Nghiên cứu phát hiện dexamethanson có thể trộn trái phép trong thuốc đông dược bằng phương pháp sắc ký

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •

o & o

HOÀNG THỊ HOA
■
NGHIÊN cú u PHÁT HIỆN DEXAMETHASON CÓ THÊ
TRỘN TRÁI PHÉP TRONG TH LấC ĐÔNG Dược
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẢC KÝ
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2003 - 2007)
ỆSệ,
ỉ ị ì i ) f í ĩ v i l
Ị
£ ự m
p :ĩllỊ^V]ỆN!
ilnV '
Người hướng dẩn : PGS. TS. Thái Duy Thìn
TS. Trần Việt Hùng
Noi thực hiện : Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Bộ môn hoá dược - ĐH Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện : Từ tháng 01 đến tháng 05- 2007
HÀ NỘI, 05 - 2007
L Ờ I C Â M Ơ N
Để hoàn thành được khoá luận tốt nghiệp này, trước hết tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc tới P G S . Tổ. THAI DU Y THÌN - Tổ. TQẦN VỆT HÙNG, những
người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt thòi gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn 7ĨỈS. MAI ANH TUẨN ngưòi đã giúp đỡ tôi rất
nhiệt tình trong thời làm khoá luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ Khoa Vật lý Đo Lường - Viện

Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương và thầy cô giáo Bộ môn Hoá Dược đã tạo
mọi điều kiện thuận lọi giúp đỡ tôi trong thời gian tôi làm thực nghiệm tại
khoa.
Tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ Trường Đại Học Dược
Hà Nội lời cảm ơn chân thành nhất
Trong quá trình học tâp và nghiên cứu thực hiện khoá luận, tôi cũng
nhận được sư giúp đỡ quý báu của Ban giám đốc Bệnh viện huyện Mai Sơn-
Tỉnh Sơn La. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này.
Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên và
giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường và hoàn tốt nhất khoá luận này.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2007
HOÀNG THỊ HOA
MỤC LỤC
Lòi cảm ơn
Muc luc
• •
Danh muc các chữ viết tắt
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN I: TỔNG QUAN 3
1.1. Các thuốc tân dược có thể trộn trái phép vào thuốc đông dược 3
1.1.1. Các nhóm thuốc tân dược có thể bị trộn trái phép vào các
thuốc đông dược 3
1.1.2. Đại cương về dexamethason 5
1.2. Phương pháp phân tích các chất có thể trộn trái phép trong
thuốc đông dược 7
1.2.1. Xử lý mẫu 7
1.2.2. Sắc ký lớp mỏng 8
1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổ 10
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 14

2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 14
2.1.1. Hóa chất và thuốc thử 14
2.1.2. Thiết bị và Dụng cụ 14
2.1.3. Nguyên liệu 15
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu 16
2.2. Kết quả và bàn luận 19
2.2.1. Xác định nhanh dexamethason có thể trộn lẫn trong thuốc
đông dược bằng sắc ký lớp mỏng 19
2.2.2. Định tính và định lượng dexamethason bị trộn lẫn trong thuốc
đông dược bằng LC- MS 21
2.2.3. Kết quả khảo sát một số mẫu thuốc đông dược 31
2.2.4. Bàn luận 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT
BP 2001 : British Pharmacopoeia 2001 (Dược điển Anh 2001)
c o x : Cyclooxygenase
CE : Collion Enengy (Năng lượng va chạm)
DĐVN m : Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ ba
DM : Dung môi
ESI : Electrospray Ionization (Kỹ thuật phun ion)
HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu
năng cao)
LC-MS : Liquid Chromatography - Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng
ghép khối phổ)
LOD : Giói hạn phát hiện
LOQ : Giới hạn định lượng
NSAID : Nonsteroidal Anti - Inflammatory Drugs (Thuốc hạ nhiệt -
giảm đau - chống viêm phi steroid)

QIT : Quadrupole Ion Trap (Bộ phân tích khối bẫy ion)
RSD : Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)
SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)
SIM : Selected Ion Monitoring
SKLM : Sắc ký lớp mỏng
SKĐ : Sắc ký đồ
S/N : Signal to noise Ratio
(Tỷ số tín hiệu trên nhiễu)
USP 27 : United States Pharmacopoeia 27 (Dược điển Mỹ 27)
UV- VIS : Ultraviolet (Tia tử ngoại)
ĐẶT VÂN ĐỂ
- Nền y học cổ truyền của nước ta bắt nguồn từ một nền y học dân gian hết
sức phong phú thông qua thực tiễn và kinh nghiệm được đúc kết qua nhiều
đcd. Từ xa xưa, cha ông ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quí giá của đất
nước vói các phương pháp chế biến khác nhau và dạng bào chế thích hợp để
phòng và chữa bệnh cho người. Đó là các thuốc đông dược, trong đó các vị
thuốc có thể được dùng riêng lẻ hoặc được phối hợp để trở thành phương
thuốc dựa trên tính vị và sự qui kinh của chúng. Cho tới nay, nhờ sự phát triển
của khoa học kỹ thuật, nhiều vị thuốc và phương thuốc đã được chứng minh
tác dụng dược lý và tác dụng lâm sàng dựa trên cơ sở phân tích thành phần
hóa học của chúng.
- Như chúng ta đã biết, thuốc đông dược là những thuốc có nguồn gốc thực
vật, động vật hay khoáng vật và thường có thành phần phức tạp. Chúng thường
là những thuốc không độc hoặc ít độc được dùng điều trị dài ngày, sử dụng với
số lượng lớn nhằm mục đích điều trị tận gốc nguyên nhân của bệnh. Tác dụng
của thuốc thường diễn ra chậm, không nhanh như các thuốc tân dược, nhưng
khi có hiệu quả thì thường chắc chắn và lâu dài. Do vậy, thuốc đông dược
thường được nhiều người ưa chuộng. Tuy nhiên để làm giảm nhanh các triệu
chứng bệnh hoặc nhằm đánh lừa, hấp dẫn người bệnh như làm tăng cân giả do
i

giữ nước, kích thích ăn ngon, một số nhà sản xuất và cơ sở chữa bệnh tư nhân
đã trộn trái phép vào thuốc đông dược một số loại thuốc tân dược và người
bệnh không biết cứ dùng với liều lớn và kéo dài như với thuốc đông dược
thông thường nên đã gây ra nhiều biến chứng cũng như tác dụng phụ nguy
hiểm đến tính mạng. Hiện nay ở nước ta đã có qui định cụ thể nghiêm cấm
việc trộn trái phép thuốc tân dược trong đông dược, tuy nhiên việc thực hiện
còn gặp nhiều khó khăn. Trên thế giới có một số nước như Mỹ đã tuyệt đối
nghiêm cấm việc trộn tân dược trong thuốc đông dược.
1
- Một số nhóm thuốc tân dược như: nhóm thuốc chống viêm steroid
(dexamethason, betamethason, prednisolon ), nhóm thuốc hạ nhiệt-giảm đau
-chống viêm phi steroid (NSAID), (aspirin, ibuprofen, diclofenac,
paracetamol, indomethacin ), nhóm thuốc kháng histamin (cyproheptadin)
thường được trộn lẫn vào thuốc đông dược vói mục đích làm giảm nhanh triệu
chứng viêm, sốt, ho , đồng thời có thể kích thích ăn ngon hay giữ nước tạo
tình trạng béo giả tạo
- Dexamethason là một glucocorticoid bán tổng hợp, có tác dụng (chống viêm,
chống dị ứng) mạnh, kéo dài, không giữ muối, nước. Do đó nó được dùng
rộng rãi và cũng dễ bị trộn trái phép vào thuốc đông dược.
- Nhằm góp một phần nhỏ vào việc phân tích, kiểm nghiệm các thuốc đông
dược, đảm bảo an toàn cho người bệnh, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu phát hiện Dexamethason có thể trộn trái phép trong thuốc
đông dược bằng phương pháp sắc ký”
Đề tài có những mục tiêu cụ thể sau đây:
1. Xây dựng quy trình sắc ký lớp mỏng để phát hiện nhanh thuốc
Dexamethason có thể trộn trái phép trong thuốc đông dược.
2. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký lỏng
khối phổ (LC-MS) để định tính và định lượng Dexamethason bị trộn lẫn trong
thuốc đông dược
2

PHẦN 1 -TỔNG QUAN
1.1. CÁC TÂN DƯỢC CÓ THỂ TRỘN TRÁI PHÉP VÀO THUỐC ĐÔNG
DƯỢC
1.1.1. CÁC NHÓM THUỐC TÂN Dược CÓ THỂ BỊ TRỘN TRÁI PHÉP VÀO
CÁC THUỐC ĐÔNG Dược
1.1.1.1. Nhóm thuốc chống viêm steroid [3],[5],[10], [15]
- Thuốc chống viêm steroid là những glucocorticoid tự nhiên hay bán tổng hợp
có tác dụng chống viêm rất mạnh, chống dị ứng và ức chế miễn dịch nhưng
cũng có rất nhiều tác dụng không mong muốn nặng nề và nguy hiểm như: loét
đường tiêu hoá, loãng xương, chậm lớn ở trẻ em, giữ nước Khi sử dụng cần
phải chọn thuốc, liều dùng và thòi gian điều trị thích hợp. Chỉ dùng liều tối
thiểu đủ tác dụng, điều chỉnh liều trong khi điều trị và giảm dần liều trước khi
ngừng thuốc.
- Các thuốc như: Betamethason, prednisolon, dexamethason hay bị trộn trái
phép vào các thuốc đông dược để chữa thấp khớp, thuốc làm tăng cân, kích
thích ăn ngon với mục đích giảm nhanh triệu chứng viêm, đồng thời giữ nước
tạo nên tình trạng béo giả tạo , nếu sử dụng liều cao kéo dài sẽ rất nguy
hiểm cho người bệnh.
1.1.1.2. Nhóm thuốc kháng Histamỉn Hj [3], [4], [10]
- Các thuốc kháng Hj đối kháng cạnh tranh với Histamin tại receptor Hị của tế
bào đích, vì vậy nó ngăn được tác dụng của histamin lên tế bào đích. Các
thuốc này được sử dụng trong điều trị dị ứng, chữa ho hen, ngoài ra còn có tác
dụng ức chế thần kinh trung ương, chống nôn, chống say tàu xe, một số tác
dụng kháng serotonin, kích thích ăn ngon.
- Một số chất như: cyproheptadin, doxylamin hay được trộn trái phép trong
thuốc đông dược để kích thích ăn ngon, tạo tình trạng béo giả tạo do nước.
3
I.I.I.3. Nhóm thuốc giảm đau -hạ sốt - chống viêm phi steroid (NSAID)
[2], [3], [4], [10].
- Là những chất có tác dụng hạ nhiệt- giảm đau- chống viêm ở mức độ khác

nhau, không thuộc nhóm các opiat và trong cấu tạo của chúng không có cấu
trúc steroid. Vì thế chúng được gọi chung là các thuốc chống viêm phi steroid
(NSAID). Các thuốc này có tác dụng ức chế sự tiết trung gian hoá học gây đau
ở ngoại vi nên còn được gọi là thuốc giảm đau ngoại vi. Một số chất đồng thời
có cả ba tác dụng trên, có thể có một, hai tác dụng trội hơn hoặc không có một
tác dụng nào đó nhưng có cùng một cơ chế tác dụng là ức chế enzym
cyclooxygenase (COX) là enzym xúc tác việc sản xuất một số chất trung gian
hoá học, đặc biệt là các chất prostaglandin là những chất gây ra phản ứng
viêm, đau, sốt.
- Ngoài ra tác dụng hạ nhiệt còn do ức chế trung tâm điều hoà nhiệt độ ở vùng
dưới đồi gây giãn mạch ngoại biên, tăng toả nhiệt và tăng tiết mồ hôi. Như vậy
thuốc hạ nhiệt chỉ có tác dụng chữa triệu chứng.
- Tác dụng giảm đau của nhóm thuốc này chỉ với triệu chứng đau nhẹ do viêm
như đau đầu, đau răng, đau dây thần kinh, đau khớp, đau cơ, không có tác
dụng giảm đau nội tạng, không kích thích, không gây nghiện, tuy nhiên chúng
cũng có một số tác dụng không mong muốn là có thể gây loét dạ dày- ruột, có
khi gây xuất huyết, hoại tử gan, viêm thận kẽ nhất là khi dùng liều cao kéo
dài.
- Một số thuốc như: Aspirin, diclofenac, paracetamol, ibuprofen,
indomethacin là những thuốc không đắt tiền, thông dụng và dễ kiếm, hay được
trộn trái phép vào các thuốc đông dược trị cảm cúm, đau xương khớp với mục
đích làm tăng hiệu quả điều trị nhưng dễ gây hiệu quả nghiêm trọng đối với
những người bị bệnh gan, thận, trẻ em khi dùng liều cao, kéo dài.
4
1.1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ DEXAMETHASON [3], [5], [9], [10], [19],
Công thức cấu tạo:
C22H19F05 Ptl: 392,5
Tên khoa học: 9 - Fluoro - 1 lß , 17,21 - trihydroxy - 16ot - methyl
pregna - 1,4 - dien - 3,20 dion.
Tính chất vật lý :

- Bột kết tinh trắng hoặc tinh thể không màu, không mùi. Chảy ở 253 - 255°c
(kèm phân huỷ). Thực tế không tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96% khó
tan trong cloroform, tan trong aceton.
Định tính :
- Đo phổ hấp thụ của dẫn chất hydrazon: cho phản ứng với Phenylhydrazin
trong môi trường acid cho dẫn chất pheninhydrazon có màu vàng (hấp thụ cực
đại Ở419nm).
- Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp vói phổ hồng ngoại của
dexamethason chuẩn.
- Dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM): Dùng bản mỏng Silicagel
GF254 hệ dung môi triển khai là butanol bão hoà nước - toluen - ether
(5: 10: 85).
- Phản ứng màu: Oxy hoá với tác nhân H2S04 đặc, có màu đỏ nhạt (thường
kèm huỳnh quang). Pha loãng với nước, màu biến mất.
5
-Trộn 5mg chế phẩm với 45mg oxyd magnesi nặng rồi nung trong chén sứ đến
khi được cặn trắng (thường khoảng 5 phút). Để nguội, thêm lmL nước, 1 giọt
dung dịch phenolphtalein và khoảng lmL dung dịch HC1 loãng để làm mất
màu dung dịch. Lọc, cho lmL dịch lọc vào một hỗn hợp mới pha gồm 0,lmL
dung dịch alizarin (TT), 0,1 mL dung dịch zirconyl nitrat (Zr(N03)2) (TT).
Trộn đều, để 5 phút. Làm song song mẫu trắng (không cho 5mL chế phẩm).
Dung dịch thử có màu vàng, dung dịch mẫu trắng có màu đỏ.
Định lượng:
- Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV- Vis): Hoà tan chế phẩm trong
ethanol; đo ở khoảng 238,5 nm, mẫu trắng là ethanol. Lấy E (1% lcm) của
dexamethason ở 238,5 nm là 394 để tính kết quả.
- Phương pháp HPLC bằng đo diện tích píc so với chất chuẩn
Tác dụng dược lý:
- Dexamethason tác dụng bằng cách gắn vào thụ thể ở tế bào, chuyển vị vào
nhân tế bào và ở đó đã tác động lên một số gen được dịch mã. Dexamethason

có các tác dụng chính của glucocorticoid là chống viêm, chống dị ứng và ức
chế miễn dịch, còn tác dụng lên cân bằng điện giải là rất ít.
Chỉ định:
- Liệu pháp không đặc hiệu bằng steroid, khi cần điều tn tích cực, như điều trị
trạng thái hen, bệnh dị ứng nặng, phản ứng sau truyền máu, viêm thanh quản
rít.
- Dùng phối hợp vói các cách điều trị khác trong phù não, trong sốc do nhiều
nguyên nhân khác nhau.
- Liệu pháp bổ trợ bằng dexamethason trong điều trị viêm màng não phế cầu.
- Điều trị tại chỗ: tiêm trong và quanh khớp ở người bệnh viêm khớp dạng
thấp, thoái hoá xương khớp, viêm quanh khớp. Còn được dùng tại chỗ trong
một số trường hợp bệnh lý tai mũi họng, nhãn khoa, ngoài da
6
Liều và cách dùng:
- Liều ban đầu người lớn: Uống 0.75 - 9 mg/ngày, tuỳ theo bệnh và thường
chia làm 2 - 4 lần
- Trẻ em: Uống 0.024 - 0.34 mg/kg/ngày, hoặc 0.66 - 10 mg/m2/ngày chia
làm 4 lần
1.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHẤT CÓ THỂ BỊ TRỘN TRÁI
PHÉP TRONG THUỐC ĐÔNG DƯỢC
1.2.1. XỬ LÝ MẪU [12], [14], [15]
- Các thuốc đông dược thường là những thuốc có thành phần phức tạp, do đó
để phân tích các thuốc tân dược lẫn trong các thuốc đông dược thì việc xử lý
mẫu, tách chiết chất cần quan tâm ra khỏi mẫu để định tính và định lượng
được chính xác hàm lượng của chúng là rất quan trọng.
- Chúng ta có thể sử dụng các kỹ thuật chiết kinh điển đơn giản như chiết
lạnh, chiết Soxhlet, .hoặc dùng các phương pháp chiết khác như chiết pha rắn
(SPE) để chiết, làm sạch và làm giàu dịch chiết.
- Chiết lạnh: Là kỹ thuật chiết đơn giản nhất, sử dụng dung môi hữu cơ để
chiết các đối tượng phân tích tan trong dung môi chiết từ mẫu đã được làm

nhỏ.
- Chiết Soxhlet: Dung môi ở nhiệt độ cao sẽ chiết liên tục và chiết kiệt các
hoạt chất trong mẫu phân tích đã làm nhỏ. Đây là kỹ thuật chiết kinh điển
nhưng hiệu quả.
-Chiết pha rắn SPE: Là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc của sắc ký
lỏng nhằm loại các chất có ảnh hưởng tới chất cần phân tích, làm giàu chất
trước khi phân tích chúng. Kỹ thuật này có thể giảm đáng kể lượng dung môi
hữu cơ được sử dụng, chiết có chọn lọc các chất cần quan tâm, thời gian chiết
nhanh, hiệu quả chiết tốt và độ lặp lại cao.
7
1.2.2. SẮC KÝ LỚP MỎNG [7], [9], [17]
1.2.2.1. Khái niệm về sắc ký lớp mỏng [7], [.9]
- Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi
cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần
tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích,
được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc
phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hay đa thành phần được trộn
vói nhau theo tỷ lệ sao cho việc tách các chất là tối ưu.
- Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu
thử được di chuyển trên lớp mỏng, cùng hướng pha động với những tốc độ
khác nhau. Kết quả ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
- Cơ chế của quá trình tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc
phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tuỳ thuộc vào tính chất
của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
1.2.2.2. Trang bị:
- Chất hấp phụ : Trong SKLM, cần dùng bột chất hấp phụ rất mịn. Các chất
hấp phụ thường dùng: silicagel, nhôm oxyd, thạch cao hoặc các chất khác như
celuloza, bột poliamit.
- Bản mỏng: Các bản mỏng được dùng để sắc ký được chia làm hai loại: bản
mỏng dính chắc và bản mỏng không dính chắc.

- Dung môi: Dung môi phải tinh khiết, các dung môi thường gặp như,
methanol, nước, tuluen, methylen clorid, butanol, anhydrit acetic, ether Có
thể dùng hỗn hợp 2-3 trong các dung môi trên với các tỷ lệ khác nhau.
- Bình sác ký: Có thể dùng các loại bình chuyên dùng cho sắc ký lớp mỏng
hoặc các lọ rộng miệng, bình hình trụ thông thường có nắp kín.
1.2.2.3. Các đặc trưng cơ bản của sắc ký lớp mỏng [7], [9], [17]
- Hệ số di chuyển Rf:
8
+Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và
khoảng dịch chuyển của dung môi:
R,= f (1)
b
Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính
bằng cm
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi
của vết tính bằng cm.
Rf chỉ có giá tn từ 0 đến 1
+Theo định nghĩa Rf là đại lượng đặc trưng cho hệ sắc ký lớp mỏng, Rf không
phụ thuộc nồng độ và các yếu tố khác. Tuy nhiên thực nghiệm chứng minh Rf
đo được không đủ lặp lại, đặc biệt khi phân tích các chất vô cơ. Rf chịu ảnh
hưởng của nhiều yếu tố: chất lượng và tính hoạt động của chất hấp phụ, độ ẩm
của chất hấp phụ, chất lượng của các dung môi và các yếu tố khác, đó là các
yếu tố rất khó kiểm soát.Thực tế người ta thường dùng đại lượng tương đối.
R =
Ĩ M ~ ~R
f,c
Rf c cũng được tính theo phương trình (1) của một chất chọn làm chuẩn.
Chất chuẩn được hoà tan trong cùng dung môi với chất nghiên cứu và được
chấm trên đường xuất phát bên cạnh mẫu nghiên cứu, vậy quá trình sắc ký của

chất chuẩn và mẫu nghiên cứu được thực hiện trong cùng điều kiện.
- Số đĩa lý thuyết n: Số đĩa lý thuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng
được tính theo hệ thức: n = 16
( ỉ ^
l n
\ } h J
ln là chiều cao cùa vết sắc ký
1H là khoảng cách từ đường xuất phát đến đầu của vết sắc ký
9
1.2.3. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ SẮC KÝ LỎNG KHỐl PHổ
1.2.3.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao [7], [8], [9], 12]
- Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tách trong đó pha
động là một chất lỏng, còn pha tĩnh (chứa trong cột) là một chất rắn đã phân
chia dưới dạng tiểu phân, hoặc là một chất lỏng phủ trên một chất mang dạng
rắn, hay là một chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion hay loại trừ theo kích cỡ.
1.2.3.2. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký [7], [9], [12], [16]
- Thòi gian lưu (tR)
+Thời gian lưu tuyệt đối (tR): Mức độ tách của các chất trong hỗn hợp tùy
thuộc khả năng bị lưu giữ của chúng trên pha tĩnh. Thòi gian lưu tuyệt đối (tR)
là thời gian cần thiết để chất đó đi ra khỏi cột sắc ký, được tính từ lúc bắt đầu
bơm mẫu cho đến khi xuất hiện đỉnh pic.
+Thời gian chết (tj: Là thòi gian cần thiết để pha động đi qua hệ thống tách,
tm có thể được xác định thông qua chất không lưu giữ. Ví dụ: như với sắc ký
pha đảo sử dụng cột C18 và C8, pha động là methanol và nước, hoặc
acetonitril và nước thì người ta hay sử dụng Urasil làm chất không lưu giữ để
xác định tm
+Thời gian lưu thực ịtR'): Là thòi gian chất bị lưu giữ trong pha tĩnh, được xác
định bằng hiệu số giữa thời gian lưu tuyệt đối và thời gian chết.

v = h - tm H°ặc VR - VR - v m
Trong đó: VR là thể tích lưu tuyệt đối
VR’là thể tích lưu thực
Vm là thể tích chết
10
- Hệ số dung lượng k’ (Capacity factor): Là đại lượng nói lên khả năng chứa
của các chất cần phân tích trong pha tĩnh và pha động.
k’ = ÍÌl = ÍR ~ tfíl - ỈR \
tm tm
- Độ chọn lọc a (sectivity) : Là đại lượng nói lên tốc độ di chuyển của 2
chất. Hai chất chỉ được tách ra nếu chúng có giá trị k’ khác nhau và phải có độ
chọn lọc a thích hợp.
a = - A-
k\
- Số đĩa lý thuyết N: Là một đại lượng thường được dùng để đặc trưng cho
một hệ thống phân tách. Đĩa lý thuyết được định nghĩa như là một khu vực của
hệ thống phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập
giữa nồng độ trung bình của một cấu tử trong pha tĩnh và trong pha động.
N = 5,54
V
lR
yw0,5j
= 16
lR
WbJ
Trong đó: vv0 5 là độ rộng pic ở 1/2 chiều cao của pic.
wb là độ rộng đáy pic.
- Độ phân giải R (Resolution): Một trong những yêu cầu quan trọng của
HPLC là độ phân giải R phải đủ lớn để tách các cấu tử gần nhau ra khỏi nhau.
Độ phân giải R là đại lượng đo mức độ tách giữa 2 chất, R được tính như sau:

R = 2
™b,i + wbJ
Trong đó: tR ¡và tR j là thời gian lưu của cấu tử i và cấu tử j.
wb là độ rộng đáy pic
Độ phân giải R phụ thuộc vào hệ số dung lượng k \ độ chọn lọc a và số đĩa lý
thuyết N theo công thức:
„ _ Vĩv a - 1 k'2
R= - X

X z
4 a 1 + k \
11
R = 0,75 Hai pic tách không tốt
R = 1 Hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau khoảng 4%
R = 1,5 Hai pic tách hoàn toàn, còn xen phủ khoảng 0,3%.
I.2.3.3. Sắc ký lỏng khối phổ [11], [16]
- Sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS) là sự kết nối của sắc ký lỏng hiệu năng cao
và detector khối phổ.
Phân tích khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính
xác khối lượng phân tử chất đó. Chất phân tích được chuyển thành trạng thái
hơi, rồi được chuyển thành ion bằng những phương pháp thích hợp. Các ion
tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích của khối phổ kế. Tuỳ
theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân biệt máy khối
phổ ion dương hoặc âm. Các khối phổ kế đều làm việc trong môi trường có độ
chân không cao.
- Ngưòi ta sử dụng phương pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các nguyên tố
hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hoặc hơi. Phương pháp khối phổ có
thể ứng dụng vào quá trình đồng nhất, vào việc xác định công thức cấu tạo
hoặc vào phân tích định lượng các chất.
- Các bộ phận cơ bản của một máy sắc ký lỏng khối phổ: Pha động, hệ thống

bơm, bộ phận tiêm mẫu tự động, cột sắc ký, detector khối phổ và máy ghi.
- Pha động: Trong sắc ký lỏng, thành phần của dung môi rửa giải (pha động)
là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tách. Pha động thường là các
dung môi hữu cơ hoặc dung dịch nước. Khi phân tích người ta có thể sử dụng
chương trình dung môi, tốc độ dòng hay chương trình nhiệt độ.
- Bơm: Trong HPLC, bơm và detector là những bộ phận quan trọng nhất. Yêu
cầu của bơm là phải đẩy được dung môi rửa giải thành dòng qua cột tách và
không có xung ở áp suất cao. Dòng không liên tục sẽ gây nhiễu đường nền.
12
- Cột tách: Cột tách trong HPLC được coi như là trái tim của cả hệ thống thiết
bị. Cột tách sắc ký lỏng phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và có
thể chịu được áp suất cao, có chiều dài từ vài cm đến 10 m và đường kính
trong từ 2- 4 mm. Thường sử dụng thủy tinh, thép không gỉ để làm cột
tách.
- Kích thước hạt của chất nhồi trong cột thường là 5 - 10 ỊLim. Các chất nhồi
thường được sử dụng là silicagel, nhôm oxyd, hoặc các loại pha đảo C2, C8,
C18
- Detector khối phổ: Khối phổ kế thông thường bao gồm các bộ phận sau, bộ
phận ion hoá, bộ phân tích khối phổ, bộ phân tích bẫy ion Qỉĩ, bộ phận phát
hiện ion, bộ xử lý dữ liệu.
-
Việc sử dụng khối phổ kế làm detector cho sắc ký đem lại một số ưu điểm
như: có thể đưa ra thông tin về cấu tạo hoá học của chất phân tích, thông tin về
chất đặc hiệu có độ nhạy cao với các chất bay hoi vì dòng khối nhạy. Ngoài ra
nó có độ nhạy cao hơn rất nhiều so vói các detector khác (tử ngoại khả kiến,
đo độ dẫn, hồng ngoại )
13
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM
2.1.1. HOÁ CHẤT -THUỐC THỬ

- Anhydrid acetic PA
- Methanol: Tinh khiết HPLC
- Ethanol (96%).
- Aceton.PA
-Ether PA
- Methylen clorid PA
-Toluen PA
- Acetonitril: Tinh khiết HPLC
- Acid acetic : Tinh khiết HPLC
- Chất chuẩn dexamethason (Viện Kiểm nghiệm thuốc T.ư cung cấp).
2.1.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG cụ
- Bản mỏng silica gel GF254.
- Đèn tử ngoại bước sóng 254nm
- Máy sắc ký lỏng Thermo vói bộ tiêm mẫu tự động và detector khối
phổ LCQ Advantage Max của Thermo - Finnigan
- Cột sắc ký Beta Basic C18(5cmx 2,lmm, 5|im)
- Máy sinh khí nitơ.
- Bình khí heli tinh khiết MS (99,999%)
- Bình chạy sắc ký lớp mỏng.
- Máy lắc siêu âm.
- Tủ sấy, bình nón, bình định mức và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
14
■T
Hình 2.1. Máy sắc ký khối phổ Thermo - Finnigan Advantage Max
2.1.3. NGUYÊN LỆƯ:
- Các dược liệu thu mua tại các cửa hàng thuốc đông dược đem về rửa sạch,
phơi khô và nghiền nhỏ thành bột, sau đó đem cân từng vị theo thành phần
công thức, nghiền trộn đều rồi đem đóng thành lọ để tiến hành thí nghiệm
- Mẫu đông dược tự tạo (Ml): Chúng tôi chọn một công thức chữa phong thấp
điển hình để nghiên cứu xây dựng phương pháp, đó là mẫu hoàn cứng Phong

thấp cốt thống hoàn, hiện đang bán rộng rãi trên thị trường (do Lương y Tăng
Phàm Ngọc, 33/7 ấp Mỹ Thiện, xã Mỹ Đức, Huyện Châu Phú, tình An Giang
sản xuất).
Công thức của hoàn Phong thấp cốt thống hoàn (cho gói 5 g hoàn cứng)
Độc hoạt
0,5 g Đương qui
0,25 g
Tang ký sinh
0,5 g Bạch thược
0,5 g
Phòng phong 0,25 g
Cam thảo
0,1 g
Tần giao 0,25 g
Xuyên khung
0,25 g
r
r p Á
A
A
Tê tân
0,25 g
Sinh địa 0,25 g
Quế chi
0,25 g Ngưu tất 0,5 g
Đỗ trọng
0,5 g Hoạt th ạch V đ 5,0 g
15
- Mẫu 2 (M2) Phong thấp cốt thống hoàn (số lô SX 020906, HSD 09/2007)
- Mẫu 3 (M3): mẫu MI trộn dexamethason. Giả sử liều đơn trung bình của

dexamethason là 1 mg/lần, liều dùng của mẫu MI là 1,4 g/lần, do đó tỷ lệ
trộn để khảo sát là 1 mg dexamethason trong 1,4 g mẫu Ml.
- Mẫu 4 (M4) Tăng phì hoàn (Ceng Fui Yen), mẫu lấy trên thị trường (Lô sản
xuất: 901082E. SDK: MAL-19988931T. NSX: Công ty TNHH Dược phẩm
WELIP , Malaysia; CTNK: Công ty cổ phần dược liệu TW2), lưu tại Viện
Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
- Mẫu 5 (M5): Cotaxoang (C.Ty TNHH Dược phẩm Công Tâm, số lô 161006,
HSD 10.08)
- Mẫu 6 (M6): thuốc cảm gia truyền (17 Trần Xuân Soạn) do TS Phạn Văn
Khiển cung cấp.
2.1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu
- Để phân tích, chúng tôi định hướng loại tân dược cần tìm vào nhóm thuốc
có công dụng tương tự như công dụng của loại thuốc đông dược cần phân tích,
trong đó tập trung vào những loại thuốc được bán rộng rãi trên thị trường và
không đắt tiền. Đồng thời có thể dựa vào triệu chứng của người bệnh sau khi
đã dùng loại thuốc đông dược đó. Ở đây chúng ta định hướng vào nhóm thuốc
chống viêm steroid là dexamethason.
2.I.4.I. Xây dựng quy trình chiết
- Chọn dung môi chiết: dexamethason không tan trong nước, tan trong ethanol
và aceton. Do đó có thể sử dụng các dung môi này để chiết dexamethason ra
khỏi hỗn hợp dược liệu. Để tránh sự phân huỷ dexamethason chúng tôi tiến
hành chiết ở nhiệt độ phòng.
- Cách chiết: chiết thông thường.
16
2.1.4.2. Xác định nhanh dexamethason có thể bị trộn lẫn trong thuốc
đông dược bằng sắc ký lớp mỏng
- Khảo sát hệ dung môi để tách dexamethason: chúng tôi tiến hành khảo sát
trên ba hệ dung môi (DM) theo các chuyên luận dexamethason, dexamethason
acetat, dexamethason natri phosphat (trong D ĐVNIII)
DM1: Butanol bão hoà nước- tuluen- ether (5 : 10 : 85)

DM2 : Nước -methanol-ether-methylenclorid (1,2 : 8 : 15 :77)
DM3 : Anhydrid acetic- nước - butanol (2 : 2 :6 )
-
Dung dịnh mẫu thử: dung dịch đã chiết từ các mẫu thuốc để chấm sắc ký
- Dung dịch đối chiếu: là dung dịch dexamethason chuẩn trong ethanol 96%
(0,lmg/mL)
- Bản mỏng silica gel GF254 (đã được sấy ở 110°c trong 30 phút)
- Cho dung môi vào bình triển khai, bão hoà hơi dung môi bằng cách lót giấy
lọc xung quanh thành trong bình để giấy lọc thấm đều dung môi. Đậy kín bình
và để yên 1 giờ ở 20 - 25°c. Lượng dung môi cần lấy sao cho sau khi thấm
đều giấy lọc còn lại một lớp dày 5-10 mm
- Tiến hành :
- Chấm các dung dịch thử, chuẩn và mẫu trắng trên cùng một bản mỏng, đường
xuất phát cách mép dưới của bản mỏng 1,5 - 2cm, các vết cách nhau lcm,
- Thể tích chấm: Mỗi loại dung dịch 5ụL
- Làm khô vết và đưa bản mỏng vào bình triển khai đã bão hoà dung môi. Triển
khai cho đến khi dung môi chạy được 10 - 15cm thì lấy bản mỏng ra và để khô.
- Phát hiện vết: Soi u v ở bước sóng 254 nm.hoặc phun hỗn hợp acid sulfuric
- ethanol 96% (20 : 60 )
- Khảo sát giói hạn phát hiện
Vì kết quả sắc ký được xác định bằng mắt thường khi soi dưới đèn tử ngoại ở
bước sóng 254nm hoặc khi phun hỗn hợp acid sulfuric - ethanol 96% (20 :
mắt thường được. Các mẫu thử được chuẩn bị và chiết như trên, nhưng lượng
dexamethason trong mẫu thì giảm dần (pha loãng dần dung dịch thử)
2.I.4.3. Định tính và định lượng dexa methason bị trộn lẫn trong thuốc
đông dược bằng LC- MS
a. Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký
- Sử dụng dung dịch chuẩn dexamethason lOppm trong pha động tiêm vào hệ
thống HPLC (detector PDA), để khảo sát xây dựng chương trình sắc ký (pha
động, tốc độ dòng )

b. Xây dựng chương trình sắc ký khối phổ phân tích dexamethason
- Chương trình sắc ký: pha động, tốc độ dòng đã được khảo sát ở ( mục a)
nêu ở trên
- Khảo sát điều kiện khối phổ:
+Kỹ thuật MSI lần, phân tích toàn thang xác định mảnh mẹ (ion phân tử)
+Kỹ thuật MS 2 lần, phân tích toàn thang tìm những ion đặc trưng (mảnh mẹ
và mảnh con) để định tính.
+Kỹ thuật chọn ion (SIM) để định lượng
c. Đánh giá phương pháp
- Khảo sát độ tuyến tính:
+ Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện tích píc và nồng độ
chất phân tích. Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng
nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu xác định phương trình hồi qui
(y= ax +b) và hệ số tương quan r
- Khảo sát độ lặp lại:
+ Độ lặp lại của hệ thống: Xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện
tích píc của cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần.
+ Độ lặp lại kết quả phân tích: Đánh giá thông qua sai số tương đối của kết
quả phân tích.
- Khảo sát độ đúng:
18
Bằng phương pháp thêm chất chuẩn và định lượng để xác định khả năng tìm
lại.
- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):
Xác định gián tiếp (ngoại suy). LOD của mỗi chất được xác định bằng 3 lần
tỷ số giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của nó. Độ nhạy được xác
định bằng hệ số góc của đường hồi qui giữa tín hiệu (Y, mV) và nồng độ (X,
|xg/mL hoặc |ig/g). LOQ được tính bằng 3,3 lần LOD. Sau khi đã xác định
được giói hạn phát hiện theo phương trình vừa nêu, đối với một mẫu, kiểm tra
lại bằng cách thêm một vài chất chuẩn ở khoảng nồng độ của ngưỡng phát

hiện vào mẫu để kiểm tra lại.
d.Tính toán và xử lý kết quả:
Hàm lượng dexamethason trộn lẫn trong mẫu thuốc đông dược (mg/g) sẽ được
tính toán dựa vào phương trình hồi quy đường chuẩn, hệ số pha loãng và lượng
cân mẫu thuốc đông dược đem phân tích. Kết quả được xử lý thống kê sử
dụng phần nềm Microsoft Exel làm công cụ hỗ trợ
2.2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
2.2.1. XÁC ĐỊNH NHANH DEXAMETHASON CÓ THỂ BỊ TRỘN LAN
TRONG THUỐC ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
2. 2.1.1. Tách dexamethason bằng sắc ký lốp mỏng
+ Qua khảo sát chúng tôi chọn hệ DM2: Nước —methanol- ether-
methylenclorid (1,2 : 8 : 15 :77)
+Mầu thử ị MI và M3): Cân l,4g bột thuốc vào bình có nút mài, thêm 15mL
aceton lắc kỹ và lắc siêu âm lOphút. Lọc qua giấy lọc vào một cốc có mỏ.
Chiết tiếp 2 lần, mỗi lần 5 mL aceton. Dịch gộp được bay hoi dung môi trên
cách thuỷ tới cắn. Hoà tan trong lmL ethanol 96%
19
+ Mẫu chuẩn: Dung dịch có chứa dexamethason lmg/lmL ethanol 96%
- Chấm lần lượt 5|LiL mẫu chuẩn và mẫu thử lên bản mỏng đã hoạt hoá. Triển
khai bằng bình sắc ký.
- Sau khi triển khai, lấy bản mỏng để khô tự nhiên, hiện màu bằng soi dưói
đèn tử ngoại u v 254nni hoặc phun với thuốc thử hiện màu. Kết quả được thể hiện
ở hình 2.2 và hình 2.3
Hình 2.2. SKĐ soi đèn uv ở 254 nm, Hình 2.3. SKĐ sau khi phun hỗn hợp acid
vết (1): chuẩn, vết (2): M3, vết (3): M l sulfuric - ethanol 96% (20 : 60)
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy giá trị Rf của dexamethason là 0,35.
Mẫu tự tạo có trộn dexamethason cũng cho thấy 1 vết có Rf tương đương và
tách ra khỏi các vết của thuốc đông dược.
Vậy hệ DM2 có thể chọn làm dung môi triển khai SKLM phát hiện nhanh
dexamethason trộn trái phép trong thuốc đông dược.

20