tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của protease chịu kiềm từ bacillus sp. sv1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC




TINH SẠCH VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA
PROTEASE CHỊU KIỀM TỪ BACILLUS sp. SV1






CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG NGUYỄN CHÂU SANG
MSSV: 3092505
LỚP: CNSHTT K35

Cần Thơ, Tháng 7/2013






Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)


Dương Thị Hương Giang Nguyễn Châu Sang

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)












Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


LỜI CẢM TẠ
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Dương Thị Hương Giang
đã tận tình hướng dẫn chuyên môn, giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi để
em hoàn thành bài luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy Cô giảng viên Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học của Trường Đại học Cần Thơ đã truyền thụ cho em
nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt những năm học tập và nghiên cứu
tại Viện.
Em xin cảm ơn anh Nguyễn Văn Tính, bạn Nguyễn Hoàng Vũ đã tận tình giúp
đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô và
anh chị phụ trách các Phòng thí nghiệm của Viện đã tạo điều kiện cho em sử dụng
trang thiết bị để hoàn thành luận văn.
Và nhất là gửi lời tri ân đến cha mẹ đã luôn ở bên con, ủng hộ về vật chất lẫn tinh
thần giúp con vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn này.

Cần Thơ, ngày 03/12/2013
Nguyễn Châu Sang












Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


TÓM LƯỢC

Protease kiềm tính từ Bacillus sp. SV1 đã được tinh sạch bằng phương pháp tủa

ammonium sulfate bão hòa ở nồng độ 60%, kết hợp sắc ký trao đổi ion dương SP-
streamline và sắc ký trao đổi ion âm Unosphere Q với đệm phosphate pH 7,8. Bằng kỹ
thuật SDS-PAGE và điện di nhuộm hoạt tính với cơ chất casein, protease được xác
định là một đơn phân và có khối lượng phân tử khoảng 19,2 kDa. Các thí nghiệm khảo
sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính cho thấy, protease này hoạt động
mạnh ở pH tối ưu 9,0 và nhiệt độ tối ưu 45
o
C. Trong điều kiện thí nghiệm, sự có mặt
của 2,5mM ion Ca
2+
làm tăng hoạt tính protease gấp hai lần, bên cạnh đó protease
này có thể bị ức chế hoàn toàn bởi 2,0 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), có
khả năng đây là một serine protease .
Từ khóa: Bacillus sp. SV1, đơn phân, protease kiềm tính, sắc ký, tinh sạch

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


MỤC LỤC
Trang
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Phân loại protease 3
2.1.1. Exopeptidase 3
2.1.1.1. Aminopeptidase 3
2.1.1.2. Carboxypeptidase 4
2.1.2. Endopeptidase 4
2.1.2.1. Serine protease 4
2.1.2.2. Aspatic protease 5
2.1.2.3. Cystein/thiol protease 5
2.1.2.4. Metaloprotease 6
2.2. Protease chịu kiềm 7
2.3. Các đặc điểm của alkaline protease. 8
2.3.1. Nhiệt độ tối ưu 8
2.3.1. pH tối ưu 8
2.3.3. Điểm đẳng điện (isoelectric point) 8
2.3.4. Trọng lượng phân tử 9

2.3.5. Ion kim loại và các chất ức chế 9
2.4. Ứng dụng của protease kiềm tính 10
2.4.1. Công nghiệp thực phẩm 10
2.4.2. Chất tẩy rửa 10
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


2.4.3. Thuộc da 10
2.4.4. Y học 10
2.4.5. Xử lý môi trường 11
2.4.6. Ứng dụng khác 11
2.5. Các phương pháp tinh sạch protease 11
2.5.1. Tủa bằng amonium sulfate 11
2.5.2. Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography) (Richard and Deuscher, 2010)
13
2.6. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) (Hames, 1998) 15
2.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16
2.6.1. Trong nước 16
2.6.2. Ngoài nước 17
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1. Phương tiện nghiên cứu 19
3.1.1. Địa điểm-thời gian 19
3.1.2. Nguyên liệu 19
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ 19
3.1.4. Hóa chất 19
3.2. Phương pháp nghiên cứu 19
3.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn, thu nhận protease thô 19
3.2.2. Tinh sạch protease từ dịch nuôi cấy 20
3.2.2.1. Kết tủa phân đoạn protease bằng ammonium sulfate bão hòa 20
3.2.2.2. Tinh sạch enzyme protease bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 20

3.2.3. Xác trọng lượng và độ tinh sạch của protease 21
3.2.4. Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease 21
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của protease 21
3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng ion Ca
2+
lên hoạt động của protease 22
3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế PMSF đến hoạt động của protease 22
3.2.8. Phân tích thống kê 22
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
4.1. Tinh sạch protease 23
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT


4.1.1. Kết tủa bằng ammonium sulfate 23
4.1.2. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion (ion exchange chrotomagraphy)
24
4.1.2.1. Sắc ký trao đổi ion dương 24
4.1.2.2. Sắc ký trao đổi ion âm 25
4.2. Khảo sát một số yếu tố pH, nhiệt độ, ion Ca
2+
và chất ức chế PMSF đến hoạt động
của protease 27
4.2.1. Ảnh hưởng của pH 27
4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của protease 28
4.2.3. Ảnh hưởng của ion Ca
2+
lên hoạt động của protease 29
4.2.4. Ảnh hưởng của PMSF lên hoạt động của protease 29
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31
5.1. Kết luận 31

5.2. Đề nghị 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC 39




Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

v
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Thành phần môi trường Horikoshi I 5
Bảng 2. Bảng tổng kết các bước tinh sạch protease 27
Bảng 3. Ảnh hưởng của ion Ca
2+
đến hoạt động của protease 29

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

vi
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Tỷ lệ tiêu thụ enzyme trên toàn thế giới 1
Hình 2. Phân loại protease dựa vào vị trí xúc tác trên cơ chất. 7
Hình 3. Ảnh hưởng nồng độ muối lên tính tan của protease 12
Hình 4. Kết quả điện di trên gel arylamide (A) và điện di nhuộm hoạt tính trên cơ chất
casein của các phân đoạn protein (B) 23
Hình 5. Biểu đồ sắc ký trên cột SP-streamline của phân đoạn protein 60% bão hòa 24
Hình 6. Biểu đồ sắc ký trên cột UnosphereQ của phân đoạn protein 60% bão hòa 25
Hình 7. Kết quả điện di các phân đoạn protein sau khi qua cột sắc ký (A) và kết quả
điện di nhuộm hoạt tính trên gel casein (B) 26
Hình 8. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của protease 27
Hình 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của protease 28
Hình 10. Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của protease 29

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

vii
TỪ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulfate
AS Ammonium sulfate
BME β-mercaptoethanol
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
OD Optical Density
pI Isoelectric point
PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide gel electrophoresis

TCA Trichloroacetic acid
TEMED N, N, N
’
, N
’
–tetra methyl ethylene diamine
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


1
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Enzyme là các chất xúc tác sinh học được sử dụng rộng rãi trong đời sống và sản
xuất. Protease (EC.3.4.21-24, 99; còn được gọi là peptidase hay proteinase) là nhóm
các enzyme có khả năng phân hủy protein thành những thành phần đơn giản hơn như
các chuỗi polypeptide ngắn hay các acid amin tự do nhờ vào khả năng cắt đứt các liên
kết peptide (-CO-NH-). Dựa vào hoạt tính ở những điều kiện pH khác nhau, protease
được chia thành 3 nhóm bao gồm: protease acid, protease trung tính và protease kiềm
tính. Theo đó, protease acid hoạt động tốt nhất ở pH 2,0 đến 5,0; protease có pH tối ưu
vào khoảng 7 được gọi là protease trung tính; protease kiềm tính có hoạt tính tốt nhất
khi pH lớn hơn 8 (pH kiềm) (Khan et al, 2011).

Hình 1. Tỷ lệ tiêu thụ Enzyme trên toàn thế giới
(*Nguồn: Rao et al., 2008)
Ngày nay, protease được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghiệp như:
sản xuất chất tẩy rửa, chế biến thực phẩm, thuộc da, dược phầm và xử lý môi trường.

Theo ước tính, ngành công nghiệp enzyme thu về khoảng 1 tỷ đô la vào năm 1995,
trong đó lợi nhuận từ protease chiếm khoảng 60% (Rao et al., 1998). Tổ chức Global
Industry Analysts (2013) đã dự đoán lợi nhuận sẽ là trên 3,74 tỷ đô la vào năm 2015.
Theo một báo cáo của Horikoshi (1999), lượng protease trong lĩnh vực giặt tẩy tương
đương 30-40% tổng lượng protease trên toàn thế giới (chưa tính đến các enzyme dùng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


2
trong dược phẩm). Một lượng lớn các enzyme trong các chất tẩy rửa này thuộc
protease kiềm tính. Protease kiềm tính có thể hoạt động trong một khoảng pH rộng-từ
trung tính đến kiềm, đồng thời có nhiệt độ tối ưu trung bình vào khoảng 60
o
C (Rao et
al., 1998). So với các loại protease trung tính, đặc tính này không chỉ tỏ ra ưu việt
trong lĩnh vực sản xuất chất tẩy rửa mà còn trong những quá trình sản xuất khác. Bên
cạnh đó, protease kiềm tính không bị mất hoạt tính dưới tác động của chất ức chế
EDTA hay các tác nhân oxi hóa như sodium perborate (Cowan, 1994).
Enzyme nói chung và protease nói riêng đóng vai trò quan trọng trong các lĩnh
vực sản xuất và đời sống của con người. Trước những đòi hỏi ngày càng cao về hiệu
quả sản xuất cũng như những điều kiện trong các quy trình công nghiệp và ảnh hưởng
của biến đổi khí hậu, nhu cầu về nguồn enzyme có hoạt tính cao hơn, bền hơn được
đặt ra như một lẽ tất yếu. Trong khoảng 3000 loại enzyme đã được nghiên cứu chủ yếu
đều thuộc nhóm trung tính (Genckal, 2004). Những enzyme này chỉ hoạt động tốt
trong một khoảng pH và nhiệt độ rất hạn chế, do vậy chúng vẫn chưa là nguồn enzyme
lý tưởng cho sản xuất. Chính vì lẽ đó, tìm kiếm những enzyme thay thế mới từ nguồn

vi sinh vật vô cùng đa dạng là xu hướng chung trên thế giới và ở Việt Nam. Một trong
những loại enzyme có thể đáp ứng được yêu cầu trên đó là protease kiềm tính. Trên cơ
sở đó, đề tài ''Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của protease chịu kiềm từ
Bacillus sp.SV1'' được tiến hành.

1.2. Mục tiêu đề tài
Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của protease chịu kiềm bởi dòng Bacilus sp.SV1
mới, được phân lập từ phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện NC&PT CNSH,
Đại học Cần Thơ.



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


3
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Phân loại protease
Trong hệ thống phân loại enzyme sinh học, proteases được xếp vàp phân nhóm 4
nhóm 3, nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân có sự tham gia của nước
(International Union of Biochemistry and molecular Biology, 1992). Tuy nhiên, qui
tắc này không được tuân thủ một cách nghiêm ngặt do sự đa dạng về hoạt động và cấu
trúc của protease là rất lớn. Trên thực tế, những enzyme này được phân loại dựa trên
các tiêu chuẩn như: kiểu phản ứng xúc tác, bản chất hóa học của tâm xúc tác, mối quan
hệ tiến hóa dựa trên cấu trúc của chúng (Barett, 1994).
Dựa vào vị trí phân cắt liên kết trên cơ chất, protease được chia thành hai nhóm

lớn là exopeptidase và endopeptidase. Dựa vào thành phần acid amin hiện diện ở tâm
hoạt động, protease được chia thành 4 nhóm là: serine protease, aspartic protease,
cysteine protease (hay thiol protease) và metalloprotease (Harley, 1960). Bên cạnh đó,
còn có một số protease đặc biệt không thuộc vào bất cứ nhóm nào kể trên. Ví dụ,
protease phụ thuộc ATP nhất thiết phải có ATP để hoạt động (Menon & Goldberg,
1987). Dựa vào trình tự acid amin, protease lại được xếp vào 5 họ khác nhau, các họ
này lại được phân chia thành các nhánh là tập hợp các protease có cùng một nguồn gốc
(Sloma et al., 1988). Mỗi họ protease được ký hiệu bởi một chữ cái đại diện cho loại
phản ứng mà chúng xúc tác: S, A, C, M hay U lần lượt là serine, aspartic, cysteine,
metallo hay chưa rõ (unknown).
2.1.1. Exopeptidase
Exopeptidase là những protease chỉ hoạt động gần hai đầu của chuỗi polypeptide.
Tùy vào vị trí cắt ở đầu N hay C mà chúng được gọi là aminopeptidase hoặc
carboxypeptidase.
2.1.1.1. Aminopeptidase
Aminopeptidase cắt ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide và giải phóng một acid
amin tự do hoặc một đoạn peptide ngắn có từ 2 đến 3 acid amin. Aminopeptidase hiện
diện trong rất nhiều loài vi sinh vật bao gồm vi khuẩn và nấm mốc (Watson, 1976).
Nhìn chung, chúng là những enzyme nội bào, tuy nhiên vẫn có báo cáo nghiên cứu về
aminopeptidase ngoại bào ở A. oryzae (Labbe et al., 1974).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


4
2.1.1.2. Carboxypeptidase
Khác với aminopeptidase, carboxypeptidase lại cắt ở đầu C trên chuỗi

polypeptide và giải phóng một acid amin tự do hoặc đoạn peptide gồm 2 acid amin.
Dựa vào acid amin có mặt ở tâm hoạt động mà carboxypeptidase có thể được chia
thành 3 nhóm: serine, cysteine và metallocarboxypeptidase.
2.1.2. Endopeptidase
Endopeptidase cắt tại những liên kết peptide nằm bên trong, cách xa hai đầu N và
C của chuỗi polypeptide. Sự có mặt của những nhóm amino hoặc carboxyl ảnh hưởng
không tốt đến hoạt động của enzyme. Chúng được chia thành 4 nhóm dựa theo cơ chế
xúc tác gồm: serine protease, aspartic protease, cysteine protease và metalloprotease.
2.1.2.1. Serine protease
Serine protease là những protease có sự hiện diện của nhóm serine tại tâm hoạt
động. Chúng rất đa dạng và đều được tìm thấy ở virus, vi khuẩn và sinh vật nhân thực.
Chứng tỏ tầm quan trọng của serine protease đối với những sinh vật này. Dựa trên
những điểm giống nhau về cấu trúc, serine protease được phân thành 20 họ khác nhau,
những họ này lại được phân chia thành 6 nhánh - mỗi nhánh có một nguồn gốc chung
(Berett, 1994). Các protease của 4 nhánh chymotrypsin (SA), subtilis (SB),
carboxypeptidase C (SC) và Escherichia D-Ala-D-Ala peptidase (SE) hoàn toàn không
có liên hệ với nhau về mặt tiến hóa, tuy nhiên chúng có cùng một cơ chế phản ứng với
tác chất do sự hiện diện của bộ ba acid amin: serine (nucleophile), aspartate
(electrophile) và histidine (base). Một số serine proteaes còn bị ức chế bởi các hợp
chất thiol như p-chloromercuribenzoate (PCMB) nếu có sự hiện diện của cysteine gần
tâm phản ứng.
Serine protease bị ức chế hoàn toàn bởi 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI), L-
3carboxytrans 2,3-epoxypropyl-leucylamido (4-guanidine) butane (E.64),
diisopropylflourophosphate (DFP), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) và tosyl-L-
lysine chloromethyl ketone (TLCK).
Serine protease kiềm tính (Subtilisin): những protease này cắt liên kết peptide ở
vị trí đầu carboxyl của các acid amin như: tyrosine, phenylalanine hoặc leucine. pH tối
ưu khoảng 10, khối lượng phân tử khoảng từ 15 đến 30 kDa. Subtilisin Carlsberg, sản
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


5
xuất bởi Bacillus licheniformis được phát hiện vào năm 1947 tại phòng thí nghiệm
Carlsberge, được sử dụng trong công nghiệp giặt tẩy. Sản lượng hàng năm vào khoảng
500 tấn protease thô.
2.1.2.2. Aspatic protease
Aspartic protease, thường được biết đến như protease acid, là những
endoprotease có những nhóm aspartic acid tại tâm hoạt động. Những enzyme này được
xếp vào 3 họ: pepsin (A1), retropepsin (A2) và những enzyme từ pararetrovirus (A3)
(Barett, 1995).
Hầu hết các aspartic protease đều hoạt động tốt nhất ở pH thấp (pH 3-4). Chúng
bị ức chế bởi pepstatin (Fitzgerald et al, 1990). Nếu có sự hiện diện của ion đồng, các
protease này sẽ bị mất hoặt tính bởi các hợp chất diazoetone như diazoacetyl-DL-
norleucine methyl ester (DAN) and 1,2-epoxy-3(p-nitrophenoxy)propane (EPNP).
Aspartic protease cũng có thể được chia thành 2 nhóm lớn: 1. các enzyme giống với
pepsin được sản xuất bởi Aspergillus, Penicillum, Rhizopus và Neurospora và 2. Các
enzyme giống với rennin sản xuất bởi Endothia và Mucor spp. (Rao et al., 1998).
2.1.2.3. Cystein/thiol protease
Cysteine protease có ở cả sinh vật nhân sơ và nhân thực. Có khoảng 20 họ
cystein protease đã được công nhận. Hoạt động của các enzyme này phụ thuộc vào
nhóm 2 acid amin tại tâm phản ứng. Trật tự của chúng (Cis-His hay His-Cys) ở các họ
protease là khác nhau (Berett, 1994). Nhìn chung, cysteine protease chỉ hoạt động
được khi có sự hiện diện của các nhân tố có tính khử như HCN hoặc cysteine. Chúng
được chia thành 4 nhóm lớn: 1. các enzyme giống papain, 2. các enzyme giống trypsin
(cắt ở vị trí có nhóm arginine), 3 các enzyme chuyên biệt nhận biết acid glutamic và 4.
các enzyme khác.

Papain là một cystein protease phổ biến. Cũng giống như các cysteine protease
khác, papain có pH tối ưu ở mức trung tính. Tuy nhiên, một số protease trong
lysosome lại hoạt động tốt nhất ở pH acid. Những enzyme này bị bất hoạt bởi các hợp
chất sulfhydryl, tuy nhiên hoàn toàn không bị ảnh hưởng bởi diisopropyl
fluorophosphate (DFP) và các hợp chất tạo phức với ion kim loại (chelating agent)
(Rao et al., 1998).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


6
2.1.2.4. Metaloprotease
Metalloprotease là nhóm đa dạng nhất trong tất cả các loại protease (Berett,
1995). Đặc điểm nổi bậc nhất của nhóm này là cần những ion kim loại hóa trị hai để
hoạt động. Chúng thuộc nhiều nguồn khác nhau như collagenase từ những sinh vật bậc
cao, những chất độc chết người trong nọc rắn, và thermolysin từ vi khuẩn (Hibbs et al.,
1895; Shannon, 1989; Weaver et al., 1977; Wilhelm, 1987). Đã có khoảng 30 họ
metalloprotease đã được công nhận, trong số đó 17 họ thuộc nhóm endopeptiase, 12
họ thuộc exoprotease và một họ gồm cả exo và endo protease. Dựa vào sự chuyên hóa
trong hoạt động, metalloprotease có thể được phân thành 4 nhóm, 1. neutral, 2.
alkaline, 3. mexobacter II , 4. mexobacter II. Protease trung tính chuyên biệt nhật biết
các amino acid có nhóm R kị nước trên chuỗi polypeptide, trong khi đó thì dãy chuyên
hóa của protease kiềm tính lại rộng hơn (Rao et al., 1998). Myxobacter I chuyên hóa
đối với các amino acid có kích thước nhỏ, không phụ thuộc vào vị trí của nó trong liên
kết peptide còn myxobater II thì chỉ cắt các liên kết tại vị trí amino acid lysine trên liên
kết peptide.
Một metalloprotease quan trọng là collagenase. Enzyme này lần đầu tiên được

phát hiện trong dịch nuôi cấy loài vi khuẩn kỵ khí Clostridium hystolyticum như là một
sản phẩm thừa. Hoạt động của collagenase có tính chuyên biệt rất cao. Trong khi
collagen và gelatin bị phân hủy bởi collagenase thì những protein thông thường khác
hoàn toàn không hề bị ảnh hưởng (Rao et al., 1998).








Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


7

Hình 2. Phân loại protease dựa vào vị trí xúc tác trên cơ chất
(*Nguồn: Rawling et al., 2010)
- Mỗi hình tròn biểu thị cho một amino acid trong chuỗi polypeptide;
- Mũi tên màu đen cho thấy vị trí cắt đầu tiền;
- Mũi tên màu trắng tương ứng các vị trí cắt tiếp tho;
- Hình tròn màu đen là amino acid được cắt đầu tiên, hình tròn màu xám là các
amino acid sau đó
2.2. Protease chịu kiềm
Protease kiềm tính (EC.3.4.21-24, 99) có thể hoạt động trong khoảng pH trung

tính đến kiềm. Những enzyme này thuộc nhóm serine protease (tâm hoạt động chứa
nhóm serine) hay nhóm metalloprotease. Chúng có thể được tinh sạch từ nhiều nguồn
khác nhau bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật (Rao et al., 1998). Tuy nhiên, vi
sinh vật vẫn là một nguồn sản xuất protease chính trong thực tiễn, đặc biệt là vi khuẩn.
Những protease này vẫn hoạt động tốt ở pH cao, độ chuyên biệt cơ chất rộng, nhiệt độ
tối ưu vào khoảng 60
o
C. Trong khi đó, protease từ nấm mốc có tốc độ xúc tác chậm và
chịu nhiệt kém hơn hẳn. So với các sinh vật nhân thực, sự vượt trội trong sản xuất của
vi khuẩn còn thể hiện ở tốc độ sinh trưởng nhanh, không đòi hỏi không gian rộng và
nhất là có thể dễ dàng biến đổi di truyền để thu nhận những enzyme có tính chất mong
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


8
muốn cho các ứng dụng khác nhau. Hầu hết các protease đã được sản xuất thương mại
hiện nay, chủ yếu là trung tính và kiềm tính, đều được sản xuất từ chủng Bacillus
(Subtilisin)
2.2.1. Protease chịu kiềm từ Bacillus sp.
Bacillus là những vi khuẩn gram dương, hiếu khí, hình que và có khả năng hình
thành nội bào tử. Vi khuẩn bacillus chịu kiềm có thể tìm thấy ở hầu hết các môi trường
có pH kiềm như đất soda, hồ muối soda và lớp bùn sâu dưới lòng biển. Đặc biệt, chúng
còn được tìm thấy trong những môi trường có pH trung tính (Horikoshi, 1999).
Những chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus là nguồn sản xuất của nhiều enzyme
quan trọng. Chúng có thể được nuôi ủ ở điều kiện nhiệt độ và pH cao để có thể tạo ra
được những enzyme có hoạt tính cao và bền. Một số đại diện tiêu biểu có khả năng sản

xuất protease kiềm tính cao có thể kể đến là những chủng thuộc loài B. lincheniformis,
B. subtilis, B. amloliquefaciens, và B. Majovensis (Gupta et al., 2002)
2.3. Các đặc điểm của protease kiềm tính.
2.3.1. Nhiệt độ tối ưu
Nhiệt độ tối ưu của protease chịu kiềm nằm trong khoảng 50-70
o
C. Đặc biệt,
protease từ chủng Bacillus sp. B189 có nhiệt độ tối ưu đến 85
o
C. Những chủng
Bacillus, Streptomyces và Thermus sản xuất những protease có độ bền cao với nhiệt độ
và việc bổ sung Ca
2+
có thể giúp gia tăng sự chịu nhiệt của enzyme (Gupta et al.,
2002).
2.3.2. pH tối ưu
pH tối ưu của protease chịu kiềm thông thường ở khoảng 9-11. Một số protease
đặc biệt có pH tối ưu rất cao vào khoảng 11.5 (Yum et al., 1994; Tobe et al., 1995;
Takami, 1990), pH 11-12 (Horikoshi, 1971; Kumar, 1997), pH 12.3 (Nakanishi et al.,
1974; Kobayashi et al.; 1995 201 ) và pH 12-13 (Fujiwara et al., 1993).
2.3.3. Điểm đẳng điện (isoelectric point)
Điểm đẳng điện là giá trị pH mà ở phân tử enzyme không mang điện, nói cách
khác tổng điện tích âm và điện tích dương bằng không. Tại điểm đẳng điện, độ tan của
enzyme là thấp nhất. Trong dung dịch, những nhóm mang điện tương tác với những
phân tử nước phân cực và giúp phân tử protease tan. Do đó, phân tử protease với ít
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

9
nhóm mang điện tích và nhiều nhóm kỵ nước sẽ tan ít hơn trong nước. Giá trị pH càng
xa so với pI, số lượng nhóm mang điện tích tăng lên và do đó cũng làm tăng độ tan.
Từ đó, giá trị pI của một phân tử enzyme đặc trưng cho độ tan cũng như sự tương tác
giữa những enzyme với nhau (Richard and Deutscher, 2010).
Protease kiềm tính có pI cao nên thường được tinh sạch bằng phương pháp trao
đổi ion dương (Kumar and Takagi., 1999).
2.3.4. Trọng lượng phân tử
Trọng lượng phân tử của protease chịu kiềm thường nằm trong khoảng từ 15-30
kDa ( Forgaty et al., 1974). Một vài protease có trọng lượng cao hơn vào khoảng 31,6
kDa (Freeman, 1993), 33 kDa (Larcher et al., 1996; Samal et al., 1991); 36 kDa
(Tsujibo et al., 1990) và 45 kDa (Kwon et al., 1994). Tuy nhiên, protease chịu kiềm từ
Kurthia spiroforme có trọng lượng phân tử rất thấp, chỉ 8 kDa (Steele et al., 1992). Ở
một vài loài Bacillus, có sự xuất hiện nhóm nhiều band sau khi thực hiện kỹ thuật điện
di với protease của chúng (Kumar, 1997; Kobayashi, 1995; Zuidweg et al., 1972).
Điều này có thể là do sự biến đổi gốc amine ở các nhóm glutamine và asparagine hoặc
do sự tự thủy phân của các phân tử protease (Kobayashi, 1996).
2.3.5. Ion kim loại và các chất ức chế
Để protease kiềm tính hoạt động tối ưu, cần thiết phải có sự hiện diện của các ion
kim loại hóa trị II như Ca
2+
, Mg
2+
và Mn
2+
hoặc sự kết hợp đồng thời các ion này. Ion
kim loại cũng cho thấy khả năng làm tăng tính bền nhiệt của enzyme. Theo Kumar và
Takagi (1999), những ion kim loại giúp bảo vệ và đóng vai trò quan trọng trong việc

duy trì cấu trúc của enzyme ở nhiệt độ cao.
Protease kiềm tính bị ức chế hoàn toàn bởi phenylmethylsulfonyl fluoride
(PMSF) và diisopropyl flourophosphate (DFP). Theo đó, PMSF phản ứng với nhóm
serine ở tâm hoạt động làm cho enzyme mất hoạt tính hoàn toàn. Những protease loại
này được xếp vào nhóm serine protease. Một số protease khác lại cho thấy sự phụ
thuộc vào các ion kim loại do sự ức chế hoặc giảm hoạt tính bởi những chất tạo phức
với ion kim loại (chelating agents) như EDTA. Những chất ức chế cysteine protease
không ảnh hưởng nhiều đến hoạt động của protease kiềm tính từ Bacillus spp., mặc dù
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


10
chúng vẫn có tác dụng ức chế đối với những protease kiềm tính từ Streptomyces sp.
(Kumar and Takagi, 1999).
2.4. Ứng dụng của protease kiềm tính
2.4.1. Công nghiệp thực phẩm
Trong những năm gần đây, việc sử dụng enzyme để thủy phân đậu nành, gelatin,
casein và những loại protein khác để sản xuất thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao
ngày càng trở nên phổ biến. Đơn cử như protease chịu kiềm từ B. amyloliquefaciens
được sử dụng để sản xuất thực phẩm giàu methionine từ đậu gà (George et al., 1997).
Ngoài ra, protease còn có thể đóng vai trò như chất làm mềm thịt, đặc biệt là thịt bò.
Elastase kiềm tính (Takagi et al., 1992) và protease chịu kiềm chịu nhiệt (Wilson et al.,
1992) có khả năng thủy phân loại các mô liên kết cũng như protein dạng sợi ở các bó
cơ.
2.4.2. Chất tẩy rửa
Ứng dụng quan trọng nhất của các protease kiềm tính là trong công nghiệp chất

tẩy rửa. Enzyme được sản xuất trong ngành công nghiệp này chiếm đến 30% toàn bộ
lượng enzyme sản xuất ra trên toàn thế giới. Rất nhiều protease từ Bacillus đã được
thương mại hóa. Để được sử dụng như một protease bổ sung vào chất tẩy rửa, chúng
phải đáp ứng những điều kiện sau đây: (i) có phổ pH hoạt động rộng, (ii) vẫn giữ hoạt
tính ở pH cao, (iii) hoạt động tốt và ổn định khi có mặt các chất hoạt động bề mặt, (iv)
độ ổn cao đối với các chất kềm giữ ion kim loại (chelating agent) và chất tẩy trắng
(baleaching agent), (v) hoạt động tốt ở một phổ nhiệt độ rộng, (vi) thời gian giữ được
hoạt tính lâu dài, (vii) giá thành sản xuất thấp (Horikoshi, 2011)
2.4.3. Thuộc da
Protease kiềm tính cũng đã được sử dụng trong ngành công nghiệp thuộc da. Quá
trình này diễn ra ở điều kiện pH từ 8 đến 10.
2.4.4. Y học
Protease kiềm tính cũng được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm dược
phẩm quan trọng. Kudrya và Simonenko (1994) đã phát hiện khả năng phân hủy
eslatin của elastoterase kiềm tính từ B. subtilis 316M. Sau đó đã được sử dụng trong
chữa trị bỏng, vết thương nhiễm trùng, nổi nhọt và mưng mủ. Kim et al., (2001) cũng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


11
đã công bố việc sử dụng protease kiềm tính từ Bacillus sp. CK 11-4 như một tác nhân
làm tan các cục máu đông.
2.4.5. Xử lý môi trường
Protease kiềm tính được sử dụng để xử lý chất thải từ nhiều nguồn khác nhau, từ
các hoạt động sản xuất công nghiệp cho đến sinh hoạt ở khu dân cư. Những enzyme
này giúp hòa tan protein trong chất thải trong quá trình gồm nhiều bước để thu nhận lại

dịch thủy phân có giá trị dinh dưỡng cao dùng làm thức ăn cho cá hoặc vật nuôi (
Shoemaker, 1986; Shih, 1993).
Protease từ một chủng B. subtilis đã được ứng dụng để xử lý lông từ các lò giết
mổ gia cầm. Lông gia cầm (chiếm khoảng 5% khối lượng cơ thể của chúng và có thể
trở thành một nguồn thực phẩm giàu đạm trong chăn nuôi) bị phân hủy hoàn toàn sau
kết hợp xử lý với NaOH, nghiền nhỏ và thủy phân bằng enzyme (Dalev, 1994). Tương
tự, rất nhiều protease kiềm tính khác đã được sử dụng trong công nghiệp sản xuất thức
ăn gia súc và thủy phân rác thải sinh hoạt (Mukhopadhyay and Chandra, 1992).
2.4.6. Ứng dụng khác
Một ứng dụng rất thú vị của protease kiềm tính được phát triển bởi Fujiwara et
al. (1987, 1991, 1993). Họ đã sử dụng protease B18’ để phân hủy lớp gelatin bao bọc
ngoài của tấm phim X quang, nhờ đó bạc có thể được phục hồi. Protease này có pH tối
ưu vào khoảng 13 và nhiệt độ tối ưu ở 85
o
C. Enzyme phân hủy cơ chất glaletin tốt
nhất ở pH 10.
2.5. Các phương pháp tinh sạch protease
2.5.1. Tủa bằng amonium sulfate
Tủa bằng ammonium sulfate là phương pháp được sử dụng trong tinh sạch
protein dựa vào độ tan của chúng. Độ tan của một phân tử protein thay đổi theo lực ion
của dung dịch và do vậy, phụ thuộc vào nồng độ muối. Có thể xảy ra hai trường hợp,
độ tan của protein tăng khi tăng nồng độ muối (vì lực ion tăng). Khi nồng độ muối
tăng thêm, độ tan của protein sẽ bắt đầu giảm. Ở một nồng độ muối đủ lớn, protein gần
như được kết tủa hoàn toàn. Kết tủa ammonium sulfate là phương pháp được sử sụng
phổ biến nhất do (i). ở nồng độ cao, nó có thể làm kết tủa hầu hết tất cả các loại
protein; (ii) không tỏa nhiều nhiệt khi hòa tan vào nước; (iii) ngay cả khi đã bão hòa
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


12
(4.04M ở 20
o
C) thì mật độ muối cũng không ảnh hưởng đến quá trình lắng kết của
protein trong khi ly tâm; (iv) nồng độ cao giúp hạn chết sự phát triển của vi sinh vật;
(v) trong dung dịch muối, protein được bảo vệ khỏi sự biến tính (Richard and
Deuscher, 2010).

Hình 3. Ảnh hưởng nồng độ muối lên tính tan của protease
(*Nguồn: Voet et al., 2013)
Có 2 kỹ thuật chính trong quy trình kết tủa protein. Ở quy trình thứ nhất, nồng độ
muối được tăng lên bằng cách thêm từ từ dung dịch muối bão hòa hoặc tinh thể
ammonium sulfate vào hỗn hợp protein. Ví dụ, nồng độ muối đạt 25% bão hòa khi
thêm 1ml dung dịch muối bão hòa vào 3ml dung dịch protein không chứa muối; đạt
50% bão hòa nếu thêm vào 3mL và đạt 75% nếu thêm 9ml. Protein kết tủa được thu
theo và phân biệt theo nồng độ muối mà ở đó chúng kết tủa. Quả trình này được gọi là
kết tủa phân đoạn (fractionation). Đơn cử, protein được thu ở nồng độ muối 20-21%
thường được phân biệt như phân đoạn 20-21%. Những phân đoạn trong giai đoạn đầu
của quá trình kết tủa có độ tan thấp hơn so với những phân đoạn sau. Ở quy trình thứ
hai, protein được kết tủa nhiều nhất có thể ở lần đầu tiên bằng dung dịch muối nồng độ
cao. Sau đó, dung dịch ammonium sulfate (ở 0
o
C) với nồng độ giảm dần được sử dụng
để phân tách một cách chọn lọc những thành phần protein tan ở nồng độ muối cao hơn.
Sau đó, dịch protein được tinh thể hóa và phục hồi trạng thái ban đầu bằng cách làm
ấm một cách từ từ dung dịch cho đến khi đạt nhiệt độ phòng. Kết tủa protein bằng cách
này có thuận lợi là dung dịch được thêm chất đệm hoặc những nhân tố giúp duy trì

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


13
hoạt tính của enzyme. Hiệu suất khôi phục đạt khoảng 30-90%, tùy vào loại protein.
Sự kết tinh lại của protein có thể xảy ra nhanh chóng hoặc mất nhiều giờ. Tuy nhiên,
rất ít trường hợp sự kết tinh lại không xảy ra. Sự hiện diện của những tinh thể nhỏ
protein nhỏ bé có thể được nhận thấy bằng mắt thường nhờ vào độ đục của dung dịch.
2.5.2. Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography) (Richard and
Deuscher, 2010)
Sắc ký trao đổi ion là phương pháp phổ biến nhất để phân tách protein. Được sử
dụng như một công cụ vô cùng hữu dụng trong việc phát hiện những loại protein mới,
tinh sạch protein với độ tinh sạch cao và sản xuất protein cho các quá trình sản xuất
công nghiệp. Protein được phân tách trong khoảng nồng độ muối và pH sinh lý nên
trong hầu hết các trường hợp protein thu được vẫn giữ được cấu trúc ban đầu.
Nguyên tắc:
Sắc ký trao đổi ion được dựa trên sự tương tác giữa những phân tử mang điện
tích ngược nhau. Điện tích bề mặt của protein thay đổi phụ thuộc vào giá trị pI của
phân tử protein đó và pH của môi trường. Gel trao đổi ion (pha tĩnh) bao gồm những
hạt có lỗ để đảm bảo đủ bề mặt cho sự bám của protein. Các gốc chức năng, mang điện
âm hoặc dương, được gắn vào những hạt gel này. Có 2 loại gel được sử dụng gồm gel
trao đổi ion dương tích điện âm và gel trao đổi ion âm tích điện dương. Nếu pH của
môi trường lớn hơn pI, protein tích điện âm và bám vào gel trao đổi ion âm. Nếu pH
nhỏ hơn pI, protein tích điện dương và bám vào gel trao đổi ion dương. Gel trao đổi
ion có thể phản ứng với pH với mội trường như một base hoặc acid trong trường hợp
nhóm chức năng là một base hoặc acid yếu.

Pha tĩnh:
Thông thường, pha tĩnh có cấu tạo là những hạt nhỏ có lỗ gắn với một nhóm
chức năng. Những hạt này có thể được làm từ nhiều loại vật liệu khác nhau (Janson
and Ryden, 1998). Trong số đó, polysaccharide (cellulose, dextran, agarose), polymer
nhân tạo (polyacrylamide, polymethancrylate, polystyrence) và vật liệu vô cơ (silica,
hydroxyapatite) được sử dụng phổ biến nhất. Gel trao đổi ion âm với một số nhóm
chức năng thường dùng như: Diethylaminoethyl (DEAE), Quaternary aminoethyl
(QA), Quaternary ammonium (Q)… Gel trao đổi ion dương thì có Carboxymethyl
(CM), Methyl sulfonate (S), Sulfopropyl (SP)… Tùy vào điều kiện của môi trường tinh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2013 Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


14
sạch (dung môi, nồng độ muối, protein, nhiệt độ, pH ) để lựa chọn gel phù hợp cho
từng trường hợp.
Lựa chọn dung dịch đệm
Trên nguyên tắc của phương pháp sắc ký trao đổi ion, việc lựa chọn dung dịch
đệm là vô cùng quan trọng. Để lựa chọn một dung dịch đệm phù hợp, nhất thiết phải
cân nhắc những nguyên tắc sau:
- Phải dựa vào giá trị pI của protein. pH đệm lớn hơn pI, protein tích điện âm và
bám vào gel trao đổi ion âm; pH đệm nhỏ hơn pI, protein tích điện dương và
bám vào gel trao đổi ion dương. Tuy nhiên, cũng phải quan tâm tới mức độ
sạch của mẫu và tính bền của protein.
- Chất đệm phải có giá trị pK
a
gần với giá trị pH được chọn trong khoảng 1 đơn

vị pH.
- Chất đệm không được bám vào gel trao đổi ion. Ví dụ, không nên sử dụng
acetate với gel trao đổi ion âm và Tris với gel trao đổi ion dương vì sẽ làm cho
pH không ổn định dẫn đến kết quả không ổn định.
- Ở gần bề mặt của hạt gel, pH có thể dao động đến 1 đơn vị. Cụ thể, đối với
trường hợp gel trao đổi ion dương, pH ở xung quanh hạt gel có thể thấp hơn 1
đơn vị do sự bám của các ion hydronium. Trong khi đó, pH xung quanh hạt gel
trao đổi ion âm có thể cao hơn 1 đơn vị do sự bám của các ion hydroxyl. Điều
này đặc biệt quan trọng đối với các protein dễ bị biến tính.
Rửa giải
Các protein gắn với các nhóm chức năng trên cột gel trao đổi ion sẽ được rửa giải
bằng cách gia tăng lực ion (nồng độ muối) hay thay đổi pH để làm giảm độ tương tác
giữa protein với giá thể. Thông thường thì gradient nồng độ muối NaCl được dùng vì
cách này có thể thực hiện dễ dàng hơn. Các ion Na
+
hay Cl
-
sẽ cạnh tranh với protein
trong tương tác với gel và do kích thước nhỏ, điện tích mạnh chúng sẽ đẩy protein ra
khỏi gel. Trong trường hợp với gradient pH, nếu là cột trao đổi ion âm thì sử dụng
gradient pH giảm, và ngược lại, với cột trao đổi ion dương thì rửa giải bằng gradient
pH tăng.
Có hai cách để rửa giải protein: