khảo sát điều kiện lên men thủy sâm

B GIÁO DO
I HC C
VIN NGHIÊN CU VÀ PHÁT TRIN CÔNG NGH SINH HC





LUT NGHII HC
NGÀNH VI SINH VT HC

KHU KIN LÊN MEN THY SÂM


CÁN B NG DN SINH VIÊN THC HIN
PHM HNG QUANG NGUYN VÂN S
MSSV: 3103983
LP: VI SINH VT HC K36



Cần Thơ, tháng 12/2013
PHN KÝ DUYT



CÁN B NG DN SINH VIÊN THC HIN



Phạm Hồng Quang Nguyễn Vân Sơn

DUYT CA HNG BO V LU







C
CH TCH HNG








LI CM T
Trong quá trình thực hiện, em đã nhận được sự động viên và sự giúp đỡ tận tình
của cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị và các bạn để có thể hoàn thành tốt đề tài. Với
lòng biết ơn sâu sắc chúng em xin gửi lời cám ơn chân thành đến:
Cha, mẹ; những người luôn cổ vũ, động viên, tạo điều kiện tốt nhất để con có thể
phấn đấu hết mình trong học tập và nghiên cứu.
CN. Phạm Hồng Quang, người đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức, kinh
nghiệm về mặt lý thuyết lẫn thực hành cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi và quan
tâm giúp đỡ em trong tiến trình thí nghiệm.
Ths Huỳnh Xuân Phong, CN. Nguyễn Ngọc Thạnh và các cán bộ quản lý các môi

trường xung quanh thí nghiệm của Viện NC & PT Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ em
thực hiện các quy trình và cách thức sử dụng trang thiết bị phục vụ cho đề tài.
Các thầy cô ở Viện NC & PT Công nghệ Sinh học đã quan tâm và tạo điều kiện
tốt nhất cho sinh viên em thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên cùng làm việc trong phòng thí
nghiệm Công nghệ thực phẩm đã tận tình giúp đỡ và động viên em trong thời gian
qua.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013



Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc i Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
C
Thy sâm là thc uc du nhp vào Vi c 
chung nh   hiu công di vi sc khe. Vì vy, vic
nghiên cu kin lên men thu quan trng nhm nâng cao
hiu qu sn xut thy sâm. Vi m Khu kin lên men thy
sâmc thc hin.  tài này, 23 dòng nm men t c 3
tnh khác nhau: C , Trà Nóc, An Thi (C); Bn Tre và H c
phân lp. Các dòng nc tuyn chn da vào kh 
dch trà. Kt qu cho thy dòng nm men BT21 có hot tính lên men cao nht. u
kin lên men thy sâm v t l mt s nm men và vi khuc chng, n ng
u cùng nhi và thc kho sát vi ging chng là
dòng nm men BT21 và dòng vi khun HG3.1. Kt qu cho u kin t l mt s nm
men-vi khun 10
5
-10

5
(t bào/mLc chu trong dung dch trà lipton 1%
có n  ng bng 15
o
Brix, pH 5,5,   30
o
      ng
c cao nht. Dòng nm men BT21 có hoc
nh danh b     và c x nh thuc loài Saccharomyces
cerevisiae.
T khóa: vi khun acid acetic, nm men, thy sâm, Saccharomyces cerevisiae,
trà lipton.
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc ii Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
MC LC
Trang
PHN KÝ DUYT
LI CM T
C i
MC LC ii
DANH SÁCH HÌNH v
DANH SÁCH BNG vii
T VIT TT 1
I THIU 2
t v 2
1.2. M tài 2
NG QUAN TÀI LIU 3
2.1 Tng quan v thy sâm 3
2.1.1 Giới thiệu về thủy sâm 3

2.2. Tình hình nghiên cc 5
2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 5
2.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 5
2.3. Tng quan v trà 5
2.3.1. Sơ lược về trà 5
2.3.2. Thành phần hóa học của lá trà 6
2.3.3. Đặc tính sinh học của trà 11
2.4. Tng quan v nm men 12
2.4.1. Hình dạng và kích thước của nấm men 13
2.4.2. Cấu tạo của nấm men 13
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc iii Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
2.4.3. Sự sinh sản và phát triển của nấm men 14
2.4.4 Quá trình lên men rượu 14
2.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men trong quá trình lên men rượu 15
2.4.4. Vai trò và ứng dụng của nấm
men
17
2.5. Tng quan v vi khun acid acetic 18
2.5.1. Đặc điểm chung 18
2.5.2. Một số loài vi khuẩn acid acetic điển hình 19
U 21
n nghiên cu 21
3.1.1. Dụng cụ, thiết bị 21
3.1.2. Nguyên vật liệu 21
3.1.3. Hóa chất 21
3.2. Thm 22
ên cu 22
3.2.1. Phân lập nấm men từ mẫu thủy sâm 22

3.2.2. Tuyển chọn nấm men lên men ethanol mạnh trong môi trường nước trà 22
3.2.3. Khảo sát điều kiện thích hợp cho lên men thủy sâm 23
3.2.4. Đánh giá chất lượng sản phẩm sau lên men 26
3.2.5. Định danh các dòng nấm men được chọn 26
T QU VÀ THO LUN 27
c tính hình thái nm men phân lc 27
4.2. Tuyn chn các dòng nm men có hong
c trà 33
4.2.1. Khả năng sinh CO
2
33
4.2.2. Khả năng sinh ethanol 35
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc iv Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
4.3. Khu kin thích hp cho lên men thy sâm 36
4.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ mật số giống chủng ban đầu đến lượng ethanol và acid
thu được 36
4.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường và pH ban đầu đến lượng ethanol và acid thu
được 40
4.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men đến lượng ethanol và acid thu
được 43
4.4. Mt s nm men và vi khun acid acetic trong lên men 47
ng thy sâm sau khi lên men 48
4.6nh danh dòng nm men có hot tính ethanol cao 50
4.6.1. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của dòng nấm men BT21 50
4.6.2. Định danh dòng nấm men BT21 51
T LUN VÀ KIN NGH 52
5.1 Kt lun 52
5.2. Kin ngh 52

TÀI LIU THAM KHO 53
PH LC
Phụ lục 1. Hình ảnh các thiết bị sử dụng trong môi trường xung quanh thí nghiệm
Phụ lục 2. Các phương pháp phân tích
Phụ lục 3. Số liệu thí nghiệm
Phụ lục 4. Kết quả phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16.2.1

Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc v Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Thủy sâm 3
Hình 2. Công thức cấu tạo một số loại catechin 8
Hình 3. Công thức hóa học của flavonol 9
Hình 4.Các công thức cấu tạo của các anthocyanidin 9
Hình 5. Công thức cấu tạo của các acid phenolic 10
Hình 6. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol 11
Hình 7. Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol 11
Hình 8. Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện
tử
13
Hình 9. Cơ chế lên men glucose tạo ethanol của nấm men (Norr et al., 2003) 14
Hình 10. Khuẩn lạc BT22 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 30
Hình 11. Khuẩn lạc TN7 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 30
Hình 12. Khuẩn lạc HG6 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 30
Hình 13. Khuẩn lạc BT21 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 31
Hình 14. Khuẩn lạc HG4 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 31
Hình 15. Khuẩn lạc BT12 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 31
Hình 16. Khuẩn lạc BT201 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 32

Hình 17. Khuẩn lạc BT24 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 32
Hình 18. Khuẩn lạc BT11 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 32
Hình 19. Khuẩn lạc HG2 và tế bào trên kính hiển vi ở vật kính E100 33
Hình 20. Lượng ethanol trung bình sau 05 ngày lên men ở nhiệt độ môi trường (28-
32ºC) của 23 dòng nấm men 35
Hình 21. Lượng ethanol thu được ở các tỉ lệ giống chủng khác nhau 36
Hình 22. Lượng acid thu được ở các tỉ lệ giống chủng khác nhau 38
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc vi Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
Hình 23. Lượng ethanol thu được ở các tỉ lệ nồng độ đường và pH khác nhau 40
Hình 24. Hàm acid thu được ở các tỉ lệ nồng độ đường và pH ban đầu khác nhau 42
Hình 25. Lượng ethanol thu được ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian lên men 44
Hình 26. Lượng acid thu được theo nhiệt độ và thời gian lên men 45
Hình 27. Phương trình tương quan tuyến tính đơn giữa lượng ethanol và acid thu được
47
Hình 28. Sự thay đổi mật số nấm men và vi khuẩn acid acetic theo thời gian trong môi
trường thủy sâm 48
Hình 29. Khuẩn lạc dòng nấm men BT21 50
Hình 30. Dòng nấm men BT21 dưới kính hiển vi với vật kính E100 50
Hình 31. Kết quả định danh dòng nấm men BT21 51







Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________

Chuyên ngành Vi sinh vt hc vii Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
DANH SÁCH BNG
Trang
Bảng 1. Một số công dụng của thủy sâm đói với sức khỏe con người 4
Bảng 2. Phân loại khoa học cây trà 6
Bảng 3. Thành phần các hợp chất polyphenol trong lá trà xanh 6
Bảng 4. Thành phần catechin trong lá trà 7
Bảng 5. Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm, thức uống có
cồn và sản phẩm lên men 17
Bảng 6. Đặc điểm hình thái của các dòng nấm men phân lập 27
Bảng 7. Chiều cao cột khí CO
2
(cm) trong chuông Durham 34
Bảng 8. Ảnh hưởng của mật số nấm men được chủng ban đầu đến lượng ethanol thu
được 37
Bảng 9. Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn được chủng ban đầu đến lượng ethanol thu
được 37
Bảng 10. Ảnh hưởng của mật số nấm men được chủng ban đầu đến lượng acid thu
được 39
Bảng 11. Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn chủng ban đầu đến lượng acid thu được 39
Bảng 12. Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu đến lượng ethanol sinh ra 41
Bảng 13. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến lượng ethanol sinh ra 41
Bảng 14. Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu đến lượng acid thu được 42
Bảng 15. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến lượng acid sinh ra 43
Bảng 16. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến lượng ethanol thu được 44
Bảng 17. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến lượng ethanol thu được 45
Bảng 18. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến lượng acid thu được 46
Bảng 19. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến lượng acid thu được 46
Bảng 16. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu lý hóa và vi sinh 48
Bảng 17: Kết quả đánh giá cảm quan theo các chỉ tiêu của Hội đồng gồm 10 thành viên49

Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 1 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
T VIT TT
MS: Mật số
NM: Nấm men
AAB: vi khuẩn acid acetic
CFU: Colony form unit
v/v: volume/volume
w/v: weight/volume
rDNA: ribosomal DNA
Viện NC&PT CNSH: Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
DNA: Deoxyribose nucleic acid
ITS: Internal transcribed pacer
mL: milliliter
NCBI: National Center for Biotechnology Information
PGA: Potato glucose agar
g/l: gram/ lít
STT Số thứ tự
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 2 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
I THIU
1.1. t v
Thủy sâm là loại thức uống đang được nhiều người ưa chuộng do có vị chua ngọt
từ quá trình lên men hỗn hợp nước trà đường và vị nồng nhẹ của rượu gây cảm giác
thích thú lạ miệng. Ngoài vai trò là một loại thức uống, thủy sâm còn được cho là có tác
dụng điều trị một số bệnh mãn tính nên được rất nhiều gia đình ưa chuộng nhân giống
sản xuất. Nhiều nghiên cứu cho thấy thủy sâm có tác dụng tích cực đối với sức khỏe

con người như làm giảm chứng viêm khớp (Dufresne và Farnworth, 2000), táo bón, khó
tiêu và cao huyết áp (Erst, 2003),… Dù đã có nhiều người nuôi và sử dụng thủy sâm,
các nghiên cứu chính thống, khoa học ở nước ta về loại thức uống này vẫn còn rất hạn
chế. Các thông tin nhiều chiều về tác dụng cũng như tác hại của thủy sâm làm người
dân cảm thấy bối rối trước sản phẩm lên men tương đối mới lạ này. Ngoài ra, việc nhân
giống sản xuất thủy sâm hiện nay chủ yếu bằng phương pháp thủ công ở quy mô hộ gia
đình, không đảm bảo chất lượng, vệ sinh và tính an toàn cho người sử dụng cũng như
nguồn gốc. Các hộ gia đình cũng nhân nuôi thủy sâm theo nhiều nguồn hướng dẫn khác
nhau, dẫn đến chất lượng của con giống không đảm bảo, khó kiểm soát.
Vì những lý do đã đưa ra thì việc nghiên cứu, tổng hợp các báo cáo khoa học về
vấn đề sử dụng thủy sâm đối với sức khỏe con người là rất cần thiết. Đồng thời, việc
xác định nguồn vi sinh chủ yếu có khả năng lên men mạnh trong thủy sâm cùng các
điều kiện nuôi cấy thích hợp sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất đại trà với chất
lượng cao loại thức uống lên men này. Góp phần thúc đẩy sự phát triển của ngành thực
phẩm nước ta.
1.2. M tài
 Phân lập các dòng nấm men từ thủy sâm, tuyển chọn và định danh các dòng có
khả năng lên men tốt trên nhất trong dịch trà.
 Kết hợp dòng nấm men được tuyển chọn với dòng vi khuẩn acid acetic HG3.1
để khảo sát điều kiện lên men thủy sâm thích hợp.
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 3 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
. TNG QUAN TÀI LIU
2.1 Tng quan v thy sâm
2.1.1 Gii thiu v thy sâm
Đây là loại thức uống được lên men trong dung dịch trà đường bởi loại nấm –
người Pháp gọi là – Champignon De Longuc Vie (nấm trường sinh), Người Nhật gọi nó
là Kombucha. Thời xưa, người vùng Kargasok thuộc Nga dùng trà nấm này có tác dụng
giúp sống khỏe và kéo dài tuổi xuân nên nó có tên gọi là trà nấm Kargasok. Những

người hưởng thọ ở Nga cho rằng sống lâu như vậy không những ở môi trường, tập quán
sinh hoạt và tâm hồn thư thả mà từ hàng trăm năm nay họ còn có thói quen dùng trà lên
men này. Nấm Thủy Sâm - Kombucha (Kargasok) là một loại men (giống như men
giấm), được nuôi trong dung dịch nước trà đường. Lọc nước (trà giấm) để uống. Do dễ
uống nên được dùng như 1 loại nước giải khát.









Hình 1. Thy sâm
(Nguồn: , 1/10/2013)
Thành phần trà Kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ.
Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% ethanol, acid acetic, acid
gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid carbonic, acid caprilic, acid citric, acid
oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B6, B12, vitamin C, acid
folic, amino acid, và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc.
(*Ngun: ngày 17/9/2012).
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 4 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
2.1.2 Giá tr ng và tác dng
Dufresne và Farnworth (1999) đã tổng hợp các nghiên cứu về công dụng của thủy
sâm đối với sức khỏe con người và được thể hiện ở Bảng 1.
Bng 1. Mt s công dng ca thi sc khi
Mt s ng có li ca thy sâm

ng
nuôi - Trà
Giải độc cơ thể

Giảm mức cholesterol

Giảm xơ vữa động mạch
X
Giảm huyết áp
X
Giảm các triệu chứng viêm khớp, thấp khớp và bệnh gút

Thúc đẩy chức năng gan

Cân bằng hệ vi sinh đường ruột, chữa bệnh trĩ

Giảm béo phì và điều chỉnh sự thèm ăn

Ngăn chặn / chữa lành nhiễm trùng bàng quang

Kích thích hệ thống tuyến nội tiết

Bảo vệ chống lại bệnh tiểu đường

Tăng sức đề kháng cơ thể với ung thư
X
Có chứa một loại kháng sinh có thể kháng lại vi khuẩn,
virus và nấm men
X
a

Tăng cường hệ thống miễn dịch, kích thích sản xuất
interferon

Chữa viêm phế quản và hen suyễn

Giảm rối loạn kinh nguyệt

Cải thiện sức khỏe da, tóc và móng tay

Giảm nghiện rượu, bia

Giảm căng thẳng và rối loạn thần kinh, mất ngủ

Giảm nhức đầu

Cải thiện thị lực

Ngăn quá trình lão hóa

Tăng cường sự trao đổi chất

Giảm nguy cơ sỏi thận

x
a
: Những hiệu quả chỉ quan sát thấy ở nồng độ trà cao.
Nhiều nghiên cứu cho thấy thủy sâm có tác dụng tích cực đối với sức khỏe con
người như làm giảm chứng viêm khớp (Dufresne và Farnworth, 2000), táo bón, khó tiêu
và cao huyết áp (Erst, 2003).

Nghiên cứu của Bauer-Petrovska và Petrushevska-Tozi (2000) cho thấy quá trình
lên men thủy sâm đã kích thích sự tổng hợp vitamin nhóm B và acid folic. pH thủy sâm
thấp là kết quả của quá trình sinh tổng hợp các acid hữu cơ (Blance, 1996). Đây cũng
chính là điều kiện thuận lợi cho việc bảo quản thủy sâm chống lại tạp nhiễm từ các vi
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 5 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
khuẩn lân cận. Sreeramulu et al. (2000) phát hiện các hoạt chất kháng sinh tìm thấy
trong thủy sâm thể hiện kết quả dương tính đối với S. sonnei, S. typhimurium, S.
enteritidis, và C. jejuni.
2.2. Tình hình nghiên cc
2.2.1 Tình hình nghiên cu c
Các nghiên cứu về thủy sâm ở Việt Nam còn rất hạn chế. Các bài viết về thủy sâm
chủ yếu được góp nhặt từ những thông tin chưa chính thống.
2.2.2. Tình hình nghiên cc
Thủy sâm (kombucha) là dịch trà lên men với nguồn giống là sự kết hợp giữa vi
khuẩn acetic acid và nấm men (Aidoo, Nout, và Sarkar, 2006).
Trong quá trình lên men thủy sâm, glucose được tạo thành từ sucrose, sau đó một
phần được chuyển hóa thành cellulose và gluconic acid bởi vi khuẩn acid acetic. Lượng
cellulose sinh ra kết thành một lớp màng sinh học dày, tạo thành chỗ đeo bám cho các
tế bào vi khuẩn và nấm men. Một phần glucose sinh ra được oxy hóa thành ethanol bởi
nấm men, lượng ethanol này lại bị oxy hóa thành acid acetic bởi hoạt động của các vi
khuẩn đã đề cập.
Số lượng nấm men trong thủy sâm có xu hướng giảm trong giai đoạn đầu của quá
trình lên men, sau đó tăng dần ở thời kỳ cuối. Vi khuẩn acid acetic biểu hiện ngược lại:
số lượng lấn át vào thời gian đầu của quá trình lên men, nhưng sau đó giảm đi rõ rệt ở
thời kỳ cuối quá trình lên men (Selma và Hamid, 2005).
2.3. Tng quan v trà
2.3.1. c v trà
Theo Trịnh Xuân Ngọ (2007) cây trà có nguồn gốc từ Đông Nam Châu Á. Đây

là một loại cây công nghiệp lâu năm, cho hiệu quả kinh tế cao, được trồng ở hơn 30
quốc gia. Trà có nhiều giống khác nhau, các giống trà phổ biến hiện nay là: Thea
Jiunnanica, Thea Assamica, Thea Ainensis, có nguồn gốc từ Trung Quốc và miền Bắc
nước ta. Ngày nay, ở hầu hết các tỉnh có đều kiện thuận lợi đều trồng trà, song ba vùng
trồng trà lớn nhất:
 Vùng chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái) chiếm
khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc.
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 6 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
 Vùng chè trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên). Đây là vùng
chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máy sản xuất lớn.
 Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủ yếu trồng
giống chè Ấn Độ và chè shan, chè Ô Long.
Bng 2. Phân loi khoa hc cây trà
khoa 

Plantee
Ngành
Magnoliopsida

Ericale

Theaceae
Chi
Camellia
Loài
C.Sinensis
(*7)
2.3.2. Thành phn hóa hc ca lá trà (Chi-Tang Ho, 2008)

 c
Thành phần chính của lá trà là nước, chiếm 75-82%, có quan hệ đến quá trình biến
đổi sinh hóa trong búp trà và đến sự hoạt động của các vi sinh vật, là chất quan trọng
không thể thiếu được để duy trì sự sống của cây.
 Hp cht phenol (tanin) hay Tannin)
Bng 3. Thành phn các hp cht polyphenol trong lá trà xanh


Flavan-3-ols (catechin)
12-24%
Flavonol và glycosides
3-4%
Anthocyanins, Leucoanthocyanidin
2-3%
Phenolic
~5%

18-36%

Tanin là một trong những thành phần chủ yếu quyết định đến phẩm chất trà. Tanin
còn gọi chung là hợp chất phenol thực vật bao gồm các polyphenol đơn giản và các
polyphenol đa phân tử, bên cạnh đó chúng còn kèm theo các hợp chất phenol thực vật
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 7 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
phi tanin có màu và vị rất đắng. Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của tannin trà
không giống nhau và tùy theo từng giống
Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của tanin chè không giống nhau và tùy
theo từng giống chè mà thay đổi. Tuy nhiên, người ta đã xác định được trong chè tanin
gồm có 3 nhóm chủ yếu là catechin, flavonol và glycoside, anthocyanidin và

leucoanthocyanidin.
 Catechin
Một hợp chất không màu, tan trong nước, có vị đắng chát ở mức độ khác nhau và
có khả năng chống oxi hóa. Catechin chiếm khoảng 85-90% tổng lượng tannin trong
trà. Chúng dễ dàng bị oxy hóa và tạo hợp chất phức tạp với nhiều với nhiều chất khác
nhau như methylxanthine.
Trong lá trà có 6 loại catechin chính đó là epicatechin (EG), epigallocatechin-3-
gallate (EGCG), epigallocatechin (EGC), epicatechin (EC),epigalocatechin-3-gallate
(EGCG), epigallocatechin (EGC), epicatechingallate (ECG), gallocatechin (GC), và
catechin (C). Trong đó EGCG là thành phần polyphenol chủ yếu trong trà chiếm
khoảng 12% khối lượng chất khô trong trà kế đến là EGC, ECG và EG.
Bng 4. Thành phn catechin trong lá trà


Epicatechin (EC)
1-3%
Epigallocatechin (EGC)
3-6%
Epicatechin gallate (ECG)
3-6%
Epigallocatechin gallate
(EGCG)
8-12%
Catechin (C)
1-2%
Gallocatechin (GC)
3-4%

Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________

Chuyên ngành Vi sinh vt hc 8 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc

Hình 2. Công thc cu to mt s loi catechin
 Flavonol và glycoside
Flavonol và glycoside Chiếm khoảng 1-2% chất khô và bao gồm các thành phần
chính quercetin (0,27-0,48%), kaempferol (0,14-0,32), myricitin (0,07 -0,2%). Các
glucoside của flavonol là dạng liên kết của Flavonol với monosacchaside (như glucose,
rhamnose, galactose, arabinose) hoặc disaccharide (như rutinose). Những flavonol
glucoside cơ bản trong trà bao gồm: rutin (0,05-0,1%), quercerin glycoside (0,2 – 0,5%)
và kaempferol glycoside (0,16 -0,35%). Các flavonol và glucoside thường có màu vàng
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 9 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
sáng. Có ít nhất 14 chất đã được tìm thấy. Các flavonol ít bị biến đổi trong quá trình lên
men. Chúng là các thành phần có lợi cho sức khỏe trong chè mà không có độc tính. Sau
khi vào cơ thể chúng xuất hiện trong máu, thể hiện hoạt tính mà không tích lũy lại.

Hình 3. Công thc hóa hc ca flavonol
 Anthocyanidin và Leucoanthocyanidin
Anthocyanidin là một hợp chất không màu, nhưng khi tác dụng với dung dịch
acid vô cơ thì có màu đỏ, dễ bị oxi hóa và trùng hợp. Anthocyanidin thường tồn tại dưới
dạng glycoside, còn gọi là anthocyanin.
Anthocyanidins bao gồm pelargonidin, cyanidin, delphinidin, and tricetinidin,
chúng chiếm khoảng 0.01% khối lượng lá trà khô.

Hình 4.Các công thc cu to ca các anthocyanidin
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 10 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
Bên cạnh các chất Anthocyanidin, trong lá trà còn thấy có Leucoanthocyanidin

(Flavadiol – 3,4) và các dẫn xuất glucoside của chúng. Leucoanthocyanidin hợp chất
không màu, dễ dàng bị oxy hóa và ngưng tụ hình thành sắc tố trong quá trình lên men
trà. Chúng là tiền tố của nhóm chất màu quan trọng là anthocyanidin và anthocyanin
(Anthocyanidin glucoside).
Ngoài các nhóm flavonoid nêu trên, chè còn chứa các chất có giá trị khác như tinh
dầu, các carotenoid, vitamin, các chất khoáng vi lượng, và caffein. Tùy theo từng chủng
loại, chè có 1,5 – 5% caffein. Trong y học, caffein được dùng rộng rãi với paracetamol
làm thuốc hạ sốt.
 Acid phenolic
Acid phenolic là một nhóm chất bao gồm các acid chính sau: acid gallic (0.5-
1.4%), acid chlorogenic (0.3%), và theogallin (1-2%). Trong trà xanh, acid phenolic là
tiền tố của catechin gallate.

Hình 5. Công thc cu to ca các acid phenolic
Ngoài các hợp chất polyphenol, trà còn có nhiều hợp chất khác, bao gồm alkaloid,
amino acid, protein, glucid, volatile và kim loại dạng vết.
Protein chiếm 15% hàm lượng chất khô trong trà, protein này bao gồm các enzym
như: polyphenol oxydase (xúc tác phản ứng oxy hóa catechin), glucosidase (xúc tác
phản ứng thủy phân các hợp chất mùi), lipooxydase (xúc tác sự hình thành các
andehyde dễ bay hơi) và một số enzym xúc tác cho sự tổng hợp methyl xanthine.
Hơn nữa trong trà còn có một số chất như canxi, mangan, crom, flo. Một số hợp
chất bay hơi bao gồm: Ethanol, carbonyl, ester, và các hợp chất vòng.
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 11 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
c tính sinh hc ca trà
a) Hot tính chng oxy hóa (Mai Tuyên et al. 2008)
Polyphenol chiết xuất từ lá trà xanh thứ phẩm có tác dụng kháng oxy hóa rất rõ rệt
và mạnh hơn nhiều so với acide ascorbic và tocopherol. Tác dụng sinh học của các
polyphenol trà hay của dịch chiết lá trà xanh được giải thích là do chúng có tác dụng

khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất antioxidant. Trong các polyphenol
trà, những gốc có chức năng chống oxy hóa là gốc ortho-3,4-dihydroxyl (catechol),
hoặc các vị trí 3,4,5-trihydroxyl (gallate) của vòng B, nhóm gallate ở vị trí C
3
của vòng
C, nhóm hydroxyl ở vị trí C
5
, C
7
của vòng A.

Hình 6. Các nhóm có chng oxy hóa ca các polyphenol
Cơ chế chống oxy hóa của trà thuộc cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất
phenol. Tính chống oxy hóa của các ankylphenol thể hiện ở chỗ chúng có khả năng vô
hiệu hóa các gốc perocyte, do đó nó có thể cắt mạch oxy hóa. Sản phẩm đầu tiên xuất
hiện là các gốc phenol tạo thành do nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl được nhường
cho gốc perocyte:

 chng oxy hóa ca polyphenol
Các gốc phenol rất ổn định, kém hoạt tính, nhờ vậy chúng không có khả năng sinh
mạch oxy hóa tiếp theo. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất ankylphenol được
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 12 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
tăng lên bằng cách hydroxyl hóa vào phân tử phenol, vì các hợp chất polyphenol có
hoạt tính tốt hơn monophenol.
Ngoài ra, các hợp chất catechin trong trà còn có khả năng tạo phức kim loại chủ
yếu là Fe, Cu, đây là những chất xúc tác để tạo ra những gốc tự do. Tỉ lệ EGC, EGCG,
ECG và EC tạo phức với kim loại là 3:2, 2:1, 2:1, 3:1.
Cả 2 catechin và theaflavin có thể tạo phức với Fe (III). Theaflavin có thể tạo phức

với Fe (III) để tạo thành dạng phức, sau đó bị oxy hóa thành o-quinon và được chuyển
đổi thành dehdro theaflavin, theanaph thoquinon và polymer.
b) Hot tính kháng khun
Theo T. Shimaura (1996) khẳng định catechin trong trà xanh có khả năng tiêu diệt
các loại vi khuẩn làm hư hỏng thực phẩm và loại bỏ các độc tố do chúng gây ra. Các
thí nghiệm của ông cho thấy trà xanh có thể diệt 100.000 khuẩn E. Coli trong vòng 5
giờ. Cơ chế hoạt động của các catechin là phá hủy màng tế bào bên ngoài của vi khuẩn.
EGCG và ECG là catechin có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất. Catechin là
polyphenol có thể gây ra hiện tượng ngưng kết bằng cách tạo liên kết trực tiếp với
protein. Đây là tính chất đặc trưng của catechin chịu trách nhiệm cho hoạt tính kháng
khuẩn.
2.4. Tng quan v nm men
Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có những đặc điểm như cấu tạo đơn
bào, đa số sinh sôi nảy nở bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, nhiều loại có khả
năng lên men đường. Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các
môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉ
đường, mật ong, trong đất ruộng trồng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có
nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Nấm men có nhiều ứng dụng rộng rãi trong
lĩnh vực thực phẩm, con người từ lâu đã biết ứng dụng nấm men vào sản xuất các loại
thực phẩm truyền thống như rượu, bia, bánh mì,…
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 13 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc


Hình 8. T bào nm men quan sát di kính hin in
t

(Ngu ngày 18/04/2013)

2.4.1. Hình dng và kích tc ca nm men
 Hình dng t bào: Nấm men thường có hình cầu, hình elip, hình ovan và có
cả dạng hình dài. Chúng hầu hết tồn tại dưới dạng đơn bào, một số loài như Candida
albicans không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành khuẩn ty giả và
Eremothecium gossypii hình thành khuẩn ty thật (Kurtzman và Piškur, 2006).
 Kích th bào: Kích thước của nấm men khác nhau tùy theo loài và thời
kỳ sinh trưởng của nấm men. Saccharomyces cerevisiae là nấm men thường được
sử dụng trong lên men rượu, bia có kích thước chiều rộng khoảng 2,5 – 10µm và
chiều dài 4,5 – 21µm, có thể thấy rõ dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Lân
Dũng, 1999).
2.4.2. Cu to ca nm men
Thành tế bào: Thành tế bào nấm men dày khoảng 25 nm, chiếm 15 – 30%
trọng lượng khô của tế bào nấm men, được cấu tạo chủ yếu từ glucan (60% khối
lượng thành tế bào), mannoprotein, chitin và một lượng nhỏ lipid.
 Màng nguyên sinh ch Màng nguyên sinh chất có 3 tầng kết cấu khác
nhau, được cấu tạo chủ yếu từ protein (50% khối lượng khô), phần còn lại là lipid và
một ít polysaccharide (Nguyễn Lân Dũng, 1999).
 Ch nguyên sinh: Chất nguyên sinh của nấm men cũng tương tự như chất
nguyên sinh của vi khuẩn, thành phần chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid, enzyme.
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 14 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
 Nhân t bào: Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên
trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Nhân tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể.
 Các bào quan và thành phn khác: Ty thể, không bào, ribosome,…

2.4.3. S sinh sn và phát trin ca nm men
Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh sản
hữu tính và sinh sản vô tính.

- Sinh sản hữu tính: Nấm men hình thành bào tử túi ở các chi Saccharomyces,
Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales.
- Sinh sản vô tính: Chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi
nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi
Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans).
u
Quá trình lên men rượu là quá trình lên men yếm khí của nấm men, chuyển hóa
đường thành rượu etylic và CO
2
.


 lên men glucose to ethanol ca nm men (Norr et al., 2003)
ng quát:
C
6
H
12
O
6
C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ 2ATP + 2H
2
O
Người ta thường chia quá trình lên men rượu thành 2 thời kỳ chính:

- Thi k phát trin sinh khi: giai đoạn này với sự có mặt của O
2
, tế bào nấm men
gia tăng kích thước và khối lượng.
- Thi k lên men chuy   u và CO
2
: đường và các chất dinh
dưỡng được hấp thu qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu vào trong. Ở đó các enzyme sẽ tác
Lut nghii hc Khóa 36 - 2013 
_____________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Vi sinh vt hc 15 Vin NC&PT Công ngh Sinh hc
động qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo ra sản phẩm chính là rượu và CO
2
(Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005).
2.4.5. Các yu t n nu
a) ng ca nhi
Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với dòng
ưu nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối là 35
o
C và nhiệt
độ thích hợp cho sự lên men là 40
o
C. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu
nằm trong giới hạn 28-32
o
C. Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả
năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Nếu làm lạnh dịch đường từ 20-22
o
C sẽ hạn chế
được sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8-10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng lên 28-30

o
C. Ở
nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic
và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 30
o
C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn
Saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35-38
o
C chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8
lần (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005). Mặt khác, khi lên men ở
nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều este aldehyde và tổn thất rượu theo CO
2
sẽ tăng.
b) ng ca pH
Nồng độ của ion H
+
có ảnh hưởng đáng kể đến sự lên men trong công nghiệp do
pH đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn có thể bị nhiễm và ảnh
hưởng lên sự phát triển của nấm men. Năng suất lên men ethanol cao nhất thường dao
động ở pH 4,5 – 4,7. Khi pH được điều chỉnh lên 7 hoặc cao hơn thì acid acetic được
tạo thành từ acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehyde
dehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al., 2001).
c) ng ca n u
Quá trình nuôi cấy nấm men chủ yếu là tạo điều kiện cho nấm men phát triển sinh
khối, đạt số lượng theo yêu cầu. Song nấm men cũng thực hiện một số quá trình lên
men rượu đáng kể. Thường trong dịch nấm men có khoảng 4-6% rượu. Nồng độ rượu
sinh ra ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu còn
ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển riêng của nấm men phụ thuộc vào thời
gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Cùng một môi
trường nuôi cấy, số lượng tế bào nấm men cho vào môi trường bằng nhau, điều kiện