Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM





NGUYỄN TRƯƠNG BẢO TRÂN



CHỌN GIỐNG VI KHUẨN VÀ KHẢO SÁT
MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ACETIC
ĐỂ LÀM GIẤM TRÁI CÂY


Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã Số : 60 42 40


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRỊNH THỊ HỒNG





Thành phố Hồ Chí Minh – 2007

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn CÔ- TIẾN SĨ TRỊNH THỊ HỒNG- đã
tạo điều kiện và tận tình chỉ bảo để em hoàn thành luận văn này.


Em vô cùng cảm ơn CÁC THẦY CÔ KHOA SINH HỌC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM đã truyền những kiến thức quý báu
trong suốt quá trình em học tại trường.


Em xin chân thành cảm ơn CÁC THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN
PHÒNG THÍ NGHIỆM BỘ MÔN VI SINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho em trong
suốt thời gian em thực hiện đề tài.



Tôi xin cảm ơn CÁC BẠN HỌC VIÊN CAO HỌC KHOÁ 15
cùng ĐỒNG NGHIỆP BẠN BÈ đã ở bên cạnh giúp tôi hoàn thành
luận văn này.




Con vô cùng biết ơn BA MẸ và MỌI NGƯỜI TRONG GIA
ĐÌNH mãi mãi là chỗ dựa vững chắc và ấm áp cho con.

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Trong các loại thực phẩm lên men thì giấm ăn là loại gia vị, thực phẩm
phổ biến và phần lớn các gia đình Việt Nam đều sử dụng. Giấm sử dụng trong
che biến thực phẩm hàng ngày, bảo quản thực phẩm, làm gia vị chế biến thực
phẩm. Ngoài ra, giấm được dùng như bài thuốc chữa nấc cục, buồn nôn, tàn
nhang, lở loét, các vết cắn của chó, bò cạp, rết hay côn trùng.
Ở Việt Nam, q
uá trình “lên men” acetic rất quen thuộc với nhân dân
thông qua việc nuôi giấm trong gia đình. Giấm được tạo ra bằng phương pháp
lên men dân gian từ các nguyên liệu như chuối, dứa, nước dừa, rượu ngũ cốc,
rượu trái cây. Nước ta có rất nhiều loại trái cây, có thể sử dụng các loại trái
cây này để làm giấm.
Do đó, đề tài “Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên
men acetic để làm giấm trái cây” rất có ý nghĩa đối với sản xuất và đời sống.
2. Mục đíc
h của đề tài nghiên cứu
 Tìm điều kien để vi khuẩn sinh acetic acid sinh trưởng mạnh.
 Tìm biện pháp tối ưu để tăng hiệu suất lên men acetic trong thời gian
ngắn, tạo ra những sản phẩm giấm trái cây thơm ngon và có giá trị dinh
dưỡng cao.


3. Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp nghiên cứu tài liệu nhằm
xây dựng tổng luận nghiên cứu:
Thu thập tài liệu, nghiên cứu, phân tích, tổng hợp những tài liệu về

những nội dung có liên quan đến đề tài.
 Phương pháp thực nghiệm, chứng minh.


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. Các loại giấm thông dụng và một số vấn đề về giấm trái cây

1.1.1. Sơ lược lịch sử lên men acetic. [12], [31], [32]
Từ đầu thế kỷ XIV ở Pháp đã có những cơ sở công nghiệp sản xuất giấm.
Đến năm 1786 người ta đã bắt đầu để ý đến vai trò cua oxy và nhấn mạnh
độ thoáng khí ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tạo thành giấm .
Năm 1822 Person đã chú ý đến 1 lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt
giấm và ông đặt tên Mycoderma (là 1 loài vi khuẩn hiếu khí ).
Từ năm
1837 đến 1838 Turpin và Kiizing đã nhấn mạnh quá trình lên men
acetic là do vi sinh vật và đặt tên vi sinh vật đó là Ulviva acetic.
Năm 1862 đến 1868, nhà bác học người Pháp Louis Pasteur khám phá ra
được bản chất của quá trình lên men này. Ông miêu tả được vi khuẩn sinh
acid acetic hiện diện trong màng mỏng của giấm, và chứng minh được quá
trình lên men giấm thực chất là quá trình chuyển hóa rượu thành acid acetic
trong điều kiện có oxy và ông đặt tên vi khuẩn này là Mycoderma aceti.
Năm 1901 M.W Bejerinck phân lập thuần khiết được vi khuẩn lên men
acetic và gọi là vi khuẩn Acetobacter.
Ngày
nay ứng dụng của quá trình lên men acetic, người ta đã sản xuất
nhiều loại giấm khác nhau, thường là giấm ăn chứa khoảng 3% acid acetic.

1.1.2. Các loại giấm thông dụng [28], [42].

- Giấm cồn “Spirit vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua,
dung dịch cồn nguyên chất được pha loãng, có bổ sung các muối vô cơ và
chất dinh dưỡng.
- Giấm vang “Wine vinegar” : là sản phẩm của quá trình lên men chua
dịch rượu vang nho.


- Giấm gạo “Rice vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch
bột gạo đã được chuyển hoá thành đường rồi thành rượu.
- Giấm mạch nha “Malt vinegar” là sản phẩm của quá trình lên men chua
dịch tinh bột đã được chuyển hoá thành malt.
- Ngoài ra giấm còn được làm từ các loại nước trái cây khác : nước ép
thơm, nước ép trái điều, nước dừa. Từ rượu vang các loại: vang dứa, vang
sơri, vang mít…
1.1.3. Thành phần của giấm ăn [28], [42].
Bên cạnh acetic acid và e
thanol, giấm còn chứa các sản phẩm thứ cấp,
có vai trò quan trọng trong việc tạo mùi vị… Những thành phần này có nguồn
gốc từ nguyên liệu hay được bổ sung trong khi lên men, tạo thành do vi khuẩn
Acetic hoặc do mối tương tác giữa các sản phẩm tạo thành. Trong giấm còn
có những hợp chất không giải thích được nguồn gốc.
Trong giấm chứa nhiều amino acid (ví dụ giấm cồn có 18 loại amino acid),
nguồn gốc amino acid được tạo ra chủ yếu từ sự tự phâ
n của vi khuẩn
Acetic.
Các hợp chất bay hơi: Trong giấm có chứa nhiều hợp chất bay hơi khác
nhau như ethylacetate, aldehyt, ethylformate…
1.1.4. Nguyên liệu sử dụng để làm giấm [12], [24]
Ethanol là nguyên liệu trực tiếp để lên men tạo acid acetic. Ngòai ra còn
dùng dung dịch chứa đường như: mật rỉ đường, mật ong, các loại trái cây có

chứa đường (nho, lê, đào, táo, chuối,mận,dứa…) hay tinh bột đã qua quá trình
đường phân.
 Nguyên liệu có bột  Đường  Rượu  acid acetic.
 Nguyên liệu có đường  Rượu  acid acetic.
 Nguyên liệu có rượu  acid acetic.


Các muối khoáng, nguồn Nitơ dễ đồng hóa (muối Amon) hết một lượng
ít acid acetic để tạo pH ban đầu thích hợp cho vi khuẩn họat động lên men.
Nồng độ rượu thích hợp là 6-15%. Khi hết rượu vi khuẩn có thể oxy hóa
acid acetic thành CO
2
và H
2
O theo phương trình:
CH
3
COOH + 2O
2
 CO
2
+ H
2
O
Vì thế trong quá trình lên men bao giờ cũng phải đảm bảo hàm lượng
ethanol tối thiểu là 0,3-0,5% .
1.1.5. Đặc điểm 1 số loại trái cây sử dụng để làm giấm
I.1.5.1. Đặc điểm của dứa. [9] ,[29]
Dứa có tên khoa học là Ananas Comonus thuộc họ Bromeliace (lớp
thứ Một lá mầm ), là cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới

Châu Mỹ- Braxin hay Paragoay, do đó thích hợp nhiệt độ cao và độ ẩm cao.
Dứa là loại cây không kén đất vì chúng c
ó thể sinh trưởng trên các vùng gò
đồi, dốc (20 độ trở xuống), nghèo dinh dưỡng như đất phèn ở Đồng bằng
Sông Cửu Long, đất đá vôi, đất vàng đỏ ở ở các tỉnh miền Bắc. Sau 1-2 năm
trong dứa có thể cho năng suất 10-12 tấn/ha, thậm chí là 30-35 tấn/ha.
Hàm lượng đường trong dứa trung bình từ 8-12%, có nơi trồng giống tốt
và chăm sóc tốt tỷ lệ đường đạt đến 15-16% (trong đó 66% đường dưới dạng
saccaroz v
à 34% dưới dạng fructoz và glucoz ).
Dứa có độ acid khoảng 0,6% (trong đó có tới 87% acid citric).
Hàm lượng chất tro chiếm 0,4-0,6% trọng lượng (chủ yếu là kali, magie
và canxi).
Trong dứa có chứa nhiều vitamin C : 24-28mg/100g.
Trong dứa có enzym Bromelin có tác dụng tiêu hoá rất tốt.
Dứa cung cấp năng lượng đáng kể cho cơ thể con người: 1kg trái dứa cho
400-420 calo hoặc 150ml nước dứa cung cấp 100-150 calo.



Bảng 1.1 : Thành phần dinh dưỡng của dứa
Thành phần Hàm lượng
Nước (%) 54,3
Protein(%) 0,5
Acid hữu cơ (g%) 0,6
Glucid (g%) 3,9
Tro (g% ) 0,2
Muối khoáng (mg%)
Ca
P

Fe

9,0
10,2
0,3
Vitamin (mg%)
B
1
B
2

PP
C

0,05
0,01
0,1
14
1.1.5. Đặc điểm của nho. [9], [29]
Nho là loại cây ăn trái có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, được nhập
vào Việt Nam vào đầu của thập niên 70 thế kỉ trước và ngày càng được trồng
phổ biến ở một số vùng của nước ta.
Thành phần dinh dưỡng của nho được trình bày ở bảng sau
Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của nho
Thành phần Hàm lượng
Nước (%) 85%
Đường tổng số g/100g trái cây 16,8
Acid malic g/100g trái cây 1,0
Protein g/100g trái cây 0,5
Chất tro g/100 g trái cây 0,4

Thiamin (B
1
) g
160-450
Riboflavin (B
2
) g
3-60
Acid panthothenic 0,5-1,4


Pyridoxin (B
6
) mg 0,16-0,5
Nicotinamit (PP) mg 0,68-2,6
Acid p-amiobenzoic g
15-92

1.1.6. Các tác nhân gây hại giấm [18], [20], [24], [28].
Giấm dễ bị hỏng trong thời gian bảo quản do nhiều nguyên nhân
 Giấm chưa đạt chất lượng dễ bị oxy hóa quá mức tạo thành CO
2
và
H
2
O làm giấm bị giảm độ chua và vẩn đục.
 Các vi sinh vật làm hư giấm như nấm men thuộc giống Candida.
 Các sinh vật làm hư giấm như: lươn giấm, ruồi giấm, bọ giấm…
 Lươn giấm có tên là Anguila aceti, là loại sâu phổ biến trong
sản xuất giấm. Nó có dạng giống giun tròn, có thể nhìn thấy

bằng kính lúp. Chúng xúât hiện trong thùng lên men giấm và
trong dung dịch rượu trước khi lên acid hóa. Con đực trưởng
thành dài 1mm, con cái dài 1-2mm. Lươn giấm
sinh sản và
phát triển mạnh ở nồng độ giấm thấp, ở nồng độ acid cao từ
9-10% chúng bị ưc chế nhưng không hoàn toàn ngưng sinh
sản, với nồng độ cao hơn chúng mới chết. Lươn giấm sống
bằng cách ăn vi khuẩn acetic, một phần rượu, acid acetic,
đạm, các khoáng hòa tan làm giảm độ chua của giấm. Lươn
giấm không độc đối với nguời, nhưng với số lượng lớn, chúng
làm
vỡ màng giấm, làm vẩn đục giấm và giấm không ngon.
Lươn giấm có trong giấm là do không vệ sinh sạch sẽ trong
quá trình lên men.
 Ruồi giấm : làm giảm acid, sinh ấu trùng, có thể ăn vi khuẩn
Acetic.


 Vi khuẩn Lactic:Vi khuẩn Lactic tạo mùi khó chịu và làm mất
màu giấm, giảm độ chua. Có 3 cách chống vi khuẩn lactic:
o Lọc và tiệt trùng rượu đã lên men.
o Bổ sung giấm ngon vào dịch trước khi lên men
tạo độ chua ban đầu để hạn chế vi khuẩn lactic.
o Bổ sung SO
2
vào giấm.
 Giấm chuyển thành màu đen: do 3 nhân tố là tannin,sắt và
các men oxy hóa. Khắc phục tannin và sắt bằng cách thông
khí và lọc. Một số men oxy hóa cũng làm thay đổi màu
giấm, khắc phục bằng cách thanh trùng Pasteur.

1.1.7. Các tiêu chuẩn về thực phẩm của giấm ăn. [26], [28], [42]
Giấm ăn là loại thực phẩm không độc đối với người và không có vi
sinh vật gây bệnh. Một mẫu giấm phải đạt các tiêu chuẩn sau:
 Trạng thái cảm
quan tốt: giấm trong suốt hoặc hơi đục (nếu
nguyên liệu là tinh bột), màu trắng trong (giấm rượu, nước
dừa…) hoặc có màu vàng nhạt đến nâu (giấm bia, rượu vang, rỉ
đường, trái cây…). Mùi vị chua dịu, có thể có mùi của nguyên
liệu như rượu, bia, rỉ đường…Nếu giấm có nhiều mùi vị của
nguyên liệu thì sự lên men chưa đạt, giấm chóng hỏng.
 Không có lươn giấm.
 Không chứa acid vô cơ tự do.
 Không có kim
loại nặng.
 Không chứa phẩm màu.
 Không chứa chất sát trùng.
 Không chứa hơn 2% ethanol.
1.1.8. Bảo quản giấm ăn. [28], [42]


Giấm thu được sau khi lên men gọi là giấm tươi, giấm có ít hoặc nhiều
vẩn đục do chứa vi khuẩn acetic và các chất phân hủy từ nguyên liệu ban đầu
nên cần được xử lý trước khi tiêu thụ.
 Phương pháp thanh trùng Pasteur
Các loại giấm sản xuất từ rượu vang, dịch ép trái cây thường tạo tủa ở đáy
chai sau 1 thời gian bảo quản. Người ta thanh trùng bằng cách đun sôi ở 75
o
-
80
o

C trong 30-40 giây,nếu thanh trùng ở nhiệt độ cao thì ảnh hưởng đến mùi
vị và giấm bị đục.
 Sử dụng chất chống oxy hóa (Sulfit).
SO
2
là tác nhân chống oxy hóa được phép sử dụng trong bảo quản thực
phẩm với hàm lượng thấp hơn 10mg/l SO
2
được thêm vào dạng khí hoặc
K
2
SO
3
ngay trước khi đóng chai. SO
2
có tác dụng làm giảmvận tốc oxy hóa
các chất có gốc aldehyt, aceton tự do trong giấm.
 Màu và sự khử màu
Các chất màu có trong giấm có nguồn gốc từ nguyên liệu sử dụng ban đầu
hoặc các chất tạo ra trong quá trình lên men. Ví dụ: màu vàng do caramen
hoặc những chất màu khác cho phep sử dụng trong thực phẩm. Giấm làm từ
nguyên liệu tự nhiên đôi khi cần có màu như màu đỏ của giấm làm từ vang
đỏ có ý nghĩa cảm quan. Ở một số nước giấm được bán sau khi đã qua
khử
màu bằng than hoạt tính.
 Đóng chai và bảo quản sản phẩm
Giấm thành phẩm dùng trong gia đình được chứa trong chai nhựa hoặc chai
thủy tinh và bảo quản bằng cách gắn xi trên nắp chai.
Giấm sử dụng trong chế biến bảo quản thực phẩm được chứa trong những
thùng có dung tích lớn và kín.

Trong gia đình, có thể bảo quản những lọ giấm bằng cách cho cào vài tép
tỏi hoặc 1 ít m
uối ăn.


Bảo quản giấm ở điều kiện thóang mát, tránh ánh sáng mặt trời và nhiệt độ
cao. Giấm đã qua lọc bảo quản được lâu hơn.
1.2. Vi khuẩn lên men sinh Acid Acetic.
1.2.1. Đặc điểm chung. [13], [30], [37], [42], [47],[50]
Vi khuẩn sinh acetic acid là những vi sinh vật Gram âm, hiếu khí bắt
buộc, có hình que và rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng sử dụng oxygen làm
chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Vi khuẩn sinh acetic acid
thường hiện diện trong những m
ôi trường có đường, alcohol hay các môi
trường acid hoá như trái cây, các loài hoa hoặc các sản phẩm lên men rượu
Khả năng oxy hoá ethanol tạo thành acetic acid và tiết ra môi trường được
xem là đặc điểm chung của vi khuẩn sinh acetic acid. Vi khuẩn Acetic di động
nhờ 1-8 tiêm mao ở cực hay chu mao, hoặc không di động. Không hình thành
nội bào tử.
Đặc điểm hình thái [13]
Các đặc điểm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng
khuẩn lạc, trạng thái Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế bào.
Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi
trên tế bào cũng có vai trò trong việc
định danh vi khuẩn sinh acid acetic.
Đặc điểm sinh thái . [13], [39]
Đặc điểm phân bố của vi khuẩn sinh acid acetic thường gắn liền với
nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu
và ở các nơi sản xuất giấm.
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. [13], [30], [34], [38], 40], [41],[42], [48],

[49]
Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân
biệt bởi các điểm sinh lý, sinh hoá sau:
- Oxy hoá acetate và lactat
e tạo CO
2
và H
2
O.


- Phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau.
- Phát triển sinh khối khi nuôi cấy trong các môi trường chứa: D-glucose
30%; acid acetic 0.35%; KNO
3
1.0%; methanol; glutamate; mannitol.
- Sinh acetic acid từ nguồn cơ chất ethanol.
- Tạo sắc tố hoà tan trong nước.
- Tạo các polysaccharide có cấu trúc giống levan.
- Đồng hoá ammonia trong môi trường chứa D-glucose, D-mannitol hay
ethanol.
- Tạo dihydroxyaceton từ glycerol.
- Phát triển sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon
duy nhất là: D-glucose, D-mannose, D-galactose, D-fructose, L-sorbose, D-
xylose, D-arabinose, L-rhamnose, D-mannitol, D-sorbitol, D-arabitol, meso-
ribitol, dulcitol, meso-erythritol, myo-inositol, glycerol, maltose, lactose,
melibiose, sucrose, sucrose, raffinose và ethanol.
1.2.2. Vai trò của vi khuẩn sinh acetic acid [13]
Các ứng dụng và triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh acetic a
cid

- Sản xuất giấm.
- Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học: Đặc tính oxy hoá không
hoàn toàn nhiều loại nguồn carbon khác nhau của giống Gluconobacter đặc
biệt có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp. Ví dụ:
G.oxydans có vai trò rất quan trọng ở giai đoạn chuyển hoá D-sorbitol thành
L-sorbose trong nghành công nghiệp sản xuất vitamin C; G.oxydans còn được
sử dụng trong sản xuất dihyroxyacetone (DHA) nhờ quá trình chuyển hoá
glycerol.
- Sản xuất một số loại nước giải khát lên m
en truyền thống. Ví dụ: sản
xuất rượu Kombucha, 1 loại nước giải khát có vị hơi chua và sủi bọt được ưa
thích ở Nhật Bản, Trung Quốc, An Độ và một số nước Châu Au, là quá trình


lên men trà đen đã bổ sung đường bởi tổ hợp nấm men cùng 3 giống
Acetobacter, Gluconobacter và Gluconacetobacter .
-Sản xuất cellulose vi khuẩn.
1.2.3. Phân loại. [13]
Vi khuẩn sinh acetic acid được phân loại trong họ Acetobacteraceae
thuộc phân lớp

-Proteobacteria. Theo International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology (IJSEM)- Tạp chí Quốc Tế về Phân loại và
Tiến hóa của Vi sinh vật, cho đến nay họ Acetobacteraceae có 10 giống gồm:
Acetobacter Beijerinck 1898, Gluconobacter Asai 1935, Acidomonas
Urakami và cộng sự 1989, Gluconacetobacter Yamada và cộng sự 1998,
Asaia Yamada và cộng sự 2000, Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002,
Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004, Swaminathania Loganathan và Nair
2004, Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006, và Granulibacter Greenberg và
cộng sự 2006

1.2.3.1. Giống Acetobacter Beijerinck 1898
Beijerinck (1898) dùng thuật ngữ “ Acetobacter” để chỉ các vi khuẩn
hiếu khí hình que, Gram âm, có khả năng sinh acetic acid từ ethanol. Các
chủng Acetobacter có thể dễ dàng phân biệt với các loài thuộc những giống
khác trong họ Acetobacteraceae bởi các đặc điểm k
iểu hình sau: Q-9 là thành
phần ubiquinone chính trong màng tế bào và oxy hoá 2 nguồn cơ chất acetate
và lactate cho sản phẩm cuối cùng là CO
2
và H
2
O.
Hiện nay, giống Acetobacter gồm 16 loài gồm: A. aceti,
A.pasteurianus, A.pomorum, A.indonesiensis, A.tropicalis, A.orientalis,
A.syzygii, A.cibinogensis, A.tropicalis, A.orientalis, A.cibinogensis,
A.estunensis, A.orleanensis, A.peroxydans, A.cerevisiae, A.malorum, A.oeni
và A.nitrogenifigens; A.aceti là loài điển hình của giống.
1.2.3.2. Giống Gluconobacter Asai 1935


Giống thứ hai trong họ Acetobacteraceae, Gluconobacter được đề
nghị bởi Asai vào năm 1935. Vào thời điểm này tất cả các chủng vi khuẩn có
khả năng sinh acetic acid đều được định danh là giống Acetobacter, Asai đã
đề nghị phân loại các chủng có khả năng tạo acetic acid từ ethanol kém nhưng
oxy hoá mạnh D-glucose thành D-gluconic vào 1 nhóm phân loại mới với tên
giống là Gluconobacter, các chủng có khả năng oxy hoá mạnh ethanol thành
acetic acid vẫn được xác định là Acetobacter.
1.2.3.3. Giống Acidomonas Urakami và cộng sự-1989
Tên giống Acidomonas được đề nghị bởi Urak
ami và cộng sự (1989)

với chỉ 1 loài là Acidomonas methanolica. Giống này được công nhận với các
đặc điểm Gram âm, tế bào hình que, ưa acid và đặc biệt là có khả năng dinh
dưỡng methyl tùy ý.
1.2.3.4. Gluconacetobacter Yamada và cộng sự- 1998
Thuật ngữ “ Gluconoacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ
phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984)
nhận thấy thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào sinh vi khuẩn sinh
acetic acid khác nhau. Các chủng có Q-10 là thành phần ubiquinone chính
được phân loại trong giống phụ Gluconoacetobacter, trong khi Q-9 là thành
phần ubi
quinone chính trong màng tế bào Acetobacter. Sau đó, giống phụ
Gluconoacetobacter được đưa lên thành giống thứ tư trong họ
Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh loài khi phân tích một phần
trình tự mã hoá 16S rRNA.
1.2.3.5. Giống Asaia Yamada và cộng sự-2000
Giống Asaia được giới thiệu là giống thứ năm trong họ
Acetobacteraceae bởi Yamada và cộng sự (2000). Các loài Asaia có những
đặc điểm
khá khác biệt so với các giống đã biết; Không sinh acetic acid hoặc
tạo thành 1 lượng rất ít từ nguồn cơ chất ethanol và hầu như bị kìm hãm phát


triển trong môi trường có chứa acid acetic với nồng độ 0,35%. Hầu như tất cả
các chủng Asaia được phân lập từ các loài hoa ở vùng nhiệt đới và phát triển
tốt trong môi trường có nguồn cơ chất là đường.
1.2.3.6. Giống Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002
Giống mới Kozakia được phát hiện khi Lisdiyanti (2002) khảo sát 1
cụm phát sinh loài mới trên cây phát sinh loài của vùng trình tự 16S đối với
các chủng vi khuẩn sinh acetic acid phân lập tại Indonesia.

1.2.3.7 Giống Swaminathania Loganathan và Nair 2004
Các chủng Swaminathani
a phân lập từ cây lúa hoang mọc ở khu vực
sinh thái ngập mặn. Loganathan và Nair (2004) xác định giống
Swaminathania dựa vào khả năng sinh acetic acid từ ethanol và vị trí phân
loại của các chủng thuộc giống này trên cây phát sinh được xây dựng dựa vào
trình tự 16S rDNA.
1.2.3.8. Giống Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004
Đặc điểm nổi bật của Saccharibacter là tính ưa áp suất thẩm thấu, chỉ
có thể tồn tại và phát triển trong môi trường có nồng độ đường cao từ 5-40%.
Ngoài ra, Saccharibacter không sinh acid aceti
c từ ethanol và không thể phát
triển trong môi trường có 0,35% c acid acetic.
1.2.3.9. Giống Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006
Neoasaia, giống thứ chín trong họ Acetobacteraceae, được Yukphan
và cộng sự phát hiện và chỉ có 1 loài là Ne. chiangmaiensis. Giống này được
phân loại dựa vào đặc điểm kiểu hình cùng với kết quả phân tích trình tự vùng
16S rDNA, 16S-23S rDNA ITS và kết quả lai DNA bộ gen với loài điển hình
của các chủng đã biết.
1.2.3.10. Giống Granulibacter Greenberg và cộng sự 2006


Granulibacter là giống thứ 10 trong họ Acetobacteraceae được công
bố trên tạp chí IJSEM vào cuối năm 2006. Đây là giống đầu tiên thuộc họ
Acetobacteraceae được biết đến như chủng gây bệnh cho người khi được
phân lập từ bệnh nhân bị u hạch mãn tính.
1.3. Cơ chế của quá trình lên men “Acetic” và 1 số phương pháp lên men
1.3.1. Cơ chế của quá trình lên men acetic [2], [12]
Acid acetic thu nhận từ nhiều phương pháp: Chưng cất gỗ, tổng hợp hóa

học hay sinh học lên men. Lên men acetic thực chất là quá trình oxy hóa
không hoàn toàn ethanol thành acid acetic dưới tá
c dụng của vi khuẩn.
Louis Pasteur là người khám phá ra cơ chế của quá trình lên men acetic
vào năm 1802.
Phương trình tổng quát:
CH
3
CH
2
OH + O
2
 CH
3
COOH +H
2
O + 117kcal
Thực chất trải qua các giai đọan sau:
2CH
3
CH
2
OH + O
2
 CH
3
CHO +2H
2
O
ethanol Acetaldehyt

CH
3
CHO + H
2
O  CH
3
CH(OH)
2

Hydrat của acetaldehyt
CH
3
CH(OH)
2
+1/2 O
2
CH
3
COOH + H
2
O
Acid acetic
Ngoài ra vi khuẩn Acetic còn có khả năng oxy hóa nhiều chất khác
nhau như:
Propanol  acid propionic.
Lactic acid  acetoin.
Glycerine  dyhiroxyacetol.
D-sorbitol  L-sorbose.
D-Ribit  L-ribulose.

D-Manit  D-Fructose.
D-Glucose  acid gluconic  D-5-ketogluconic.
Lactic acid  pyruvic acid.
1.3.2 . Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lên men.[12]
1.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid.
Trong quá trình lên men acetic, nồng độ acid ảnh hưởng rất quan
trọng đến sự lên men.
Nếu nồng độ acid acetic đạt 8% sẽ ức chế họat động của vi khuẩn và
nếu nồng độ đạt acid acetic từ 12-14% sẽ ức chế hoàn toàn vi khuẩn.
1.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ rượu.
Nồng độ rượu trong m
ôi trường lên men là 6-7% thể tích hoặc 9-
14% đối với lọai vi khuẩn khác. Nếu trong môi trường không có rượu thì vi
khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic để thu nhận năng lượng dùng trong sự
sống. Vì thế đây là 1 quá trình có hại.
Việc sử dụng acid acetic bởi vi khuẩn dấm gọi là sự quá oxy hóa và
acid acetic bị mất đi theo phản ứng:
CH
3
COOH + 2O
2
=2CO
2
+2H
2
O
Trong sản xuất người ta thường giữ lại độ rượu trong môi trường là
0,3-0,5%.
Sự quá oxy hóa phụ thuộc vào độ acid của môi trường. Đối với những

lòai vi khuẩn khác nhau tồn tại một giá trị pH giới hạn làm ngừng sự quá oxy
hóa. Giá trị pH đối với sự quá oxy hóa luôn cao hơn giá trị pH giới hạn đối
với sự oxy hóa rượu 1 ít. Do đó khi có rượu thì sẽ kìm hãm sự quá oxy hóa.
Đầu tiên rượu có mặt bị oxy hóa và chỉ khi độ acid chuyển sang giá trị giới
hạn thì sự quá oxy hóa bắt đầu.
1.3.2.3.Nhiệt độ


Vi khuẩn Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp đối với
chúng là từ 25-32
o
C. Ở nhiệt độ thấp thì quá trình lên men xảy ra chậm.Ở
nhiệt độ cao sẽ ức chế họat động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh
sản của tế bào làm tăng sự tổn thất cho vi khuẩn và hiệu suất của quá trình
lên men giảm do sự bay hơi của acid acetic và rượu etylic.
Tùy theo từng lòai mà nhiệt độ tối ưu cho quá trình oxy hóa sẽ thay
đổi. Nhưng trong sản xuất người ta dùng những l
òai vi sinh vật thích ứng cho
quá trình oxy hóa là 30-40
0
C.
1.3.2.4. Độ thoáng khí
Oxy là 1 yếu tố quan trọng và là nhân tố điều chỉnh quá trình lên men.
Theo cơ chế của quá trình oxy hóa, lượng không khí cung cấp cho quá
trình lên men là tương đối lớn.
Trong thực tế càng thóang khí năng suất càng cao( có giới hạn do năng
suất của chủng vi khuẩn).
1.3.2.5. Ảnh hưởng của nguồn C.N. P và các nguyên tố vi lượng
Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh, trong dịch lên men ngòai acid
acetic, rượu etylic, dung dịch lên men cần đượcc bổ sung 1 số muối khóang

(NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
PO
4,
KH
2
PO
4
, MgSO
4
, CaHPO
4
, FeCl
3
…tùy theo nhu cầu
cụ thể của từng loài. Ngòai ra trong môi trường dung dịch còn được bổ sung
thêm vitamin và chất kích thích sinh trưởng: pepton, cao nấm men, cao thịt,
sữa…Theo nghiên cứu của 1 số tác giả Nhật Bản trong môi trường dung dịch
còn được bổ sung sake, myglycerin, lactic acid …
1.3.3. Các phương pháp lên men [12], [20]
1.3.3.1. Phương pháp chậm
Nguyên lý

Phương pháp chậm còn được gọi là phương Pháp – Orleans, được biết
đến từ năm 1670, khời đầu là vùng nho nổi tiếng cuả Pháp. Người ta thấy dịch


vang nho để trong thùng gỗ bị hở nắp dần dần đục hơn, có màng phủ trên bề
mặt và trở nên chua.
Để sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta dùng những thùng
gỗ đứng có vòi tiếp nguyên liệu và rót giấm (thường bằng thủy tinh, nhựa…).
Vật liệu cấy là dấm tươi lấy từ thùng lên men khác, cho vào 1/5 thể tích thùng
là dấm tươi, sau đó đổ dịch lên men vào đến khoảng ½ thùng. Tiếp đó cứ theo
1 chu kỳ( 1tuần) đổ thêm
dịch lên men vào cho đến khi đầy thùng. Thường
dịch lên men là hỗn hợp của rượu vang và acid tạo nên dung dịch có nồng độ
từ 1-2% acid, 2-4% rượu. Vi khuẩn Acetobacter phát triển trên bề mặt chất
lỏng và “cái giấm” hình thành chứa chứa 1 lượng lớn vi khuẩn Acetobacter.
Sở dĩ ngươi ta cho acetic acid trước là để tạo điều kiện cho vi khuẩn
phát triển, mặt khác là để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, không bị
nhiễm.
Quá trình lên
men diễn ra chậm chạp do sự thâm nhập hạn chế của oxy
qua bề mặt dung dịch bị che phủ một lớp cái dấm. Thường quá trình kết thúc
sau 5 tuần nuôi cấy. Lúc đó nồng độ dịch lên men vào để lên men tiếp. Trong
quá trình lên men do bị chấn động( va chạm )” cái dấm” chìm xuống và tiêu
thụ 1 lượng cơ chất mà không tạo thành acid acetic. Đây là nguyên nhân
giảm độ acid trong giấm thành phẩm. Sau đó trên bề mặt thóang khí lại hình
thành 1 lớp màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên m
en như trên.
Giấm lấy ra được lọc trong và thanh trùng Pasteur để bảo quản được lâu.
Ưu điểm

-Cho chất lượng giấm thơm ngon.
-Thiết bị sản xuất không phức tạp, phù hợp với các cơ sở sản xuất nhỏ ở
các địa phương.
Nhược điểm

- Thời gian lên men dài.


- Năng suất thấp.
- Nồng độ acid thấp.
- Mặt bằng sản xuất phải lớn.
- Khó cơ khí hóa, tự động hóa.
- Hiện nay chỉ còn 1 vài nước chậm phát triển còn sử dụng như biện
pháp duy nhất để sản xuất giấm trong đó có Việt Nam.
1.3.3.2. Phương pháp nhanh
Nguyên lý

Phương pháp nhanh còn được gọi là phương pháp Đức. Phương pháp
này được tìm ra vào năm 1823, do Schiizenbachi, cho phép thời gian lên men
giảm xuống đáng kể.
Nguyên tắc của phương pháp này là tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa
vi khuẩn Acetobacter với không khí để oxy hóa rượu. Bề mặt lớn được tạo ra
khi sử dụng vật liệu xốp (thường dùng vỏ bào, lõi ngô xếp trong thiết bị dạng
thap, trụ, nón cụt…), tháp lên men thông thường làm bằng gỗ, thường có
chiều cao gấp đôi đường kính 2,5 – 6m x 1,2 -3m
. Vi khuẩn acetic được bám
trên vat liệu xốp (vật liệu mang). Những vật liệu này có bề mặt tiếp xúc riêng
lớn ,thể tích tự do lớn, khối lượng riêng bé, độ bền cơ học cao, rẻ tiền, dễ
kiếm, phải có đủ độ nhám, độ xốp để màng vi sinh vật có thể bám lên đó,

dịch lên men cho phương pháp nhanh thường là hỗn hợp acid 6% và 3% rượu
etylic để thu được dấm
8-9%.
Dịch lên men được chuyển từ trên xuống và không khí được chuyển từ
dưới lên. Phản ứng sinh học được thực hiện trong khối tế bào cố định, dịch
lên men được chuyển hóa nhanh thành acid acetic nhờ vi khuẩn.
Khi hầu hết rượu etylic được oxy hóa thành acid acetic người ta
thường để trong dung dịch lên men khỏang 0,2-0,5% rượu etylic để tránh quá


trình oxy hóa ngược làm giảm nồng độ acid acetic. Cuối cùng rút giấm thành
phẩm và bắt đầu 1 chu kỳ mới. Thời gian lên men khỏang 6 ngày.
Trong thực tế sản xuất người ta cho dịch lên men chảy qua thành
thùng theo nhiều phương pháp, nhưng phổ biến nhất là 1 trong 3 phương pháp
sau: vận hành đơn, vận hành kép, tuần hòan. Trong thiết bị, dịch lên men
không lấp trùm tháp mà chỉ thấm dần dần qua lớp đệm khi cho đi từ đỉnh tháp
qua khối vật liệu mang. Dịch l
ên men được tuần hòan nhiều lần qua thiết bị ,
khi chảy qua lớp đệm, rượu dần dần bị oxy hóa thành acid acetic. Lưu lượng
được tính sao cho quá trình oxy hóa trong tháp diễn ra nhanh nhất. Không khí
được đưa vào trong thiết bị thông qua các lỗ nhỏ dưới đáy tháp và bên thành
tháp. Sự thông khí nhờ sự chênh lệch nhiệt độ giữa trong và ngòai thiết bị. Để
giảm bớt tổn hao acid acetic và rượu etylic do sự bay hơi theo khí thải, người
ta bố trí 1 thiết bị hấp phụ phía
sau tháp. Với thiết bị như vậy có thể ổn định
làm việc trong 1 thời gian dài ( 20-30 năm), quá trình này được sử dụng trong
1 thế kỷ hoặc lâu hơn nữa, nhưng nếu phá vỡ quy định bình thường nào đó thì
sẽ dẫn đến hậu quả không hay và có khi ngừng sản xuất.
Do việc thông khí phụ thuộc nhiều vào độ chênh lệch giữa trong và
ngoài thiết bị nên quá trình sản xuất phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết.

Sự giảm hệ số nhiệt độ làm
giảm sự thông khí cho thiết bị và họat động oxy
hóa của vi khuẩn. Điều đó dẫn đến sự giảm nhiệt độ trong thiết bị và giảm độ
thông khí, dẫn đến sự đình chỉ hòan tòan quá trình sản xuất khi nhiệt độ môi
trường quá cao( t
o
> 30
o
C ). Vấn đề kiểm tra nhiệt độ tự động trong thiết bị
được giải quyết bằng cách làm lạnh dịch lên men trước khi bơm tuần hòan trở
lại thiết bị tới nhiệt độ 26-28
o
C. Nồng độ oxy được kiểm tra bằng
Oxygemeter, nồng độ oxy trong khí thải được bảo đảm lớn hơn 12%.


Có thể coi phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp công
nghiệp của Đức là ứng dụng đầu tiên về phương pháp cố định tế bào vi sinh
vật vào công nghiệp lên men.
Ưu điểm

- Thời gian lên men ngắn hơn so với phương pháp chậm khá nhiều, chỉ
trong 5-6 ngày.
-Giấm thu được có nồng độ cao .
Nhược điểm

-Hiệu suất kinh tế chưa cao do thiết bị khá phức tạp, điều chỉnh thiết bị
thông gió khó và cần phải nghiên cứu kỹ hơn.
-Hiệu suất của quá trình lên men không cao vì rượu và acid là chất dễ
bay hơi ( lượng thất thóat tới 2-6%). Có thể khắc phục bằng cách đặt 1 thiết bị

ngưng tụ bao gồm 2 thiết bị lọc than đặt kế tiếp nhau sau tháp lên men để
ngưng tụ rượu và acid.
1.3.3.3. Phương pháp chìm
Nguyên lý

Phương pháp chìm còn gọi là phương pháp sục khí. Việc sử dụng
phương pháp chìm cho oxy hóa rượu etylic thành acid acetic do Ebner và
Hromatka phát hiện ra vào năm 1949.
Trong phương pháp chìm không khí được sục qua khối dịch lên men
mãnh liệt và tạo thành 1 thể huyền phù có pha rắn là Acetobacter và pha lỏng
là dịch lên men trong các nồi lên men đặc biệt. Trong nồi lên men dịch rượu
etylic được chuyển thành acid acetic khá nhanh. Để lên men, dịch lên men
đưa vào thiết bị gồm 6-12% rượu etylic cộng 1-3% acid acetic. Thời gian 1
chu trình sản xuất khoảng 40-96 giờ. Sản phẩm tạo thành 7-13% acid acetic,
0,2-0,5% rượu sót. Thiết bị lên men chìm nổi tiếng nhất của Tây Đức gọi là
Axetator-Frings. Cho tới năm 1981 t
òan thế giơí có khỏang 440 Axetator-


Frings họat động. Trong khi đó ở Việt Nam chưa có Axêtator-Frings nào họat
động.
Ở thiết bị Axetator-Frings tổng hàm lượng rượu và acid cho mỗi chu kỳ
khỏang 7-15% khi hàm lượng rượu trong thùng lên men còn 0,2-0,5%, quá
trình được coi là kết thúc.
Người ta lấy 40-60% dịch lên men ra với tốc độ sao cho tránh tiêu hao
toàn bộ rượu etylic. Sau đó cho dịch lên men mới vào đúng đến lượng ban
đầu, quá trình này diễn ra từ từ tránh tác động đến tế bào do sự thay đổi nồng
độ cơ chất trong dung dịch. Thùng lên men được gắn với 1 máy nén khí,một
bộ phận khuấy và 1 bộ phận phá bọt. Acid acetic v
à rượu etylic được xác định

tự động. Tùy loại nguyên liệu sử dụng và lượng rượu etylic cho vào, quá
trình lên men có thể kéo dài 40-96 giờ với hiệu suất 90-95%.
Mặc dù có những ưu điểm rất lớn nhưng mãi cho đến gần đây nó mới
được sử dụng rộng rãi trong đời sống, nguyên nhân kìm hãm là do nhu cầu
phức tạp của thiết bị, tính ổn định không cao, quan trọng nhất là yêu cầu
nghiêm
ngặt của việc cung cấp oxy liên tục. Những công trình ngiên cứu từ
năm 1949 đã chỉ ra rằng các vi khuẩn Acetobacter khi ở trạng thái lơ lửng
trong môi trường gồm dấm, cồn, nước sẽ trở nên nhạy cảm với việc cung cấp
oxy ở những giai đọan ngắn nhất, đặc biệt khi nồng độ acid acetic đã khá cao.
Ví dụ: nồng độ tổng l
à 5%, khi ngừng cung cấp oxy trong khỏang 120 giây sẽ
làm chết 1/3 số vi khuẩn có mặt trong môi trường lên men, nếu nồng độ tổng
là 12% thì chỉ cần ngắt oxy trong 10-12 giây đã đủ làm chết 1/3 tổng số vi
khuẩn.
Ưu điểm

- Thời gian lên men nhanh.
- Thiết bị nhỏ hơn, gọn hơn, năng suất cao hơn.
- Hiệu suất cao( 90-95%).


- Có khả năng tự động hóa cao.
- Tổng sản lượng dấm sản xuất theo phương pháp đến năm 1981 là767
triệu lít năm (giấm10%), trong đó chủ yếu là nước Mỹ, Nhật Bản, Pháp, Tây
Đức và 1 số nước khác. Ở Việt Nam đã tiên hành lên men dấm và acid acetic
theo phương pháp chậm,đang nghiên cứu các phương pháp lên men nhanh và
chìm.
Nhược điểm

-Thiết bị phức tạp.
-Tính ổn định không cao.
-Yêu cầu về việc cung cấp oxy rất phức tạp..
1.3.3.4. Phương pháp phối hợp
Nguyên lý

Đây là phương pháp kết hợp 2 phương pháp nhanh và chìm. Nó xuất
hiện gần đây ở Liên Xô cũ. Thiết bị lên men theo phương pháp này gồm 2
phần
*Phần trên

Như thùng lên men theo phương pháp nhanh.Bên trong thùng đổ đầy
đệm theo phương pháp nhanh.
*Phần dưới

Phần chứa dịch lên men sau khi qua vật liệu xốp có lắp thêm bộ phận sục
khí tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như 1 nồi lên men của phương pháp
chìm.

Ưu điểm

Phương pháp này có ưu điểm khi hệ thống lên men đang họat động, nếu
ngừng cung cấp điện ( ngừng cung cấp oxy qua bộ phận sục khí ) vẫn không
ảnh hưởng đến vi khuẩn. Lúc đó các van thông khí bên trong thiết bị được mở


ra và không khí vào nhờ vào sự thông khí tự nhiên, do đó màng vi khuẩn trên
đệm không bị chết, nhưng chỉ đảm bảo phần trên máy còn phần dưới vẫn phụ
thuộc vào nguồn điện thông khí cho vi khuẩn họat động.
Phương pháp này phát huy được ưu điểm của cả 2 phương pháp nhanh

và chìm.
Nhược điểm

-Thiết bị yêu cầu phức tạp, cồng kềnh.
-Giống vi khuẩn phải phù hợp cả 2 phương pháp.
1.3.3.5. Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật
1.3.3.5.1. Định nghĩa tế bào cố định
Tế bào cố định là tế bào có sự chuyển động trong không gian bị giới
hạn, sự giới hạn của tế bào có được bằng đưa nó vào 1 phase cách ly với
phase dung dịch tự do. Phase chứa tế bào thường không tan trong nước, l
à
polymer cao phân tử ưa nước.
1.3.3.5.2. Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt
chất mang
Phương pháp này dự trên sự liên kết giữa chất xúc tác sinh học và
chất mang không tan trong nước.
a.Phương pháp liên
kết cộng hóa trị
Đây là phương pháp sử dụng để cố định enzyme và không được sử dụng
rộng rãi đối với tế bào vi sinh vật, vì tác nhân cần thiết đe tạo liên kết cộng
hóa trị có thể gây độc đến tế bào và gây khó khăn cho việc cố định.
Chất mang thường được sử dụng trong phương pháp này là polypeptide,
polysaccharide, dẫn xuất cellulose như DEAE-cellulose, DEAE-saphadex….,
agarrose, các polyme tổng hợp.
Phương pháp tiến hành