đánh giá sự di truyền tính thơm ở đậu nành rau bằng chỉ thị phân tử dna

NGUYỄN PHONG PHÚ

Cần Thơ - 2013
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỀN GIỐNG NÔNG NGHIỆP
………  ………


ĐÁNH GIÁ SỰ DI TRUYỀN TÍNH THƠM
Ở ĐẬU NÀNH RAU BẰNG CHỈ THỊ
PHÂN TỬ DNA

LUẬN VĂN KỸ SƢ KHOA HỌC CÂY TRỒNG
Chuyên Ngành: Công Nghệ Giống Cây Trồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

………  ………
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

ĐÁNH GIÁ SỰ DI TRUYỀN TÍNH THƠM
Ở ĐẬU NÀNH RAU BẰNG CHỈ THỊ
PHÂN TỬ DNA


Cán bộ hƣớng dẫn:

TS. NGUYỄN LỘC HIỀN
TS. HUỲNH KỲ

Sinh viên thực hiện:
NGUYỄN PHONG PHÚ
MSSV: 3103357

Cần thơ - 2013

i
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỀN GIỐNG NÔNG NGHIỆP

Luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ ngành Khoa Học Cây Trồng – Chuyên ngành Công
Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài:






ĐÁNH GIÁ SỰ DI TRUYỀN TÍNH THƠM Ở ĐẬU NÀNH
RAU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA



Do sinh viên Nguyễn Phong Phú thực hiện.
Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…. tháng …. năm 2013
Cán bộ hƣớng dẫn





Ts. Nguyễn Lộc Hiền










ii
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỀN GIỐNG NÔNG NGHIỆP

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ ngành
Khoa Học Cây Trồng – Chuyên ngành Công Nghệ Giống Cây Trồng với đề tài:

ĐÁNH GIÁ SỰ DI TRUYỀN TÍNH THƠM Ở ĐẬU NÀNH
RAU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA


Do sinh viên Nguyễn Phong Phú thực hiện và báo cáo trƣớc Hội đồng.
Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:



Luận văn tốt nghiệp đƣợc đánh giá ở mức:


Cần Thơ, ngày tháng năm
Hội đồng





DUYỆT KHOA
Trƣởng Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

iii
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong
bất kỳ công trình luận văn nào trƣớc đây.




Tác giả luận văn




Nguyễn Phong Phú

iv
LỜI CẢM TẠ


Đề tài luận văn tốt nghiệp này hoàn thành là do sự hƣớng dẫn giúp đỡ của
quý thầy cô và bạn bè. Em chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Thầy Nguyễn Lộc Hiền, thầy Huỳnh Kỳ đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ và
tạo mọi đều kiện để em có thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp cũng nhƣ đã dạy
dỗ em trong những năm đại học vừa qua.
Quý thầy cô Bộ môn Di truyền Giống Nông Nghiệp, cô chú trại thực nghiệm
đã giúp đỡ em trong khoảng thời gian em làm luận văn.

Thầy cố vấn học tập Huỳnh Kỳ và quý thầy, cô trƣờng Đại Học Cần Thơ đã
tận tình truyền đạt kiến thức, hƣớng dẫn em trong quá trình học tập tại trƣờng.
Em xin cảm ơn đến anh Nguyễn Quốc Chí ở phòng thí nghiệm Di truyền
giống cây trồng – Khoa Nông Nghiệp và SHƢD.
Xin cám ơn các bạn cũng nhóm làm luận văn tốt nghiệp, các bạn lớp Công
Nghệ Giống Cây Trồng K36 và tất cả các bạn của lớp em đã nhiệt tình giúp đỡ,
động viên em trong thời gian qua.

v
TIỂU SỬ CÁ NHÂN

1. TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: Nguyễn Phong Phú Giới tính: Nam
Ngày, tháng, năm sinh: 04/07/1992 Dân tộc: Kinh
Nơi sinh: ấp Bình Thới, xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang.
Họ tên cha: Nguyễn Phát Thanh
Họ tên mẹ: Nguyễn Thị Kim Tuyến
Quê quán: ấp Bình Thới, xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang.
Điện thoại: 0977025101
Email:

2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP:

-Thời tiểu học:
Thời gian đào tạo: 1998-2003
Trƣờng: Tiểu học Bình Thủy
Địa chỉ: ấp Bình Thới, xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
-Thời trung học cơ sở:

Thời gian đào tạo: 2003-2007
Trƣờng: Trung học cơ sở Bình Mỹ
Địa chỉ: xã Bình Mỹ, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
-Thời trung học phổ thông:
Thời gian đào tạo: 2007-2010
Trƣờng: Trung học phổ thông Bình Mỹ
Địa chỉ: xã Bình Mỹ, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
-Thời đại học:
Thời gian đào tạo: 2010-2014
Trƣờng: Đại Học Cần Thơ


















Ngày…tháng…năm 2013
Ngƣời khai

Nguyễn Phong Phú

vi
Nguyễn Phong Phú, 2013. “Đánh giá sự di truyền tính thơm ở đậu nành rau
bằng chỉ thị phân tử DNA”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ ngành Công Nghệ Giống
Cây Trồng, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ.
Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Lộc Hiền.


TÓM LƢỢC

Đậu nành rau là (Glycine max L.) là một trong những cây trồng bổ dƣỡng và
có giá trị kinh tế cao đƣợc trồng tại các nƣớc phía Nam và Đông Nam Á và ngày
càng phát triển ở Tây bán cầu. Hiện nay loại đậu này đƣợc ƣa chuộng hơn bởi có
nhiều giống mang mùi thơm đặc biệt. Chính hƣơng thơm này đóng vai trò quan
trọng giá trị của các sản phẩm do sở thích của ngƣời tiêu dùng chuộng loại đậu nành
có mùi thơm.
Để làm cơ sở cho công tác lai tạo và thanh lọc những giống mang đặc tính
thơm làm tăng chất lƣợng hạt đậu nành, từ đó làm tăng giá trị kinh tế cho ngƣời
trồng, những nghiên cứu về giống và sự thích nghi của chúng là bƣớc đầu tiên phải
tiến hành. Vì vậy, nghiên cứu “Đánh giá sự di truyền tính thơm ở đậu nành rau
bằng chỉ thị phân tử DNA” đã đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá sự đa dạng
di truyền và quy luật di truyền của tính trạng thơm ở 20 quần thể F2 của 4 tổ hợp lai
qua đó sẽ tuyển chọn đƣợc các cá thể vừa mang kiểu gen thơm vừa có những đặc
tính thích nghi với điều kiện môi trƣờng ở ĐBSCL.
Tổng cộng có 252 cá thể của 20 quần thể đậu nành thế hệ F2 ở 4 tổ hợp lai 4,
5, 13 và 14 đƣợc tạo ra từ hai nhóm đậu nành (đậu nành rau Nhật Bản mang gen
thơm và đậu nành không thơm). Kết quả đánh giá đƣợc sự đa dạng di truyền về tính
trạng thơm đậu nành và cho thấy tính trạng thơm do gen đơn lặn kiểm soát nhờ sử
dụng 2 cặp primer KAORI-Normal-U/ KAORI-L (nhận diện gen không thơm) và

KAORI-Chamame-U/ KAORI-L (nhận diện gen thơm).




















vii
MỤC LỤC


Đề mục Trang

Lời cam đoan iii
Lời cảm tạ iv
Tiểu sử cá nhân v

Tóm lƣợt vi
Mục lục vii
Danh sách hình ix
Danh sách bảng xi
Danh sách từ viết tắt xii
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. LƢỢT KHẢO TÀI LIỆU 2
1.1 CÂY ĐẬU NÀNH 2
1.1.1 Lịch sử cây đậu nành 2
1.1.2 Giới thiệu cây đậu nành 2
1.2 GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ DINH DƢỠNG CÂY
ĐẬU NÀNH RAU 2
1.2.1 Giá trị kinh tế 2
1.2.2 Giá trị dinh dƣỡng 3
1.3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CÂY ĐẬU NÀNH RAU 5
1.3.1 Tình hình sản xuất đậu nành rau trên thế giới 5
1.3.2 Tình hình sản xuất đậu nành rau ở Việt Nam 5
1.4 TÍNH THƠM Ở ĐẬU NÀNH RAU 6
1.5 PHƢƠNG PHÁP NHẬN DIỆN CHUYÊN BIỆT CHO TÍNH THƠM Ở
ĐẬU NÀNH 8
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 9
2.1 PHƢƠNG TIỆN 9
2.1.1 Vật liệu 9
2.1.2 Thời gian thực hiện đề tài 9
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất để sử dụng 10
2.1.3.1 Thiết bị và dụng cụ 10
2.1.3.2 Hóa chất 10
2.2 PHƢƠNG PHÁP 10
2.2.1 Ly trích DNA 10
2.2.2 Thiết kế primer 11

2.2.3 Phản ứng PCR 11
2.2.4 Điện di sản phẩm PCR 11
2.2.5 Kiểm định chi bình phƣơng cho sự phân ly kiểu gen 12
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 13
3.1 KẾT QUẢ LY TRÍCH DNA 13
3.2 NHẬN DIỆN KIỂU GEN THƠM Ở ĐẬU NÀNH 14



viii
3.2.1 Kết quả nhận diện gen thơm ở tổ hợp lai số 4 bằng chỉ thị
phân tử DNA 14
3.2.2 Kết quả nhận diện gen thơm ở tổ hợp lai số 5 bằng chỉ thị
phân tử DNA 17
3.2.3 Kết quả nhận diện gen thơm ở tổ hợp lai số 13 bằng chỉ thị
phân tử DNA 22
3.2.4 Kết quả nhận diện gen thơm ở tổ hợp lai số 14 bằng chỉ thị
phân tử DNA 26
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

ix
DANH SÁCH HÌNH



Tên hình Tựa Trang

Hình 1.1 Phổ điện di nhận diện tính thơm ở đậu nành rau 8

Hình 2.1 Sơ đồ minh họa chu kỳ phản ứng PCR 12

Hình 3.1 Phổ điện di kiểm tra DNA ở các cá thể lai F2 (dòng 5-8) 13

Hình 3.3 Phổ điện di của tổ hợp lai số 4 – dòng 4-2 (giếng 1-12) 14

Hình 3.4 Phổ điện di của tổ hợp lai số 4 – dòng 4-2 (giếng 1,2) và
dòng 4-3 (giếng 3-12) 15

Hình 3.5 Phổ điện di của tổ hợp lai số 4 – dòng 4-3 (giếng 1-8) và
dòng 4-4 (giếng 9-12) 15

Hình 3.6 Phổ điện di của tổ hợp lai số 4 – dòng 4-4 (giếng 1-10) 16

Hình 3.7 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 5-2 18

Hình 3.8 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 5-3 18

Hình 3.9 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 5-4 19

Hình 3.10 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 5-5 19

Hình 3.11 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 5-6 20

Hình 3.12 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 5-7 20

Hình 3.13 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 5-8 21

Hình 3.14 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 13-1 23

Hình 3.15 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 13-2 23

Hình 3.16 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 13-3 24

Hình 3.17 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 13-4 24

Hình 3.18 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 14-2 26


x
Hình 3.19 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 14-3 27

Hình 3.20 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 14-4 27

Hình 3.21 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 14-5 28

Hình 3.22 Phổ điện di của cá thể F2 thuộc dòng 14-6 28

xi
DANH SÁCH BẢNG


Tên bảng Tựa Trang

Bảng 1.1 Giá trị dinh dƣỡng đậu nành ở Nhật Bản so với các loại thực phẩm khác
(Masuda, 1991) 4

Bảng 2.1 Danh sách 4 giống đậu nành rau Nhật Bản 9

Bảng 2.2 Danh sách 4 tổ hợp lai đƣợc sử dụng 9

Bảng 3.1 Tỷ lệ phân ly kiểu gen ở từng dòng của tổ hợp lai số 4 thế hệ F2 16

Bảng 3.2 Kiểm định chi bình phƣơng χ2 cho sự phân ly kiểu gen
của tổ hợp lai số 4 17

Bảng 3.3 Tỷ lệ phân ly kiểu gen ở từng dòng của tổ hợp lai số 5 thế hệ F2 21

Bảng 3.4 Kiểm định chi bình phƣơng χ2 cho sự phân ly kiểu gen
của tổ hợp lai số 5 22

Bảng 3.5 Tỷ lệ phân ly kiểu gen ở từng dòng của tổ hợp lai số 13 thế hệ F2 25

Bảng 3.6 Kiểm định chi bình phƣơng χ2 cho sự phân ly kiểu gen
của tổ hợp lai số 13 25

Bảng 3.7 Tỷ lệ phân ly kiểu gen ở từng dòng của tổ hợp lai số 14 thế hệ F2 29

Bảng 3.8 Kiểm định chi bình phƣơng χ
2
cho sự phân ly kiểu gen
của tổ hợp lai số 14 29

















xii
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

AVRDC Asian Vegetable Research and Development Center
bp Base pairs
CTAB Cetyltrimenthylammonium bromide
ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates
EDTA Ethylen Dianmin Tetraacetic Acid
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic acid
SHƢD Sinh Học Ứng Dụng
SNP Single nucleotide polymorphism
TAE Tris Acetate EDTA
TE Tris EDTA

1

MỞ ĐẦU
Đậu nành là một loại hoa màu rất quan trọng vì có giá trị dinh dưỡng cao, là
nguyên liệu cho nhiều loại thực phẩm chế biến. Trước đây, chúng ta chỉ biết đến
đậu nành như một loại cây rau màu hay cây công nghiệp ngắn ngày, được ứng dụng
để làm một số thực phẩm như: nước tương, đậu hủ, chao hay được chế biến để làm
sữa đậu nành. Ngày nay, người ta còn biết đến một loại đậu nành ăn hạt lúc còn
xanh đó là đậu nành rau.
Đậu nành thơm (hay còn gọi là “Chamame”), là một nhóm đậu nành rau
chứa chất có mùi thơm giống như chất tạo nên tính thơm của gạo như Jasmine và

Basmati (Fushimi and Masuda 2001), có mùi thơm tương tự như mùi bắp nổ
(Adams and DeKimpe 2006). Tính thơm này liên quan đến sự có mặt của chất 2-
acetyl-1-pyrroline (2AP) (Arikit et al., 2010; Fushimi và Masuda 2001; Plonjarean
et al., 2007; Wu et al., 2009).
Tính trạng thơm trên cây trồng nói chung, cây đậu nành thơm nói riêng là
một trong những tính trạng khó đánh giá quy luật di truyền đối với các nhà chọn
giống cây trồng (Bradbury et al., 2005) và đã có nhiều chương trình chọn giống
khảo sát tính thơm trên gạo hay cơm (Wanchana et al., 2005). Tương tự như lúa, ở
đậu nành, khảo sát tính thơm đã được nghiên cứu như đánh giá cảm quan hay lượng
hóa bằng phân tích sắc ký (AVRDC 2003). Tuy nhiên có nhiều giới hạn trong các
phương pháp này như khi thực hiện trên số lượng mẫu lớn.
Vì vậy đề tài “Đánh giá sự di truyền tính thơm ở đậu nành rau bằng chỉ
thị phân tử DNA” được thực hiện với mục tiêu đánh giá quy luật di truyền của tính
trạng thơm ở quần thể F2 bằng chỉ thị phân tử DNA với cặp primer KAORI-
Normal-U/ KAORI-L (nhận diện gen không thơm) và KAORI-Chamame/ KAORI-
L (nhận diện gen thơm) nhằm làm cơ sở cho công tác lai tạo, thanh lọc những giống
mang đặc tính thơm, làm tăng chất lượng hạt đậu nành từ đó làm tăng giá trị kinh tế
cho người trồng.

2
CHƢƠNG 1

LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU NÀNH

1.1.1 Lịch sử cây đậu nành

Đậu nành Glycine max (L.) Merrill, là một trong những loài cây được trồng
từ lâu đời, vì vậy mà nguồn gốc cây đậu nành sớm được xác minh. Theo Sinclair và
Backman (1989), bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng
đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc và sớm đưa vào Châu Âu trong thế kỷ XVII.
Tại Việt Nam, cây đậu nành cũng được biết từ rất sớm, từ thời vua Hùng ông cha ta
đã trồng và sử dụng loại đậu này. Đồng thời, Việt Nam cũng được xem là một
trong những trung tâm khởi nguyên của đậu nành (Ngô Thế Dân và ctv., 1999).

1.1.2 Giới thiệu cây đậu nành rau

Đậu nành rau (vegetable soybean) có tên khoa học là Glycine max (L.)
Merrill, thuộc họ đậu (Fabaceae), là một cây họ đậu thân thảo hằng năm, có dạng
cây bán đứng. Là loại đậu nành được thu hoạch khi trái vẫn còn màu xanh, hạt lấp
đầy 80-90% chiều rộng vỏ. Nó khác đậu nành bình thường là hạt lớn hơn và với
hương vị hơi ngọt (Horri, 1997). Với đặc tính sinh trưởng hữu hạn, có khả năng
chịu nhiệt, chất lượng tốt, trồng được cả 3 vụ/năm (xuân, hè, đông) cho năng suất

ổn định trên các vùng sinh thái từ Bắc vào Nam, dễ để giống, giống từ vụ trước có
thể chuyển sang vụ sau không phải lưu kho lạnh, tạo điều kiện mở rộng diện tích
trên quy mô lớn, đặc biệt diện tích đậu nành vụ đông (vụ III) sau lúa mùa (Mai
Quang Vinh, 2007). Đậu nành rau có hạt to được thu hoạch khi trái vẫn còn xanh,
lúc hạt đạt kích thước tối đa nhưng chưa chuyển sang vàng và đã chín khoảng 80%
(Shanmugasundaram et al, 1996).

1.2 GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ DINH DƢỠNG CÂY ĐẬU NÀNH RAU

1.2.1 Giá trị kinh tế

Ở khu vực Đông Nam Á việc sử dụng đậu nành rau còn tươi là rất phổ biến,
tuy nhiên ở trạng thái khô thì loại đậu nành này cũng có thể dùng để làm đậu phụ và
các soyfood khác, cũng có thể sử dụng như một nguồn dầu phong phú, các sản
phẩm công nghiệp hoặc thức ăn gia súc. Đậu nành rau được tiêu thụ sớm nhất tại
Hoa Kỳ và phương Tây vào năm 1855. Năm 1914, nó được trồng và bán thương
mại ở Pháp (Shurtleff and Aoyagi, 2007).
Đậu nành rau sớm được sử dụng phổ biến tại Mỹ và Nhật Bản nên hằng năm
nhiều quốc gia như Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan thu được khoảng lợi nhuận lớn
từ nguồn lợi này. Đậu nành rau đông lạnh nhập khẩu từ Đài Loan và Trung Quốc
vào Mỹ tăng từ 300 đến 500 tấn/năm vào những năm 1980 và đạt 10.000 tấn vào
năm 2000 (Lin, 2001). Giá trị đậu nành rau tại thi trường Nhật Bản, Hoa Kỳ, Hàn

3
Quốc biến động từ 2 đến 4 USD/kg và giá trị thu nhập từ đậu nành rau là 20.000
đến 40.000 USD/ha/vụ, cao gấp 4 đến 8 lần so với đậu nành thường (đậu nành
thường năng suất 2 tấn/ha, tính giá 250 USD/tấn) (Tomas, 2001).

1.2.2 Giá trị dinh dƣỡng

Đậu nành rau là một trong số những cây trồng có giá trị dinh dưỡng cao và
được coi là loại thực phẩm rau an toàn, được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới.
Dinh dưỡng trong hạt đậu tương rau rất cao ở cả 2 dạng, hạt non và hạt khô. Hàm
lượng dinh dưỡng trong 100g hạt non được trình bài ở (bảng 1.1).
Đồng thời, trong hạt khô có hơn 40% protein, khoảng 20% lipid (không
cholesterol), 33%, Carbohydrate 6% chất sơ và 5% tro tính trên một đơn vị khối
lượng hạt khô (Shamugasundaram, 1996).
Đậu nành rau là nguồn cung cấp tốt các loại protein, chất xơ, vitamin,
khoáng chất (Song và ctv 2003). Hạt đậu nành tươi có hàm lượng protein từ 35%
đến 38% trọng lượng khô và 5% đến 7% lipitd theo trọng lượng tươi, nguồn cung
cấp tự nhiên isoflavon (78 - 220 µg/g hạt khô) và tocopherols (vitamin E) khoảng
84 đến 128 µg/g hạt khô (Mohamed và ctv, 2001).
Những phân tích về dinh dưỡng trong hạt đậu nành trong hạt đậu nành ở
Colorado, Mỹ (Johnson và ctv.1999) và Nhật (Masuda, 1991) cho thấy hàm lượng
dinh dưỡng cao hơn rất nhiều so với đậu Hà Lan. Giá trị năng lượng cao hơn gấp 6
lần, lượng canxi cao hơn 60% và hàm lượng photpho, kali nhiều hơn gấp 2 lần.
Hàm lượng natri và carotene của đậu nành rau bằng 1/3 của đậu Hà Lan và hàm
lượng của sắt, vitamin B1, B2 thì như nhau. Đậu nành rau giàu acid ascorbic nhưng
thấp về niacin (Masuda, 1991).
Có nhiều giống đậu nành rau có mùi thơm đặc trưng như: Takihime,
Funasari chamme, Fukunari, Yuagari musume và Natsunokoe (Nguyễn Lộc Hiền và
ctv, 2012).

4
Bảng 1.1: Giá trị dinh dƣỡng đậu nành ở Nhật Bản so với các loại thực phẩm khác (Masuda,
1991)

Thành Phần Đậu nành Nattou Đậu Phụ Đậu Hà Đậu Hà lan
Rau (momen tofo) Lan (Pea) non
(Green pea)

Năng lượng (Kcal/100g) 582 200 77 30 96

Nước (g/100g) 71,1 59,5 86,8 90,3 75,7

Protein (g/100g) 11,4 16,5 6,8 2,9 7,3

Lipid (g/100g) 6,6 10 5 0,1 0,2

Carbohydrate (không 7,4 9,8 0,8 5,4 13
phải dạng sợ) (g/100g)

Xơ (g/100g) 1,9 2,3 0 0,8 2,9

Tro (g/100g) 1,6 1,9 0,6 0,5 0,9

Canxi (mg/100g) 7,0 90 120 55 28

Photpho (mg/100g) 140 190 85 60 70

Săt (mg/100g) 1,7 3,3 1,4 0,8 1,9

Natri (mg/100g) 1 2 3 1 3

Kali (mg/100g) 140 660 85 60 70

Caroten (mg/100g) 100 0 0 620 360

Vitamin B1 (mg/100g) 0,27 0,07 0,07 0,12 0,25

Vitamin B2 (mg/100g) 0,14 0,56 0,03 0,1 0,12

Niacin (mg/100g) 1 1,1 1 0,6 1,9

Acid ascorbic (mg/100g) 27 0 0 34 18

5
1.3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CÂY ĐẬU NÀNH RAU

1.3.1 Tình hình sản xuất đậu nành rau trên thế giới.

Cây đậu nành rau có nguồn gốc rất lâu đời và được trồng chủ yếu ở Nhật
Bản, Trung Quốc và các nước Châu Á. Đậu nành rau được trồng trên khắp Nhật
Bản nhưng tập trung chủ yếu ở Tokyo và các quận có chung biên giới phía Bắc với
nó. Theo thống kê của chính phủ Nhật Bản, diện tích trồng đậu nành rau 1946 là
7.000 hecta với sản lượng là 30.000 tấn. Năng suất cao nhất vào năm 1969 là 10
tấn/ha. Vào năm 1982, diện tích và sản lượng đạt mức cao nhất 14.000 ha với
122.000 tấn (Lumpkin và Konovsky, 1991).
Trên thế giới, năm 2010, diện tích đậu nành rau chiếm 102,4 triệu ha, năng
suất bình quân 2,58 tấn/ha, sản lượng đạt 264,9 triệu tấn, tăng 9 triệu ha và 46,6
triệu tấn so với năm 2005. Đây là một trong những cây trồng mang tính chiến lược
đối với những quốc gia có điều kiện phát triển vì có giá trị trao đổi rất cao trên thị
trường do nhu cầu sử dụng protein, dầu thực vật, thực phẩm chức năng và nguyên
liệu thức ăn chăn nuôi gia súc ngày càng gia tăng. Diện tích đậu nành trên thế giới,
tập trung chủ yếu ở Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Argentina và Ấn Độ, trong đó nước
Mỹ thường chiếm 1/3 diện tích đậu nành rau hằng năm (31 triệu ha). Trong khu vực
châu Á, diện tích đậu nành Việt Nam đang được tăng dần, đã vượt qua Myanmar và
đang đứng thứ 4 sau các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên (Faostat, 2012).
Năng suất và hàm lượng protein là chỉ tiêu phản ánh tiến bộ nghiên cứu về
đậu nành trên thế giới. Dự báo diện tích trồng đậu nành trên thế giới có thể tăng
nhiều vào cuối thập kỷ này do chính sách quản lý và thương mại của các quốc gia,
đặc biệt trong hoàn cảnh ngày càng có nhiều quốc gia sử dụng các giống được cải
tiến thông qua chỉ thị phân tử, biến đổi gen. Năm 2011, diện tích cây trồng ứng
dụng công nghệ sinh học trên toàn cầu đạt 140 triệu ha, trong đó đậu nành chiếm

gần 60%, tập trung ở các nước Mỹ, Achentina, Braxin, Canada, Ấn Độ, Trung
Quốc, Paraguay, Nam Phi, Uruguay (Clive James, 2011).

1.3.2 Tình hình sản xuất đậu nành rau ở Việt Nam.

Ở ĐBSCL, cây đậu nành rau được gieo trồng trước năm 1990, chủ yếu là để
xuất khẩu cho một số công ty nước ngoài, các công ty này cung cấp giống và bao
tiêu toàn bộ sản phẩm. Nhưng từ khoảng 1995, nông dân không còn trồng và xuất
khẩu như trước nửa, diện tích trồng đậu nành rau giảm nhiều so với lúc trước và chủ
yếu trồng nhỏ lẻ chưa được thống kê cụ thể. Diện tích đậu nành rau hiện nay tập
trung chủ yếu ở 2 tỉnh Đồng Tháp và An Giang, các tỉnh khác như Cần Thơ, Vĩnh
Long, Hậu Giang, cũng có sản xuất nhưng không đáng kể. Theo thống kê sơ bộ năm
2011, toàn vùng ĐBSCL có 2,7 ngàn ha, năng suất 2,07 tấn/ha, sản lượng 5,5 ngàn
tấn, so với năm 2005, diện tích giảm hơn 11 ngàn ha, sản lượng giảm gần 28 ngàn
tấn (Niên giám thống kê, 2012). Đậu nành ở (1) Viện Khoa học Kỹ thuật Nông
nghiệp Miền Nam (2) Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long trồng được 2 vụ trong
năm, Đông Xuân và Xuân Hè, trong đó Xuân Hè là vụ trồng chính. Do được luân
canh sau lúa, gieo sạ, nên diện tích bình quân trên nông hộ rất cao (từ 0,5-1 ha/nông
hộ). Nguồn giống đậu nành trong sản xuất rất đa dạng chủng lọai, chủ yếu do người

6
dân tự chuyền tay nhau, một phần từ các công ty hạt giống cung cấp, tuy nhiên số
lượng này có hạn, không đủ để đáp ứng, trong khi địa phương lại có nhu cầu rất cao
khi vào vụ trồng. Đậu nành tại ĐBSCL sản xuất với phương thức gieo sạ là chủ yếu,
do phải trải qua một mùa lũ, nên nguồn giống trong sản xuất phần lớn được luân
chuyển từ vùng khác đến theo mùa trồng, khó kiểm sóat được độ thuần và chất
lượng hạt giống. Người dân chưa có tập quán bón vôi và sử dụng phân bón đặc
chủng cho đậu nành, trong khi đa số những địa bàn trồng đậu nành đều có pH thấp.
Xét về vùng nguyên liệu thì vùng ĐBSCL có rất nhiều thuận lợi để phát triển, có thể
trở thành vựa đậu nành của cả nước giống như cây lúa từ bấy lâu nếu có những giải

pháp kinh tế - kỹ thuật thích hợp.
Đậu nành rau thu trái xanh nên thời gian sinh trưởng ngắn, chi phí đầu tư
thấp mà năng suất thu hoạch cũng như giá trị kinh tế cao nên được nhiều nông dân
bắt đầu ưa thích đưa vào cơ cấu cây trồng vụ đông, trở thành một giải pháp tăng thu
nhập và góp phần luân canh cải tạo đất.
Viện nghiên cứu các giống đậu nành rau nhập nội từ trung tâm nghiên cứu
phát triển rau hoa Châu Á (AVRDC, 2003) tại các tỉnh Hà Tây, Hà Nội, Nghệ An,
Thái Bình, Nam Định, Hải Phòng từ năm 1997 đến nay đã đưa một vài giống có
triển vọng như: AGS 333, AGS 334, AGS 335, AGS 346, AGS 356, AGS 398.
Năm 2003 Viện Di truyền nông nghiệp đã thu nhập được một số giống đậu nành rau
có nguồn gốc từ Trung Quốc, trong đó giống DAĐ02 có khả năng chịu nóng, sinh
trưởng và phát triển tốt đã được gửi đi khảo nghiệm (Mai Quang Vinh, 2007).
Trong 25 năm (1982 – 2007), Viện Di truyền nông nghiệp đã thực hiện cho ra bộ
giống đậu nành 3 vụ gồm 10 giống (4 giống chính thức và 6 giống tạm thời) :
DT84, DT90, DT96, DT55 (AK06), DT99, DT94, DT83, DT2001, đậu nành rau
DT02 và hàng chục giống có triển vọng: DT2002, DT01, DT2006, DT2007, đậu
nành rau DT06… (Mai Quang Vinh, 2007).
Năng suất toàn phần cao chỉ đạt được khi các điều kiện môi trường tương đối
thuận lợi ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển. Các yếu tố bất lợi của môi
trường nếu xảy ra ở giai đoạn sau sẽ làm giảm số trái/cây cũng như kích thước hạt
nên làm giảm năng suất (Trần Thượng Tuấn và ctv, 1983).
Nhìn chung ở nước ta cây đậu nành rau chỉ mới bắt đầu được phát triển.
Trong thời gian tới cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn về giống, kỹ thuật và thị
trường tiêu thụ để không uổng phí một loại cây trồng có giá trị như vậy.

1.4 TÍNH THƠM Ở ĐẬU NÀNH RAU

Ngày nay, khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển nên việc ứng dụng công
nghệ sinh học vào trong chọn giống cây trồng càng được quan tâm nhiều hơn và
mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặt biệt là việc sử dụng các dấu phân tử trong việc

chọn tạo giống mới. Dấu phân tử có thể nhận diện sớm các đặc tính và chúng được
di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác chúng ta có thể kiểm tra được chúng, nhận
diện, thu thập cây trồng mang allen của gen mong muốn. Trong các giống đậu nành
rau (Edamame) thì đậu nành rau thơm là một nhóm giống đặc biệt tạo ra những trái
non có chứa mùi thơm ngọt chủ yếu do sự tiết ra mùi thơm 2-acetyl-1-pyrroline
(2AP). Mùi thơm này tương tự như ở lúa thơm kiểu Basmati và Jasmine (Fushimi
and Masuda, 2001). Đậu nành thơm phổ biến ở Đài Loan, Nhật Bản cũng như đang

7
được người tiêu dùng tại Mỹ và Châu Âu chấp nhận. Do mùi thơm nên những giống
đậu nành rau thơm thường có giá cao hơn các giống đậu nành ăn hạt.
Có nhiều phương pháp để nhận diện gen thơm có trong cây trồng như dựa
trên đánh giá cảm quan, phương pháp hóa học hay sắc khí, tuy nhiên phương pháp
này tốn thời gian, khó khăn và chưa đáng tin cậy. Gần đây, có các marker phân tử
cho phép lựa chọn cây lúa hay đậu nành có tính thơm, chỉ cần một lượng mẩu nhỏ
và độ tin cậy cao (Bradbury et al., 2005). Sử dụng các dấu phân tử để nhận diện gen
thơm trên cây đậu nành rau từ đó tiến hành lai tạo giữa đậu nành rau thơm và đậu
nành ăn hạt không thơm tại địa phương có đặc tính thích nghi và năng suất cao.
Tính trạng thơm trên cây trồng nói chung, cây đậu nành thơm nói riêng là
một trong những tính trạng khó khăn nhất cho các nhà chọn giống cây trồng vì tính
trạng thơm khó biểu hiện ra kiểu hình (Bradbury et al., 2005), đã có nhiều chương
trình chọn giống khảo sát tính thơm trên gạo hay đánh giá cảm quan bằng cách đun
sôi hạt giống trong một cái ly nhỏ và ghi nhận mùi thơm (Wanchana et al., 2005).
Tương tự như lúa, người ta đã tiến hành trên đậu nành, khảo sát tính thơm đã được
báo cáo (AVRDC 2003), tuy nhiên có nhiều giới hạn trong các phương pháp này
như không có khả năng thực hiện trên số lượng mẫu lớn.
Tính thơm của đậu nành rau thơm liên quan đến sự gia tăng của hàm lượng
2AP (Arikit et al., 2010; Wu et al., 2009). Nó đóng vai trò quan trọng đến giá trị
thực phẩm theo nhu cầu của khách hàng. Tính thơm ở đậu nành, cũng như tính
thơm của lúa, là một tính thơm thách thức đối với nhà chọn giống cây trồng bởi vì

rất khó để đánh giá chính xác kiểu hình thơm. Trong nhiều chương trình chọn
giống, phương pháp cảm quan đã được sử dụng phổ biến để đánh giá tính thơm,
như trường hợp ở lúa thơm. Đối với đậu nành, AVRDC (2003) cũng đã đánh giá
bằng những phương pháp cảm quan tương tự. Tuy nhiên, cách đánh giá này có
nhiều hạn chế như khó có thể đánh giá đồng loạt một số lượng lớn mẫu chính xác
được. Thay vào đó, việc lượng hóa hàm lượng chất thơm 2AP bằng các phương
pháp sắc ký đã được ứng dụng rộng rãi. Phương pháp này có hiệu quả cao nhưng
cũng có giới hạn về thời gian đo lường (Fushimi and Masuda, 2001).
Với sự phát triển nhanh và hiệu quả, các chương trình chọn giống nhờ chỉ thị
phân tử đã chứng minh tầm quan trọng trong việc sử dụng chỉ thị phân tử để nhận
diện nhanh các tính trạng mong muốn. Mới đây, sự tổng hợp chất thơm 2AP ở đậu
nành đã được cho là do sự kiểm soát bởi một alen của gen GmAMADH2, một gen
tương đồng với gen Os2AP ở cây lúa (Arikit et al., 2010). Với kết quả này, việc
phát triển chỉ thị phân tử dựa trên gen GmAMADH2 có nhiều khả năng ứng dụng
vào chương trình chọn giống MAS ( marker-assisted selection) cho đậu nành thơm
trong việc nhận diện hay nhanh thanh lọc các giống đậu nành có chứa gen thơm.
Từ kết quả nghiên cứu của (Arikit et al., 2010), đã chọn được 14 dòng đậu
nành mang gen thơm trong số 60 tổ hợp lại giữa 5 giống đậu nành thơm (chamame,
Kouri, Kaori Hime, Yuagari Musume và Fukunari) và 5 giống đậu nành không
thơm (Okuhara Wase, Oishi Edamame, Shirono Mai, Jack và Chiang Mai 60). Ở thế
hệ F2, việc xác định các dòng đậu nành mang gen thơm dựa trên vị trí đánh dấu
Gm2AP cho tính trang thơm ở đậu nành được thiết kế dựa trên trình tự của gen
GmAMDH2 bị mất đoạn 2bp ở exon thứ 10. Các kích thước của sản phẩm PCR
khuếch đại tại vị trí Gm2AP 191 bp đối với giống đậu nành thơm và 201bp với
giống đậu nành không thơm. Kết quả này trùng khớp với tỷ lệ dự kiến cho kiểu hình

8
thơm và không thơm là (1: 3). Đông thời tỷ lệ trên cũng phù hợp với tỷ lệ tính trạng
do một kiểu gen quy định của Mendel (Arikit et al., 2010).

1.5 PHƢƠNG PHÁP NHẬN DIỆN CHUYÊN BIỆT CHO TÍNH THƠM Ở
ĐẬU NANH

Chỉ thị phân tử KAORI cho tính trạng thơm ở đậu nành đã được thiết kế
dùng phương pháp phân tích SNPs. Hai cặp primer KAORI-Normal-U/KAORI-L
và KAORI-Chamame-U/KAORI-L dùng để nhận diện kiểu gen không thơm và kiểu
gen thơm. Đó là dạng đột biến mất đoạn 2 bp (TT) ở exon 10 của gen
GmAMADH2 trong giống đậu nành rau thơm Chamame đã được Akirit et al.,
(2010) công bố. Gen này mã hóa cho enzym AMADH trong điều hòa sự tổng hợp
2-acetyl-1-pyrroline (2AP) ở đậu nành. (Nguyễn Lộc Hiền và ctv., 2012).
- Sản phẩm của cặp primer nhận diện tính không thơm có kích thước là 201 bp
KAORI-Normal-U: 5’ CAGGAAAGTATAGCAACAGAATTTCTG- 3’
KAORI-L: 5’ CCAAAGCATACCTGCCCTTT- 3’
- Sản phẩm của cặp primer nhận diện tính thơm có kích thước là 199 bp
KAORI-Chamame-U: 5’ CAGGAAAGTATAGCAACAGAATCTG-3’
KAORI-L: 5’ CCAAAGCATACCTGCCCTTT- 3’
Do sự khác biệt giữa kiểu gen thơm và kiểu gen không thơm chỉ ở 2bp nên để
phân biệt ta thực hiện riêng hỗn hợp PCR cho hai cặp primer cùng một mẫu giống.
Sau đó diện di trên cùng một gel và vị trí mẫu giống. Nếu mẫu giống có mang tính
thơm thì chỉ cho sản phẩm PCR ở phần gel đã được PCR bằng cặp primer thơm và
ngược lại mẫu giống mang tính không thơm sẽ cho sản phẩm PCR trên phần gel
được PCR với cặp primer không thơm. Hình 1.1 cho thấy các sản phẩm đặc trưng
của hai giống đậu nành rau chuẩn cho giống đậu nành rau thơm (Fukunari) và giống
đậu nành không thơm (Okuharawase). Với mong muốn kiểu gen thơm là lặn đồng
hợp tử và tính trạng thơm ở đậu nành thơm được điểu khiển bởi gen đơn đồng trội
nên những giống không thơm dị hợp tử sẽ xuất hiện ở cả hai sản phẩm của hai phần
gel sau khi điện di.

Hình 1.1 Phổ điện di nhận diện tính thơm ở đậu nành rau
(M: ladder 1 Kb plus Invitrogen;
P1: Fukunari giống đậu nành thơm;
P2: Okuharawase là giống đậu nành không thơm;
F1: cá thể lai F1 )

M P1 P2 F1

Thơm


Không Thơm

199 bp
201 bp

9
CHƢƠNG 2

PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1 PHƢƠNG TIỆN

2.1.1 Vật liệu

Bảng 2.1 Danh sách 4 giống đậu nành rau Nhật Bản


STT Tên giống Đặc điểm

1 Takihime (Thơm) Đậu nành rau

2 Fukunari (Thơm) Đậu nành rau

3 Okuharawase (Không thơm) Đậu nành rau

4 Mikawashima (Không thơm) Đậu nành rau


Bảng 2.2 Danh sách 4 tổ hợp lai đƣợc sử dụng

STT tổ Tổ hợp lai Quần thể F2
hợp lai (♀  ♂)

4 Okuharawase x Fukunari 4-2, 4-3, 4-4

5 Fukunari x Okuharawase 5-2, 5-3, 5-4, 5-5, 5-6, 5-7, 5-7, 5-8

13 Mikawashima x Fukunari 13-1, 13-2, 13-3, 13-4

14 Mikawashima x Takihime 14-2, 14-3, 14-4, 14-5, 14-6


Tất cả quần thể F2 này được chọn từ các cá thể lai F1 dị hợp tử thông qua nhận
diện bằng chỉ thị phân tử (Trần Thị Thu Thảo, 2012)

2.1.2 Thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 04 năm 2012 đến tháng 11 năm 2013 tại Trại
Thực Nghiệm Giống Cây Trồng và phòng thí nghiệm Di truyền Giống Cây Trồng,

Bộ môn Di Truyền Giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng
Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.


10
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất đề sử dụng
2.1.3.1 Thiết bị và dụng cụ
- Cân điện tử Adventure của OHAUS (Mỹ)
- Water and Oilbath WB/OB 7-45 WBU 45 của Memmert (Đức).
- Máy ly tâm Mikro 22R Hettich (Đức).
- Máy PCR GeneAmp PCR system 2700 (Amplied Biosytems – Singapore).
- Lò vi sóng EM-G47558 của SANYO (Nhật).
- Bộ điện di OWL A2 của thermo Sicientific (Malaysia)
- Máy đọc gel bằng tia UV của BioBlock Scientific (Pháp).
- Tủ lạnh SR-S22TN(S) của SANYO (Nhật).
- Một số dụng cụ: bình tam giác, chai thủy tinh. Tube 1,5ml, tube 200

l, típ 1ml,
típ 200

l, bao tay, kéo, cối và chày nghiền mẫu,
2.1.3.2 Hóa chất
- Hóa chất ly trích DNA: CTAB buffer,

-mercaptoethanol, chloroform,
isopropanol, TE, ethanol 100% và 70%,
- Hóa chất cho PCR và điện di: Taq polymerase, dNTPs, PCR buffer, agarose
tinh khiết, ethidium bromide,

2.2 PHƢƠNG PHÁP

2.2.1 Ly trích DNA

Các giống đậu nành được trồng theo hàng, được bố trí thí nghiệm mõi dòng
3 hàng mõi hàng 10 cây, phân biệt các giống bằng việc đánh số thứ tự giống trên
cọc tre đầu hàng, sau khi gieo một tuần cây bắt đầu có lá non, lấy lá tiến hành ly
trích DNA, nếu không ly trích ngay thì phải giữ lá trong tube 1.5ml ở -20
o
C.
DNA được ly trích và tinh sạch từ mô lá theo phương pháp CTAB (Doyle
and Doyle, 1990) như sau:
- Cân mỗi mẫu lá khoảng 100mg/mẫu cho vào từng cối riêng biệt.
- Cho thêm 1000

l dung dịch ly trích CTAB (đã làm nóng trong waterbath ở 65
0
C
trong 15 phút) và 10

l

-mercaptoethanol, nghiền mẫu thật mịn, hút hết phần
dung dịch cho vào tube1.5ml.
- Lắc đều và ủ ở 65
0
C trong 60 phút (tính từ mẫu cuối cùng được nghiền xong). Cứ
15 phút lắc đều mẫu một lần.
- Ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút.
- Lấy 700


l dung dịch bên trên cho vào tube mới.
- Thêm 500

l P:C:I (phennol : chloroform : Isoamyl) sau đó trộn đều.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Lấy 550

l dung dịch bên trên cho vào tube mới.
- Thêm 5

l RNAse, trộn nhẹ và ủ trong waterbath hay tủ úm ở 37
0
C trong 1 giờ.
- Cho thêm 500

l chloroform, trộn đều.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Lấy 450

l dung dịch bên trên cho vào tube mới

11
- Thêm 400

l chloroform, trộn đều.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Lấy 300

l dung dịch bên trên cho vào tube mới.
- Thêm 300


l isopropanol, trộn đều ủ trong ngăn đá 15 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút,
- Bỏ cẩn thận dung dịch trên lấy cẩn thận phần tủa.
- Thêm 500

l ethanol 70% lạnh, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bỏ cẩn thận dung dịch trên lấy phần kết tủa trắng.
- Thêm 500

l ethanol 70% lạnh, ly tâm 13000 vong/phút trong 10 phút.
- Bỏ cẩn thận dung dịch trên lấy phần kết tủa trắng.
- Thêm 500

l ethanol 100% lạnh, ly tâm 1300 vòng/phút trong 5 phút.
- Lấy phần tủa để khô tự nhiên (khoảng 90 phút), cho vào 50

l TE buffer, lắc nhẹ
(có thể ủ ở 65
0
C trong 5 phút để DNA tan đều).
- Trữ lạnh ở -4
0
C để đảm bảo chất lượng DNA.
DNA sau khi được ly trích và tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng cách điện di
trên gel agarose 0,8%, sau đó được nhuộm bằng ethium bromide và chụp hình
bằng máy chụp hình gel. Các mẫu có DNA tốt sẽ được sử dụng cho các phản ứng
PCR

2.2.2 Thiết kế primer

Sử dụng chỉ thị phân tử KAORI cho tính trạng thơm ở đậu nành dùng
phương pháp phân tích SNP. Hai cặp primer KAORI-Normal-U/ KAORI-L và
KAORI-Chamame/ KAORI-L được Bộ môn Di Truyền Giống Nông Nghiệp
(Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ) thiết kế
(Nguyễn Lộc Hiền và ctv., 2012).
- Cặp primer nhận diện tính không thơm:
KAORI-Normal-U: 5’ CAGGAAAGTATAGCAACAGAATTTCTG- 3’
KAORI-L: 5’ CCAAAGCATACCTGCCCTTT- 3’
- Cặp primer nhận diện tính thơm:
KAORI-Chamame-U: 5’ CAGGAAAGTATAGCAACAGAATCTG-3’
KAORI-L: 5’ CCAAAGCATACCTGCCCTTT- 3’
Các cặp primer này lần đầu tiên được thiết kế dựa vào cấu trúc gen thơm
GmAMADH2 của giống đậu nành rau Chamame (Akirit et al., 2010).

2.2.3 Phản ứng PCR

Hỗn hợp phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 10

l bao gồm 7,1

l nước
cất hai lần, 1

l PCR buffer 10X, 1

l dNTPs 0,2

l, 0,3


l primer KAORI-
Chamame, 0,3

l primer KAORI-Normal-U, 0,3

l primer KAORI-L, 0,1

l Taq
polymerase 5U/

l và 1

l DNA 40ng/

l. Phản ứng PCR được thực hiện qua 29
chu kỳ gia nhiệt trên máy PCR GenneAmp PCR system 2700 như sau: 2 phút ở
94
0
C, 29 chu kỳ gồm 50 giây ở 94
0
C, 50 giây ở 58
0
C và 50 giây ở 72
0
C, 5 phút ở
72
0
C sau đó trữ mẫu ở 4
0
C.