tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ bacillus subtilis s20

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


TINH SẠCH VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA
ENDOGLUCANASE TỪ BACILLUS SUBTILIS S20




 
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN HÀ CÔNG THẮNG
TS. DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG MSSV: 3092509
LỚP: CNSH TT K35




Cần Thơ, 12/2013
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)



 







DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
LỜI CẢM TẠ

Trc tp và rèn luyn ti i hc C
nhc rt nhiu s ng viên c ng dn và ch dy
tn tình ca quý thy cô cùng vi s  nhit tình ca các bn. Vi vic hoàn
c lut nghic bày t lòng cc ca mình
n Th  ng
dn tình ch dy, truyt nhng kinh nghim quý báu trong vic thc hin thí
nghi và tu kin thun li nht cho tôi trong quá trình thc hi tài
này.
c gi li cn quý thy cô Vin Nghiên cu
và Phát trin Công ngh Sinh hn tình ging dy, giúp tôi có nhng kin thc
hu ích phc v cho vic thc hi tài.
Xin chân thành cm n sinh viên và các anh ch hc viên cao hc ca
phòng thí nghim Sinh hóa và phòng thí nghim Công ngh p th
lp Công ngh sinh hc tiên ti và chia s nhiu kinh
nghim quý báu trong sut thi gian tôi hc tp và thc hi tài này.
Cui cùng, tôi xin bày t lòng bi
ng viên, khích l và luôn ng h tôi v mt vt chn trong sut
thi gian tôi hc tp và thc hi tài nghiên cu này.
Kính chúc quý v nhiu sc khe, ht.
Xin trân trng c
C 
Hà Công Thng
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƢỢC
Đề tài “Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ Bacillus
subtilis S20” được thực hiện nhằm mục tiêu thiết lập quy trình tinh sạch
endoglucanase từ Bacillus subtilis S20 và xác định một số đặc điểm cơ bản của
endoglucanase tinh sạch. Dịch nuôi của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis S20, sau khi
được ủ kỵ khí trong 5 ngày ở 38

o
C, được thu nhận và ly tâm để loại cơ chất và tế bào.
Endoglucanase được tinh sạch bằng cách tủa phân đoạn với AS và sắc ký trao đổi ion
trên gel Uno Sphere Q. Kết quả, ở bước tủa phân đoạn, hai phân đoạn 70% và 80% có
hoạt tính riêng cao nhất lần lượt là 105 và 119 (U/mg), hai phân đoạn này được giữ
lại và tinh sạch tiếp tục. Sau khi qua cột sắc ký, phân đoạn F1 thể hiện hoạt tính riêng
cao nhất (720 U/mg) với hàm lượng protein tổng là 0,24 mg. Toàn bộ quá trình tinh
sạch đạt hiệu suất và độ tinh sạch lần lượt là 24,3 và 23 lần. Endoglucanase thu được
là 2 đồng phân của nhau với trọng lượng phân tử là 79,6 kDa và 74 kDa.
Endoglucanase tinh sạch có nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 60
o
C và 8. Hoạt tính của
endoglucanase được kích hoạt bởi ion K
+
(đạt 148% so với mẫu đối chứng 100%) và
bị bất hoạt bởi các ion như Cu
2+
, Fe
3+
và Mn
2+
(hoạt tính còn lại lần lượt là 41,2%,
51,9% và 81,2% so với mẫu đối chứng 100%). Endoglucanase thể hiện hoạt tính cao
nhất trên cơ chất CMC, tuy nhiên, enzyme này vẫn có hoạt tính trên avicel và giấy lọc
nhưng không đáng kể.
Từ khóa: Bacillus subtilis S20, đặc hiệu cơ chất, endoglucanase, khảo sát, tinh sạch.
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
Trang

PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
t v 1
1.2. M tài 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Tng quan v Bacillus subtilis 3
2.1.1. Lch s phát hin 3
2.1.2. Phân loi 3
m ca Bacillus subtilis 3
2.2. Tng quan v Endoglucanase 4
2.2.1. C hong ca endoglucanase 4
2.2.2. ng ca mt s yu t n hot tính ca endoglucanase 7
2.2.2.1. ng ca nhi 7
2.2.2.2. ng ca pH 7
c hiu t ca endoglucanase 7
2.2.2.4. ng ca mt s cht c ch và hot hóa 7
2.2.3. Mt s m khác ca endoglucanase 7
u 8
t ta protein 8
c ký 9
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
n di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate 
polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) 11

nh hot tính enzyme 13
2.3.5. Tình hình nghiên cc 13
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
n nghiên cu 16
3.1.1. Thm 16
3.1.2. Dng c, thit b 16
3.1.3. Nguyên vt liu 16
3.1.4. Hóa cht 16
u 17
3.2.1. Tinh sch endoglucanase bn vi ammonium
sulphate 17
3.2.2. Tinh sch endoglucanase bi ion 17
3.2.3. Kho sát ng ca nhi n hot tính ca endog
sch 18
3.2.4. Kho sát ng cn hot tính cch 19
3.2.5. Kho sát ng ca ion kim lon hot tính c
tinh sch 19
3.2.6. Khc hit cch 20
3.3. X lý s liu 20
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
4.1. Tinh sch endoglucanase bn vi ammonium
sulphate 21
4.2. Tinh sch endoglucanase bi ion 24
4.3. Kho sát ng ca nhit  n hot tính cch
27
4.4. Kho sát ng cn hot tính cch 28
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
4.5. Kho sát ng ca mt s ion kim lon hot tính c
tinh sch 29

4.6. Khc hit cch 30
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31
5.1. Kt lun 31
5.2. Kin ngh 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC






Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Trang
 21
 24
 26
 tính 
29
 30
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Trang
 4
 5
 6
  6

 8
 10
-250 12
 22
-PAGE 23
 24
 25
-PAGE 25
 27
 28
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TỪ VIẾT TẮT
APS Ammonium persulfate
AS Ammonium sulphate
BSA Bovine serum albumin
CD Catalytic domain
CMC Carboxymetyl cellulose
CBD Cellulose binding domain
DTT Dithiotheitol
IEF Isoelectric focusing
NBS N-Bromosuccinimide
pI Isoelectric point
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate  polyacrylamide
gel electrophoresis
TEMED Tetramethylethylenediamine
UB Unbound

Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cellulose là ngung tái to dc xem là
vt cht hn ti vng ln nht và là thành phn chi
tuyi trong gii thc vt. Ngun nguyên liu sinh hc này có ti n
trong vic thay th nhiên liu hóa thn kit. K t 
công ty sn xuu tiên t c thành lp bi Ewan và các cng s,
  u nghiên c  c thc hi  tìm cách s dng hiu qu ngun
nguyên liu này.
Quá trình phân gii sinh hc c   c nghiên cu t nhi 
c bic nghiên
cu và khc phân loi vào nhóm enzyme glycosyl hydrolase, là
mu t xúc tác quá trình chuyn hóa cellulose thành glucose qua mt
chui các phn ng vi s tham gia ca các cu t bao gm endoglucanase,
- glucosidase. Mi cu t có m ng khác n phân
ct cu trúc polymer phc tp cc diu ct liên
kt -1,4-glycosidic trong phân t cellulose.
c ng d ci thin giá tr ng ca th

gia cm; ch bin thc phm; trích ly các cht t thc vt, t cây thung
hóa các ph liu giàu  sn xut ethanol sinh hc (Trn Thnh Phong et
al., 2007); ng dng trong công nghip dt, công nghip giy, công nghip cht ty ra
bt git hay ng dng trong vic to các ch phm h tr tiêu hóa, các kháng sinh
thuc dng chitooligosaccharide, trong nghiên c to t bào trn (Sukumaran et
al., 
Trong mt s ng hp ng dng nhc bi s
dt hiu qu và an toàn thì v c s dng phi  tinh
sch cao và m ca enzyme phc nghiên cu. y, tinh sch là mt
c rt cn thit cho vic nghiên cu và ng dng cellulase. Theo Sukumaran et al.
(2005), cellulase có th thc t nhiu ngum, vi khun, x khun; trong
s các vi khun có kh ng hp cellulase, Bacillus subtilis là mt trong các
loài vi khun có kh ng hp cellulase ngoi bào khá cao. c t
các nghiên cu v cellulase t Bacillus vn còn hn ch so vi các nghiên cc
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
thc hin trên nm.  c ta các nghiên cu v  yp trung
ng là các loài nm. Vi nhng v và tn t ch
và kho sát mt s m ca endoglucanase t Bacillus subtilis  xut
thc hin nhm m ng nghiên cu mi v cellulase t vi khuc ta.
1.2. Mục tiêu đề tài
Tinh sch endoglucanase t Bacillus subtilis S20 nh mt s 
bn ca nó.
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis c phát hin lu tiên bi i tên
gi là Vibrio subtilis, i tên thành Bacillus subtilis vào i

Cohn.
Bacillus subtilis c phát hin lu tiên trong phân nga bi T
chc y hc Nazi cc. Thm này, Bacillus subtilis c s d u tr
bnh kit l cho các binh c  chiu  Bc Phi.
Ngày nay, Bacillus subtilis c nghiên cu r khai thác các
ti  ng dng rng rãi trong nhi       , công
nghi
2.1.2. Phân loại
Theo phân loi ca Bergey, vi khun Bacillus subtilis thuc
Gii : Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lp : Bacilli
B : Bacillales
H : Bacillaceae
Chi : Bacillus
2.1.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis thuc nhóm vi khun hiu khí hoc k khí không bt buc, chúng
là loài vi khun ph bic tìm thc, không khí, và các loi
rác thi có ngun gc thc vt, tuy nhiên nhiu bng chng cho thy Bacillus subtilis
n ti trong rut ng vt (
ngày 28/07/2013).
Bacillus subtilis thuc nhóm trc khuc khong 2,5-
ng nuôi cy (Sargent, 1975). Bacillus subtilis có kh 
bào t và tn tu kin khc nghit (Claus và Berkeley, 1986).
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
H enzyme ca Bacillus subtilis r     ng gm protease,
amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase. Bacillus subtilis 
c ng dng khá nhic bit là trong công nghip sn xu
amylase, cellul Bacillus subtilis ng lo

u qu nh
hreonine, isoleusine,
Bacillus subtilis

            
Baxilomicin (A,B,C,R), Bacillopectin, Mycobacil(

2.2. Tổng quan về Endoglucanase
2.2.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của endoglucanase
Endoglucanase (EC 3.2.1.4) còn có các tên g   Beta-1,4-endoglucan
hydrolase, Beta-1,4-glucanase, Carboxymethyl cellulase, Celludextrinase, Endo-1,4-
beta-D-glucanase, Endo-1,4-beta-D-glucanohydrolase, Endo-1,4-beta-glucanase.
Endoglucanase thuc h glycosyl hydrolase 5.
Ging cu t khác ca phc h enzyme cellulase, endoglucanase gm
2 domain chính là domain xúc tác (catalytic domain-CD) và domain gn kt cellulose
(cellulose binding domain-CBD), hai domain này có cu trúc và chc lp.
Ngoài ra, còn có mn acid amin ngn có vai trò kt ni gia CD và CBD (Zvidzai
và C. Johnson, 2012).

Hình 1. Mô hình cấu trúc của endoglucanase
(*Nguồn: Zvidzai và Johnson, 2012)

Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CD chu trách nhim thy phân liên kt -1,4-nh hình ca
phân t  tn oligosaccharide có chiu dài khác nhau; tuy nhiên,
theo Ogawa et al. (1991) endoglucanase t Trichoderma reesei có th thc
cellulose tinh th nh.

Hình 2. Cơ chế hoạt động của endoglucanase

(*Nguồn ngày
15/02/2013)
Phn ng thy phân liên k-1,4-glycosidic  acid/base
vi s tham gia ca các amino acid là aspartic acid và/hoc glutamic acid. S hình
thành ion oxic h tr và duy trì bn vng bi các amino acid cn k
trong tâm ho   aspartic acid, glutamic acid, tryptophan hay histidine
(Henrissat et al., 1989; Gilkes et al., 1991; Kawaminami et al., 1998; Gebler et al.,
1992). Tâm hong ca endoglucanase ca vi khung có trình t bo tn gm
8 amino acid, 2 tryptophan, lysine, serine, 2 tyrosine, glutamate và histidine (hình 3)
(Zvidzai và Johnson, 2012).
 lp th khác nhau trong s thy phân liên k -1,4-glycosidic:
thy phân o cu hình (inversion mechanism) và thy phân duy trì c   
(retetion mechanism) ca liên kt b phân ct (hình 4).
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 3. Giản đồ minh họa tâm hoạt động của endoglucanase
khi gắn với cellobiose
(*Nguồn: Davies et al., 1998)

Hình 4. Cơ chế lập thể của phản ứng thủy phân cellulose
(*Nguồn: Schülein, 2000)
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CBD có vai trò gn kt vi enzyme vi s tham gia ca các amino acid
d1998). Domain này ci thin kh 
bám và h tr hot tính ct không nh
t hòa tan (Linder và Teeri, 1997).
2.2.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hoạt tính của endoglucanase
2.2.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ

Tùy vào tng chng vi khun c th mà nhi ta endoglucanase có th
n ln endoglucanase vi khun th hin hot tính cao
nht  nhi khong 55
o
C  60
o
 bn nhit c
ph thuc vào ngun vi khu ng gi c
khong 90% - 100% hot tính  nhi 0
o
C  50
o
C (Yin et al., 2010).
2.2.2.2. Ảnh hƣởng của pH
Endoglucanase t ng có hot tính cao nht trong
khong 5-7, ví d, endoglucanase ca Bacillus subtilis YJ1 có hot tính
cao nht  pH 6-6,5 (Yin et al., 2010), trong khi ca Bacillus subtilis CH43 và HR68 
pH 6,5 (Mawadza et al., 2000). Endoglucanase bn trong khong pH 6-10 tùy vào tng
loài c th.
2.2.2.3. Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase
Endoglucanase th hin hot tính cao nht vi carboxmethyl cellulose (CMC) và
- hin hot tính vi mt s 
avicel, cotton, giy lc, xylan t tính không cao (Yin et al., 2010; Mawadza
et al., 2000).
2.2.2.4. Ảnh hƣởng của một số chất ức chế và hoạt hóa
Hot tính ca endoglucanase có th  khi b sung mt s
cht ho   
2+
, Mn
2+

và -Mercaptoethanol. Trong khi Fe
3+,
Cd
2+,
Hg
2+
,
Sodium dodecyl sulfate hay Iodoacetic acid làm gim hot tính ca endoglucanase.
Các ion K
+
, Na
+
, Ca
2+
, NH
4
+
không n hot tính ca endoglucanase khi
c thêm vào phn ng (Yin et al., 2010; Mawadza et al., 2000).
2.2.3. Một số đặc điểm khác của endoglucanase
Endoglucanase ca mi chng vi khun khng có trng phân
t ng, endoglucanase ca vi khung có M khong
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
23-146 kDa (Gilkes et al., 1991). Tuy nhiên, endoglucanase ca Bacilli ng trong
khong 35-82 kDa (Park et al., 1991; Han et al., 1995; Kim et al., 1995; Mawadza et
al., 2000).
 n khác nhau tùy vào ngun trích ly.
ng, mt chng vi khung tng hp mt loi endoglucanase duy
nht. Tuy nhiên, có mt s chng có th tng hp nhiu loi endoglucanase khác nhau,

s kt hp hong gia các loi endoglucanase này góp ph  u qu
thy phân CMC (Akhtar, 1998).
2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp kết tủa protein
c s di ph bi thu nhn protein. Protein
có th c kt ta theo nhiu cách a bng mui, ta bng dung môi
hi pH ca dung dch có cha protein hay có th ta bng nhit.
Phƣơng pháp tủa bằng muối
 bi ta protein.  nng  mui thp, tính tan ca protein
 (salting in) ng mun tích b mt
ca protein, làm gim tính trt t ca lc bên ngoài nên s 
ca h thng. Tuy nhiên,  n mui cao, tính tan ca protein gim mnh (salting
out).       n salting out s tranh giành dung môi vi
protein và làm gim hing thn tích trái du
trên protein nên s cho phép protein kt ta.

Hình 5. Biểu đồ minh họa quá trình tủa bằng muối
(*Nguồn: ngày 10/07/2013)
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Các muc dùng  ta protein (NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4

, MgSO
4
Tuy
n thy mui (NH
4
)
2
SO
4
là tt nht vì nó không nhng không phá
hy cu trúc mà còn làm nh hu ht các loi protein. Loi mui này li r tin và
ph bi hòa tan ca nó li rt ln (bão hòa 767g/l  25
o
C) 
2006).
N (NH
4
)
2
SO
4
cn thi kt ta các protein enzyme khác nhau thì khác
nhau nhiu.
2.3.2. Phƣơng pháp sắc ký
c ký là mt trong nhc ng dng
rng rãi nht hin nay vì u qu nh tách các cht ra khi
mt hn hp ngay c vi nhng hn hp phúc tp. c
Nga .
Nguyên tn ca sc ký là da vào s khác bit v ái lc ca các cu t
trong hn hp cht cn phân tích vng có th là cht

lng hoc khí có tác dng lôi kéo các cht cn tách di chuyn ra khi ct sc ký có
cht lng nhc ph trên b mt bên trong ca ct mao
qun hoc là nhng ht cht rn nh c nhi vào ct có tác dng gi cht  l
c các cht t mt hn hp cn có s ng ca c pha ng. S
i vi tng cu t khác nhau là khác nhau. Vì vy khi cho hn hp cht
cn phân tích vào ct và ra gii bng thì các cu t s b tách khi nhau và
t  ng chúng.
Tùy theo bn chng mà ta chia thành hai loi sc ký sau:
- Sc ký lng là cht lng, có th s dng mt loi dung môi hay hn hp
nhiu loi dung môi.
- Sóa hc hay vt lý vi cht
cn phân tích.
c ký lc s dng bao gm: si ion,
sc ký lc gel, s c, sc ký ái lc.
Sắc ký trao đổi ion
Ti mm pH bt k tr u có mang mn
tích nhnh ng vn tích thc ca chúng ti mt
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
m pH nhnh, ta có th phân tách c hn hi là
i ion.  là nhng ht có kh
 i ion gi là cht i ion (ion exchanger). Các ht c cu to t
cht nc gn vn tích. Các ht này s 
tác vi các phân t n tích trái du vi chúng. C th, nu ht mang
n âm (ch-cation exchanger) thì s i nhng phân t
 c gi là sc li, nu ht
i ion âm-anion exchanger) s i phân t
n tích âmc gi là si ion âm. Trong quá trình sc ký các phân
t protein trong dung dch s liên kt ion thun nghch v
bám s c theo dòng dung dm, các protein bám s c gi li trên pha

 c ra gii ra bng dung dch mui hoa gii
là ra gii gradient liên tc (continuous gradient) và ra gii tc (stepwise).
Các protein s y ra khi ct da vào m n ca tng protein,
nói cách khác da vào lnh hay yu c
u s c li.

Hình 6. Minh họa sắc ký trao đổi ion
(*Nguồn: Biochemistry, 7
th
edition)
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.3.3. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate –
polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)
  -PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
c gn di không liên tc và gây bin
tính mu c phát trin t n vc s dng ph bin  các phòng
thí nghic nghiên cu ci ting nhu cu ca thc tin
nghiên cuc x lý vi SDS là tác nhân làm bit tính và
âm tính hóa các phân t protein và -mercaptoethanol hoc dithiotheitol (DTT) là tác
nhân kh cu ni disulfite. Khi x lý protein vi 2- mercaptoethanol hay dithiotheitol
thì các tác nhân này s ct các cu ni disulfite (SS) ca protein, vì vy protein t
cu trúc bc 2c bii thành chui polypeptide bc mt và nh s có mt
ca SDS tt c n âm. Nh ng cn
ng các phân t n âm s di chuyn v c và s di chuyn này ch
ph thuc, nhng phân t c ln s di chuyn ch
nhng phân t c nh t l c nhnh.
SDS-PAGE s dng h thng gel không liên tc gm hai lp: lp gel tp trung
hay gel gom (stacking gel) và lp gel phân tích (running gel hoc separating gel). Lp
gel t     to gi    ng có n  gel thp vào

khong 4-c l gel ln giúp tp trung các protein trong ging v
cùng mt vch xut phát (hình thành nên mt lng nm ngay phía trên
li tác dng cn
ng. Lp gel phân tích nc chun b  gel
tp trung, có n i gel tp trung, tn
hu s t tùy thuc vào trng
phân t ca chúng. K thut SDS- nh phân tách nhng phân
t protein có trng ng phân t trong khong t 10-200 kDa. Nhng phân t protein
có trng phân t l nh trên gel có n
     />dien-di-protein-sds-page-va-ung-dung-danh-gia-phan-427.html ngày 15/07/2013).
2.3.4. Một số phƣơng pháp khác
2.3.4.1. Phƣơng pháp Bradford
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
 nh n 
             thành m 
c s dng ph bin  nhiu phòng thí nghim.
ng b
dch. Vì vy, mung protein mt mu ta phi trích ly protein. Hàm
   nh s ph thuc vào hiu qu trích ly (kh    a
protein trong dung môi trích ly) (Bài ging thc tp sinh hóa, 2011).
   a trên s liên kt các cht nhum Coomassie Blue
G250 và protein. Nhng nghiên cu chi tit cho thy cht nhum t do này có th tn
ti  bn dng ion có giá tr ng mang tính
acid trong dung d   n vi protein thì thuc nhum  d có
c sóng hp thu ci 465nm và khi kt hp vi protein thì thuc nhum chuyn
sang dng màu p thu ci   hp th  c
sóng 595 nm có liên h mt cách trc tip ti n protein. Vì vng protein
có th c bit bng thuc nhum  dn âm màu xanh
 hp th ca dung dch  c sóng 595nm.

 nh protein trong mu tiên ta xây dng mng chun vi dung
dch protein chuc n. Dung dch protein chung là bovine
serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dch protein vào dung dch thuc nhum,
màu s xut hin sau 2 phút và bn ti 1 gi. Ti quang hn hp dung
dch bng máy quang ph k (Bài ging thc hành sinh hóa, 2009).








Hình 8. Công thức cấu tạo của Coomassie Brilliant Blue G-250
(*Nguồn: ngày 4/07/2013)
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.3.4.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme
*  pháp nh tính bng  ng kính vòng halo
Mnh mu có ho tip tc thc hi
giá khác.
Nguyên tc: Congo red liên kt vi cu n -1-4-glycosidic nguyên vn trên
CMC t trên b mng và không b ra trôi bi dung dch NaCl. Khi
liên kt này b ct bi endoglucanase, congo red không còn tip tc bám và b ra trôi.
c tin hành bng cách nh git mu enzyme vào các gic
sng chc   nhi và thi gian
thích h enzyme phn ng. Sau n hành nhum trong 15 - 60 phút, ri ra li
bng dung dch  mu có hot tính thy
phân cu n-1-4-glycosidic s to vùng không bt màu vi congo red xung quanh
ging (vòng    ng kính càng ln th hin enzyme có hot tính

càng mnh (Teather và Wood, 1981).
ng ng kh sinh ra b
 phn ng to màu ging kh vi thuc th
ng kh s tác dng vi thuc th   gch.
Khi cho thuc th Aseno Moblybdate s làm chuyn sang màu xanh da tr
màu ca hn hp phn ng t l thun vi n ng kh trong mt phm vi nht
c tin hành   c sóng 520nm. Kt hp vi  th ng chun ca
glucose tinh khit vi thuc th Nelson s c hng kh ca mu
nghiên cu.
Khi enzyme endoglucanase phn ng vt s to thành các long kh
có chng kh này s nh và t c hot
tính ca enzyme.
2.3.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Các nghiên cu v tinh sch endoglucanase trên các dòng Bacillus subtilis hin
vn còn rt hn ch.
n nay vu nào v tinh sch cellulase nói
chung hay endoglucanase nói riêng trên vi khuc công b. Các nghiên
cc ch yu ch tp trung vào cellulase thu nhn t nm.
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Trên th gii, các nghiên cu v cellulase t vi khun Bacillus vn còn hn ch.
Enzyme cellulase t hai chng Bacillus subtilis c tinh
sch và kho sát trong nghiên cu ca Mawadza et al (2000). Kt qu cho thi vi
chng Bacillus subtilis CH43 sau khi tri qua quá trình tinh sch gm ta bng
acetone, s c, sc ký lc gel và sc
enzyme endoglucanase vi  tinh sn so vi dch enzyme thô
u và hiu sut tinh si vi chng Bacillus subtilis HR68 sau khi
tri qua quá trình tinh sch gm ta bng acetone, s n di
n (Isoelectic focusing-c endoglucanase v tinh sch
là 113, 5 ln và hiu sut 35,3 %,. Endoglucanase t hai chng vi khun này có

cùng trng phân t và pI là 40kDa và 5,4. C hai có pH tng 5-
6,5 và có nhi tn lt là 65
o
C và 70
o
i vi CH48 và HR68. Ion Co
2+
có
kh t hóa c enzyme ca c hai chng, trong khi, Mn
2+
và Hg
2+
c ch hot
tính ca hai enzyme này. Ion Ag
+
có kh   t enzyme ca chng HR68
i bt hot chng CH43. Hai enzyme này có hot tính cao nh-glucan
và k        t tính vi mt s   
hydroxyethylcellulose, avicel, giy l    t tính vi hemicellulose

      có báo cáo v kt qu tinh sch
Carboxymethyl Cellulase (Endoglucanase) t mt ch c phân lp t
rung lúa. Trong nghiên c dng pháp
ta bng ammonium sulphate (AS) và tin hành tinh sch lt bng si
ion trên gel diethylaminoethyl (DEAE) cellulose và sc ký lc gel vi gel Sephadex G-
75. Sn phm tinh sng k thut SDS-PAGE. Kt qu cho thy sau
quá trình tinh sch gc k  tinh sch là 14,5 ln và hiu sut 24% .
Carboxymethyl Cellulase tinh sch t chng vi khun này có trng phân t 58
kDa, có nhi và pH t
o

C và 6. Hot tính cc ci thin
bi ion Mn
2+
và b bt hot bHg
2+
, Cu
2+
, Zn
2+
, Mg
2+
, Na
2+
và Ca
2+
.
Mc tinh sch t chng Bacillus subtilis 
c công b trong nghiên cu ca c tinh sch qua
c bao gm kt ta vi AS, si ion trên gel Macro-Prep và sc ký lc
gel (Bio-Gel P-t hiu su tinh sch 289 ln. enzyme tinh
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
sch có trng 32,5 kDa, hong t 60
o
C và pH 6. Enzyme này có hot
tính cao nhc kích hot bi Mn
2+
và Co
2+
, b c ch bi SDS, DTT

hay Fe
2+
, Fe
3+
, Hg
+
, Cd
2+
.