Cộng đồng Châu Âu.

Trang 3

Sulfamid là kháng sinh kìm khuẩn, chúng ức chế dihydrofolat
synthetase – một enzyme tham gia tổng hợp acid folid. Sulfamid có cấu tạo
khá giống PABA (Para Amino Benzoic Acid), là một nguyên liệu rất cần thiết
cho vi khuẩn để tổng hợp acid folid phục vụ cho quá trình phát triển. Chính vì
vậy mà sulfamid đã tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid
folic của vi khuẩn (Võ Văn Ninh, 2007).
Phổ kháng khuẩn của sulfamid rất rộng, hầu hết các cầu khuẩn và các
trực khuẩn gram âm và dƣơng:
- Cầu khuẩn gram (+): liên cầu, phế cầu, tụ cầu (tụ cầu vàng)
- Cầu khuẩn gram (-): màng não cầu, lậu cầu
- Trực khuẩn gram (+): ƣa khí và kỵ khí
- Trực khuẩn gram (-): đặc biệt là trực khuẩn đƣờng ruột
- Một số sulfamid tác dụng với clamydia, ký sinh trùng sốt rét,
toxoplasma.

- Hiện nay do tỷ lệ kháng thuốc và kháng chéo giữa các sulfamid cao
nên ít dùng. Vi khuẩn kháng thuốc bằng cách tăng tổng hợp PABA
hoặc giảm tính thấm với thuốc. Dựa vào dƣợc động học, các
sulfamid đƣợc chia làm 4 loại:
- Loại hấp thu nhanh, trừ nhanh: thời gian bán thải
2
t
= 6 – 8 giờ,
sulfadiazin, sulfadimidin, sulfamethoxazol
- thải Loại hấp thu rất ít: điều trị viêm ruột, loét đại tràng:
sulfaguanidin (ganidan), phtalylsulfathiazol
- Loại thải trừ chậm: duy trì nồng độ điều trị trong máu lâu,
2
t
= 7 – 9
ngày, nên chỉ uống 1 lần/ngày: sulfadoxin (fanasil) có trong thành
phần viên fansidar thuốc điều trị sốt rét
- Loại dùng tại chỗ: ít hoặc không tan trong nƣớc, dùng điều trị các vết
thƣơng tại chỗ (mắt, vết bỏng ). Dạng dùng: dung dịch hoặc kem
(sulfacetamid, bạc sulfadiazin, mafenid).
2.2.2 Sulfamethoxazole (SMX)
Công thức cấu tạo:
C
10
H
11
N
3
O
3

S




Hình 2.1 Công thức cấu tạo SMX

Trang 4


Sulfamethoxazole là 4 – amino – N – (5 – methylisoxazol – 3 – yl) –
benzenesulfonamide.
Tính chất
Sulfamethoxazole bột trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, vị đắng, không
tan trong nƣớc, ít tan trong ethanol
Màu sắc của dung dịch
Hòa tan 0,5 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch natri hydroxyd 1 M
(TT). Dung dịch thu đƣợc có màu không đƣợc đậm hơn dung dịch màu mẫu.
Giới hạn acid
Lấy 1,25 g chế phẩm đã đƣợc nghiền mịn, thêm 25 ml nƣớc không có
carbon dioxyd, lắc đều. Đun nóng khoảng 70
0
C trong 5 phút. Làm nguội trong
nƣớc đá khoãng 15 phút và lọc. Hút 20 ml dịch lọc, thêm 0,1 ml dung dịch
xanh. Bromothymol (TT), không đƣợc dùng quá 0,2 ml dung dịch natri
hydroxyd 0,1 M (CĐ) để làm
chuyển
màu của chỉ thị.
Tác dụng
Sulfamid ngày càng ít dùng đơn thuần vì nhiều độc tính và đã có kháng

sinh thay thế. Các chế phẩm hay dùng dƣới dạng phối hợp với trimethoprim.
Các chỉ định hiện nay còn dùng: điều trị phong, nhiễm khuẩn tiêu hoá, tiết
niệu, mắt hột, viêm kết mạc, sốt rét, dịch hạch, dự phòng dịch tả và điều trị tại
chỗ.
Trong nuôi trồng thủy sản sulfamethoxazole thƣờng đƣợc sử dụng kết
hợp với trimethoprim để trị các bệnh nhiễm khuẩn.
Phƣơng pháp định lƣợng
Hòa tan 0,250 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 20 ml dung dịch acid
hydrocloric 2 M và 50 ml nƣớc. Thêm 3 g kali bromid, làm lạnh dung dịch
trong nƣớc đá và chuẩn độ chậm bằng dung dịch natri nitrit 0,1 M, xác định
điểm kết thúc bằng phƣơng pháp chuẩn độ đo ampe. 1 ml dung dịch natri nitrit
0,1 M tƣơng đƣơng với 27,83 mg C
12
H
14
N
4
O
2
S.
2.3 Sơ lƣợc về Trimethoprim (TMP) – đại diện chính của
diaminopyrimidine
2.3.1 Công thức cấu tạo: C
14
H
18
N
4
O
3

Trimethoprim là 2,4 diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidin,
phải chứa từ 98,5đến 101,% C
14
H
18
N
4
O
3
, tính theo chế phẩm đã làm khô.

Trang 5







2.3.2 Tính chất
Bột trắng hoặc trắng hơi vàng. Rất khó tan trong nƣớc, khó tan trong
ethanol 96%, tan ít trong chloroform, thực tế không tan trong ether.
2.3.3 Dƣợc lý và cơ chế tác dụng
Trimethoprim có tác dụng kìm khuẩn, ức chế enzym dihydrofolate
– reductase của vi khuẩn. Trimethoprim chống lại tác nhân gây nhiễm khuẩn
đƣờng tiết niệu nhƣ E.coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter,
Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus faecalis và chống lại nhiều vi
khuẩn dạng E. Coli
Trimethoprim đƣợc hấp thu nhanh và hầu nhƣ hoàn toàn qua đƣờng

tiêu hóa, nồng độ đỉnh trong máu đạt đƣợc sau 1 – 4 giờ là 1 microgam/mL
sau khi uống liều 100mg. Gắn với protein huyết tƣơng khoảng 45%.
Trimethoprim phân bố trong nhiều mô và các dịch gồm thận, gan, phổi, dịch
phế quản, nƣớc bọt, thủy dịch ở mắt, tuyến tiền liệt và dịch âm đạo. Thuốc đi
qua hàng rào nhau thai và có trong sữa mẹ. Thời gian bán hủy của thuốc là 8 -
11 giờ ở ngƣời lớn và ít hơn ở trẻ em, kéo dài hơn ở ngƣời suy thận và ở
trẻ sơ sinh. Trimethoprim đào thải chủ yếu qua thận thông qua lọc cầu thận
và bài tiết ở ống thận, chủ yếu dƣới dạng không đổi. Khoảng 40 - 60% liều
đƣợc đào thải qua thận trong 24 giờ. Trimethoprim có thể bị loại khỏi máu qua
lọc máu.
Trong thủy sản trimethoprim là loại kháng phòng, trị các bệnh do
nhiểm khuẩn.
2.4 Thuốc thú y thủy sản Trimesul của Vemedim
Trimesul là sản phẩm của công ty cổ phần xuất khẩu kinh doanh vật tƣ
và thuốc thú y Vemedim. Thành phần chính của Trimesul là sulfamethoxazole
20 % và trimethoprim 6%. Thuốc có tác dụng đặc trị các bệnh đƣờng tiêu hóa
– chƣớng hơi, phình ruột. Hiệu quả cao trong việc trị các bệnh nhiễm của cá
do vi khuẩn gây ra, đặc hiệu trên các giống vi khuẩn Vibrio, Pseudomonas,
Hình 2.2 Công thức cấu tạo TMP

Trang 6

Enterobacteria, Aeromonas, Filamentous bacteria gây bệnh viêm dạ dày –
ruột, sình bụng, lòi mắt, chƣớng hơi, bệnh lở loét, tuột nhớt, tuột vảy, mòn
đuôi, đốm trắng, đốm đỏ, xuất huyết.
Trimesul đƣợc sử dụng bằng cách trộn chung với thức ăn cho thủy sản.
Trộn vào thức ăn cho cá liên tục 5 – 7 ngày theo liều sau: 5g/kg thức ăn, dùng
cho 20kg cá.
2.5 Tổng quan về cá tra
Hình 2.3 Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

2.5.1 Phân loại
Bộ cá nheo Siluriformes
Họ cá tra Pangasiidae
Giống cá tra dầu Pangasianodon
Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878, Fish base).
2.5.2 Phân bố
Cá tra phân bố ở lƣu vực sông Mekong, có mặt ở cả 4 nƣớc Lào, Việt
Nam, Campuchia và Thái Lan. Ở Thái Lan còn gặp chúng ở lƣu vực sông
Mekong và Chao phraya.
Ở nƣớc ta những năm trƣớc đây, khi chƣa có cá sinh sản nhân tạo, cá
bột và cá giống đƣợc vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trƣởng thành chỉ
thấy trên ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên. Việt Nam đã thành công trong sinh
sản nhân tạo và đã đáp ứng đƣợc nhu cầu về giống cho nghề nuôi thƣơng
phẩm.
Cá tra là một trong những loài cá có giá trị kinh tế phổ biến ở Đồng
bằng sông Cửu Long. Đây là loài cá có kích thƣớc lớn, dễ nuôi, tăng trọng
nhanh. Hiện nay cá tra có nguồn gốc sinh sản nhân tạo đã đƣợc thả nuôi ổn

Trang 7

định và là một trong những đối tƣợng nuôi trồng thủy sản đang đƣợc phát triển
với tốc độ nhanh tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Năng suất nuôi cá Tra
rất cao, trong ao đạt tới 60 – 70 tấn/ ha, trong bè có thể đạt tới 100 –
300kg/m
3
nƣớc bè nuôi. Tập trung nhiều tại An Giang và Đồng Tháp, và là
một trong những loài cá có giá trị xuất khẩu cao.
Cá tra ngoài tự nhiên phân bố ở những sông, hồ, kinh, rạch, mƣơng
vùng nƣớc ngọt, sống ở các thủy vực nƣớc tĩnh và nƣớc chảy. Cá cũng đƣợc
nuôi với hình thức nuôi bè, ao, hầm.

2.5.3 Hình thái sinh lý
Cá tra là cá da trơn (không vảy) thân dài, lƣng xám đen, bụng hơi bạc,
miệng rộng, có 2 đôi râu dài. Cá tra sống chủ yếu trong nƣớc ngọt, có thể sống
ở vùng nƣớc hơi lợ (nồng độ muối từ 7 – 10% ) có thể chịu đựng đƣợc nƣớc
phèn với pH từ 6,0 – 8,0 (Dương Nhật Long, 2003). Cá dễ chết ở nhiệt độ thấp
≤ 15
0
C nhƣng chịu nóng đến 39
0
C (Hội nghề cá Việt Nam VINAFISH, 2004).
Oxy thích hợp cho sự phát triển của cá là ≥ 3,0 (Thông tư số 45/2010/TT-
BNNPTNT).
Cá tra có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí và da
nên chịu đựng đƣợc môi trƣờng thiếu oxy hòa tan, cá có ngƣỡng oxy thấp nên
sống đƣợc ở ao tù nƣớc bẩn.
2.5.4 Đặc điểm dinh dƣỡng
Cá hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tƣơi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫn
nhau ngay trong bể ấp, thậm chí cá vớt trên sông vẫn thấy chúng ăn nhau
trong đáy vớt cá bột. Chúng ăn các loại phù du động vật có kích thƣớc vừa cở
miệng chúng.
Khi cá lớn tính ăn tạp thiên về động vật và dễ chuyển đổi loại thức ăn.
Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức
ăn bắt buộc nhƣ mùn, bã hữu cơ, động vật đáy.
2.5.5 Đặc điểm sinh trƣởng
Cá tra có tốc độ sinh trƣởng tƣơng đối nhanh, lúc còn nhỏ cá tăng
nhanh về chiều dài. Cá ƣơng trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10 – 12cm
(14 – 15g/con). Từ khoảng 2,5 kg trở đi mức tăng trọng lƣợng nhanh hơn so
với tăng chiều dài cơ thể. Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm. Đã
gặp cỡ cá trong tự nhiên 18kg/con hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m.
Nuôi trong ao một năm cá đạt 1 – 1,5kg/con. Những năm sau cá tăng

trọng nhanh hơn có khi đạt tới 5 – 6kg/con/năm. Tùy môi trƣờng sống và sự
cung cấp thức ăn cũng nhƣ loại thức ăn có hàm lƣợng đạm nhiều hoặc ít. Độ

Trang 8

béo của cá tăng dần theo trọng lƣợng và nhanh nhất ở những năm đầu. Cá đực
thƣờng có độ béo cao hơn cá cái và độ béo thƣờng giảm đi khi vào mùa sinh
sản.
2.5.7 Thành phần dinh dƣỡng cá tra
Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng cá tra trên 100g thành phẩm
Thành phần dinh dƣỡng
Giá trị
Tổng năng lƣợng (cal)
124
Tổng đạm (Kcal)
30,8
Tổng béo (g)
3,42
Chất béo bão hòa (g)
1,64
Cholesterol (mg)
25,2
Natri (mg)
70,6
Carbohydrat (g)
0
Chất xơ (g)
0
Protein (g)
23,4

2.6 Tổng quan về cá rô phi đỏ
Hình 2.4 Cá rô phi đỏ (Oreochromis sp)
2.6.1 Phân loại
Ngành: Chordata
Lớp: Actinopterygii
Bộ: Perciformes
Họ: Cichlidae
Giống: Oreochromis
Loài: Oreochromis sp

Trang 9

2.6.2 Đặc điểm dinh dƣỡng
Tất cả các loài rô phi đều có tính ăn tạp, tuy nhiên thức ăn ƣa thích của
rô phi là những sinh vật thuỷ sinh lơ lửng trong nƣớc. Ngoài ra rô phi còn có
khả năng sử dụng trực tiếp những loại thức ăn do con ngƣời cung cấp nhƣ
cám, tấm, các loại rong bèo (bèo tấm, bèo hoa dâu). Đây là đặc điểm rất thuận
lợi cho nghề nuôi cá.
Cá rô phi đỏ có thể sống đƣợc cả môi trƣờng nƣớc ngọt và nƣớc lợ, pH
từ 5 – 9, thích hợp nhất là 6,8 – 8,3 nhiệt độ dao động từ 7 – 45
0
C, tốt nhất là
từ 25 – 32
0
C. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng của cá rô phi là 20 –
35
0
C, tối ƣu ở 28 – 30
0

C. Trên 32
0
C tốc độ tăng trƣởng và tiêu thụ thức ăn tỷ
lệ nghịch với quá trình tăng nhiệt độ. Khi nhiệt độ dƣới 20
0
C cá tăng trƣởng
chậm và ngừng ăn khi dƣới 15
0
C. Dƣới 10
0
C tỷ lệ cá chết rất nhiều. Giới hạn
nhiệt độ gây chết là 11
0
C và 42
0
C (Nguyễn Việt Dũng, 2008)
2.6.4 Đặc điểm dinh dƣỡng
Sau một tháng tuổi cá con có thể đạt trọng lƣợng 2 – 3g/con và sau
khoảng 2 tháng tuổi có thể đạt 10 – 12g/con. Cá cái sẽ lớn chậm hơn sau khi
tham gia sinh sản trong khi đó cáđực vẫn lớn bình thƣờng vì vậy trong đàn cá
rô phi thì cá đực bao giờ cũng có kích thƣớc lớn hơn cá cái. Sau khoảng 5 – 6
tháng nuôi cá rô phi vằn đực có thể đạt 200 – 250g/con và cá cái có thể đạt
150 – 200g/con.
2.7 Các phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng Sulfamid và Trimethoprim
2.7.1 Phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng sulfamid theo TCN196:2004:
Sulfamid trong sản phẩm thuỷ sản – Phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc kí
lỏng hiệu năng cao HPLC.
Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004, qui định phƣơng pháp xác định
hàm lƣợng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin,
sulfamethazin, sulfamethoxypiridazine, sulfacloropyridazin, sulfadoxin,

sulfamethoxazone, sulfadimethoxin và sulfachinoxalin) trong sản phẩm thủy
sản bằng HPLC đầu dò huỳnh quang. Các chất nhóm sulfonamide có trong
mẫu sản phẩm thủy sản đƣợc chiết tách bằng hỗn hợp acetonitril và
dichlorometan. Dịch chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch
fluorescamine để tạo dẫn xuất huỳnh quang. Hàm lƣợng các dẫn xuất đƣợc
xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phƣơng pháp
ngoại chuẩn.
Kháng sinh Sulfamid trong mẫu thủy sản đƣợc chiết tách bằng
acetonitril và dichlorometan. Cột sắc ký: Cột Nucleosil 250 x 3 mm 100-5 C18

Trang 10

AB.
Pha động bao gồm dung dịch H
3
PO
4
0,02 M (hòa tan 2,3 g H
3
PO
4
85%
với nƣớc cất rồi định mức thành 1000 ml) và hỗn hợp dung dịch methanol và
acetonitril (tỷ lệ 1:1) (hòa tan 500 mL methanol trong 500 mL acetonitril). Pha
động đƣợc chạy theo chƣơng trình cụ thể nhƣ sau:
Bảng 2.2 Chƣơng trình pha động
Thời gian
Dung dịch
H
3

PO
4
0,02 M
Hỗn hợp dung dịch methanol và
acetonitril (tỷ lệ1:1)
Bắt đầu
60
40
20 phút
60
40
25 phút
50
50
39 phút
50
50
40 phút
45
55
50 phút
45
55
51 phút
60
40
58 phút
60
40

Hàm lƣợng sulfonamide trong dịch chiết đƣợc xác định trên hệ thống
HPLC với đầu dò huỳnh quang tại bƣớc sóng kích thích là 405 nm, bƣớc sóng
phát xạ là 495 nm theo phƣơng pháp ngoại chuẩn. Độ lặp lại 2 lần, độ thu hồi
đƣợc cho mỗi lần chạy mẫu nằm trong khoảng 60 – 70%. Ðộ lệch chuẩn
(CVS) tính theo diện tích peak sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch
chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. Dựng đƣờng chuẩn giữa tỷ số diện tích peak các
chuẩn sulfonamide/diện tích peak chuẩn nội sulfanilamide và nồng độ theo
quan hệ tuyến tính bậc nhất (phƣơng trình y = ax + b).
2.7.2 Phƣơng pháp xác định đồng thời sulfadiazin và trimethoprim trên
cá vền biển bằng HPLC (Papapanagiotou et al., 2013).
Phƣơng pháp này dựa trên chất chuẩn Sigma (StLouis, MO, Hoa Kỳ)
nhằm xác định đồng thời cả hai kháng sinh sulfadiazin (SDZ) và trimethoprim
(TMP)trong cùng một điều kiện. Mẫu đƣợc chiết tách bằng dichlorometan với
pH khoảng 3. Cột sắc ký Nucleosil 100 RP C18 (250 x 4,6 mm x 5µm). Pha
động bao gồm acetonitrile: axit photphoric với tỉ lệ 16:84, tốc độ dòng 1,0
mL/phút, phát hiện nhạy nhất ở bƣớc sóng 271 nm.
Độ tồn lƣu của SDZ và TMP trong mẫu cá vền biển sau thời gian 7
ngày kể từ khi ngừng cho ăn thức ăn chứa kháng sinh đƣợc trình bày trong
bảng 2.2.

Trang 11

Bảng 2.2 Mức độ tồn lƣu của SDZ và TMP trong mẫu cá vền biển
sau 7 ngày ngừng cho ăn thức ăn chứa kháng sinh (ng/g)
Cá
Cơ và da
Gan
Mang
Thận
SDZ

TMP
SDZ
TMP
SDZ
TMP
SDZ
TMP
1
583
378
314
1158
359
829


2
186
200
298
1338
187
359
305
18155
3
301
222
1500
7613

661
1319


2.7.3 Xác định một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc
gia cầm bàng phƣơng pháp sắc ký lỏng LC-MS/MS (Vũ Thị Trang, 2012).
Phƣơng pháp nghiên cứu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách
và xác định các SAs, tối ƣu quá trình xử lý mẫu, ứng dụng phân tích trên một
số mẫu thực tế. Mẫu đƣợc chiết tách theo phƣơng pháp QuEChERS với
nguyên tắc: chiết các SAs ra khỏi nền mẫu bằng ACN, loại nƣớc bằng MgSO4
khan, làm sạch dịch chiết bằng phân tán pha rắn với bột PSA (primary
secondary amine) và bơm vào hệ LC-MS/MS. Cột sắc ký loại C18 (150mm x
2,1mm x 3,5μm) của Agilent (USA). Pha động bao gồm nƣớc chứa 0,1% acid
formic và acetonitril, tốc độ pha động 0,4 ml/phút, nhiệt độ cột tách 30
0
C.
Bảng 2.2 Điều kiện phân mảnh
STT
Ion mẹ
Ion con
DP (eV)
CE (eV)
CXP (eV)
1
SIM - 279
124*
80
29
16
86

80
23
12
2
SD - 251
156*
80
21
20
92
80
31
16
3
STZ - 256
156*
85
19
18
92
85
33
14
4
SP - 250
92
85
31
10
156*

85
28
12
5
SM - 265
156*
80
23
12
92
80
35
14
6
SMM - 281
156*
85
23
10
108
85
33
14
7
SCP - 285
156*
80
21
14
92

80
37
16
8
SMX - 254
156*
80
21
18
108
80
31
16

Trang 12

9
SSA - 268
156*
80
19
16
113
80
21
16
10
SDM - 311
156*
80

27
20
92
80
41
14
11
IS - 315
156*
80
29
20
96
80
39
14
(*) Ion dùng để định lượng
Kết quả phân tích 18 mẫu của 6 đối tƣợng: thịt lợn, thịt gà, thịt bò, thận
lợn, gan lợn, phủ tạng gà đƣợc lấy tại 3 chợ: chợ Nguyễn Cao, chợ Mơ, chợ
Lĩnh Nam (Hà Nội). Kết quả cho thấy có 3 mẫu nhiễm SAs: mẫu thịt gà và nội
tạng gà 10 mua từ chợ Nguyễn Cao nhiễm SDM với hàm lƣợng lần lƣợt là
11,1 và 9,82 μg/kg, mẫu thịt bò mua tại chợ Mơ nhiễm SD với hàm lƣợng 6,00
μg/kg, không có mẫu nào nhiễm 8 SAs còn lại. Tuy nhiên, tất cả các mẫu
nhiễm đều nằm dƣới giới hạn dƣ lƣợng tối đa cho phép (100 μg/kg).

Trang 13

CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Bộ môn dinh dƣỡng và chế biến – Khoa Thủy sản – Trƣờng Đại Học
Cần Thơ
3.1.2 Nguyên liệu
Nguyên liệu cá tra giống, cá rô phi đỏ giống đƣợc mua từ trại cá giống
Cần Thơ.
3.1.3 Thời gian
Thời gian thực hiện từ tháng 8 – 2013 đến tháng 12 – 2013
3.2 Vật liệu và phƣơng pháp
3.2.1 Vật liệu
Cá tra có trọng lƣợng 40±7g/con và cá rô phi đỏ có trọng lƣợng 10±4g
không bệnh, không dị tật khỏe mạnh mua ở trại cá giống Cần Thơ. Cá đƣợc
thuần dƣỡng trƣớc khi tiến hành thí nghiệm 2 tuần.
3.2.2 Hóa chất
Thuốc Trimesul của Vemedim, thành phần chính gồm
sulfamethoxazole 20% và trimethoprim 6%.
Dầu mực
3.2.3 Phƣơng pháp phân tích
Phƣơng pháp phân tích sulfamethoxazole và trimethoprim bằng hệ
thống sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ LC – MS/MS đã đƣợc tối ƣu hóa tại
phòng thí nghiệm hóa Trung tâm chất lƣợng nông lâm thủy sản Vùng 6 (Địa

chỉ: 386C Cách Mạng Tháng Tám – Phƣờng Bùi Hữa Nghĩa – Quận Bình
Thủy – Thành phố Cần Thơ).
 Hóa chất cho phân tích
- Chuẩn sulfamethoxazole dạng rắn  98% (Dr. Ehrenstorfer, Germany).
- Chuẩn trimethoprim dạng rắn  98% (Dr. Ehrenstorfer, Germany).
- Nƣớc dùng cho UPLC (Merck, Germany).
- Acetonitril (Merck, Germany)
- Acid acetic 100% (JT Baker, USA)
- Acid formic 99% (Merck, Germany)

Trang 14

- MgSO
4
(JT Backer, USA)
- NaCl (Merck, Germany)
- Bột C18 Bondesil C18 40 µm, 100 mg (Agilent, USA)
- PSA (Agilent, USA)
 Thiết bị
- Máy ly tâm 50 RS (Hettich zentrifugen, Germany)
- Máy lắc (Multi – Shaker, Japan)
- Bể đánh siêu âm Elma (Elamasonic, Germany)
- UPLC (Acquity of Water, USA)
- Đầu dò: Xevo TQ MS (Water, USA), sử dụng phần mềm MassLynx
4.1, phần mềm định lƣợng TargetLynx.
- Bộ đựng mẫu cho vào máy UPLC (Water N/P, USA)
- Cột sắc ký Acquity UPLC BEH C18 (1,7, 3µm x100mm) có gắn cột
bảo vệ cùng loại (Waters, USA)
 Đƣờng chuẩn
Từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm pha loãng ra các nồng độ thấp hơn

100 ppm , 10 ppm và 1ppm để sử dụng.
Đƣờng chuẩn sulfamethoxazole đƣợc pha theo các nồng độ 0, 1, 2, 4, 8
ng/mL. Đƣờng chuẩn trimethoprime đƣợc pha theo các nồng độ 0, 10, 20, 40,
80 ng/mL.
 Điều kiện dung môi pha động
- A: Acetonitril (CAN)
- B: 0,1 % acid formic HCOOH trong nƣớc cất dùng cho UPLC
Chƣơng trình pha động:
Thời gian (phút)
%A
%B
0,00
20,0
80,0
1,00
20,0
80,0
2,50
35,0
65,0
4,00
40,0
60,0
5,00
60,0
40,0
5,20
20,0
80,0
6,50

20,0
800
- Tốc độ dòng chảy: 280 µL/min
- Nhiệt độ cột: 40.0
0
C
- Thể tích tiêm: 10 L

Trang 15

 Điều kiện phân mảnh
Simple
Ion mẹ
(m/z)
Ion con
(m/z)
Dwell(s)
Cone(v)
Collision(v)
Sulfamethoxazole
254.1
92.1
156.1*
0.025
0.025
25
25
28
16
Trimethoprim

291.2
123.2
230.2*
0.02
0.02
35
35
25
25
(*) Ion dùng để định lượng
 Tách chiết mẫu
- Cân 2 g mẫu phân tích
- Chiết bằng 10 mL dung dịch: 1% CH
3
COOH trong ACN
- Thêm 1mL nƣớc cất
- Lắc, đánh siêu âm 10 – 15 phút
- Thêm 2 g MgSO
4
và 1g NaCl lắc mạnh
- Ly tâm 6 phút, 4500 rpm
- Hút 5 mL dịch trên
 Làm sạch mẫu
- Chuẩn bị bột làm sạch bao gồm 900 mg MgSO
4
:150 mg PSA:100mg
bột C18
- Chuyển 5 mL dung dịch vừa chiết xong vào ống trên
- Thêm 0,5 mL toluen
- Ly tâm 6 phút, 4500rpm

- Hút lớp trên
- Thổi khô dƣới dòng khí nitrogen 50
0
C
- Hút 1 mL pha động vào hoàn nguyên. Pha động bao gồm ACN và 0,1
acid formic với tỷ lệ 20:80
- Đánh siêu âm vài phút, vortex
- Lọc và cho vào vial
- Bơm mẫu vào LC-MS/MS