ảnh hưởng của naa và atonik lên giai đoạn ra rễ và thuần dưỡng huệ trắng (polianthes tuberosa l.) in vitro trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và ánh sáng tự nhiên trong nhà lưới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC









LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC





ẢNH HƯỞNG CỦA NAA VÀ ATONIK LÊN
GIAI ĐOẠN RA RỄ VÀ THUẦN DƯỠNG HUỆ TRẮNG
(POLIANTHES TUBEROSA L.) IN VITRO TRONG ĐIỀU
KIỆN ÁNH SÁNG NHÂN TẠO VÀ ÁNH SÁNG
TỰ NHIÊN TRONG NHÀ LƯỚI

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN BẢO TOÀN LÊ LÝ VŨ VI
MSSV:3093169
LỚP:CNSHTT K35




Cần Thơ, Tháng 11/2013



PHẦN KÝ DUYỆT




CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN






PGs.Ts. Nguyễn Bảo Toàn Lê Lý Vũ Vi

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

















LỜI CẢM TẠ
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến:
Thầy Nguyễn Bảo Toàn, cô Phùng Thị Hằng, thầy và cô đã tận tình hướng

dẫn, đóng góp nhiều ý kiến và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Mọi người trong gia đình đã chăm sóc và ủng hộ cho tôi.
Chị Lan, chị Hạnh, Phú, Diệu, Ngân, em Thu và Linh đã giúp đỡ tôi rất nhiều
trong quá trình thực hiện nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Lê Lý Vũ Vi










Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

i
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƯỢC
Nghiên cứu này được thực hiện để xác định ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
và điều kiện ánh sáng lên giai đoạn ra rễ in vitro và khả năng thích nghi của huệ
trắng (Polianthes tuberosa L.) trong giai đoạn thuần dưỡng. Nghiên cứu gồm 2 thí
nghiệm. Thí nghiệm 1 nhằm xác định ảnh hưởng của NAA và atonik ở các nồng độ
khác nhau trên giai đoạn ra rễ in vitro của cây huệ trắng trong điều kiện ánh sáng
nhân tạo và tự nhiên trong nhà lưới. Thí nghiệm 2 nhằm xác định khả năng thích
nghi của cây con trong giai đoạn thuần dưỡng. Kết quả thí nghiệm cho thấy, atonik ở
nồng độ 2 ml/l và 4 ml/l kích thích ra rễ in vitro hiệu quả hơn NAA ở nồng độ 0,5

mg/l và 1 mg/l. Điều kiện ánh sáng tự nhiên (120 µmol.m
-2
.s
-1
) kích thích sự ra rễ in
vitro hiệu quả hơn điều kiện ánh sáng nhân tạo (50 µmol.m
-2
.s
-1
). Nghiệm thức atonik
2 ml/l kết hợp ánh sáng tự nhiên là thích hợp để tạo rễ in vitro. Cây huệ trắng đã
được nuôi cấy trong môi trường có atonik thích nghi tốt hơn so với cây trong môi
trường có NAA. Không có sự khác biệt về khả năng thích nghi giữa cây được nuôi
cấy trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và ánh sáng tự nhiên. Cây thích nghi tốt sau
khi được nuôi cấy trong môi trường có atonik 2 ml/l và atonik 4 ml/l trong cả hai
điều kiện ánh sáng (tỉ lệ sống hơn 93%). Rễ ex vitro có cấu trúc cải thiện hơn rễ in
vitro.
Từ khóa: ánh sáng, atonik, NAA, Polianthes tuberosa L., ra rễ in vitro, thuần
dưỡng.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


ii
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
TỪ VIẾT TẮT vi
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về giống huệ Polianthes tuberosa L 3
2.1.1 Đặc điểm chung của huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) 3
2.1.2 Giá trị thực tiễn của cây huệ 3
2.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây huệ trắng 3
2.2. Giai đoạn ra rễ in vitro 4
2.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng 4
2.2.2 Điều kiện ánh sáng 5
2.3. Giai đoạn thuần dưỡng 6
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
3.1. Phương tiện nghiên cứu 8
3.1.1 Vật liệu thí nghiệm 8
3.1.2 Thiết bị và hóa chất 8
3.1.3 Điều kiện thí nghiệm 8
3.2 Phương pháp nghiên cứu 8
3.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 8
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


iii
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

3.2.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ

in vitro của cây huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) trong điều kiện ánh
sáng nhân tạo và tự nhiên 9
3.2.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng thích nghi của cây con trong
giai đoạn thuần dưỡng tại nhà lưới 11
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13
4.1. Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ in vitro của
cây huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) trong điều kiện ánh sáng
nhân tạo và tự nhiên 13
4.1.1 Hiệu quả của NAA và atonik lên số rễ, chiều dài rễ, đường kính
rễ, chỉ số SPAD của cây huệ trắng in vitro trong điều kiện ánh sáng
nhân tạo và tự nhiên 13
4.1.2 Hình thái của rễ in vitro 16
4.1.3 Cấu trúc giải phẫu của rễ in vitro 17
4.2. Đánh giá khả năng thích nghi của cây con trong giai đoạn
thuần dưỡng tại nhà lưới 21
4.2.1 Tỉ lệ sống (%) của cây con trong giai đoạn thuần dưỡng ở nhà
lưới 21
4.2.2. Cấu tạo rễ của cây huệ trắng đã thích nghi 24
4.2.3 Chỉ số SPAD của cây huệ trắng cấy mô vào ngày 7 và ngày
30 trong giai đoạn thuần dưỡng 25
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28
5.1. Kết luận 28
5.2. Đề nghị 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

iv
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Bảng phối hợp nhân tố chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng 10
Bảng 4.1 Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng lên số rễ,
chiều dài, đường kính rễ và chỉ số SPAD của cây huệ trắng in vitro thời điểm 60
ngày sau khi cấy 14
Bảng 4.2 Tỉ lệ sống (%) của cây con sau 30 ngày thuần dưỡng tại nhà lưới 22
Bảng 4.3 Chỉ số SPAD của cây con vào ngày 7 và ngày 30 trong giai đoạn thuần
dưỡng 26
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


v
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Bao cấy nhựa PP được dùng trong thí nghiệm 9
Hình 4.1 Sự hình thành rễ ở các nghiệm thức vào thời điểm 60 ngày sau cấy 17
Hình 4.2 Sự hình thành lông hút của rễ in vitro ở các nghiệm thức vào thời điểm
60 ngày sau cấy nhìn dưới vật kính X4 18
Hình 4.3 Mặt cắt rễ in vitro ở các nghiệm thức vào thời điểm 60 ngày sau cấy
nhìn dưới vật kính X10 19
Hình 4.4 Hệ mạch của rễ in vitro ở các nghiệm thức vào thời điểm 60 ngày sau cấy
nhìn dưới vật kính X40 21
Hình 4.5 Cây huệ trắng cấy mô sau 30 ngày thuần dưỡng 23

Hình 4.6 Rễ con mới tạo thành trong điều kiện ex vitro sau 30 ngày thuần dưỡng . 24
Hình 4.7 Cấu tạo rễ ex vitro sau 30 ngày thuần dưỡng nhìn dưới vật kính X10 25
Hình 4.8 Hệ mạch của rễ ex vitro sau 30 ngày thuần dưỡng và của rễ in vitro 60
ngày sau cấy 25
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


vi
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

TỪ VIẾT TẮT
IAA Indole-3-acetic acid
MS Murashige and Skoog
NAA Napthalene acetic acid
SPAD Soil and Plant Analysis Development
PP Polypropylen
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

1
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) là loài có giá trị cao trong canh tác hoa cắt
cành ở Việt Nam. Thông thường, huệ được nhân giống vô tính bằng củ. Tuy nhiên, bất
lợi của kỹ thuật này là dễ mang theo mầm bệnh và côn trùng sang các củ con, làm
giảm năng suất và chất lượng hoa (Huang và Chiang, 1975), (Cuc và Pilon, 2007).
Hơn nữa, hệ số nhân giống từ củ tương đối thấp (Rees, 1969). Do đó, việc nghiên cứu
các giai đoạn vi nhân giống huệ trắng là cần thiết vì kỹ thuật này tạo ra được số lượng
rất lớn cây con sạch mầm bệnh trong thời gian ngắn. Trong vi nhân giống, giai đoạn ra

rễ in vitro và thuần dưỡng đóng vai trò quan trọng vì 2 giai đoạn này ảnh hưởng đáng
kể đến sức sống của cây cấy mô. Chất điều hòa sinh trưởng thường dùng để kích thích
sự tạo rễ in vitro. Trong các chất được sử dụng, atonik là chất điều hòa sinh trưởng
tổng hợp có thành phần chính gồm sodium-s-nitrogualacolate, sodium-o-
nitrophenolate và sodium-p–nitrophenolate, có tác dụng kích thích cây ra rễ. Nguyễn
Minh Kiên (2011) báo cáo atonik có tác dụng kích thích sự ra rễ in vitro ở cây huệ
trắng. Trong khi đó, NAA là auxin thường được sử dụng để kích thích sự tạo rễ in
vitro. Tuy nhiên, hiệu quả của NAA trên sự ra rễ cây huệ in vitro vẫn còn hạn chế trên
cây huệ trắng. Trong nuôi cấy in vitro, ánh sáng nhân tạo thường được sử dụng. Do đó,
giá thành cây con cao do chi phí thắp sáng cao. Hơn nữa, việc sử dụng ánh sáng nhân
tạo còn làm cây con thích nghi kém với bức xạ cao của ánh sáng tự nhiên trong giai
đoạn thuần dưỡng. Vì vậy, sử dụng nguồn ánh sáng tự nhiên có thể giảm giá thành và
tăng khả năng thích nghi của cây con trong giai đoạn thuần dưỡng (Pospisilova et al.,
1998). Việc sử dụng ánh sáng tự nhiên trong nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu trên
nhiều loài như khóm (Ananas comosus) (Be và Debergh, 2006), cỏ vertiver (Vetiveria
zizanioides L.) (Be et al., 2008). Đối với cây huệ trắng, ảnh hưởng của ánh sáng nhân
tạo và tự nhiên lên sự ra rễ in vitro và thuần dưỡng vẫn chưa được công bố. Vì vậy,
nghiên cứu về “Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ và thuần dưỡng cây
huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) in vitro trong hai điều kiện ánh sáng nhân tạo và
ánh sáng tự nhiên trong nhà lưới” được tiến hành.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

2
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

1.2 Mục tiêu đề tài
Xác định ảnh hưởng NAA và atonik trong giai đoạn ra rễ in vitro của huệ trắng
(Polianthes tuberosa L.) trong điều kiện ánh sáng nhân tạo trong phòng tăng trưởng và
điều kiện ánh sáng tự nhiên tại nhà lưới.

Xác định khả năng thích nghi của cây huệ trắng trong trong giai đoạn thuần
dưỡng tại nhà lưới.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

3
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về giống huệ Polianthes tuberosa L.
2.1.1 Đặc điểm chung của huệ trắng (Polianthes tuberosa L.)
Huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) là loài đơn tử diệp, thân thảo, rễ chùm, thuộc
họ Agavaceae (Patil và Pai, 2011), nguồn gốc từ Mexico, ưa sáng, ưa nhiệt và nở hoa
quanh năm (Sangavai và Chellapand, 2008). Huệ có lá đơn, dài, màu xanh, mọc thẳng
và là loài nở hoa vào ban đêm. Một nhánh huệ dài 100 cm có thể cho 20 hoa màu trắng
(Cuc và Pilon, 2007). Theo Huỳnh Thị Huế Trang et al. (2007), huệ trắng có hai giống
là huệ trắng đơn và huệ trắng kép. Huệ trắng đơn còn gọi là huệ xẻ, cây thấp, hoa ngắn
và thưa. Huệ trắng kép còn gọi là huệ tứ diện, cây cao, hoa dài và dày. Huệ kép được
nhiều người ưa chuộng hơn.
2.1.2 Giá trị của cây huệ
Huệ trắng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong công nghiệp hoa cắt cành, mỹ
phẩm và dược liệu (Sangavai và Chellapand, 2008). Tại đồng bằng sông Cửu Long,
cành hoa huệ trắng được sử dụng để thờ cúng trong các dịp lễ tết (Cuc và Pilon, 2007).
Tinh dầu chiết xuất từ hoa huệ được sử dụng là hoạt chất tạo hương và chăm sóc da
trong công nghiệp mỹ phẩm. Ngoài ra, tinh dầu hoa huệ được sử dụng để xông hơi thư
giãn nhờ vào mùi hương dễ chịu (Roberts, 2000). Majima et al. (1995), Sadiqa et al.
(1999) báo cáo củ huệ có nhiều saponin, hoạt chất có khả năng tăng cường trao đổi
chất trong cơ thể động vật và bảo vệ tế bào trước sự tấn công của vi khuẩn.
2.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây huệ trắng

Nhu cầu về cây huệ trắng là khá lớn nhưng nguồn cung cấp huệ bị giảm sút do sự
ảnh hưởng của côn trùng và bệnh hại. Điển hình là bệnh chai bông do tuyến trùng
Aphelenchoides besseyi Christie, gây thiệt hại nghiêm trọng cho người canh tác. Đặc
điểm nhận dạng là các đốm nâu trên nhánh huệ, làm mất giá trị sử dụng của cây, sau
đó dẫn đến cây huệ bị chết dần (Cuc và Pilon, 2007). Theo Huang và Chiang (1975),
tuyến trùng có thể tồn lưu trong củ huệ trong thời gian dài, cây huệ mới có nguy cơ
nhiễm bệnh cao nếu tiếp tục sử dụng nguồn củ huệ đã nhiễm tuyến trùng để nhân
giống. Ngoài ra, tốc độ nhân giống bằng củ huệ với phương pháp truyền thống tương
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

4
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

đối thấp. Đối với cây huệ trắng, một củ chỉ có thể tạo ra 1.000 củ con trong vòng 16
năm (Rees, 1969).
Yêu cầu đặt ra là sản xuất số lượng lớn cây huệ sạch bệnh để cung cấp cho nhu
cầu thị trường. Giải pháp cho vấn đề trên chính là nuôi cấy mô cây huệ. Từ một vài
mẫu cấy sạch bệnh có thể sản xuất ra số lượng lớn cây con sạch bệnh và khoẻ mạnh
nếu được nuôi cấy và thuần dưỡng trong điều kiện thích hợp (George, 1993). Theo
Nguyễn Bảo Toàn (2010), vi nhân giống có thể chia làm các giai đoạn như sau:
Giai đoạn 0: Chuẩn bị và lựa chọn mẫu cấy (explant) từ cây mẹ.
Giai đoạn 1: Tiệt trùng mẫu cấy bằng các chất khử trùng bề mặt như NaOCl,
HgCl
2
.
Giai đoạn 2: Nhân chồi bằng cách bổ sung cytokinin và auxin vào môi trường.
Giai đoạn 3: Kích thích rễ và tiền thuần dưỡng bằng auxin và tăng khả năng tự
dưỡng cho cây con bằng cách giảm bớt nồng độ carbohydrate trong môi trường nuôi
cấy.
Giai đoạn 4: Thuần dưỡng cây cấy mô bằng cách chuyển từ điều kiện in vitro

sang điều kiện nhà lưới hoặc ngoài đồng.
Mỗi giai đoạn đều có vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng và khả năng
thích nghi của cây cấy mô ở điều kiện ex vitro.
Hiện nay, nhiều nghiên cứu về vi nhân giống cây huệ trắng (Polianthes tuberosa
L.) đã được công bố trên thế giới (Nasreen et al., 1994), (Naz et al., 2012). Tại Đại học
Cần Thơ, Huỳnh Thị Huế Trang et al. (2007) đã thực hiện thành công qui trình vi nhân
giống cây huệ trắng sạch bệnh từ mô phân sinh chồi.
2.2 Giai đoạn ra rễ in vitro
Theo George (1993), cây thân thảo cần ra rễ in vitro trước khi được thuần dưỡng
trong điều kiện ex vitro vì bộ rễ giúp cây hấp thu chất dinh dưỡng và nước từ môi
trường ex vitro tốt hơn.
2.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng
NAA (Napthalene acetic acid)
Auxin là chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò chính trong sự tạo và phát triển
rễ in vitro. Trong các auxin được sử dụng, auxin tổng hợp NAA được đề xuất sử dụng
vì tính bền vững và có khả năng giữ hoạt tính khi bị hấp khử trùng ở 121
0
C, 100kPa
(Dai et al., 1987). NAA đã được dùng để kích thích sự ra rễ in vitro ở nhiều loài khác
nhau (George, 1993). Tuy nhiên, Huỳnh Thị Huế Trang et al. (2007) báo cáo số rễ in
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

5
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

vitro của cây huệ trắng sau 4 tuần nuôi cấy ở các nồng độ NAA 0,5 mg/l, 1 mg/l và đối
chứng không khác biệt ý nghĩa thống kê.
Atonik
Atonik là chất điều hòa sinh trưởng gồm các nitrophenol (sodium-s-
nitrogualacolate, sodium-nitrophenolate và sodium-p-nitrophenolate), có tác dụng kích

thích ra rễ ở cây trồng. Đây là sản phẩm giá thành thấp, được đóng gói ở dạng bột khô
hoặc dung dịch. Theo tài liệu được công bố vào tháng 11 năm 2008 của Cục Bảo vệ
Môi trường Hoa Kì (EPA), atonik không gây độc cho cây và động vật tiêu thụ khi
được sử dụng làm chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), với liều
sử dụng thấp, các hoạt chất nitrophenol nhanh chóng được chuyển hóa thành những
sản phẩm vô hại. Theo kết quả nghiên cứu trên cây kê (Pennsetum glaucum), Datta et
al. (1986) atonik có tác dụng điều hòa sinh trưởng của cây vì chất này tăng sự tổng hợp
auxin nội sinh của cây. Djanaguiraman et al. (2005) báo cáo atonik làm tăng hàm
lượng auxin nội sinh IAA là nhờ sự ức chế enzyme IAA oxidase-loại enzyme phân
hủy IAA của cây trồng. Đã có nhiều nghiên cứu về khả năng kích thích và phát triển rễ
trên cây trồng của atonik. Ví dụ, Bhonde et al. (1992), báo cáo atonik làm tăng số rễ
và năng suất trên củ hành (Allium cepa). Tuy được sử dụng rộng ở điều kiện ex vitro,
atonik vẫn chưa được sử dụng rộng trong giai đoạn ra rễ in vitro. Tại trường Đại học
Cần Thơ, đã có những nghiên cứu về sử dụng atonik trong giai đoạn ra rễ in vitro ở
cây lan giáng hương (Aerides sp.) (Bùi Xuân Vinh, 2013), (Nguyễn Thị Mai Hạnh,
2013). Đối với cây huệ trắng in vitro, các nồng độ atonik 10 ml/l, 15 ml/l kích thích sự
ra rễ, tuy nhiên, nồng độ atonik 15 ml/l cho số rễ thấp hơn atonik 10 ml/l (Nguyễn
Minh Kiên, 2011).
2.2.2 Điều kiện ánh sáng
Diệp lục tố hấp thu chủ yếu phần quang phổ xanh dương (430 nm) và đỏ (660
nm). Tuy nhiên, ánh sáng đèn compact trắng trong phòng tăng trưởng chủ yếu là phần
quang phổ xanh dương, rất ít phần quang phổ đỏ (Aube et al., 2013). Hơn nữa, bức xạ
thấp của ánh sáng nhân tạo lại làm cây khó thích nghi khi chuyển sang bức xạ cao
trong giai đoạn thuần dưỡng. Trong khi đó, ánh sáng tự nhiên có đủ quang phổ xanh
dương, đỏ và bức xạ ánh sáng gần giống như bức xạ trong giai đoạn thuần dưỡng. Vì
vậy, ánh sáng tự nhiên có thể được dùng trong giai đoạn in vitro để giúp cây sinh
trưởng tốt và thích nghi với bức xạ cao, giúp tăng tỉ lệ sống trong giai đoạn thuần
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

6

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

dưỡng ex vitro (Pospisilova et al., 1998). Ngoài ra, ánh sáng tự nhiên còn được dùng
để giảm chi phí thắp sáng. Nhiều nghiên cứu trên cây lan đã tận dụng điều kiện ánh
sáng tự nhiên trong nhà lưới (Bùi Xuân Vinh, 2013), (Nguyễn Thị Mai Hạnh, 2013).
Nguyễn Thị Mai Hạnh (2013) báo cáo cây lan được đặt trong điều kiện ánh sáng tự
nhiên cho nhiều rễ in vitro hơn so với cây ở điều kiện ánh sáng nhân tạo. Tuy nhiên, rễ
in vitro lại ngắn hơn so với tại điều kiện ánh sáng nhân tạo. Ngoài ra, nghiên cứu của
Be et al. (2008) trên sự ra rễ in vitro lại nhận thấy điều kiện ánh sáng nhà lưới (95–125
µmol.m
-2
.s
-1
) và phòng tăng trưởng (30 µmol.m
-2
.s
-1
) không ảnh hưởng khác biệt đến
số rễ in vitro của cỏ Vertiver (Vetiveria zizanioides L.). Tuy nhiên, Kyte (1987) vẫn đề
xuất không sử dụng ánh sáng tự nhiên trong giai đoạn in vitro vì tính không ổn định và
khó kiểm soát của yếu tố này; chồi cấy dễ chết khi tiếp xúc với điều kiện bức xạ và
nhiệt độ cao.
2.3 Giai đoạn thuần dưỡng
Mục tiêu của giai đoạn thuần dưỡng là giúp cây con sống sót và thích nghi với
điều kiện độ ẩm thấp, bức xạ cao ở môi trường ex vitro. Aracama et al. (2008) đề xuất
bộ rễ phát sinh in vitro của cây Uniola paniculata có thể hấp thu nước và muối khoáng
trong điều kiện ex vitro. Ngược lại, Nguyễn Bảo Toàn (2010) đề xuất rằng bộ rễ phát
sinh in vitro trên nhiều loài không hấp thu được nước và muối khoáng từ giá thể trong
giai đoạn thuần dưỡng ex vitro, điều này làm giảm sức sống của cây.
Nguyên nhân chính làm cây chết trong giai đoạn thuần dưỡng là: rễ không thể

hấp thu nước từ giá thể do chưa hoàn chỉnh chức năng (George, 1993) và mất nước
qua lá do thiếu lớp cutin và sự đóng khí khổng (Saez et al., 2012). Cây con cần đủ thời
gian để hoàn thiện chức năng và thích nghi với điều kiện thuần dưỡng. Sự thích nghi
của cây cấy mô khi chuyển từ điều kiện in vitro (bức xạ ánh sáng thấp) sang điều kiện
ex vitro (bức xạ ánh sáng cao) còn thể hiện ở sự gia tăng hàm lượng diệp lục
(Pospisilova et al., 1998) trong thời gian thuần dưỡng. Sự thích nghi diễn ra nhanh hay
chậm là tùy thuộc vào mỗi loại cây (Pospisilova et al., 1999).
Sự thích nghi của cây cấy mô trong điều kiện ex vitro
Tỉ lệ sống và sự thích nghi của cây liên quan đến khả năng hút nước và khoáng
của bộ rễ. Bộ rễ phát sinh in vitro có thể tăng tỉ lệ sống của cây trong giai đoạn ex vitro
nhờ vào sự khả năng giữ và hấp thu nước (Diaz-Perez et al., 1995). Nghiên cứu trên
cây lan Cymbidium Joy Polis cho thấy, bộ rễ phát sinh trong giai đoạn in vitro vẫn
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

7
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

thích nghi tốt với điều kiện nhà lưới, mặc dù bộ rễ có các mạch gỗ kém phát triển,
thành mạch gỗ chưa hoàn thiện (Mayer et al., 2008). Tuy nhiên, không phải lúc nào rễ
được tạo ra trong điều kiện in vitro cũng thích nghi với điều kiện môi trường bên
ngoài. Trong những ngày đầu của giai đoạn thuần dưỡng ex vitro của dây nho (Vitis
vinifera), rễ thiếu khả năng hấp thu nước, đây là một trong những nguyên nhân làm
cây mất nước và dễ chết (Fila et al., 1998). Tuy vậy, những bất thường về cấu tạo rễ
phát sinh in vitro vẫn có thể được chỉnh sửa và hoàn chỉnh chức năng sau một thời
gian thuần dưỡng ở điều kiện ex vitro ( McClelland et al., 1990).
Hàm lượng diệp lục lá
Sau một thời gian thuần dưỡng, hàm lượng diệp lục lá của cây Azadirachta
indica cao hơn hẳn so với lúc bắt đầu giai đoạn, tác giả cũng cho rằng sự gia tăng hàm
lượng diệp lục có thể phản ánh khả năng quang hợp và thích nghi tốt hơn của cây
(Lavanya et al., 2009). Tuy nhiên, nghiên cứu trên cây thân thảo Spathiphyllum

floribundum của Van Huylenbroeck et al. (1995) lại ghi nhận sự mất màu diệp lục
(photobleaching) khi cây cấy mô được thuần dưỡng trong điều kiện bức xạ ánh sáng
cao (300 µmol.m
-2
.s
-1
), đây là biểu hiện của sự quang ức chế (photoinhibition) do cây
kém thích nghi với bức xạ ánh sáng cao. Nemali và Iersel (2004) kiến nghị rằng bức xạ
ánh sáng có thể làm tăng hoặc giảm hàm lượng diệp lục, điều này phụ thuộc vào đặc
tính sinh lý của từng loài.
Để trích xuất diệp lục trong lá, các phương pháp thường được dùng là nghiền
mẫu lá trong các dung môi hữu cơ như acetone, dimethylsulfoxide hoặc methanol
(Porra, 2002). Tuy nhiên, hàm lượng diệp lục của lá cũng có thể được đánh giá một
cách nhanh chóng bằng chỉ số SPAD (Soil and Plant Analysis Development) mà
không làm hư hại mẫu lá. Đây là thiết bị cầm tay được sử dụng rộng rãi trong nghiên
cứu trên nhiều loài khác nhau (Markwell et al., 1995). Thiết bị này sử dụng 2 diot phát
sáng và 1 cảm biến ánh sáng để đo ánh sáng được truyền qua lá, từ đó cho phép đánh
giá hàm lượng diệp lục có trong lá cây được đo (Lê Duy, 2011). Nghiên cứu trên
Arabidopsis thaliana, cho thấy chỉ số SPAD có mối liên hệ rất chặt với hàm lượng
diệp lục lá với r
2
>0,996, chỉ số SPAD thể hiện độ xanh của lá, chỉ số SPAD càng cao
thì hàm lượng diệp lục càng cao và ngược lại (Ling et al., 2011).

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

8
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện thí nghiệm
3.1.1Vật liệu thí nghiệm
Mẫu chồi huệ trắng (Polianthes tuberosa L.) in vitro được tạo từ Phòng Thí
nghiệm Vi nhân giống của Trại nghiên cứu và thực nghiệm nông nghiệp, Khoa Nông
nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Thiết bị và hóa chất
Tủ cấy vô trùng, nồi khử trùng nhiệt ướt, bếp điện, cân kỹ thuật, máy đo pH, bao
cấy bằng nhựa PP, máy đo ánh sáng Lux meter Extech, SPAD Chlorophyll meter 502
Minolta.
Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), nước dừa, cồn, NAA
(naphthalene acetic acid), atonik 1,8 DD là sản phẩm của công ty Asahi (Nhật Bản) và
do công ty TNHH ADC đóng gói và phân phối. Thành phần gồm các nitrophenol với tỉ
lệ sodium-s-nitrogualacolate 0,03%, sodium-o- nitrophenolate 0,06%, sodium-p-
nitrophenolate 0,09%, loại gói nhỏ 10 ml/l được pha loãng với 1 lít nước. Lượng sử
dụng cho thí nghiệm là lượng đã được pha loãng.
3.1.3 Địa điểm và điều kiện thí nghiệm
Điều kiện thí nghiệm
Nguồn ánh sáng trong phòng tăng trưởng là ánh sáng nhân tạo từ đèn compact
trắng, ngoài ra còn có một phần nhỏ ánh sáng tự nhiên khuếch tán qua cửa sổ phòng;
cường độ ánh sáng trong phòng là 50 µmol.m
2
.s
-1
. Ánh sáng tự nhiên ngoài nhà lưới là
ánh sáng mặt trời chiếu xuống nhà lưới qua lớp lưới che sáng để giảm bớt cường độ
sáng. Cường độ ánh sáng trung bình trong nhà lưới là 120 µmol.m
2
.s
-1

. Cường độ ánh
sáng tự nhiên được ghi nhận vào lúc 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ vào mỗi tuần.
Nhiệt độ phòng 29 ± 1
0
C. Nhiệt độ ngoài nhà lưới 30 ± 1
0
C.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Môi trường sử dụng là môi trường MS được bổ sung nước dừa (80 ml/l), các
vitamin và chất điều sinh trưởng ở các nồng độ tương ứng cho từng nghiệm thức. Môi
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

9
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

trường nuôi cấy được chỉnh ở pH 5,8. Sau đó, phân phối môi trường vào chai thủy tinh
có thể tích 0,5 lít và đưa đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
0
C trong 30 phút dưới áp suất
100 kPa. Sau khi hấp khử trùng môi trường được phân phối vào trong bao nhựa PP với
kích thước 15 cm x 25 cm xếp vuông góc dưới đáy. Mỗi bao nhựa chứa 100 ml môi
trường (Hình 3.1).


3.2.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ in vitro ở
huệ trắng trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên
Mục tiêu
Xác định hiệu quả của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ in vitro của huệ trắng
trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên.

Mô tả thí nghiệm
Chồi được kích thích ra rễ in vitro bằng chất điều hòa sinh trưởng (0 ml/l, NAA
0,5 mg/l, NAA 1 mg/l, atonik 2 ml/l và atonik 4 ml/l) và đặt trong hai điều kiện ánh
sáng (ánh sáng nhân tạo và ánh sáng tự nhiên). Chọn các chồi có chiều cao từ 7-8 cm,
mỗi bao cấy chứa 3 chồi. Sau khi cấy, gắp miệng bao lại và dán kín bằng băng keo
trong. Hai tuần đầu sau khi cấy, chồi cây được giữ trong phòng tăng trưởng. Đến tuần
thứ 3, chồi cây được đặt trong điều kiện ánh sáng tương ứng với từng nghiệm thức.


Hình 3.1 Bao cấy nhựa PP được dùng trong thí nghiệm
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

10
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm thừa số 2 nhân tố, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại, mỗi lặp
lại là 1 bao cấy, mỗi bao cấy chứa 3 chồi.
Bảng 3.1 Bảng phối hợp nhân tố chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện
ánh sáng
Điều kiện ánh sáng
(µmol. m
-2
.s
-1
)
Chất điều hòa sinh trưởng

0

NAA 0,5 mg/l

NAA 1 mg/l
1 mg/l
Atonik 2ml/l
2 ml/l
Atonik 4 ml/l
4 ml/l
Nhân tạo
0T
(ĐC)

N
0,5
T
N
1
T
A
2
T
A
4
T
Tự nhiên
0N
N
0,5
T
N

1
N
A
2
N
A
4
N
0: đối chứng chất điều hòa sinh trưởng
N
0,5
: NAA 0,5 mg/l; N
1
: NAA 1 mg/l
A
2
: atonik 2 ml/l; A
4
: atonik 4 ml/l
T: ánh sáng nhân tạo; N: ánh sáng tự nhiên
Chỉ tiêu theo dõi
Số rễ /chồi: Đếm số rễ hình thành trên mỗi chồi, bắt đầu ghi nhận khi rễ dài 0,3
cm trở lên.
Chiều dài rễ (cm): Ghi nhận chiều dài rễ trên mỗi chồi trong thời gian thí nghiệm.
Đường kính rễ (mm): Ghi nhận đường kính rễ tại phần giữa của đoạn rễ.
Chỉ số SPAD: Chỉ số này được đo bằng SPAD Chlorophyll meter 502 (Minolta)
với đơn vị là SPAD; chỉ số SPAD phản ánh hàm lượng diệp lục của lá. Mỗi cây lấy 1
lá thứ 2 từ trong ra để đo.
Quan sát hình thái giải phẫu của rễ phát sinh in vitro ở các nghiệm thức bằng
phương pháp nhuộm sôn phèn lục iod, chụp ở kính hiển vi quang học (Olympus

optical Co., LTD. Japan) với các độ phóng đại vật kính X4, X10 và X40. Phương pháp
được thực hiện theo qui trình nhuộm hai màu của Hà Thị Lệ Ánh (2000). Với phương
pháp nhuộm này, sôn phèn nhuộm màu hồng vách cellulose và lục iod nhuộm xanh
vách tế bào tẩm mộc tố (lignin).
Các bước thực hiện:
Mẫu rễ sử dụng là mẫu rễ sống lấy từ các nghiệm thức trong thí nghiệm 1. Mỗi
nghiệm thức lấy 1 cây, lấy 1 rễ non nhất. Cắt rễ thành nhiều lát mỏng.
Mỗi lát rễ ngâm dung dịch NaOCl trong 7 phút. Sau đó, rửa sạch bằng nước cất.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

11
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Tiếp tục ngâm các lát rễ trong dung dịch acetic acid trong 5 phút. Sau đó rửa sạch
bằng nước cất.
Nhuộm dung dịch sôn phèn iod trong vòng 15 phút. Rửa lại các lát rễ bằng nước
cất.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Các chỉ tiêu được ghi nhận 1 lần khi thí nghiệm kết thúc.
3.2.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng thích nghi của cây con trong giai đoạn
thuần dưỡng tại nhà lưới
Mục tiêu
Xác định khả năng thích nghi của cây con đã trong giai đoạn thuần dưỡng tại nhà
lưới
Mô tả thí nghiệm
Cây ở từng nghiệm thức từ thí nghiệm 1 tiếp tục được theo dõi khả năng thích
nghi trong thí nghiệm 2.
Lấy cây khỏi bao cấy, cẩn thận rửa sạch agar. Một cây trồng vào một ly nhựa đã
được đục lỗ ở đáy ly để thông nước. Giá thể được dùng là xơ dừa đã được ngâm, xả,
hấp khử trùng và để nguội. Cây con ở các nghiệm thức đều được thuần dưỡng trong

điều kiện giống nhau tại nhà lưới (bức xạ ánh sáng180 µmol.m
-2
.s
-1
và nhiệt độ 31 ±
1
0
C). Cây được tưới phun sương 2 giờ 1 lần. Phun sương bổ sung dinh dưỡng MS một
lần mỗi tuần.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm thừa số được bố trí theo thể thức hoàn ngẫu nhiên, 2 nhân tố, 10
nghiệm thức, 5 lặp lại, mỗi lặp lại 3 cây.
Chỉ tiêu theo dõi
Tỉ lệ sống sót (%): Tính tỉ lệ cây sống sót sau 30 ngày thuần dưỡng.
Chỉ số SPAD: Mỗi cây lấy đại diện 1 lá, lấy lá thứ 2 từ trong ra.
Quan sát hình thái giải phẫu của rễ phát sinh ex vitro ở các nghiệm thức.
Thí nghiệm được tiến hành trong 30 ngày. Tỉ lệ sống và giải phẫu rễ được ghi
nhận vào ngày 30. Chỉ số SPAD được ghi nhận vào ngày 7 và ngày 30.
Xử lý số liệu
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

12
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Số liệu được xử lý bằng phần mềm phân tích thống kê SPSS 16.0 để phân tích
phương sai và phép kiểm định Duncan mức 5%.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

13

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Ảnh hưởng của NAA và atonik lên giai đoạn ra rễ in vitro ở huệ trắng
(Polianthes tuberosa L.) trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên
4.1.1 Hiệu quả của NAA và atonik lên số rễ, chiều dài rễ, đường kính rễ, chỉ số
SPAD của cây huệ trắng in vitro trong điều kiện ánh sáng nhân tạo và tự nhiên
Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1 cho thấy chất điều hòa sinh trưởng và điều
kiện ánh sáng đều có tác động lên số rễ, chiều dài, đường kính và chỉ số SPAD của
chồi in vitro. Các nghiệm thức có số rễ nhiều, chiều dài rễ và chỉ số SPAD lớn thuộc
nhóm nghiệm thức atonik. Trong khi đó, đường kính rễ lớn rơi vào các nghiệm thức
NAA. Những nghiệm thức trong điều kiện ánh sáng tự nhiên thể hiện sự sinh trưởng
rễ và chỉ số SPAD tốt hơn các nghiệm thức trong ánh sáng nhân tạo. Kết quả tương tác
cho thấy, kết hợp giữa nhân tố chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng không ức chế các
chỉ tiêu sinh trưởng được khảo sát của cây trong giai đoạn rễ in vitro.
Số rễ
Các nghiệm thức có số rễ nhiều là atonik 2 ml/l (9,5 rễ) và atonik 4 ml/l (9,0 rễ),
khác biệt thống kê so với những nghiệm thức còn lại. Đối với điều kiện ánh sáng, các
nghiệm thức trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có số rễ nhiều hơn và có ý nghĩa thống
kê so với các nghiệm thức trong điều kiện ánh sáng nhân tạo. Kết quả tương tác cho
thấy nghiệm thức atonik 2 ml/l trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có số rễ cao nhất
(13,1 rễ) và có khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại.
Các nghiệm thức atonik có số rễ nhiều có thể vì atonik đã ức chế hoạt động của
enzyme giải IAA oxidase, từ đó làm tăng lượng IAA nội sinh (Djanaguiraman et al.,
2005) và IAA đã kích thích sự tạo rễ ở chồi cấy. Như vậy, atonik ở nồng độ 2 ml/l và 4
ml/l có thể kích thích huệ trắng ra rễ in vitro. Các nghiệm thức trong ánh sáng tự nhiên
có số rễ nhiều hơn có thể là do ánh sáng tự nhiên đã kích thích sự quang hợp của cây
(Saez et al., 2012). Quang hợp tăng lên dẫn đến việc tạo ra nhiều carbohydrate hơn. Do
đó, chồi cây cần nhiều rễ hơn để tăng khả năng hấp thu nitrogen từ môi trường để đảm

bảo sự ổn định của tỉ lệ C/N (Zheng, 2009). Thêm vào đó, cường độ cao hơn của ánh
sáng tự nhiên làm tăng sự vận chuyển auxin từ chồi đỉnh xuống, kích thích sự tạo rễ
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

14
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

(Halliday et al., 2009). Phân tích kết quả tương tác cho thấy nghiệm thức atonik 2 ml/l
kết hợp với điều kiện ánh sáng tự nhiên là hiệu quả cho việc kích thích rễ in vitro.
Bảng 4.1 Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện ánh sáng lên
số rễ, chiều dài, đường kính rễ và chỉ số SPAD của cây huệ trắng in vitro
thời điểm 60 ngày sau khi cấy
Nhân tố
Số rễ
Chiều
dài
(cm)
Đường kính
(mm)
Chỉ số SPAD
Chất điều hòa sinh trưởng
(A) (A)




0 ml/l (0)
1,9
c

1,5
d

0,3
d

13,8
d

NAA 0,5 mg/l (N
0,5
)
6,7
b

2,0
c

0,9
b

19,7
b

NAA 1 mg/l (N
1
)
6,9
b

2,4
c

1,1
a

18,0
c

Atonik 2 ml/l (A
2
)
9,5
a

3,5
b

0,8
c

22,3
a

Atonik 4 ml/l (A
4
)
9,0
a

4,3
a

0,8
c

22,1
a

Điều kiện ánh sáng (B)






Nhân tạo (T)
5,9
b

2,4
b

0,6
b

14,0
b

Tự nhiên (N)

7,7
a

3,1
a

0,9
a

24,0
a

Tương tác(AxB)




0T
1,9
e

0,8
e

0,3
d

8,5
g

N
0,5
T
6,3
cd

2,1
d

0,7
c

17,7
d

N
1
T
6,4
cd

2,0
d

1,0
b

12,6
f

A
2
T
5,9
d

3,2
b

0,6
c

15,5
e

A
4
T
9,1
b

4,1
a

0,6
c

15,7
e

0N
2,0
e

2,2
cd

0,4
c

19,2
d

N
0,5
N
7,1
cd

2,0
d

1,2
a

21,7
c

N
1

N
7,4
c

2,8
bc

1,3
a

23,5
b

A
2
N
13,1
a

3,9
a

0,9
b

29,2
a

A
4

N
8,9
b

4,5
a

1,0
b

28,5
a

F(A)
**
**
**
**
F(B)
**
**
**
**
F(AxB)
**
*
*
**
CV(%)
14,8

16,3
17,0
7,2
Những số có chữ theo sau giống nhau trong cùng một cột thì không khác biệt thống kê; *: khác biệt ở
mức ý nghĩa 5%, **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%.
Chiều dài rễ
Các nghiệm thức atonik 4 ml/l cho rễ dài nhất và khác biệt có ý nghĩa so với
những nghiệm thức còn lại. Các nghiệm thức trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có rễ
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

15
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

dài hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức trong ánh sáng nhân
tạo. Kết quả tương tác cho thấy các nghiệm thức cho rễ dài và khác biệt có ý nghĩa
thống kê là atonik 2 ml/l trong ánh sáng tự nhiên và các nghiệm thức atonik 4 ml/l ở
hai điều kiện ánh sáng.
Như đã thảo luận, chồi cấy trong môi trường có atonik có thể có lượng IAA nội
sinh cao, tế bào rễ được kéo dài theo chiều dọc, dẫn đến chiều dài rễ gia tăng. Kết quả
cho thấy, nghiệm thức atonik 4 ml/l có tác dụng rõ rệt lên sự kéo dài rễ in vitro. Các
nghiệm thức ở điều kiện ánh sáng tự nhiên có rễ dài hơn có thể là do quang phổ đầy đủ
và bức xạ cao của ánh sáng tự nhiên đã giúp cây quang hợp tốt, dẫn đến tăng cường sự
sinh trưởng và kéo dài của rễ để tăng diện tích tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng
(Webb, 1976). Kết quả tương tác cho thấy sử dụng atonik 2 ml/l trong điều kiện ánh
sáng tự nhiên và atonik 4 ml/l ở hai điều kiện ánh sáng là thích hợp cho sự kéo dài của
rễ in vitro.
Đường kính rễ
Các nghiệm thức NAA 1 mg/l cho đường kính rễ lớn nhất và khác biệt thống kê
với những nghiệm thức còn lại. Đường kính rễ ở các nghiệm thức ánh sáng tự nhiên
lớn hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức trong ánh sáng nhân

tạo. Kết quả tương tác cho thấy, các nghiệm thức NAA 0,5 mg/l, NAA 1 mg/l trong
ánh sáng tự nhiên cho đường kính rễ lớn hơn và có nghĩa thống kê với những nghiệm
thức còn lại.
Nghiên cứu trên cây Karwinskia Humboldtiana in vitro cho thấy, rễ ở các
nghiệm thức có bổ sung NAA có đường kính rễ lớn (Kollarova et al, 2004). Kết quả
tương tự cũng được ghi nhận ở đường kính rễ của các nghiệm thức NAA trong thí
nghiệm này. Như vậy, việc bổ sung NAA vào môi trường kích thích sự tăng trưởng
theo chiều ngang của rễ cây huệ trắng in vitro. Đường kính rễ ở các nghiệm thức trong
ánh sáng tự nhiên cao hơn có thể là do quang phổ và bức xạ cao của ánh sáng tự nhiên
đã tác động tích cực lên sự sinh trưởng và trao đổi chất của của cây, làm tăng đường
kính bộ rễ (Taiz và Zeiger, 2002). Kết quả tương tác cho thấy, sử dụng NAA 0,5 mg/l
và NAA 1 mg/l trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có tác động tăng đường kính rễ rõ
rệt.
Chỉ số SPAD
Đối với chất điều hòa sinh trưởng, các nghiệm thức atonik 2 ml/l và atonik 4 ml/l
cho chỉ số SPAD cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường Đại Học Cần Thơ

16
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chỉ số SPAD trung bình của các nghiệm thức ánh sáng tự nhiên cao hơn khác biệt có ý
nghĩa so với các nghiệm thức ánh sáng nhân tạo. Nghiệm thức atonik 2 ml/l và atonik
4 ml/l trong điều kiện ánh sáng tự nhiên cho kết quả SPAD cao và khác biệt có ý nghĩa
thống kê với các nghiệm thức còn lại.
Như đã thảo luận ở phần 2.3, chỉ số SPAD thể hiện hàm lượng diệp lục lá, chỉ số
SPAD càng cao thì hàm lượng diệp lục lá càng cao (Ling et al., 2011). Theo nghiên
cứu của Przybysz et al. (2010) và Yan et al. (2011), các nitrophenol trong atonik có
tác dụng đẩy nhanh sự trao đổi chất của cây và kích thích sự sinh tổng hợp diệp lục tố,
dẫn đến sự gia tăng hàm lượng diệp lục lá. Các nghiệm thức atonik 2 ml/l và atonik 4

ml/l có chỉ số SPAD cao nghĩa là các nghiệm thức này có hàm lượng diệp lục cao hơn
các nghiệm thức còn lại. Đối với sự tác động của ánh sáng, nghiên cứu trên cây
Castanea sativa in vitro cho thấy chồi ở bức xạ 150 µmol.m
-2
.s
-1
có hàm lượng diệp
lục cao hơn chồi ở bức xạ 50 µmol.m
-2
.s
-1
(Saez et al., 2012). Hơn nữa, ánh sáng tự
nhiên cũng cung cấp đủ quang phổ hấp thu của diệp lục, điều này góp phần gia tăng
sự sinh tổng hợp diệp lục lá (Taiz và Zeiger, 2002). Kết quả phân tích tương tác cho
thấy, sử dụng atonik ở 2 ml/l và 4 ml/l kết hợp ánh sáng tự nhiên là hiệu quả cho sự
tăng hàm lượng diệp lục lá ở huệ trắng in vitro.
4.1.2 Hình thái của rễ in vitro
Có thể thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hình thái rễ ở các nghiệm thức. Những cây
trong môi trường có atonik 2 ml/l và atonik 4 ml/l cho ra loại rễ nhỏ, dài (Hình 4.1 G,
H, I, J). Điều tương tự được ghi nhận ở các nghiệm thức đối chứng (Hình 4.1 A, B).
Tuy nhiên, những nghiệm thức có sử dụng NAA lại cho kiểu hình rễ to, ngắn (Hình
4.1 C, D, E, F). Cùng một nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, hình thái rễ ở các
nghiệm thức trong điều kiện ánh sáng tự nhiên và nhân tạo là như nhau (Hình 4.1).