Nghiên cứu phương pháp định lượng cephalexin trong nước tiểu nhằm đánh giá sinh khả dụng của viên nang cephalexin 500mg sản xuất trong nước

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
i ì "ểtaểkaể*
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEPHALEXIN
TRONG NƯỚC TIỂU NHẰM ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA
VIÊN NANG CEPHALEXN 500mg SẢN XUẤT TRONG NƯỚC
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1998 - 2003)
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
NƠI THỰC HIỆN
THỜI GIAN THỰC HIÊN
: PGS. TS. TRẦN TỬ AN
Th.s. NGUYỄN THỊ KIỂU ANH
: Bộ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH
: 03- 06/2003
HÀ NỘI - 06/2003
LÒI CẢM ON
Trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp em đã nhận được
sự giúp đõ hết sức quý báu vả chân tình của các thầy GÔ, gia đình và bè
bạn.
Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tối:
PG&TỔ. Trần Tử An
Th.ô. Nguyễn Thị Kiéu Anh
đã tận tình hướng dẫn em hoàn thầnh luận văn này.
Em cũng xin bảỵ tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tối các thầy cô trong BỘ MÔN
HOÁ PHÂN TÍCH đã tận tình giúp đõ và tạo mọi điểu kiện thuận lợi cho em
trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp nầỵ.
Em xin chân thảnh cảm ơn!
Hà Nội, ngảỵ 25 tháng 5 năm 2003
ổinh viên
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THAO

MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về cephalexin
2
1.1.1. Công thức và tính chất lý hoá 2
1.1.2. Tính chất dược lý và dược động học 2
1.1.3. Chỉ định 3
1.1.4. Chống chỉ định 3
1.1.5. Tác dụng không mong muốn 3
1.1.6. Liều dùng 4
1.1.7. Dạng bào chế 4
1.1.8. Các phương pháp định lượng 4
1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 6
1.2.1. Phân loại các phương pháp sắc k ý 6
1.2.2. Đặc điểm phương pháp 7
1.2.3. Nguyên tắc của phương pháp 8
1.2.4. Một số thông số đặc trưng của HPLC 8
1.2.5. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC 10
1.3. Sinh khả dụng của thuốc 10
1.3.1. Khái niệm về sinh khả dụng 10
1.3.2. Cách đánh giá sinh khả dụng in vivo 11
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên yật liệu và phương pháp nghiên cứu 13
2.1.1. Nguyên vật liệu và hoá chất 13
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm 14
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 16
2.2.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

16
2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng cephalexin trong nước
tiểu 20
2.2.3. Bước đầu đánh giá sinh khả dụng của viên nang cephalexin
500mg sản xuất trong nước 25
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT
3.1. Kết luận
32
3.2. Đề xuất 33
Tài liệu tham khảo

.
34
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
A Diện tích pic
ACN Acetonitril
AUC Diện tích dưới đường cong
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IS Chất chuẩn nội
MeOH Methanol
R Tỷ số diện tích pic
R-CEF/IS Tỷ SỐ diện tích pic giữa cephalexin và chất
chuẩn nội
SK Sinh khả dụng
TĐSH Tương đương sinh học
XNDF TW1 Xí nghiệp dược phẩm trung ương 1
ĐẶT VẤN ĐỂ
Trong những năm trở lại đây, song song với sự phát triển của nhiều ngành
khoa học khác, ngành công nghệ dược phẩm đã và đang thu hút được sự quan
tâm chú ý và đầu tư của nhiều nước, trong đó có Việt Nam. Thị trường dược

phẩm trở nên phong phú và vô cùng đa dạng với sự ra đời của nhiều chế phẩm
thuốc mới, dưới nhiều tên biệt dược khác nhau. Cephalexin là kháng sinh
cephalosporin thế hệ 1, được hấp thu gần như hoàn toàn qua đường tiêu hoá,
đào thải qua đường niệu dưới dạng không biến đổi.
Ở Việt Nam, cephalexin là kháng sinh đã được đưa vào sản xuất khá phổ
biến, với giá thành rẻ, hiệu quả điều trị tốt. Tuy nhiên do tâm lý người tiêu
dùng luôn đánh giá thuốc ngoại tốt hơn thuốc sản xuất trong nước mặc dù giá
thành đắt hơn và hiệu quả điều trị của hai thuốc có thể là tương đương. Hiện
vẫn chưa có tài liệu nào nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của viên nang
cephalexin sản xuất trong nước vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài
“Xây dựng
phương pháp định lượng cephalexin trong nước tiểu nhầm đánh giá sinh
khả dụng của viên nang cephalexin 500mg” với mục tiêu :
- Xây dựng một chương trình định lượng cephalexin trong nước tiểu
bằng kỹ thuật HPLC.
- Áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng cephalexin trong
mẫu nước tiểu người sau khi uống viên nang cephalexin 500mg nhằm đánh
giá sinh khả dụng của viên nang cephalexin 500mg sản xuất trong nước (so
sánh với viên đối chiếu của nước ngoài).
1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CEPHALEXIN
1.1.1. Công thức và tính chất lý hoá [3], [9], [20]
- CTCT:
COOH
- CTPT: C16H17N 30 4S . H20.
- Phân tử lượng: 365,4.
- Tên khoa học: acid 7-a-D phenylglycylamino-3 methyl -3- cephem- 4-
carboxylic monohydrat.
- Tính chất lý hoá: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng. Khó hoà tan

trong nước. Thực tế không tan trong cloroform, ethanol 96% và ether.
1.1.2. Tính chất dược lý và dược động học [4], [8], [14], [15]
Cephalexin là kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 1, là kháng sinh
uống có hoạt tính lên nhiều loại vi khuẩn gram dương và gram âm, có tác
dụng diệt khuẩn do ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Cephalexin bền
vững với penicillinase của staphylococcus do đó có tác dụng với cả các chủng
S. aureus tiết penicillinase kháng penicillin (hay ampicillin). Cephalexin cũng
có hoạt tính lên đa số E. coli đề kháng ampicillin.
Cephalexin được hấp thu gần như hoàn toàn ở đường tiêu hoá, đạt nồng
độ tối đa trong máu sau uống khoảng 1 giờ. Thức ăn làm chậm khả năng hấp
thu cephalexin nhưng tổng lượng thuốc hấp thu không thay đổi. Thuốc liên kết
protein huyết tương 15%. Thời gian bán thải là 0,5 - 1,2 giờ, dài hơn ở trẻ sơ
2
sinh và tăng khi chức năng thận giảm. Cephalexin không bị chuyển hoá, thuốc
được đào thải với nồng độ cao trong nước tiểu, sau khi uống 6 giờ khoảng
80% liều dùng được thải trừ qua nước tiểu ở dạng không biến đổi, với liều
500mg nồng độ cephalexin trong nước tiểu cao hơn lmg/lml. Cephalexin
được đào thải qua lọc máu và thẩm phân màng bụng (20%-50%).
1.1.3. Chỉ định [4], [8]
Cephalexin được chỉ định điều trị các nhiễm khuẩn do các vi khuẩn nhạy
cảm, nhưng không chỉ định điều trị các nhiễm khuẩn nặng :
- Viêm đường tiết niệu: viêm thận - bể thận cấp và mãn, viêm bàng
quang, viêm tuyến tiền liệt. Điều trị dự phòng nhiễm khuẩn đường niệu tái
phát.
- Nhiễm khuẩn hô hấp: viêm phế quản cấp và mãn, giãn phế quản bội
nhiễm.
- Nhiễm khuẩn tai mũi họng: viêm tai giữa, viêm xoang, viêm amidan,
viêm họng.
- Nhiễm khuẩn sản phụ khoa.
- Nhiễm khuẩn da, mô mềm và xương.

- Bệnh lậu (khi penicillin không phù hợp).
- Trong nha khoa: điều trị dự phòng thay penicillin cho người bệnh mắc
bệnh tim phải điều trị răng.
1.1.4. Chống chỉ định [4]
- Dị ứng với kháng sinh khóm cephalosporin.
- Bệnh nhân có tiền sử choáng phản vệ do penicillin hoặc phản ứng trầm
trọng khác qua trung gian globulin miễn dich IgE.
1.1.5. Tác dụng không mong muốn [4], [8]
- Trên tiêu hoá: rối loạn tiêu hoá như buồn nôn, nôn, tiêu chảy.
- Toàn thân: đau đầu, chóng mặt, phản ứng phản vệ, mệt mỏi.
- Phản ứng quá mẫn ở da: ngứa, mề đay, phát ban.
3
- Máu: giảm bạch cầu trung tính có hồi phục.
- Gan: tăng transaminase có hồi phục.
1.1.6. Liều dùng [8]
- Người lớn và trẻ em trên 12 tuổi: 500mg/lần X 31ần/ngày.
- Trẻ em từ 5-12 tuổi: 250mg/lần X 31ần/ngày.
- Trẻ em từ 1-5 tuổi: 125mg/lần X 31ần/ngày.
- Trẻ em dưới 1 tuổi: 125mg/lần X 21ần/ngày.
Lưu ý [4]: thời gian điều trị nên kéo dài ít nhất từ 7-10 ngày, nhưng trong
các nhiễm khuẩn đường niệu phức tạp, tái phát, mạn tính, nên điền trị 2 tuần
(lg X 2 lần mỗi ngày). Cũng như đối với những kháng sinh đào thải chủ yếu
qua thận, cephalexin có thể có tích tụ trong cơ thể khi chức năng thận giảm
dưới một nửa mức bình thường, do đó nên giảm liều tối đa cho phù hợp với
những bệnh nhân này. Ở người cao tuổi cần đánh giá mức độ suy thận. Khi
phối hợp với các thuốc khác cũng độc với thận như aminoglycosid hay thuốc
lợi tiểu mạnh, liều cao cephalexin có thể ảnh hưởng xấu tới chức năng thận.
1.1.7. Dạng bào chế [4], [8]
- Viên nang: 250mg, 500mg.
- Viên nén: 250mg, 500mg, lg.

- Nhũ dịch: 125mg/5ml, 250mg/ml.
- Siro: 250mg/ml, 500mg/ml.
- Thuốc giọt dùng cho trẻ em: 125mg/l,25ml.
- Thuốc bột 250mg: gói 3g.
* Biệt dược [5], [14]: Novo-lexin, Opxil, Ceporex, sporidex, Ospexin
1.1.8. Các phương pháp định lượng
Ll.8.1. Phương pháp đo ỉod [3], [13], [18] định lượng cephalexin trong chế
phẩm.
4
Oxy hoá dung dịch cephalexin bằng dung dịch iod 0,02N trong môi
trường natri hydroxyd, định lượng iod thừa bằng dung dịch natri thiosulfat
0,02N với chỉ thị là dung dịch hồ tinh bột (CT). Song song làm một mẫu
chuẩn trong cùng điều kiện.
Hàm lượng cephalexin trong mẫu thử được tính theo công thức:
VT
Cị =

X Cc
vc
Trong đó: Cp là nồng độ cephalexin trong mẫu thử (mg/ml)
Cclà nồng độ cephalexin trong mẫu chuẩn (mg/ml)
v x là thể tích dung dịch iod 0,02N dùng cho dung dịch thử (ml)
v c là thể tích dung dịch iod 0,02N dùng cho dung dịch chuẩn (ml)
1.1.8.2. Phương pháp đo quang [3]: định lượng cephalexin trong nguyên liệu
và chế phẩm.
Dung dịch cephalexin trong nước có cực đại hấp thụ ở 262 nm. Đo độ
hấp thụ của dung dịch cephalexin thử ở bước sóng 262 nm. Tính hàm lượng
cephalexin trong mẫu thử bằng cách so sánh với chuẩn.
Hàm lượng cephalexin trong mẫu thử được tính theo công thức sau:
Dt

Cp = — — X Cc
Dc
Trong đó: DT là mật độ quang của dung dịch thử
Dc là mật độ quang của dung dịch chuẩn
1.1.8.3. Phương pháp vi sinh vật [3]
- Chủng chỉ thị: Staphylococcus aureus ATCC 19737.
- Phương pháp định lượng: phương pháp khuyếch tán (phiến kính phẳng).
1.1.8.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Trong HPLC, sắc ký phân bố pha đảo với cột c 8, C18 hay phenyl và pha động
là các dung môi hữu cơ như methanol, acetonitril là phương pháp được sử
dụng phổ biến để định lượng cephalexin trong nguyên liệu chế phẩm và dịch
5
sinh học. Riêng đối với dịch sinh học, cephalexin trong mẫu thử thường được
loại protein bằng một số dung môi như acid tricloroacetic, acid percloric, acid
phosphoric Một số điều kiện định lượng cephalexin bằng HPLC được trình
bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1: Một số điều kiện định ỉượng cephalexin bằng HPLC
STT Tài liệu
Pha động
Cột Mẫu thử
1
[3], [9],
[10], [20]
MeOH : ACN : d2 KH2P04
1,36% :H20 (2:5: 10: 83)
C18(5,10|-im)
250 X 4,5mm
Nguyên liệu,
chế phẩm
2

[12]
MeOH: đệm phosphat 0,1M
(27 : 73), pH 3,6.
Phenyl 10|am
300 X 3,9mm
Nguyên liệu,
chế phẩm
3
[11]
ACN: (NH4)H2P04 0,5M
(10: 90), pH 3,0.
C18 5|am
250 X 4,6mm
Huyết tương,
nước tiểu
4
[16]
MeOH : NaH2P04 0,02M
(23 : 77), pH 5,0.
c 18 5|0,m
250 X 4,6mm
m ô
5
[17]
ACN 30% có chứa 2- propan
sulfonat 0,005M, pH 3,0.
Ci8
Huyết tương
1.2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography -

HPLC) hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại đã ra đời
vào những năm cuối của thập kỷ 60. Nó được xây dựng và phát triển không
ngừng và ngày càng thể hiện rõ tính ưu việt, đặc biệt là trong lĩnh vực sinh
dược học và kiểm nghiệm.
1.2.1. Phân loại các phương pháp sắc ký [2]
Theo bản chất của quá trinh sắc ký, người ta chia làm 4 loại.
- Sắc ký phân bố hiệu năng cao + sắc ký lỏng-lỏng (LLC)
+ Sắc ký phân bố pha liên kết (BPC).
6
- sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (sắc ký lỏng rắn : LSC).
- Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel (sắc ký theo loại cỡ).
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng phân bố
pha liên kết (Bonded Phase Chromatography: BPC). Đây là phương pháp hay
được sử dụng trong việc tách, định lượng các chất thuộc nhiều lĩnh vực như :
Dược ( thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau ), hoá sinh ( acid amin, protein,
lipit ), thực phẩm , hoá chất công nghiệp , hoá pháp và môi trường.
1.2.2. Đặc điểm của phương pháp [2], [6]
Bản chất chính của sự tách sắc ký là dựa trên sự phân chia khác nhau của
các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau và luôn tiếp xúc nhau: một pha
tĩnh và một pha động.
< Đặc điểm của pha tình
Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học (liên
kết) với chất mang (hạt silicagel) tạo nên hợp chất cơ Siloxan:
- Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay
phenyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril ta có sắc ký pha
đảo (sắc ký pha ngược).
- Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin -(CH2)n-NH2 hay alkylnitril
-(CH2)n-CN và dung môi ít phân cực như hexan —> ta có sắc ký pha thuận.
<Đặc điểm của pha động

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra
khỏi cột sắc ký. Trong sắc ký pha đảo của sắc ký phân bố pha liên kết, pha
CH
CH3
H,c CH
-SĨ-OH+ Cl-Si-R
- Si - o - Si-R
CH3
Dẫn chất
H3C c h 3
Dẫn chất
Siloxan
của Silicagel Clorosilan
7
động là một hệ dung môi phân cực và được dùng khá phổ biến là các dung
môi methanol, tetrahydrofuran, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với
nước với đệm.
Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống các chất cần
tách và khác vói pha động.
Hiện nay sắc ký pha đảo được dùng rất rộng rãi để tách nhiều hỗn hợp mẫu
từ vô cơ đến hữu cơ, từ chất phân cực đến chất không phân cực vì nó cho kết
quả tách tốt với nhiều đối tượng tách khác nhau.
1.2.3. Nguyên tắc của phương pháp [6]
Các chất trong hỗn hợp phân tích được tách khỏi nhau dựa trên khả năng
phân bố khác nhau của chúng vào hai pha không hoà lãn vào nhau, luôn tiếp
xúc nhau: một pha tĩnh và một pha động .
Dung dịch các chất phân tích được đưa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm
mẫu và được dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ một bơm cao áp.
Tại cột xảy ra quá trình tách, những phân tử nào có ái lực thấp với pha tĩnh thì
được rửa giải ra trước, còn những phân tử nào có ái lực mạnh với pha tĩnh thì

được rửa giải ra sau. Chất ra khỏi cột được phát hiện bằng detector gắn vói
máy ghi, máy tính hay máy tích phân. Thời gian lưu tR là đặc trưng định tính
của chất. Chiều cao hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất, sắc ký
được tiến hành so với chuẩn.
1.2.4. Một sô thông sô đặc trưng của HPLC [2], [9]
Ví dụ ta có sơ đồ sau:
Hình 1.1: Một số thông số đặc trưng của HPLC.
8
Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu, qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm mẫu
vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic). So sánh thời gian lưu của
mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.
- Thời gian chết tM (phút) là thời gian của một chất không bị lưu giữ tức
là bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi.
Cs
- Hệ số phân bố: k = ——
Cm
Với một chất, k lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh và sẽ di
chuyển chậm, nếu k nhỏ chất sẽ di chuyển nhanh.
- Thừa số dung lượng k’ mô tả tốc độ di chuyển của một chất:
ỵ _ Qs _ tạ _ tR ~ tM _ VR — VM
Qm t-M tM VM
Qs, Qm là lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh và pha động.
Với một chất k’ càng lớn, tốc độ di chuyển càng thấp, thường chọn k’
nằm trong khoảng từ 1 đến 8: k’ nhỏ hơn 1 pic sẽ xuất hiện quá sớm dễ lẫn với
tạp chất, k’ lớn hơn 8 thời gian phân tích quá dài.
- Thừa số chọn chọn lọc a: mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất.
a = — k B _ ^R .B
k A k ’A t'RA
Quy ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a >1. Để tách riêng 2 chất

thì a >1, thường từ 1,05 - 2,00.
- Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột sắc ký.
N = ì6 x
Ír
2
hay N = 5,54 X
ỈR
- W B_
_Wl/2_
9
Trong đó: WB chiều rộng pic ở đáy pic.
w1/2 chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
- Độ phân giải Rs là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc
ký.
Để tách riêng hai chất, Rs >1,5 (khi 2 sắc đồ có độ lớn cùng cỡ).
- Chiều cao pic hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất. Khi
so sánh chiều cao hay diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn trong cùng điều
kiện phân tích ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử.
1.2.5. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC.
Để tính kết quả trong phương pháp HPLC, người ta có thể dựa vào:
- Phương pháp đường chuẩn.
- Phương pháp thêm.
- Phương pháp so sánh.
Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán kết
quả dựa vào đường chuẩn được xây dựng bằng cách chủ động cho chất chuẩn
với nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật. Xử lý mẫu và đem chạy sắc ký.
1.3. SINH KHẢ DỤNG CỦA THUỐC
1.3.1. Khái niệm về sinh khả dụng [1], [7]
Sinh khả dụng là khái niệm đặc trưng cho quá trình sinh dược học của
dạng thuốc, nó phản ánh mức độ và tốc độ hấp thu của dược chất từ dạng bào

chế vào hệ tuần hoàn và đưa đến nơi có tác dụng. Trong đó, mức độ hấp thu
được đánh giá bởi diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC), tốc
độ hấp thu dược chất được đánh giá bởi giá trị nồng độ cực đại (Cmax) và thời
gian đạt nồng độ cực đại (Tmax).
Các thông số dược động học cần quan tâm khi đánh giá sinh khả dụng
của thuốc được trình bày ở bảng 1.2.
10
Bảng 1.2: Các thông số dược động học chính của thuốc.
T
A max
Thời gian dược chất đạt nồng độ cực đại
c
^max
Nồng độ cực đại của dược chất
K
Hằng số tốc độ thải trừ
Ti/2
Thời gian bán thải
AUC
Diện tích dưới đường cong nồng độ thời gian
Trong đó:
Tmax và Cmax: Xác định được nhờ quan sát trực tiếp dữ liệu nồng độ
dược chất trong dịch sinh học tại từng thời điểm.
Xz được tính từ độ dốc của đường cong logarit nồng độ dược chất trong dịch
sinh học theo thời gian tại những điểm lấy mẫu cuối cùng của pha thải trừ.
Thời gian bán thải:
Diện tích dưới đường cong AƯC có thể tính theo phương pháp tích phân
hoặc có thể tính đơn giản theo quy tắc hình thang.
Khi đánh giá SKD, phải xem xét đồng thời các yếu tố trên.
1.3.2. Cách đánh giá SKD in vivo [7]

Sinh khả dụng in vivo đánh giá giai đoạn hấp thu dược chất từ chế phẩm
bào chế. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã có các tiểu ban chuyên về đánh
giá SKD và TĐSH và đã đưa ra các quy định hoặc các hướng dẫn về việc đánh
giá SKD và TĐSH của thuốc:
- Thử in vivo ở người bằng cách xác định sự biến thiên nồng độ dược chất
hoặc chất chuyển hoá trong máu, huyết tương, huyết thanh hoặc các dịch sinh
học thích hợp khác theo thời gian.
- Thử in vivo ở người bằng cách đo dược chất hoặc chất chuyển hoá bài
tiết trong nước tiểu theo thời gian.
11
- Thử in vivo ở người bằng cách đo tác dụng dược lý của dược chất hoặc
chất chuyển hoá theo thời gian nếu tác dụng đó có thể đo được một cách đủ
chích xác, đủ nhạy và đủ lặp lại.
- So sánh tác dụng lâm sàng một cách thích hợp.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành đánh giá SKD tương đối của viên
nang cephalexin 500mg sản xuất trong nước thông qua việc xác định lượng
thuốc được bài tiết trong nước tiểu theo thời gian (so sánh với viên đối chiếu
của nước ngoài).
AUC*ử
SKD tương đối =
X 100(%)
AUCđối C |-|j £'u
Hai thuốc được coi là tương đương sinh học với nhau nếu chế phẩm thử
có SKD = 100 ± 20% so với chế phẩm đối chiếu.
12
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.
2.1.1. Nguyên yật liệu và hoá chất.
<Nguyên vật liệu.
- Cephalexin monohydrat (chất đối chiếu hoá học).

- Cefotaxim (chất đối chiếu hoá học).
- Cefazolin (chất đối chiếu hoá học).
- Theophyllin 99,95% (chất đối chiếu hoá học).
- Viên nang cephalexin 500mg (XNDF TW1).
- Viên nang cephalexin 500mg (Ospexin, Áo).
< Hoá chất.
- Acetonitril (HPLC grade-Merck).
- Methanol (HPLC grade-Merck).
- Natri acetat anhydrid (PA grade- Merck).
- Triethylamin (PA grade- Merck).
- Acid acetic băng (HPLC grade- Merck).
<Dụng cụ.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao:
+ Bơm cao áp Merck Hitachi L-600.
+ Detector Merck- Hitachi L-4000 uv.
+ Máy tích phân Merck-Hitachi D-2500 chromato-integrator.
+ Van tiêm mẫu Rheohyne 1725-USA.
- Máy quang phổ uv-VIS.
- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh).
- Cân phân tích Satorius (Đức).
- Máy siêu âm Branson (Mỹ).
- Máy lắc Labinco.
13
- Autopipet lO-lOOpl, 100-1000|il.
- Tủ siêu lạnh Frigor (Đan Mạch).
- Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức.
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm
2.1.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký.
Khảo sát tìm chất chuẩn nội và lựa chọn hệ dung môi (pha động) chạy
sắc ký

Trong sắc ký pha đảo của sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là một hệ
dung môi phân cực, hay dùng là các dung môi methanol, acetonitril hay hỗn
hợp của methanol, acetonitril với nước, với đệm. Để khảo sát lựa chọn chất
chuẩn nội chúng tôi sử dụng những chất có cấu trúc và tính chất gần giống với
cephalexin cho vào mẫu trắng có chứa cephalexin chuẩn. Tiến hành sắc ký với
từng hệ dung môi, xác định thời gian lưu của cephalexin và chất chuẩn nội,
tính thừa số chọn lọc a , tính Rs của từng hệ dung môi và thời gian phân tích,
trên cơ sở đó lựa chọn hệ dung môi và chất chuẩn nội thích hợp để phân tích
cephalexin trong nước tiểu. Chất chuẩn nội sử dụng phải tách hẳn với
cephalexin và tạp chất trong nước tiểu, bền vững và phát hiện dễ dàng ở điều
kiện sắc ký khảo sát.
2.1.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng cephalexin trong nước tiểu.
< Khảo sát khoảng tuyến tính.
Chủ động cho cephalexin vào mẫu trắng (nước tiểu không có cephalexin)
để được các nồng độ 0,5 - 2 - 4 - 6 - 8 - 12 - 16 - 20mcg/ml. Sau đó, cho vào
các ống nghiệm cùng một lượng chất chuẩn nội (IS) là 10mcg/ml. Tiến hành
sắc ký, kết quả thu được là diện tích pic, từ đó xây dựng mối tương quan giữa
nồng độ cephalexin và tỷ số diện tích pic giữa cephalexin và IS.
< Xác định tính chính xác của phương pháp: trong cùng một ngày và giữa các
ngày phân tích.
14
Tiến hành làm nhiều lần ở cùng một nồng độ, kết quả thu được là diện tích
pic, từ đó tính được tỷ số diện tích pic giữa cephalexin và IS. Xác định sai số
của phương pháp (biểu thị bằng RSD%). Làm ở 3 nồng độ 4mcg/ml,
12mcg/ml, 16mcg/ml.
< Xác định tính đúng của phương pháp: Bằng phương pháp thêm
Thêm chính xác một lượng chất chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ
cephalexin sao cho tổng nồng độ cephalexin trong mẫu phân tích nằm trong
khoảng nồng độ đã khảo sát. Tiến hành sắc ký, kết quả thu được biểu thị bằng
diện tích pic của cephalexin và IS, từ đó tính được nồng độ cephalexin trong

các mẫu phân tích và % cephalexin chuẩn tìm lại được.
2.I.2.3. Bước đầu đánh giá sính khả dụng của viên nang cephalexin 500mg
sản xuất trong nước.
< Xác định độ đồng đều hàm lượng.
Tiến hành thử trên 10 nang cephalexin riêng rẽ được lấy bất kỳ, xác định
hàm lượng cephalexin trong mỗi nang bằng phương pháp đo quang. Dung dịch
cephalexin trong nước có cực đại hấp thụ ở 262nm.
Với mỗi nang: cân chính xác một lượng bột thuốc đã nghiền nhỏ tương
ứng với khoảng 0,250g cephalexin, lắc kỹ trong 30 phút với khoảng 100ml
nước, thêm nước cho vừa đủ 250ml, trộn đều và lọc, bỏ khoảng 20ml dịch lọc
đầu.
Lấy chính xác 1,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100ml, thêm nước
cho vừa đủ. Trộn đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng
262nm. Tính hàm lượng cephalexin trong mẫu thử bằng cách so sánh với
chuẩn có nồng độ tương đương.
Song song tiến hành với 10 nang Ospexin 500mg.
< Đánh giá sinh khả dụng.
* Đối tượng thử.
Chọn 6 người tình nguyện khỏe mạnh.
15
+ Không hút thuốc.
+ Không mắc các bệnh về gan - thận.
+ Không dùng các thuốc và các thực phẩm có chứa cồn, cafein hoặc các chế
phẩm có chứa xanthin khác hai tuần trước khi thử và trong suốt qúa trình thử.
+ Nhịn ăn qua đêm ít nhất 10 giờ trước khi dùng thuốc và 2 giờ sau khi dùng
thuốc.
* Bố trí thí nghiệm
Mỗi người tình nguyện uống một liều đơn viên nang cephalexin 500mg với
240ml nước.
* Lấy mẫu thử và mẫu đối chiếu

Mẫu nước tiểu được lấy ở 8 thời điểm: 0 - 1 - 2,5 - 4 - 6 - 8 - 12 - 24 giờ
sau khi uống thuốc và mẫu được bảo quản ở điều kiện lạnh (-30°C) tới khi
phân tích.
* Định lượng
Hàm lượng cephalexin trong mẫu thử được tính theo phương pháp đường
chuẩn. Đường chuẩn được xây dựng theo ngày phân tích.
* Theo dõi độ ổn định của cephalexin trong mẫu thử theo thời gian bảo quản.
Mẫu nước tiểu người sau khi uống viên nang cephalexin 500mg được bảo
quản ở điều kiện -30°c và theo dõi độ ổn định của cephalexin sau 10, 20, 30
ngày bảo quản.
2. 2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT.
2.2.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
Dùng sắc ký phân bố pha liên kết
< Cột sắc ký.
Tiến hành khảo sát trên các cột sắc ký khác nhau : cột C18, cột C8,và cột
phenyl. Qua các kết quả thu được thấy cột phenyl phù hợp.
< Khảo sát tìm chất chuẩn nội và lựa chọn dung môi (pha động) chạy sắc
ký.
16
* Chất chuẩn nội: dùng cefotaxim, cefazolin và theophyllin là những chất có
cấu trúc và tính chất gần giống với cephalexin để khảo sát lựa chọn chất chuẩn
nội. Chất chuẩn nội phải đảm bảo tách khỏi cephalexin và tạp chất trong nước
tiểu và ổn định trong điều kiện sắc ký.
* Pha động', tiến hành khảo sát trên các hệ pha động khác nhau, xác định độ
phân giải và khả năng tách của cephalexin với các tạp trong nước tiểu và khả
năng tách của cephalexin với .chất chuẩn nội.
Chúng tôi đã tiến hành sắc ký, dùng cột phenyl với 6 hệ pha động sau:
1. MeOH : NaCH3COO 0,1 M (10 : 90, pH = 5,6).
2. ACN : NaCH3COO 0,1 M (8 : 92, pH = 5,2).
3. ACN : MeOH : NaCH3COO 0,1 M (4,5 : 2,5 : 93, pH = 5,2).

4. MeOH : H20 : CH3COOH (30 : 70 : 0,1).
5. ACN : MeOH : NaCH3COO 0,1 M (11,52 : 0,48 : 88, pH =5,4).
6. ACN : MeOH : NaCH3COO 0,1 M (4,5 : 2,5 : 93) + 0,3%
triethylamin, pH = 6,4 (điều chỉnh pH bằng acid acetic băng).
Pha các dung dịch hỗn hợp của cephalexin và cefotaxim (IS1), cephalexin
và cefazolin (IS2), cephalexin và theophyllin (IS3) trong mẫu trắng. Tiến hành
sắc ký với từng hệ dung môi, xác định thời gian lưu tR của mỗi chất, tính thừa
số chọn lọc a của các chất đối với cephalexin, độ phân giải Rs và thời gian
phân tích, từ đó lựa chọn chất chuẩn nội và hệ dung môi thích hợp (chất có a
và Rs lớn nhưng thời gian phân tích mẫu không quá dài).
Kết quả thu được như sau: hệ 1, 2, 3 cho kết quả tách không tốt (pic của
IS3 trùng với pic của tạp chất trong nước tiểu), thời gian phân tích quá dài (32
phút với IS1 và 28 phút với IS2). Hệ 4, 5 pic của IS3 trùng với pic của
cephalexin, pic của IS1 và IS2 chân pic doãng, pic không sắc nét. Hệ 6: IS1 và
IS2 cho thời gian phân tích là 25 phút, pic không đối xứng; với IS3 kết quả
tách tốt, pic đối xứng, sắc nét và chân pic khá gọn, khi ta cho thêm
triethylamin với tỷ lệ 0.3% thì các pic sắc nét hơn và chân pic gọn hơn. Hệ 6
17
cho Rs > 1,5, các pic tách nhau gần như hoàn toàn, vì vậy trong đề tài này
chúng tôi sử dụng hệ pha động là:
ACN : MeOH : NaCH3COO 0,1 M (4,5 : 2,5 : 93) + 0,3% triethylamin,
pH = 6,4 (điều chỉnh pH bằng acid acetic băng) và chất chuẩn nội là
theophyllin.
Kết quả khảo sát với hệ pha động 6 được trình bày ở bảng 2.1.
18
Bảng 2.1: Kết quả khảo sát tìm chất chuẩn nội
Chất
Ír
a
Cephalexin

COOH
o % —
/ \ h 2H » "
6,46
Cefotaxim (IS1).
COOH
Ả .
N —N OAc
o
h 2n
23,68
3,66
Cefazolin(IS2).
COONa
1 iĩ / —Me
nv -n- ^ A n>Ị ^ sJ
H H H
25,34
3,92
Theophyllin (IS3).
0
MeN''"^ỊỴ-'''Nv
Me
4,61 1,40
< Lựa chọn bước sóng: chuẩn bị dung dịch cephalexin chuẩn trong pha
động. Quét phổ u v . Cephalexin có cực đại hấp thụ ở 261nm.
19
■=> Từ các kết quả trên điều kiện sắc ký được chọn là:
- Pha tĩnh: Cột phenyl 5|0.m - 3,9 X 150 mm Waters®'
- Pha động: ACN : MeOH : NaCH3COO 0,1 M (4,5 : 2,5 : 93) + 0,3%

triethylamin (pH = 6,4). ■/
- Chất chuẩn nội: theophyllin.
- Lưu lượng dòng: 1,00 ml/phút
- Bước sóng: 261 nm
- Thể tích mẫu tiêm: 50 mcl
2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng cephalexin trong nước tiểu.
< Khảo sát khoảng tuyến tinh.
Chuẩn bị một dãy các dung dịch hỗn hợp của cephalexin và IS trong mẫu
trắng với nồng độ cephalexin là 0,5 4- 20mcg/ml và IS là 10mcg/ml. Tiến hành
sắc ký. Kết quả thu được là diện tích pic của cephalexin và IS, từ đó tính đươc
tỷ số diện tích pic của cephalexin và theophyllin (RCEP/Is)-
Bảng 2.2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính.
C(mcg/ml)
A-c e p ,
A-IS
R ce p /is
0,5
28909 588687
0,0491
2
69748
559656
0,1246
4
143712
596308
0,2524
6
224044
586134

0,3822
8
293267
570412
0,5141
12
445800
581708
0,7664
16
585777
571538
1,0249
20
747024
586177
1,2744
20