nghiên cứu một số loại thảo dược phòng bệnh vi khuẩn aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm (chitala chitala)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN




PHẠM MINH KHÁ





NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC PHÒNG
BỆNH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN
CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala)





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN




PHẠM MINH KHÁ



NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC PHÒNG
BỆNH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN
CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala)





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. TỪ THANH DUNG

2013
i
Lời cảm tạ
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Bộ môn Bệnh Học Thủy Sản-
Trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn và
tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt đề tài.
Cảm ơn cha mẹ, gia đình và người thân của tôi đã ủng hộ rất nhiều về mặt tinh
thần cũng như vật chất trong quá trình học tập.
Cảm ơn anh Nguyễn Bảo Trung, Chị Trần Thị Mỹ Hân, bạn Nguyễn Minh
Thuật lớp NTTS TT- K35 và tập thể lớp Bệnh học thủy sản K36 đã nhiệt tình
giúp đỡ, ủng hộ và chia sẻ với tôi trong suốt quá trình học tâp cũng như trong
thời gian tôi thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn!
Phạm Minh Khá

ii
Tóm tắt
Đề tài nhằm tìm hiểu hoạt tính kháng khuẩn của ba loại thảo dược (Diệp hạ
châu, cỏ mực và lá ổi) nhằm đánh giá khả năng dùng thảo dược phòng trị bệnh
do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá.
Xác định tính kháng khuẩn của thảo dược với vi khuẩn A. hydrophila được
thực hiện với 3 loại dược (Cỏ mực, diệp hạ châu, lá ổi) và pha loãng ở 3 nồng
độ khác nhau 25, 50 và 100%. Thí nghiệm được thực hiện bằng hai phương
pháp là khuếch tán và đục lỗ trên đĩa thạch, trong đó chỉ có phương pháp đục
lỗ trên đĩa thạch cho được kết quả tốt với diệp hạ châu có vòng kháng khuẩn

mạnh nhất là 15mm ở nồng độ 50 và 100%, thấp nhất là lá ổi không có vòng
kháng khuẩn.
Cá thát lát còm giống khỏe sau khi được thuần trong bể thì tiến hành bố trí thí
nghiệm, bao gồm 6 nghiệm thức có bổ sung thảo dược (Cỏ mực 3ml, 6ml;
diệp hạ châu 3ml, 6ml; lá ổi 3ml, 6ml) và một nghiệm thức đối chứng (Không
thảo dược). Trong thí nghiệm này tiến hành thu mẫu 2 đợt để phân tích các chỉ
tiêu huyết học là sau 3 tuần bổ sung thảo dược và sau khi cảm nhiễm. Kết quả
ở các nghiệm thức bổ sung thảo dược thì tế bào hồng cầu tăng sau 3 tuần và
giảm sau khi cảm nhiễm, tổng tế bào bạch cầu và bạch cầu đơn nhân thì tất cả
đều tăng trước và sau khi cảm nhiễm. Bên cạnh đó, tỉ lệ chết đối với cá có bổ
sung thảo dược có số cá chết thấp hơn nghiệm thức không bổ sung thảo dược,
thấp nhất là ở nghiệm thức cỏ mực 15% so với cá không có bổ sung thảo dược
là 65%.











iii
Mục lục
Lời cảm tạ i
Tóm tắt ii
Mục lục iii
Danh sách bảng và hình v

Danh mục từ viết tắt vi
CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
1.3 Nội dung đề tài 2
Chương II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng và sinh sản của cá thát lát còm 3
2.1.1 Đặc điểm phân loại 3
2.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng, sinh sản 3
2.2 Một số bệnh trên cá thát lát còm 4
2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 5
2.4 Tổng quan về cây diệp hạ châu, cây cỏ mực, lá ổi và ứng dụng 6
2.4.1 Cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) 6
2.4.2 Cây cỏ mực (Eclipta alba) 7
2.4.3 Cây ổi (Psidium guajava) 8
2.4.4 Chiết xuất thảo dược 9
2.4.5 Các nghiên cứu về thảo dược 9
2.5 Các chỉ tiêu huyết học 12
2.5.1 Hồng cầu 12
2.5.2 Bạch cầu 13
2.5.3 Các nghiên cứu về các chỉ tiêu huyết học 14
Chương III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
3.1.1 Thời gian 16
3.1.2 Địa điểm thực hiện 16
3.2 Vật liệu nghiên cứu 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu 17
3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 17
3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá 17
3.3.3 Định danh vi khuẩn 17

3.3.4 Kiểm tra tính nhạy của thảo dược (Lá ổi, cỏ mực, diệp hạ châu) trên vi
khuẩn Aeromonas hydrophila. 17
3.3.5 Thí nghiệm tác dụng của thảo dược phòng bệnh xuất huyết do vi khuẩn
Aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm 18
3.3.5 Định lượng và định tính hồng cầu và bạch cầu 20
3.4 Phương pháp xử lý số liệu 22
Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
4.1 Kết quả kiểm tra tính nhạy của thảo dược trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila
23
4.2 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây diêp hạ châu, cỏ mực, lá ổi lên các chỉ tiêu
huyết học của cá thát lát còm 24
4.2.1 Hồng cầu 25
4.2.2 Bạch cầu 26
4.3 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila 29
iv
4.4 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây diêp hạ châu, cỏ mực, lá ổi lên các chỉ tiêu
huyết học của cá thát lát còm cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila 30
4.4.1 Hồng cầu 30
4.4.2 Bạch cầu 31
4.5 Kết quả tái định danh vi khuẩn 32
Chương V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34
5.1 Kết luận 34
5.2 Đề xuất 34
Tài liệu tham khảo 35
Phần phụ lục 39
Phụ lục 1 39
Phụ lục 2 43
Phụ lục 3 45
Phụ lục 4 46
Phụ lục 5 47

Phụ lục 6 48
Phụ luc 7 50
Phụ lục 8 52
Phụ luc 9 54
v
Danh sách bảng và hình
Hình 2.1: Cá thát lát cườm………………………………………….………… 3
Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila………………….… 5
Hình 2.2 Aeromonas hydrophila……………….……………………………… 5
Hình 2.3 Diệp hạ châu………………………………………………… …………6
Hình 2.4 Cỏ mực…………………………………………………………… … 7
Hình 2.5 Lá ổi…………………………………………………………………… …8
Hình 3.1 A. Bố trí thí nghiệm cho ăn; B. Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm……….… 20
Hình 3.2 Thao tác lấy mẩu máu và trải mẫu……………………………………… 21
Hình 3.3 Buồng đếm hồng cầu…………………………………………………… 22
Hình 4.1 (A)Vi khuẩn Aeromonas hydrophila, (B) nhuộm Gram vi khuẩn ……… 23
Hình 4.2 Kiểm tra thảo dược với vi khuẩn Aeromonas hydrophila…………… …23
Hình 4.3 Kết quả kiểm tra thảo dược với vi khuẩn Aeromonas hydrophila. (A) diệp
hạ châu, (B) cỏ mực …………………………………………………………… ….24
Hình 4.4 Hồng cầu trên cá thát lát còm (100X)…………………………………… 25
Hình 4.5 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và
không bổ sung thảo dược………………………….…………………………… 26
Hình 4.6 Các loại bạch cầu trên cá thát lát còm (100X)…………………………….27
Hình 4.7 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng tổng bạch cầu giữa các nghiệm thức bổ
sung và không bổ sung thảo dược………………………….………………… 27
Hình 4.8 Bạch cầu đơn nhân (100X)……………………………………………… 28
Hình 4.9 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng bạch cầu đơn nhân giữa các nghiệm thức
bổ sung và không bổ sung thảo dược……………………………….……… …28
Hình 4.10 Tỉ lệ cá chết tích lũy (%) theo giờ cảm nhiễm………………………… 29
Hình 4.11 Sự thay đổi số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ

sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila
31
Hình 4.12 Sự thay đổi số lượng tổng bạch cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và
không bổ sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas
hydrophila……………………………………………………… …………………32
Hình 4.13 Sự thay đổi số lượng bạch cầu đơn nhân giữa các nghiệm thức bổ sung và
không bổ sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas
hydrophila……………………………………… ……………………………… 32
Hình 4.14 Cá thát lát còm có dấu hiệu xuất huyết………………………… ………33
Hình 4.15 (A) Nhuộm Gram vi khuẩn A.hydrophila, (B) test chỉ tiêu O/F của vi
khuẩn A.hydrophila………………………………………………………. …… 34


vi
Danh mục từ viết tắt

ĐBSCL Đồng bằng sông cửu long
ĐVTS Động vật thủy sản
NTTS Nuôi trồng thủy sản
NA Nutrient agar
TSA Tryptic soy agar
BHI-B Brain heart infusion broth
NaCL Natri clorua
CFU Colony Forming Units
DHC Diệp hạ châu
TBC Tổng bạch cầu
BCĐN Bạch cầu đơn nhân

1
CHƯƠNG I
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Việt Nam là nước có nền kinh tế nông nghiệp pháp triển lâu đời. Bên cạnh
ngành nông nghiệp lúa nước thì thủy sản cũng góp phần đáng kể trong phát
triển kinh tế với kinh ngạch xuất khẩu đạt 6,13 tỷ USD (Vasep, 2012). Trong
đó, nghề nuôi cá thát lát còm cũng đã giúp nhiều cho sự phát triển của ngành
nuôi thủy sản. Theo số liệu thống kê diện tích nuôi cá thát lát ở Hậu Giang
hiện đang tăng dần theo từng năm. Điển hình là ở huyện Phụng Hiệp (2011)
toàn huyện có khoảng 1,3 ha thì đến năm 2013 toàn huyện đã có khoảng 10
ha.
Phong trào nuôi cá thát lát còm phát triển trên nhiều tỉnh thành ở ĐBSCL như:
Hậu Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An,…nhưng khu vực phân bố tự
nhiên cá thát lát còm nhiều hơn có lẽ là vùng thuộc tỉnh Hậu Giang hiện nay.
Ngoài giá trị làm thực phẩm, cá thát lát còm còn được nuôi để làm cá cảnh.
Tình hình nuôi ngày càng phát triển đòi hỏi chúng ta phải có thêm nhiều
nghiên cứu về sản xuất giống, thức ăn, chăm sóc, quản lý môi trường cũng
như dịch bệnh. Tuy nhiên, với tình hình nuôi thâm canh ngày càng phổ biến,
dịch bệnh đang là vấn đề gây khó khăn cho các hộ nuôi. Cho đến nay, các
bệnh trên cá thát lát còm chưa được quan tâm và đầu tư nghiên cứu đúng mức.
Kết quả nghiên cứu còn rời rạc, các công trình nghiên cứu về bệnh trên đối
tượng này còn hạn chế. Mức độ thiệt hại, tình trạng bộc phát bệnh, cũng chưa
được ghi nhận nhiều. Hiện nay, trên thực tế khi bệnh xuất hiện thì đa số người

nuôi chủ yếu sử dụng các loại hóa chất và thuốc kháng sinh để điều trị là phổ
biến. Nhưng việc sử dụng không đúng cách không mang lại hiêu quả trong
việc điều trị mà ngược lại gây ra hiện tượng kháng thuốc ngày càng nghiêm
trọng. Việc điều trị bệnh như vậy, không những ảnh hưởng đến môi trường mà
còn ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng do sự tồn lưu thuốc trong sản
phẩm thủy sản.
Bên cạnh đó việc nghiên cứu sử dụng cây cỏ, thảo dược thay thế thuốc kháng
sinh, bổ sung vào thức ăn cho động vật thủy sản đang rất được quan tâm. Năm
2010, Nguyễn Quang Linh tạo ra được một chế phẩm sinh học từ lá trầu không
với tên gọi Bokashi- trầu có khả năng phòng trị một số bệnh cho ĐVTS, an
toàn sinh học và thân thiện với môi trường. Chế phẩm từ thảo dược thường là
hỗn hợp các chất chiết xuất từ nhiều loại thảo dược khác nhau. Các hoạt chất
trong thảo dược hoạt động như là một chất kháng khuẩn hay chất chống oxy

2
hóa. Nhiều loại thảo dược được sử dụng rộng rãi trong thú y và người vì đây là
các sản phẩm tự nhiên, an toàn cho người sử dụng mà còn rất có giá trị. Theo
Từ Thanh Dung (1996), đã nghiên cứu cảm nhiễm A. hydrophila với các loại
thảo dược đinh hương, cây chó đẻ, xiên tâm liên, cây nhọ nồi và một số cây
bản địa tại Thái Lan. Hiện nay hầu hết các nghiên cứu về thảo dược trong nuôi
trồng thủy sản chủ yếu tập trung vào cải thiện sức khỏe và bảo vệ gián tiếp cho
tôm chống lại các dịch bệnh và mầm bệnh, còn việc sử dụng thảo dược để
phòng và trị bệnh trên cá thì còn khá hạn chế. Xuất phát từ những thực tế đó,
đề tài “Nghiên cứu một số loại thảo dược phòng bệnh vi khuẩn Aeromonas
hydrophila trên cá thát lát còm (Chitala chitala)” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài
Tìm hiểu hoạt tính kháng khuẩn của một số loại thảo dược nhằm đánh giá khả
năng dùng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên
cá.
1.3 Nội dung đề tài

Kiểm tra tính nhạy của thảo dược (Lá ổi, cỏ mực, diệp hạ châu) trên vi khuẩn
Aeromonas hydrophila.
Thí nghiệm tác dụng của thảo dược phòng bệnh xuất huyết trên cá thát lát còm
(Chitala chitala).



















3

Chương II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng và sinh sản của cá thát lát còm
2.1.1 Đặc điểm phân loại
Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993), cá thát lát còm thuộc

hệ thống phân loại như sau: nghành có dây sống Chordata, lớp cá xương
Osteichthyes, bộ Osteoglossiformes, họ Notopteridae, giống Chitala, loài
Chitala chitala.
Tên khoa học khác: Notopterus chitala (Hamilton, 1822).
Tên địa phương: Cá thát lát cườm, cá nàng hai, cá còm,…
Hình 2.1 Cá thát lát còm (nguồn: diendancacanh.com)
2.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng, sinh sản
Cá thát lát còm hay cá nàng hai có nhiều ưu điểm hơn các loài cá thát lát khác:
kích thước lớn, tăng trưởng nhanh, thời gian nuôi ngắn, thịt có chất lượng cao.
Cá thát lát còm có dạng: thân dẹp ngang viền lưng cong rất rõ, viền bụng có
gai, đầu nhỏ nhưng miệng tương đối rộng, vây bụng bị thoái hóa, vây lưng nhỏ
nằm khoảng giữa thân, vi hậu môn dài liền với vây đuôi tạo thành một đường
viền mỏng. Vẩy tròn nhỏ, đường hoàn toàn.
Cá có phần thân giữa to, nhỏ ở phần đầu và đuôi. Phần đầu nhỏ, chỉ chiếm
khoảng 1/8 cơ thể cá. Đầu và lưng cá có màu xanh rêu, hai bên hông và bụng
màu trắng, có một đôi râu mũi ngắn, mắt nằm lệch về phía lưng của đầu. Cá
thát lát còm phân bố ở nhiều nước như Ấn Độ, Thái Lan, Myanma,
Campuchia và Nam Bộ của Việt Nam. Ở Việt Nam loài cá này không có ở các
tỉnh phía Bắc chỉ phân bố ở các tỉnh Nam Bộ. Cá thát lát còm còn nhỏ thích ăn
các loài sinh vật phù du, sau đó chuyển sang ăn động vật phù du là chính, cá
lớn ưa thích ăn động vật.

4
Cá có kích thước khá lớn, có thể đạt tới chiều dài 80-100 cm (Trong khi cá
thát lát chỉ đạt tới 40 cm (Raiboth, 1991). Tuổi thọ của cá thát lát còm có thể
đạt tới trên 10 năm.
2.2 Một số bệnh trên cá thát lát còm
Theo Từ Thanh Dung (2005) cá thát lát nuôi thường gặp một số bệnh:
Bệnh nhiễm khuẩn huyết Aeromonas: cá bệnh thường có hiện tượng cơ thể
xuất hiện từng mảng đỏ với nhiều khối u, bụng có hiện tượng sẩm màu từng

vùng , lưng có nhiều vết thương. Đuôi và vây bị hoại tử, mắt mờ đục, lồi và
sưng phù. Hậu môn sưng to, cá bỏ ăn, nổi lờ đờ trên mặt nước và cuối cùng là
chết.
Bệnh nhiễm khuẩn Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ): Cá bị bệnh cơ thể thường
hay xuất hiện nhiều đốm đỏ, rỉ máu và tiết ra nhiều dịch nhờn. Xung quanh
miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt
nhung không xuất huyết vây và hậu môn.
Bệnh trắng đuôi: Đuôi có đốm trắng, sau đó lan dần ra toàn thân, làm cho cá bị
mất nhớt và làm vẩy bị bong ra. Vây và đuôi điều bị xuất huyết. Cá bị bệnh ít
ăn, bỏ ăn từ từ. Các tia vây bị rách và cụt dần.
Bệnh trùng quả dưa (Bệnh đốm trắng): Thân cá có nhiều trùng bám tạo thành
hạt lấm tắm nhỏ, có màu trắng đục có thể nhìn thấy bằng mắt thường và cá
mắc bệnh này thường hay nổi lờ đờ trên mặt nước, giảm ăn hoặc bỏ ăn, nếu
bệnh nặng có thể làm cá chết.
Bệnh nấm thủy mi: Da cá xuất hiện vùng trắng xám có những sợi nấm nhỏ
mềm, sợi nấm phát triển mạnh đan chéo nhau thành búi như bông gòn có thể
nhìn thấy bằng mắt thường.
Ngoài ra còn có một số bệnh kí sinh khác: Bệnh trùng bánh xe, bệnh sán lá
đơn chủ, bệnh giun sán và bệnh do giáp xác,…Trong những loại bệnh trên thì
bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra là phổ biến nhất.
Theo Nguyễn Chung (2006) bệnh xảy ra chủ yếu trên cá thát lát còm là do vi
khuẩn và nấm. Chúng được xem là nguyên nhân gây bệnh thứ cấp ( tác nhân
gây bệnh cơ hội): Bệnh do vi khuẩn chủ yếu là do vi khuẩn Aeromonas spp
với dấu hiệu bệnh thường gặp là cá bỏ ăn, nổi nghiêng, bơi lội uể oải, bơi lờ
đờ chậm chạp trên mặt nước, xuất huyết ở vây, đuôi, hậu môn. Bệnh do nấm
chủ yếu là nấm thủy mi do 2 giống Saprolenia và Achlya thường có trong
nước, nhất là trong nước bẩn và trong bùn ao, dấu hiệu trên da xuất hiện
những vùng trắng xám, có những sợi nấm nhỏ như sợi bong bám vào da, có
thể nhìn thấy bằng mắt thường, nhất là khi cá bơi trong nước.

5
2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Theo Bùi Quang Tề (2005) giống vi khuẩn Aeromonas thuộc họ
Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành
Proteobacteria. Trong giống Aeromonas có 2 nhóm, (1) loài vi khuẩn không
di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở cá nước lạnh, (2) các loài vi
khuẩn di động bao gồm (A. hydrophila, A. caviae, A.sorbia). Đặc tính chung
của 3 loài vi khuẩn này là di động nhờ vào tiêm mao, vi khuẩn gram âm, hình
que ngắn, hai đầu hơi tròn, phản ứng oxidase dương tính, kháng với O/129.
Hình 2.2 Vi khuẩn A.hydrophila (nguồn: tepbac.com)
Theo Từ Thanh Dung (2008) Aeromonas hydrophila là vi khuẩn Gram âm, di
động, hình que ngắn dài 2- 3µm, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử
nitrate, có khả năng lên men, hai đầu hơi tròn, oxidase dương tính, kháng với
O/129 bao gồm A. hydrophila, A.caviae, A.sorbia. Nuôi cấy chúng phát triển
tốt nhất ở nhiệt độ 28- 30
o
C, sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp
7,1-7,2
Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Đặc điểm
A. hydrophila
Đặc điểm
A. hydrophila
Di động (<= 25°C)
+
Nitrate
+
Phát triển

Glucose

+
25°C
+
Sucrose
-
35°C

Ornithine
-
Catalase
+
Adonitol
-
Oxidase
+
Maltose
+
Voges-Proskauer
+
Urease
-
Indole
-
H
2
S
+
Salicin
+
Histidine & Arginine

+
Năm 1979, Lewis & Plumbcho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống
Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt
quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi
và cá tự nhiên.

6
Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu…Nguyên
nhân của bệnh là do vi khuẩn A. hydrophila gây ra (theo Bergey 1957, trích
dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005).
Năm 2006, Theo Bùi Quang Tề cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung
là da thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện
các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu
môn, mắt lồi đục. Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất
huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi đều
xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị
bệnh thường tách đàn treo râu.
2.4 Tổng quan về cây diệp hạ châu, cây cỏ mực, lá ổi và ứng dụng
2.4.1 Cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus)
Diệp hạ châu (tên khoa học
Phyllanthus amarus) còn có tên gọi
thông dụng là cây chó đẻ. Tên khác:
lão nha châu, diệp hòe thái, Prak phú
(tiếng Campuchia). Diệp hạ châu là
loại cây mọc hàng năm, cao thường
30cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng
đứng, thường có màu đỏ. Lá mọc so le,
lưỡng bộ trong như lá kép, phiến lá
thuôn, dài 5- 15mm, rộng 2- 5mm, đầu
nhọn hay hơi tù, mép nguyên thủy nhưng hơi có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới

màu xanh lơ, không cuống. Hoa mọc ở kẻ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, đơn tính, hoa
đực, hoa cái cùng gốc, đực ở đầu cành, cái ở dưới. Hoa không cuống hoặc có
cuống rất ngắn. Thành phần hóa học: chúng chứa chất Phyllanthin (C
24
H
34
O
6
),
Niranthin (C
24
H
32
O
7
), Nirtetralin (C
24
H
30
O
7
), Phyteralin (C
24
H
34
O
6
),
Hypophyllathin (C
24

H
30
O
7
). Đây là những chất có tính kháng vi sinh vật rất
cao (luanvan.net.vn).
Sản phẩm chiết xuất từ cây diệp hạ châu đã dược tiến hành sản xuất thử
nghiệm và đưa sản phẩm vào ứng dụng trong nuôi tôm sú, góp phần giảm
thiểu bệnh do virus đốm trắng gây ra, bảo vệ môi trường và nâng cao chất
lượng, sản lượng tôm nuôi phục vụ cho tiêu dùng trong nước và xuất khẩu
(viện nghiên cứu NTTS II). Sử dụng sản phẩm diệp hạ châu cho tôm sú trong
suốt chu kỳ nuôi có khả năng phòng được bệnh đốm trắng bằng cách cho tôm
ăn thức ăn có trộn chiết xuất từ diệp hạ châu với liều lượng 8 g/kg thức
ăn/ngày là hiệu quả nhất. Bởi khi được ăn thức ăn có trộn diệp hạ châu tôm có
Hình 2.3 Diệp hạ châu (nguồn:
dantri.com.vn)

7
Hình 2.4 Cỏ mực (nguồn:
nongnghiep.vn)
thể ức chế được sự nhân lên của virus đốm trắng trong cơ thể chúng. Các ao
nuôi có sử dụng diệp hạ châu đều có thể nuôi đến khi tôm được trên 4 tháng so
với các ao không sử dụng phải thu hoạch sớm hơn hoặc bị thiệt hại hoàn toàn
do bệnh đốm trắng. Ngay cả khi ao nuôi đã bị nhiễm bệnh đốm trắng nếu tôm
đã được cho ăn thức ăn có chiết xuất từ diệp hạ châu thì tỷ lệ tôm sống vẫn
khá cao và có thể kéo dài đến khi có thể thu hoạch được. Sản phẩm này không
ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, sản lượng tôm nuôi. Mặt khác khi sử dụng
sản phẩm diệp hạ châu liên tục trong 3 tháng thì chi phí nuôi tôm tăng không
đáng kể, trung bình tăng từ 500 đồng đến 1.000 đồng/kg tôm so với không sử
dụng. Vì vậy người nuôi tôm có thể tìm hiểu, sử dụng các sản phẩm dùng

trong nuôi tôm với chiết xuất từ diệp hạ châu để phòng bệnh đốm trắng cho
tôm nuôi nhằm hạn chế sự xuất hiện, lây lan dịch bệnh này. Đồng thời nâng
cao năng suất, sản lượng nuôi, đạt hiệu quả kinh tế cao.
2.4.2 Cây cỏ mực (Eclipta alba)
Cỏ mực (Rau mực) có tên khoa học là
Eclipta alba, thuộc họ cúc Asteraceae.
Tên đồng nghĩa là Eclipta prostrata.
Gọi là cỏ mực vì khi vò nát có nước
chảy ra như mực đen. Người ta còn gọi
nó là cây nhọ nồi, dể gây nhầm lẫn với
vị thuốc nhọ nồi lấy từ cây nồi chảo.
Tên chữ hán là hạ liên thảo (Cây có đài
quả như sen).
Cỏ mực sống một hay nhiều năm, mọc
đứng hay mọc bò, cao 30–40 cm, có thể
cao đến 80 cm. Thân màu lục hoặc đỏ tía, phình lên ở những mấu, có lông
cứng. Lá mọc đối, gần như không cuống, mép khía răng rất nhỏ, hai mặt lá có
lông dài 2-8 cm, rộng 5-12 mm. Hoa hình đầu, màu trắng, mọc ở kẽ lá hoặc
ngọn thân, lá bắc thon dài 5-6 mm cũng có lông, gồm hoa cái ở ngoài và hoa
lưỡng tính ở giữa (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Theo Christybapita et al., (2007). Tác dụng kích thích miễn dịch của
cây thuốc chiết xuất từ lá cỏ mực đã được nghiên cứu trong cá rô phi
(Oreochromis mossambicus). Với mục đích này, cá được cho ăn cho 1, 2 hoặc
3 tuần với chế độ ăn có chứa lá chiết xuất lá cỏ mực ở 0, 0,01, 0,1 và 1%. Sau
mỗi tuần, dịch thể không đặc hiệu (Lysozyme, antiprotease và chất bổ sung)
và hiệu ứng tế bào (Chứa myeloperoxidase, sản xuất oxy và nitơ) và khả năng
kháng bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila đã được xác định. Kết quả cho

8
thấy dung dịch nước chiết xuất từ lá cây cỏ mực có thể dùng làm thức ăn bổ

sung giúp tăng cường đáng kể hầu hết các thông số miễn dịch không đặc hiệu.
Trong số các phản ứng dịch thể không đặc hiệu, hoạt động lysozyme tăng lên
đáng kể sau khi ăn với dung dịch chiết xuất trong 1, 2 hoặc 3 tuần. Không có
sự thay đổi đáng kể phản ứng của tế bào sau 3 tuần cho ăn. Trong khi đó, có
sự tăng cường đáng kể oxy và myeloperoxidase sau 1 tuần cho ăn với dung
dịch chiết xuất. Khi gây cảm nhiểm với A. hydrophila sau 1, 2 hoặc 3 tuần cho
ăn, tỉ lệ cá chết giảm đáng kể. Với liều cao nhất 1% giúp bảo vệ tốt hơn so với
các liều khác với tỉ lệ sống tương đối (RPS) khoảng 64, 75 và 32 sau khi thức
ăn cho 1, 2 và 3 tuấn tương ứng. Kết quả cho thấy chế độ ăn kết hợp dung dịch
chiết xuất lá cỏ mực giúp cá tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và
khả năng kháng bệnh của O. mossambicus lại vi khuẩn A. hydrophila.
2.4.3 Cây ổi (Psidium guajava)
Vấn đề nghiêm trọng xuất hiện trong nuôi
trồng thủy sản là dịch bệnh, đặc biệt là
bệnh do vi khuẩn và virus gây ra chết
hàng loạt. Nhiều phương pháp trị liệu
được áp dụng cho việc trị bệnh do vi
khuẩn. Tuy nhiên sau khi sử dụng, chúng
ta phải đối mặt với một vấn đề khác là dư
luợng thuốc trong sản phẩm. Thảo dược
được xem là một cách khác cho việc điều
trị bệnh do vi khuẩn và vi rút trên động
vật thủy sản. Đây là sản phẩm tự nhiên và
rất an toàn cho người tiêu dung, có nhiều loại thảo dược còn được dùng như
một loại thực phẩm, trong đó có lá ổi. Theo y học cổ truyền Thái Lan, ổi còn
được dùng để điều trị bệnh tiêu chảy và các vết thương trầy xướt.
Tên khoa học của ổi là Psidium guajava L., trong dân gian còn gọi là phan
thạch lựu, thu quả, kê thỉ quả, phan nhẫm, bạt tử, lãm bạt, phan quỷ tử,…thuộc
họ Sim Myrtaceae, chi Psidium. Cây ổi cao chừng 3-5 m, cành nhỏ thì vuông
cạnh, lá mọc đối xứng, có cuốn ngắn hình bầu dục, nhẵn hay hơi có lông ở mặt

trên, mặt dưới có lông mịn, khi soi lên có thấy túi tinh dầu trong. Hoa màu
trắng mọc đơn độc ở kẽ lá. Quả nhiều hạt, hình thận, không đều (Đỗ Tất Lợi,
2006). Quả và lá đều chứa Sitosterol, Quereetin, Guaijaverin, Leucocyanidin
và Avicularin, lá còn có Volatile oil, Eugenol Theo dược học cổ truyền, lá ổi
vị đắng sáp, tính ấm, có công dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết.
Trong lá ổi có chứa 7-10% tanin, pyrogalic, axit psiditanic, khoảng 3% nhựa
và khoảng 0,36% tinh dầu chủ yếu là caryophyllene, β-bisabolene.
Hình 2.5 Lá ổi (nguồn: eva.vn)

9
Theo Direkbusarakom et al.,(1997). Chiết xuất ổi (Psidium guajava) đã được
xác định sử dụng MIC của các chiết xuất chống lại 24 chủng vi khuẩn gây
bệnh bao gồm: vi khuẩn Vibrio harveyi (9 chủng), V. splendidus (7 chủng), V.
parahaemolyticus (2 dòng) và 1 dòng của mỗi V. mimicus, V. vulnificus, V.
fluvialis, V. chorelae, V. alginolyticus và Aeromonas hydrophila.
2.4.4 Chiết xuất thảo dược
Thời gian thu hoạch thảo dược là lúc cây vừa ra hoa (Từ 1 - 6 tháng tùy vào
cách trồng và loại cây). Thảo dược được chiết tách bằng hệ thống Soxhlet cải
tiến (Nguyễn Thanh Tâm, 2011).
Tóm tắt quy trình: (1) cân khối lượng thảo dược cần chiết tách, (2) phối trộn
thảo dược và dung môi cồn 96
o
với tỉ lệ thảo dược: ethanol là 1:3, (3) cho hỗn
hợp vào hệ thống Soxhlet ly trích trong 3h, (4) thu hồi dung môi, loại bỏ cồn
đi bằng cách bay hơi trong 24h ở nhiệt độ 90
o
C, (5) thảo dược được thu ở dạng
cao và đem cân, (6) hòa tan cao thảo dược với nước theo tỉ lệ thảo dược: nước
là 1:3, (7) đóng chai dạng nén khí CO
2

để bảo quản.
2.4.5 Các nghiên cứu về thảo dược
Nghiên cứu nước ngoài
Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng
diệt khuẩn của tỏi. Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng
khuẩn của lá hồ đào với đối tượng Bacillus anthracis.
Năm 1944, nhà bác học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin
trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Thuốc kháng sinh này mạnh
bằng 1/5 thuốc penicillin, 1/10 tetracillin có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn,
xua đuổi và tiêu diệt nhiều loại sâu bọ ký sinh trùng và nấm độc.
Ở Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu trong qui mô phòng thí nghiệm với 3 loại
thảo mộc Ocimum sanctum (Os), Withania somniera (Ws) và Myristik
fragrans (Mf) có ảnh hưởng kháng lại loài vi khuẩn Vibrio harvey gây bệnh
trên cá mú (Epinephelus tauvina). Thí nghiệm được tiến hành với cá mú có
trọng lượng 30±0,5g, ba loại thảo mộc nêu trên được tách chiết trộn vào thức
ăn cho cá ăn với các nồng độ tăng dần (100, 200, 400 và 800mg/kg thức ăn).
Các lô thí nghiệm đối chứng cho thấy tỷ lệ cá chết lên đến 100%, các lô thí
nghiệm cho ăn với nồng độ 100, 200 đã giảm tỷ lệ chết 5%. Vậy bước đầu đã
có kết quả tốt trong việc sử dụng Os, Ws, Mf có tính kháng vi khuẩn Vibrio
harvey.
Năm 2004, tại Bangladesh, Muniruzzaman và Chowdhury nghiên cứu tác
dụng của chiết xuất 26 loại thảo dược với 3 vi khuẩn Aeromonas hydrophila,

10
Edwardsiella tarda và Pseudomonas fluoescens gây bệnh trên cá. Kết quả có
21 loài thảo dược (80,76%) có tác dụng với A. hydrophila, 24 loài thảo dược
(92,3%) có tác dụng với P.fluoescens tốt nhất và lá cây Bồng bồng (Calotropis
gigantea) diệt vi khuẩn E. tarda tốt nhất.
Một nghiên cứu khác cho thấy chất chiết từ lá ổi và quả ổi có tác dụng chống
lại các loài vi khuẩn Staphilococcus, Shigella, Salmonella, Pacilus, E. Coli,

Cloestridium và Pseudomonas. Năm 2004, Hasnabana đã nghiên cứu sử dụng
Azadirachta indik, Allium sativum và Poligonum hidropiper là 3 loại thảo mộc
dùng để kháng khuẩn.
Theo Zheng el al., (2009) chứng minh tinh dầu cây lá thơm oreogano
(Origanium heracleoticum) khi bổ sung vào thức ăn cho cá nheo bị nhiễm
A.hydrophila thì cá vẩn tăng trưởng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng
(p<0,005), chức năng gan và cơ quan nội tạng cũng được cải thiện, hoạt động
chống oxy hóa của cá cũng tăng cường.
Trung Quốc, người ta đã nghiên cứu hiệu quả của 2 loại thảo mộc (Astragalus
radix và Scutellavia radiis) lên tính miễn dịch không đặc hiệu của cá rô phi.
Kết quả cho thấy Astragalus radix cho ăn với nồng độ 0,1 và 0,5% trong thời
gian 3 tuần là nồng độ và thời điểm có hiệu quả tối ưu nhất. Riêng Scutellavia
radiis cần có thêm thí nghiệm để tìm ra nồng độ và thời gian cho ăn thích hợp.
Năm 2007 cũng tại Trung Quốc thêm một nghiên cứu khác về tính miễn dịch
của cá Chép, trộn lẫn một số loại thảo mộc với nhau như Astragalus
mempranaceus (phần rễ và thân), Poligonum multiflorum (phần rễ), Isatis
tinctoria (phần rễ), Glycyrrhida grabra (phần thân) cho cá Chép ăn 0,5% và
1% trong thời gian 30 ngày, kết quả cho thấy thảo dược giúp tính miễn dịch
của cá tăng lên đáng kể (2007).
Nghiên cứu trong nước
Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam – nguồn tài
nguyên sinh học quý giá – có trên 12.000 loài, trong số đó có tới hơn 3.200
loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong y học dân gian.
Đây là một lợi thế to lớn đối với ngành công nghiệp hóa dược nước ta. Tuy
nhiên, trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản việc nghiên cứu và sử dụng cây
thuốc nam và các hợp chất chiết xuất từ thảo dược còn rất mới. Do đó việc
nghiên cứu có hệ thống việc sử dụng cây thuốc, vị thuốc trong phòng trị bệnh
cho ĐVTS là rất cần thiết.
Ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu sử dụng chiết xuất thảo dược để
phòng bệnh nhiễm khuẩn ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thực

11
hiện. Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và ctv đã nghiên cứu thành công hai loại
thảo dược VTS1-C và VTS1-T phối chế từ các hoạt chất chiết tách từ tỏi
(Allium sativum) và sài đất (Weledia calendulacea) sử dụng phòng bệnh cho
tôm cá kết quả cho thấy chúng đều có tác dụng với 6 loại vi khuẩn: Vibrio
parahaemolyticus, V.harveyi, V.alginolyticus, Aeromonas hydrophila,
Edwardsiella tarda và Hafnia alvei gây bệnh ở nước lợ, ngọt, mặn.
Ở miền Bắc, Hà Ký (1995) đã nghiên cứu một số loại thảo dược điều trị bệnh
cho cá. Bước đầu đã chọn được 9 loại cây khác nhau: Rau nghề (Polygonum
hydropiper), rau sam (Portulaca oleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta),
cây cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendulacea), nhọ
nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium
indicum), cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong
phòng và trị bệnh cho động vật thủy sản.
Theo Đỗ Tất Lợi (1968), dịch chiết xuất từ cây bạch hoa xà có thể ngăn chặn
sự tăng trưởng của chủng E. coli và vi khuẩn Shigella với MIC: 0,64-10,24
ppm. Ngoài ra, khi chiết xuất cây bạch hoa xà bằng ethyl acetate, dịch chiết
thu được có tác dụng ức chế vi khuẩn Helicobacterpylori trong ống nghiệm
(Abdul và Rachender, 1995).
Theo Nguyễn Quang Linh (2010), lá trầu không được chiết xuất, tạo ra chế
phẩm sinh học với tên gọi Bokashi- trầu, có khả năng phòng trị một số bệnh
cho động vật thủy sản, an toàn sinh học và thân thiện với môi trường. nhằm
thay thế nhiều loại kháng sinh, chế phẩm lần đầu tiên được sản xuất trong
nước này được kết hợp từ các vi sinh vật hữu ích Em (Effective
microorganisms) với chất chiết xuất từ lá trầu ( có tên khoa học là Piper betle)
để phòng ngừa và trị bệnh cho một số loài động vật thủy sản. Chế phẩm này
có khả năng ức chế và tiêu diệt 2 loài vi khuẩn Vibrio Parahaemoliticus và
Aeromonas hydrophila, đây là 2 loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên động vật
thủy sản nước ngọt và nước lợ.

Nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2010) đã sử dụng 30 loại thảo dược thường
được dùng trong dân gian như: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), Bàng
(Terminalia catappa), Ổi (Psidium guajava), Từ bi (Pluchea indica),…để thử
hoạt tính kháng khuẩn trên 3 loại vi khuẩn E. ictaluri, E. tarda và Aeromonas
hydrophila cho thấy các cây thuốc này đều có khả năng kháng khuẩn
(MIC=16-2048 µg/ml). Hoạt phổ mạnh trên cả 3 loại vi khuẩn là Bàng, Ổi,
Trầu không, Tràm (MIC=64-512 µg/ml). Tác động mạnh nhất trên E. ictaluri
là Sâm đại hành (MIC=16 µg/ml), E. tarda là Rau mương (MIC=32 µg/ml),

12
Aeromonas hydrophila là Bàng (MIC=128 µg/ml). Năm 2011, Huỳnh Kim
Diệu sử dụng bột lá xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum) bổ sung vào
thức ăn của cá tra với liều 15g/kg thức ăn và cho cá ăn trong 1 tháng thì cá
tăng trọng hơn nghiệm thức đối chứng là 27%. Ở nghiệm thức cho ăn bổ sung
bột lá xuân hoa liều 20g/kg thức ăn thì tỉ lệ sống là 98,3% cao hơn so với lô
đối chứng (88,3%). Khi gây cảm nhiễm cá tra khỏe với vi khuẩn A. hydrophila
gây bệnh xuất huyết và vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan thì tỉ
lệ chết (11,67% và 15%) ở các nghiệm thức cho ăn thức ăn bổ sung bột lá
xuân hoa (Liều 20g/kg thức ăn) thấp hơn cá ở lô đối chứng (28,33% và
33,33%).
Chất chiết xuất từ cây Hoàng kỳ cũng được thử nghiệm bổ sung vào thức ăn
cho cá tra (20- 30g/con) để tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch của cá tra
(Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Yến Nhi, 2011). Cá tra khỏe (20-30g/con)
được cho thức ăn bổ sung 0,5% chiết chất Hoàng kỳ trong 5 tuần thì số lượng
hồng cầu, tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu
tăng so với cá ăn thức ăn không bổ sung chiết chất Hoàng kỳ. Sau khi gây cảm
nhiễm cá tra khỏe với vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết và vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri gây bệnh mũ gan thì số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu,
tế bào lympho, tiểu cầu ở các nghiệm thức đều giảm trong khi bạch cầu đơn
nhân, bạch cầu trung tính tăng. Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá cảm

nhiễm cao hơn cá khỏe, khả năng diệt khuẩn của huyết thanh của cá ăn thức ăn
bổ sung Hoàng kỳ cao hơn so với cá ăn thức ăn không bổ sung Hoàng kỳ.
2.5 Các chỉ tiêu huyết học
Máu là thành phần quan trọng trong hệ thống tuần hoàn của tất cả các cơ thể
sống, chịu trách nhiệm cung cấp oxy, thức ăn cho các mô khác của cơ thể và
loại bỏ dioxit carbon cũng như chất thải ra khỏi các mô (Trịnh Hồng Thái,
2002). Ở cá chiễm 5% trong lượng cơ thể (Robert, 1989). Thành phần các tế
bào máu của hệ tuần hoàn bao gồm tế bào hồng cầu, tế bào lympho, tế bào tiểu
cầu, các tế bào mono và các loại bạch cầu trung tính có hạt.
2.5.1 Hồng cầu
Tế bào hồng cầu trưởng thành của cá có hình tròn hoặc hình oval với nhân bắt
màu đậm và kích thước từ 10 x 13µm – 12 x 13µm. Đường kính nhân 4- 5µm.
Hồng cầu chưa trưởng thành ít được tìm thấy trong vòng tuần hoàn máu, kích
thước giống hồng cầu trưởng thành nhưng nhân lớn hơn. Tế bào chất bắt màu
xanh nhạt hoặc xam bởi thuốc nhuộm Wright và Giemsa (Chinabut el
al.,1991).

13
2.5.2 Bạch cầu
Tế bào bạch cầu được phân chia thành 2 nhóm: có hạt và không hạt, số lượng
giao động trong khoảng 10
3
-10
4
tế bào/mm
3
(Đoàn Nhật Phương, 2006). Bạch
cầu không giử chức năng trong sự tuần hoàn máu nhưng thông qua đó để di
chuyển đến các cơ quan của cơ thể. Bạch cầu là hàng rào sinh học giúp bảo vệ
cơ thể chống lại những yếu tố bên ngoài (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy

Liễu, 2008).
Bạch cầu không hạt
Tế bào lympho (Lymphocyte)
Tế bào lympho nhỏ hơn tế bào hồng cầu, tế bào hình tròn với đường kính 8-
10µm, chiếm số lượng lớn nhất trong các loại bạch cầu. Có 2 loại là lympho
bào T và lympho bào B. Tế bào T có thể tồn tại khoảng vài năm nhưng tế bào
B chỉ trong vài tháng. Tế bào lympho có vai trò quan trọng trong miễn dịch
đặc hiệu sau khi lien kết với các mô của cơ quan đích. Tế bào lympho bắt màu
tím đậm khi nhuộm Giemsa, tế bào chất nhỏ đôi khi không rỏ ràng và thường
bắt màu xanh (Chinabut el al., 1991).
Tiểu cầu (Thrombocyte)
Hình dạng tế bào tiểu cầu có thể là hình tròn, dài hoặc hình thoi, có một đường
viền mỏng của tế bào chất bao quanh nhân. Nhân lớn hơn nhân của tế bào
hồng cầu. tế bào chất bắt màu xanh nhạt khi nhuộm dung dịch Wright &
Giemsa. Tiểu cầu tham gia vao quá trình đông máu khi bị tổn thương
(Chinabut el al., 1991).
Bạch cầu đơn nhân (Monocyte)
Đây là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với đường kính 10- 14µm,
hình dạng không đều, tâm lệch, trong tế bào chất tồn tại những không bào có
nhiều kích thước khác nhau. Tế bào bạch cầu đơn nhân tồn tại vài ngày trong
vòng tuần hoàn máu, sau đó chuyển xuyên qua màng trong của mao mạch để
liên kết với các mô và thực hiện chức năng thực bào. Chúng thực bào, hủy diệt
những vật thể lạ (Vi khuẩn), những tế bào chết hay tế bào già cỗi (Hồng cầu)
và tham gia vào quá trình trình diện kháng nguyên (Chinabut el al., 1991).
Bạch cầu đa nhân có hạt
Bạch cầu trung tính ( Neutrophil)
Hình tròn hoặc oval, lớn hơn hồng cầu, đường kính 9-13µm. Trong tế chất có
hạt, nhân lệch, bạch cầu trung tính thành thục có từ 2- 3 nhân. Sự bắt màu của
các hạt trong tế bào chất tùy vào giai đoạn phát triển của tế bào. Bạch cầu

14
trung tính có khả năng ăn những tế bào nhỏ nên còn được gọi là tiểu thực bào.
Khi thực hiện chức năng thực bào xong thì nó cũng chết, lúc này nó trở thành
đối tượng thực bào của các đại thực bào, kết quả là xuất hiện mủ tại chổ viêm.
Chúng chỉ tồn tại trong máu khoảng 10 giờ rồi đi ống mạch tới mô (Hibiya,
1982).
Bạch cầu toan tính
Chiếm khoảng 4% tổng bạch cầu, hình tròn, đường kính 10- 14µm, có nhiều
trong mô. Chứa protein có tính chất kiềm và protein tải điện âm nên có thể bắt
màu acid như eosin. Chức năng là tiêu diệt ký sinh trùng, đời sống tương đối
ngắn (Thấp hơn 2 tuần) (Gartner và Hiatt, 1997).
Bạch cầu kiềm tính (basophil và tế bào mast)
Chiếm khoảng 1% tổng tế bào bạch cầu, hình tròn và có thể thay đổi hình
dạng khi di chuyển đến mô liên kết. Các hạt của bạch cầu kiềm tính bắt màu
xanh thẩm đến đen khi nhuộm với dung dịch Wright & Giemsa. Chúng có
chức năng tương tự tế bào mast là đáp ứng nhanh tại vị trí viêm (Gartner và
Hiatt, 1997).
2.5.3 Các nghiên cứu về các chỉ tiêu huyết học
Trên cá tra bị bệnh trắng gan thì tỷ lệ tế bào lympho giảm ở cá bệnh còn các tế
bào bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tăng lên. Các tế bào bạch cầu toan
tính và bạch cầu kiềm tính thì sai khác không đáng kể giữa cá bệnh trắng gan
và cá khoẻ (Trần Hồng Ửng, 2003). Cũng trên cá tra bị bệnh vàng da thì số
lượng tế bào hồng cầu của cá bệnh giảm đi một nửa so với cá khoẻ:
930±63x10
6
(tb/mm
3
) ở cá khỏe và 347±120x10
6
(tb/mm

3
) ở cá bệnh (Phan
Thị Hừng, 2004).
Ở cá rô phi có trọng lượng trung bình 21,432±2,38(g), khi cá bị nhiễm vi
khuẩn Edwardsiella tarda thì lượng hồng cầu giảm: 2,24±2,38x10
6
(tb/mm
3
)
ở cá khoẻ và 1,74±1,78x10
6
(tb/mm
3
) ở cá bệnh. Trong khi đó, tổng bạch cầu
thì tăng lên: 12±0,82x10
3
(tb/mm
3
) ở cá khoẻ và 21,75±2,82x10
3
(tb/mm
3
) ở
cá bệnh còn tiểu cầu là 4,28±0,60x10
3
(tb/mm
3
) (Benli và Yildiz, 2004). Trên
cá rô phi lai với trọng lượng trung bình 240g thì có một số chỉ tiêu huyết học
như sau: hồng cầu từ 1,91x10

6
– 2,83x10
6
(tb/mm
3
), tổng bạch cầu từ 2,16x10
4

– 1,55x10
5
(tb/mm
3
), tế bào lympho từ 9,63x10
3
– 1,68x10
5
(tb/mm
3
), bạch cầu
trung tính từ 5,57x10
2
-9,87x10
3
(tb/mm
3
), bạch cầu đơn nhân từ 4,00x10
2
–
4,29x10
3

(tb/mm
3
) và tiểu cầu từ 2,51x10
4
– 8,52x10
4
(tb/mm
3
) (Hrubec et.al,
2004).

15
Trên cá trê lai (Heterobranchus longifillix x Clarias gariepinus) ở giai đoạn
nhỏ thì có lượng hồng cầu là 1,43x10
6
(tb/mm
3
) và có tổng bạch cầu là
20,42x10
3
(tb/mm
3
) (Osuigue et.al, 2005). Trên cá trê (Clarias gariepenius)
nhỏ, có mật độ hồng cầu là 3,8±0,18x10
6
(tb/mm
3
) và tổng bạch cầu là
9,2±0,2x10
3

(tb/mm
3
) (Omitoyin, 2006). Ở cá trê phi (Clarias gariepenius) có
trọng lượng trung bình 75,33±3g có mật độ hồng cầu là 299,5±2,50x10
6

(tb/mm
3
) và tổng bạch cầu là 39,0±1,00x10
3
(tb/mm
3
) (Sunmonu và Oloyede,
2008).

16
Chương III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian
Đề tài được tiến hành thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 12/2013.
3.1.2 Địa điểm thực hiện
Phòng thí nghiệm và trại thực nghiệm của Bộ môn Bệnh Học Thủy Sản- Khoa
Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Chất chiết xuất: Đề tài được thực hiện trên ba loại thảo được (Diệp hạ châu,
cỏ mực và lá ổi) được trồng tại Vườn thuốc Nam - Khoa Dược Điều Dưỡng -
Đại học Tây Đô.
Chủng vi khuẩn: Chủng Aeromonas hydrophila có LD
50
là 10
3
CFU/ml từ đề
tài cấp Tỉnh Hậu Giang về bệnh trên cá thát lát còm (Chitala chitala) và giải

pháp phòng trị bệnh.
Cá thí nghiệm: Cá thát lát còm được thu mua từ các trại sản xuất giống ở Hậu
Giang với kích cỡ cá giống từ 10-12 cm.
Dụng cụ: Lọ thủy tinh 100ml, 250ml và 500ml, đĩa petri thủy tinh, ống
nghiệm, pipet, đầu col 1ml và 5ml, que tán vi khuẩn, bộ dụng cụ giải phẩu,
vợt, giấy lọc Whatman dày
Thiết bị: Máy quang phổ đo mật độ vi khuẩn, kính hiển vi, buồng đếm hồng
cầu, tủ ấm 28
o
C, tủ lạnh 4
o
C, nồi Autoclave, tủ cấy vô trùng, máy lắc vi
khuẩn, máy ly tâm, máy trộn mẩu (Vortex), bể composite 500 lít, 250 lít và xô
nhựa, máy sục khí, ống sủi khí, đá bọt và các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho
nghiên cứu
Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Cồn 96
o
, Methanol, dung dịch
Giemsa, dung dịch Wright, dung dịch Natt-Herrick, Chlorine, TSA (Tryptic
Soy Agar), NA (Nutrient Agar), BHI-B (Brain heart infusion broth).


17
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
Phục hồi vi khuẩn: Vi khuẩn được lấy ra từ tủ âm 80
o
C, và được phục hồi trên
môi trường TSA ở 28°C. Sau 24 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc,
nhuộm Gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn.

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: Sau khi có được vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt
trùng lấy khoảng 1-2 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30 mL BHI-B đã
tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá
Quan sát bên ngoài: Đặt cá lên khay nhựa và quan sát các dấu hiệu bên ngoài
như: màu sắc, vây, mang, hậu môn, vẩy, Ghi nhận các dấu hiệu của cá trước
khi mổ.
Quan sát bên trong: Trước khi mổ cá phải xịt cồn 70
o
để xát trùng cá, quan sát
kĩ mặt ngoài của gan, thận, tỳ tạng để sát định dấu hiệu bệnh của cá.
3.3.3 Định danh vi khuẩn
Vi khuẩn được định danh dựa theo tài liệu của Buller (2004) và cẩm nang
Cowan and Steel’s (1993). Các chủng vi khuẩn sau khi được tách ròng, kiểm
tra các đặc điểm về hình thái, sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng cách
test các chỉ tiêu cơ bản (Primary test) như: nhuộm Gram, phản ứng Catalase,
Oxidase, phản ứng O/F (Phụ lục 1).
3.3.4 Kiểm tra tính nhạy của thảo dược (Lá ổi, cỏ mực, diệp hạ châu) trên
vi khuẩn Aeromonas hydrophila.
Kiểm tra tính nhạy của thảo dược thực hiện bằng hai phương pháp như sau:
Phương pháp1: Khuếch tán trên đĩa thạch
Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở nhiệt độ
28
o
C. Sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra
tính thuần của vi khuẩn. Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi
khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã
tiệt trùng. Trộn và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước
sóng 610 nm với giá trị OD = 1±0,1 tương ứng với mật độ vi khuẩn là 10

9
CFU/mL. Sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến nồng độ là
10
5
CFU/ml.