Nghiên cứu khả năng bất động tế bào nấm men saccharomyces cerevisae của gel calci alginat

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ NGỌC MAI
NGHIÊN cúu KHẢ NÃNG BẤT ĐỘNG TÊ BÀO NẤM MEN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE CỦA GEL CALCI-ẠLGINAT
(Khóa luân tốt nghiêp dươc sỹ khóa 2002 - 2007) \
piỉóm í
ịuiííW
Ngưòi hướng dẫn : TS. Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện : Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện : Từ 12/2006 đến 5/2007
Hà Nội, tháng 5 năm 2007
LỜI CẢM ƠN
Vói tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Đàm Thanh
Xuân, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội - người thầy đã trực
tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Từ Minh Koóng, hiệu trưởng
trường Đại học Dược Hà Nội, ThS. Lê Xuân Hoành, bộ môn Công nghiệp Dược
trường Đại học Dược Hà Nội đã cho tôi nhiều ý kiến quý báu và giúp đỡ tôi rất
nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh, chị kỹ thuật viên trong bộ môn
Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô trong trường đã dạy dỗ, dìu
dắt tôi trong những năm học ở trường.
Cuối cùng, vói lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lòi cảm ơn đến gia đình tôi - bố,
mẹ, các anh chị và tất cả những người thân, bạn bè đã động viên, khích lệ, ủng hộ
nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Trần Thị Ngọc Mai

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN Đ Ể 1
PHẦN I-T Ổ N G QUAN 2
1.1. SACCHAROMYCES CEREVISIAE 2
1.2. LÊN MEN SẢN XUẤT ETHANOL 3
1.2.1. Các phương pháp sản xuất alcol truyền thống từ vi sinh vật 4
1.2.2. Nhược điểm của sản xuất alcol theo phương pháp truyền thống 6
1.3. PHƯƠNG PHÁP BẤT ĐỘNG TẾ BÀO
6
1.3.1. Các phương pháp bất động tế bào 8
1.3.2. Các ứng dụng của phương pháp bất động tế bào 12
1.4. ALGINAT 14
1.4.1. Cấu trúc của alginat 14
1.4.2. Tính chất của algỉnat 15
1.4.3. ứng dụng của alginat 18
PHẦN II - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

19
2.1.1. Nguyên vật liệu
19
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm 20
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25
2.2.1. Sô lượng tế bào có trong hạt gel calci alginat

25
2.2.2. Số lượng tế bào có trong dịch lên men
31
2.3. BÀN LUẬN 33
KẾT LUẬN 36

ĐỂ XUẤT 36
ĐẶT VẤN ĐỂ
Bất động tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù chỉ mới ra đời chưa lâu
nhưng nó đã thể hiện được nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với các phương pháp
truyền thống sử dụng tế bào tự do và so với cả kỹ thuật bất động enzym - cơ sở của
phương pháp bất động tế bào. Sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào cho năng
- suất tạo sản phẩm cao hơn, sản phẩm tinh khiết hơn, và đặc biệt là có thể sản xuất
liên tục trong các qui trình được tự động hóa. Bởi vậy, bất động tế bào đã thu hút
được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ngày càng có nhiều sản
phẩm sinh học được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào ở qui mô công
nghiệp, có thể kể đến một vài ví dụ tiêu biểu như: sản xuất siro fructose từ tinh bột,
sản xuất 6 - APA là tiền chất để tổng hợp nhiều kháng sinh nhóm p - lactam, sản
xuất ethanol dùng trong nhiều ngành công nghiệp và năng lượng
ở Việt Nam, bất động tế bào còn là một vấn đề khá mới mẻ và mới chỉ được
nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm. Trong khi đó, nhu cầu của con ngưòi về
những sản phẩm sinh học ngày một tăng lên đòi hỏi chúng ta phải tiếp cận với những
tiến bộ của thế giói để nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm và tạo ra nhiều sản
phẩm mới. Bởi vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu kỹ thuật bất động tế bào trong
lĩnh vực sản xuất liên tục ethanol với khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu khả năng
bất động tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae của gel calci alginat”.
Nghiên cứu này nhằm các mục tiêu:
1. Đánh giá khả năng cố định tế bào nấm men của gel caỉci alginat ở những
nồng độ algỉnat khác nhau và ở những nồng độ tế bào khác nhau.
2. Đánh giá khả năng cố định tế bào nấm men của gel calci alginat trong trạng
thái lên men liên tục và lên men tĩnh.
3. So sánh khả năng cố định tế bào của calci alginat và thạch agar ở trạng thái
lên men tĩnh.
1
PHẦN I - TỔNG QUAN
1.1. SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật, chúng phân bố rất rộng rãi
trong tự nhiên, nhất là ở các cơ chất có chứa đường, pH thấp như mật mía, ri đường,
rau quả Loại nấm men để làm rượu bia thường sử dụng là s. cerevỉsiae có kích
thước trong khoảng từ 2,5 - 10|im X 4,4 - 21|j.m, có thể nhìn thấy rõ dưới kính hiển
vi quang học.
s. cerevisiae có nhiều hình dạng: hình trứng, hình ovan, hình quả chanh Chúng
chủ yếu sinh sản theo lối nảy chồi. Ở phương thức sinh sản này, từ tế bào mẹ nảy ra
một chồi nhỏ lớn dần lên rồi sẽ tách ra. Có trường hợp tế bào con không tách rời mà
kết thành một chuỗi tạo thành khuẩn ty giả. Khi gặp điều kiện không thuận lợi s.
cerevisiae còn sinh sản bằng bào tử. [3], [8]
ứng dụng của s. cerevỉsỉae:
Từ xa xưa, loài ngưòi đã biết sử dụng nám men để làm rượu, làm bánh mỳ, nước
hoa quả và làm các loại nước có gas Ngày nay, những ứng dụng đó của nấm men
vẫn tiếp tục được sử dụng rộng rãi trong đời sống. Trong công nghiệp, nấm men được
dùng để sản xuất các loại đồ uống chứa cồn (rượu, rượu vang, bia, nước giải khát ).
Nấm men còn được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí để thu sinh khối. Từ sinh
khối nấm men người ta đã tạo ra nhiều sản phẩm rất có ích cho cuộc sống. Một số
ứng dụng của sinh khối nấm men có thể kể đến như:
- Sinh khối nấm men dưới dạng men ép được dùng làm men bánh mỳ, bột nở
trong sản xuất bánh mỳ, bánh bao và các loại bánh làm từ bột nhào.
- Men ép được dùng để sản xuất cao nấm men, bột nấm men dùng làm môi
trường lên men các vi sinh vật trong phòng thí nghiệm
- Sinh khối nấm men để sản xuất protein đơn bào làm thực phẩm và cũng là một
loại thức ăn tốt trong chăn nuôi
- Từ sinh khối nấm men có thể chiết tách được nhiều loại enzym như: amylase,
lactase, uricase
2
- Sinh khối nấm men còn có chứa hàm lượng cao vitamin nhóm B, p - caroten,
ergosterol, acid ribonucleic và các amino acid không thay thế như lysin, cystein và
methionin được dùng làm thuốc bổ. [4], [5]

Trong y dược, nhờ áp dụng những thành tựu của kỹ thuật di truyền, các nhà khoa
học đã tạo ra được những chủng nấm men có khả năng siêu tổng hợp ngoại bào.
Những chủng này có thể sinh ra một lượng enzym ngoại bào vượt xa nhu cầu sử
dụng trong trao đổi chất của chúng, lượng enzym thừa được chiết lấy để làm thuốc.
Những enzym được sản xuất theo cách này là amylase, glucoamylase, lipase dùng
làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa. Một số biệt dược là chế phẩm đông khô của nấm men có
mặt trên thị trường như Bioflor, Ultra - Levue để dự phòng và điều trị tiêu chảy,
điều trị hội chứng kích thích ruột và các trường hợp ỉa chảy do loạn khuẩn đường
ruột khi sử dụng kháng sinh. [4]
Chủng nấm men s. cerevisiae cũng có nhiều ứng dụng trong thực tế. Nuôi
s. cerevisiae trong những điều kiện đặc biệt chúng sẽ tạo ra hàm lượng cao vitamin D
hoặc ergosterin để bào chế thành những thuốc quí có giá trị trong y học. Không những
thế, s. cerevỉsỉae hiện còn đang được sử dụng như một vector để mang các AND tái tổ
hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm sinh học có hiệu quả điều tri cao như:
insulin, interferon, kháng thể s. cerevisiae cũng được dùng trong bất động tế bào để
sản xuất liên tục ethanol và một vài sản phẩm khác; nhiều nước trên thế giói đã đưa
công nghệ này vào sản xuất công nghiệp thay cho phương pháp truyền thống lên men
mẻ. [5], [7]
1.2. LÊN MEN SẢN XUẤT ETHANOL
Lên men rượu là quá trình biến đổi đường thành rượu và khí cacbonic dưói tác
dụng của vi sinh vật, thường gặp nhất là lên men bỏi nấm men.
Lên men rượu được tóm tắt theo phương trình sau:
C6H120 6 -> 2C2H5OH + 2CƠ2 + Q
( glucose) ( alcol ethylic) ( cacbonic)
Lên men rượu là một quá trình hóa sinh phức tạp, qua nhiều giai đoạn, ngoài sản
phẩm chính là rượu thì còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ như glycerin, aldehyd acetic,
acid acetic, acid lactic, acid citric, sinh khối và rượu bậc cao. [8]
3
Nguyên liệu dùng cho lên men rượu là những nguyên liệu chứa đường, tinh bột,
cellulose và dịch thuỷ phân từ gỗ, dịch thải của các nhà máy giấy ở dạng kiềm -

Sulfit Nguồn đường sử dụng là các monosaccharid như glucose và fructose;
disaccharid như saccharose và maltose; các nguyên liệu chứa đường như ri đường,
mía, củ cải đường Tinh bột và cellulose do không thể lên men trực tiếp được nên
cần qua giai đoạn thuỷ phân thành đường rồi mới được lên men.
Nồng độ đường 10 - 20%, nhiệt độ 28 - 30°c và pH trong khoảng từ 3,5 - 4,5 là
điều kiện thuận lọi nhất cho việc lên men.
Rượu sinh ra được tích tụ dần trong dịch lên men và chính nó lại trở thành chất
ức chế, kìm hãm các tế bào nấm men. Ở nồng độ 2 - 5%, rượu có tác dụng kìm hãm
nấm men phát triển, và ở nồng độ 5 - 6% rượu làm nấm men đình chỉ sinh sản mặc
dù sự lên men vẫn tiếp tục. Các nấm men rượu vang có thể lên men được ở độ rượu
16%, riêng s. ovifornis lên men được ở độ rượu tới 19 - 22%.
Kỵ khí là một yêu cầu quan trọng trong lên men rượu. Trong điều kiện kỵ khí, sự
lên men xảy ra rất mạnh mẽ (alcol ethylic tạo thành nhiều) vì khi đó nấm men thu
năng lượng để duy trì các hoạt động sống của mình chỉ bằng cách lên men glucose
thành rượu mà ít sinh sản tạo ra sinh khối. Khi có không khí, nấm men chuyển sang
chu trình hô hấp hiếu khí tạo ra nhiều sinh khối và sự lên men sẽ yếu đi.
Lên men rượu thường dùng s. cerevisiae vì chúng có khả năng sinh trưởng
nhanh, lực lên men cao và có khả năng chịu được độ cồn lớn. Có chủng có thể chịu
được nồng độ cồn đến 16 -18%, có khi còn cao hơn, thông thường vào khoảng 8 -
12%. Trong công nghiệp lên men cồn thường sử dụng các chủng nấm men đáp ứng
được các điều kiện sau:
- Lên men được nhiều loại đường khác nhau và đạt được tốc độ lên men nhanh, ít tạo
ra các tạp chất
- Chịu được độ cồn cao: 10 - 12%
- Thích nghi được với điều kiện không thuận lợi của môi trường, đặc biệt là đối với
chất sát trùng. [8], [11]
1.2.1. Các phương pháp sản xuất aỉcol truyền thống từ vỉ sinh vật
1.2.1.1. Đường hoá bằng bánh men thường hay bánh men thuốc bắc
4
Đây là phương pháp được dùng khá phổ biến trong dân gian khi nấu rượu từ các

nguyên liệu có chứa tinh bột (gạo, ngô, khoai, sắn )- Trong bánh men có một tập
hợp các vi sinh vật như: nấm sợi, nấm men, vi khuẩn được nuôi cấy và phát triển
trên môi trường tinh bột sống. Nếu là bánh men thuốc bắc thì còn có thể bổ xung
thêm từ 10 - 20 vị thuốc bắc (quế, hồi, thảo quả, sa nhân ) để tạo hương vị. Cho
bánh men ủ với tinh bột đã được nấu chín ta thu được rượu chỉ qua một giai đoạn:
HTJ I t * 1 thủy phân „ . lên men _
Tỉnh bột

—

> Đường

—

> Rượu
Rượu làm theo phương pháp này có mùi vị thơm ngon tự nhiên song hiệu suất thu
được thấp. Do vậy, hiện nay phương pháp này chỉ chủ yếu sử dụng để đường hoá
tinh bột thành đường khi sản xuất rượu theo phương thức thủ công. [6], [9]
1.2.1.2. Phương pháp Maltase
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym (chủ yếu là các enzym a và
ß - amylase) của thóc đại mạch, tiểu mạch đã nảy mầm (malt) để chuyển hoá tinh
bột đã được hồ hoá thành đường rồi cho lên men rượu nhờ s. cerevisiae. Phương
pháp này thường được dùng trong sản xuất bia. Tuy nhiên, thóc malt chủ yếu chỉ
được trồng ở vùng ôn đới nên ngày nay người ta cố gắng nghiên cứu bổ xung hay
thay thế dần phức hệ amylase của mâm thóc malt bằng amylase của nấm mốc và vi
khuẩn để có thể sử dụng được rộng rãi hơn. [6], [9]
1.2.1.3. Phương pháp Amylose
Khi sản xuất cồn theo phương pháp này, người ta cho nấm sợi Rhizopus spp. hoặc
Mucor spp. phát triển hẳn trong dung dịch cơ chất. Trong quá trình phát triển, các
loài nấm sợi này sinh tổng hợp ra các loại enzym thủy phân tinh bột, protein và cả

cellulose thành đường. Nấm men có mặt trong bình lên men sẽ song song chuyển
hóa đường này thành rượu. Phương pháp Amylose rất có hiệu quả khi sử dụng nguồn
tinh bột có độ nhớt cao trong môi trường nước để lên men. [6], [9]
1.2.1.4. Phương pháp Mycomalt
Đây là phương pháp được dùng phổ biến hơn ở cả trong nước và nước ngoài.
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng enzym của vi sinh vật để đường hóa tinh
bột, công đoạn đường hóa hoàn toàn tách hẳn công đoạn lên men. Enzym để thuỷ
5
phân tinh bột thường là a - amylase từ nấm mốc và vi khuẩn.
Các chủng nấm mốc sử dụng để đường hoá tinh bột được nuôi cấy theo hai phương
pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm. Thòi gian đường hoá dài hay ngắn tuỳ thuộc
vào chủng giống nấm mốc và nguyên liệu sử dụng. Sản phẩm của quá trình đường hoá
là hỗn hợp của dextrin, maltose và glucose, trong đó glucose chiếm tỷ lệ cao nhất. Sau
khi đường hóa, s. cerevisỉae được cho vào để lên men rượu. [6], [9], [11]
1.2.2. Nhược điểm của sản xuất alcol theo phương pháp truyền thống
Tuy việc sản xuất alcol theo phương pháp truyền thống đã có nhiều cải tiến để
đạt hiệu quả cao nhưng phương pháp này còn có nhiều nhược điểm:
- Thời gian lên men kéo dài nên tốn kém về nhân công, xây dựng nhà xưởng
- Lên men theo mẻ nên không tiến hành liên tục được
- Không thể sử dụng lại nấm men đã dùng
- Dịch lên men tĩnh nên không tạo ra sự chênh lệch cao về nồng độ cơ chất và sản
phẩm giữa bên trong và bên ngoài tế bào nấm men, ngoài ra, alcol ethylic sinh ra ức
chế ngược nấm men nên hiệu suất tạo alcol không cao
- Tế bào nấm men rất dễ bị tác động bởi các chất ức chế có trong môi trường. [4],
[13], [15]
Ngày nay, bất động tế bào được xem là giải pháp hữu hiệu để khắc phục những
nhược điểm này của lên men truyền thống. Ở nhiều nước trên thế giới, kỹ thuật bất
động tế bào đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất ethanol, amino acid,
kháng sinh cho sản phẩm tinh khiết hơn và năng suất tạo sản phẩm cao hơn. Ở
Việt Nam, việc nghiên cứu về bất động enzym, bất động tế bào để sản xuất ra các

chế phẩm sinh học mới chỉ được tiến hành ở điều kiện phòng thí nghiệm mà chưa
được áp dụng trong thực tế.
1.3. PHƯƠNG PHÁP BẤT ĐỘNG TẾ BÀO
Năm 1916, Nelson và Griffin tình cờ nhận thấy rằng enzym invertase của nấm
men khi hấp phụ lên than hoạt vẫn giữ được hoạt tính xúc tác cho phản ứng thủy
phân đường mía. Đây là phát hiện đầu tiên về bất động enzym. Sau đó, rất nhiều
nghiên cứu về vấn đề này đã được thực hiện ở nhiều noi trên thế giói. Năm 1969, bất
6
động enzym lần đầu tiên được đưa vào ứng dụng ở qui mô công nghiệp tại nhà máy
Tanabe Seiyaku. Co của Nhật Bản. Từ đó đến nay các chất xúc tác sinh học bất động
ngày càng thu hút được sự quan tâm trên toàn thế giói. [13]
Nguyên tắc của phương pháp bất động enzym có thể được mô tả tóm tắt như sau:
enzym đã tinh chế ở dạng tinh khiết được gắn hoặc gói trong những polymer không
hòa tan trong nước. Các hạt enzym này được nhồi vào các cột hình trụ có kích thước
thích hợp, sau đó cho dung địch cơ chất chảy qua, enzym sẽ thực hiện phản ứng phân
cắt cơ chất thành sản phẩm tương ứng. [5], [15]
So với các enzym ở dạng tự do chỉ có thể sử dụng được một lần và thường bị lẫn
vào sản phẩm thì các enzym đã được bất động có nhiều ưu điểm nổi bật hơn. Những
ưu điểm đó là:
- Enzym được sử dụng nhiều lần để biến đổi cơ chất trong một thời gian dài
- Enzym không lẫn vào trong sản phẩm, do đó tránh được các ảnh hưỏng không
tốt đến sản phẩm
- Có thể ngừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách enzym ra
khỏi cơ chất. [10]
Tuy vậy, bất động enzym vẫn còn gặp phải nhiều khó khăn như:
- Việc tách chiết, tinh chế enzym phức tạp và tốn kém
- Các enzym thường bị giảm hoạt tính do bị ảnh hưởng bởi các phản ứng để cố
định enzym
- Các enzym cũng thường kém ổn định hơn khi bị tách ra khỏi tế bào. [5], [16]
Để khắc phục những nhược điểm này, người ta tìm cách bất động toàn bộ tế bào

thay cho bất động enzym. Khi đó, không cần chiết tách enzym từ các tế bào nên
tránh được việc làm mất hoạt tính của enzym trong khi phá tế bào, tránh được các
qui trình đắt tiền và cho phép sử dụng enzym ở trạng thái ổn định hơn. [5]
Về nguyên tắc bất động tế bào là phương pháp giữ hoặc cố định tê bào ở
những vị trí xác định về mặt không gian mà không làm thay đổi hoạt tính xúc tác
của chúng. Các tế bào này có thể được sử dụng lại nhiều lần và sử dụng liên tục.
[13], [16]
Bất động các dạng của chất xúc tác sinh học (gồm các đơn enzym, các hệ thống
gồm nhiều enzym liên kết, các tế bào và cả các cơ quan của tế bào) nói chung và bất
7
động tế bào nói riêng giống như một cuộc cách mạng trong kỹ thuật vi sinh bởi vì nó
cho năng suất tạo sản phẩm cao hơn hẳn các qui trình truyền thống, có thể áp dụng ở
qui mô công nghiệp, sản phẩm sạch và còn nhiều lợi ích to lớn khác.
Tuy nhiên, bất động tế bào cũng có một số nhược điểm cần phải khắc phục để có
thể đưa vào áp dụng trong thực tế:
- Nhiều sản phẩm phụ được tổng hợp cùng với sản phẩm chính bởi vì các tế bào
có chứa nhiều hệ thống chuyển hóa và nhiều enzym xúc tác cho các phản ứng không
mong muốn. Để khắc phục vấn đề này cần phải chọn lọc giống phù hợp, biến đổi
gen hoặc cải tạo gen của cả dòng tế bào bất động để làm giảm bớt các enzym xúc tác
các phản ứng không mong muốn và làm tăng hoạt tính của các enzym mong muốn.
- Thành tế bào và màng nhầy của các tế bào nguyên vẹn thường cản trở sự vận
chuyển của các cơ chất, sản phẩm và các chất phản ứng khác đi ra và đi vào tế bào.
Trong trường hợp này cần phải xử lý các tế bào trước khi bất động để phá hủy hàng
rào thấm này. [13]
Tuy có những nhược điểm này nhưng bất động tế bào vẫn là kỹ thuật chìa khóa
để xây dựng những qui trình sinh học có hiệu quả cao.
1.3.1. Các phương pháp bất động tế bào
Có thể chia các phương pháp bất động tế bào thành bốn loại: liên kết vói chất
mang, tạo liên kết ngang, bẫy và kết hợp các phương pháp. Các phương pháp này đã
từng được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật bất động enzym. Mỗi phương pháp có

những ưu điểm và nhược điểm riêng nên khi thực hiện cần cân nhắc về mục đích bất
động, đặc điểm của tế bào, dạng phản ứng, dạng của thiết bị phản ứng và các vấn đề
có liên quan khác. [13], [16]
1.3.1.1. Phương pháp liên kết với chất mang
Phương pháp liên kết vói chất mang có bản chất là liên kết của các chất xúc tác
sinh học với các chất mang không tan được trong nước thông qua liên kết đồng hóa
trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh học đặc biệt. Các vật liệu dùng làm
chất mang phải có đầy đủ các đặc tính để có thể liên kết với các chất xúc tác sinh
học, có đủ độ cứng cơ học, vật lý, hóa học, có độ ổn định sinh học và phải không
độc. Các vật liệu được sử dụng làm chất mang là các polysaccharid không tan trong
8
nước (cellulose, dextran, dẫn xuất của agarose ), các protein (gelatin, albumin ),
các polymer nhân tạo (dẫn xuất của polystyren, nhựa trao đổi ion, polyurethan ) và
các vật liệu vô cơ (cát, thủy tinh, ceramic ). Phương pháp liên kết đồng hóa trị là
một trong số những kỹ thuật được sử dụng thường xuyên nhất để bất động các
enzym. Tuy nhiên, phương pháp này không sử dụng rộng rãi cho bất động tế bào bởi
vì các tác nhân cần cho sự hình thành liên kết đồng hóa trị lại thường là các chất độc
đối với tế bào và việc tìm kiếm các điều kiện để bất động tế bào gặp rất nhiều khó
khăn. [13], [16]
1.3.1.2. Phương pháp tạo liên kết ngang
Phương pháp này không sử dụng các chất mang để bất động tế bào, mà mỗi tế
bào được liên kết vói tế bào khác bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet. Tác
nhân tạo ra các liên kết ngang này là một số chất như glutaraldehyd, các
diisocyanat Glutaraldehyđ là một trong số những tác nhân được sử dụng phổ biến
nhất, các nhóm amino của chúng tạo thành các liên kết ngang liên kết các tế bào.
Các tác nhân nhóm diisocyanat như toluen diisocyanat, hexa methylen diisocyanat
lại tạo liên kết ngang bằng cách liên kết nhóm urea vói các nhóm amino.
Escherichia coli có enzym aspertase hoạt tính cao và Bacỉỉlus coagulans cũng đã
được bất động bằng phương pháp này với glutaraldehyd hoặc toluene diisocyanat.
[13], [15], [16]

1.3.L3. Phương pháp bẫy
Tùy theo tính chất của vật liệu dùng để bẫy tế bào, phương pháp bẫy có thể phân
làm bốn loại: dạng lưới, dạng nang nhỏ (microcapsul), dạng liposome và dạng màng.
Ở dạng lưới bẫy, các chất xúc tác sinh học được bẫy trong các khuôn gel của
nhiều loại polymer khác nhau. Dạng microcapsule, tế bào được gói trong các màng
polymer thẩm thấu nhân tạo thành các nang nhỏ. Dạng liposom thì tế bào được bẫy
trong các màng chất lỏng tạo thành từ hợp chất amphiphatic. Còn ở dạng màng, chất
xúc tác sinh học được tách riêng khỏi môi trường bằng các màng siêu lọc, màng ỉọc
micro hoặc bằng các sợi rỗng. [13]
Phương pháp bẫy được sử dụng rất phổ biến trong kỹ thuật bất động tế bào. Tế
bào vi khuẩn, nấm men cũng như các tế bào động vật, thực vật đều có thể được bất
9
động bằng phương pháp này. Tuy nhiên, phương pháp bẫy cũng có những nhược
điểm riêng như: các cơ chất có khối lượng phân tử lớn sẽ rất khó tiếp cận với các tế
bào bất động và khó có thể tái sử dụng lại các chất mang đã dùng để bất động tế bào.
Bẫy dạng lưới là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để bất động tế bào.
Một vài polysaccharid tự nhiên như alginat, k - carrageenan và agar là những vật
liệu gel tốt và rất được ưa dùng. Trong số đó Ca - alginat là gel được sử dụng phổ
biến hơn cả. Gel Ca - alginat có nhiều ưu điểm như: dễ chuẩn bi, không độc với tế
bào, độ bền cơ học khá tốt, độ xốp thuận lợi cho việc khuếch tán của cơ chất và sản
phẩm. Việc cố định tế bào sống với gel Ca -alginat bằng phương pháp bẫy đã trở
thành kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi và được áp dụng trong qui mô sản xuất công
nghiệp ở nhiều nước trên thế giới. Không chỉ được sử dụng để cố định tế bào nấm
men, Ca - alginat còn được dùng để cố định tế bào vi khuẩn và các tế bào động thực
vật khác. [13], [16]
Nguyên tắc chung của bất động tế bào trên cơ chất alginat là: trộn lẫn dung dịch
Na - alginat và dịch huyền phù chứa tế bào cần cố định, khuấy trộn để các tế bào
phân tán đều. Dịch huyền phù thu được cho nhỏ giọt vào một dung dịch tạo gel như
calci clorid, hạt gel sẽ nhanh chóng được tạo thành. Các hạt gel này có dạng hình
cầu. Trong mỗi hạt, gel alginat tạo thành một mạng lưói quanh các tế bào, cố định

các tế bào trong đó. Cấu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các lỗ xốp thuận tiện cho
việc khuếch tán cơ chất vào và khuếch tán sản phẩm ra khỏi hạt gel. Bằng cách này
người ta có thể dễ dàng khống chế các phản ứng, tách sản phẩm ra khỏi bình phản
ứng và sản xuất liên tục. Mặt khác, các thông số của hạt gel như: đường kính hạt, số
lượng tế bào bị gói trong hạt, độ bền gel, độ cứng của hạt là những giá trị có thể
kiểm soát và thay đổi được. Tuy nhiên, gel Ca -alginat cũng có nhược điểm là có thể
bị nứt vỡ dưới những tác động cơ học hoặc bị hòa tan dần khi có mặt các chất có khả
năng cạnh tranh các ion Ca2+. [11], [14]
Nhiều nghiên cứu, khảo nghiêm đã được tiến hành để khắc phục nhược điểm và
nâng cao tính ứng dụng của các gel alginat. Thêm acid polyacrylic vào dung dịch Na
- alginat trước khi tạo gel vói CaCl2 có thể làm tăng độ cứng cơ học của các hạt gel
bởi những chuỗi polyacrylat tạo cầu nối với các ion Ca2+. Khi tạo gel alginat, cũng
có thể làm tăng sự ổn định của các hạt gel bằng cách xử lý với glutaraldehyd hoặc
10
polyacrylamid. Khi bao ngoài các hạt gel alginat bằng Eudragid RL 100 (một chất
đồng trùng hợp của acrylic resin) cho kết quả là sự khuếch tán của cơ chất vào trong
hạt gel tăng 15% trong khi sự thoát ra của các tế bào lại giảm đi nhiều.
Gần đây, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng gel Ca - pectat có thể là sự lựa chọn
tốt hơn để thay thế cho Ca - alginat bởi vì gel này ít bị tác động bởi các anion chelat
và các tác nhân hoá học hơn, do đó sự ổn định của nó tăng lên đáng kể. [16]
Hình 1: Các phương pháp bất động tế bào cơ bản [15]
(Al)
(A2) (A3)
Hấp phụ trên bề mặt
(B)
Liên kết ion trên bề mặt Liên kết hóa trị trên bề mặt
Bẫy trong khuôn
có lỗ xốp
(D1)
Kết tụ tự nhiên

(D2)
* ■ •
Dạng vi nang
\ I ^ I
< 3 ©
Giam giữa hai bề mặt vi nang
Kết tụ nhân tạo
(Tạo liên kết ngang)
(D3)
Giam giữ trong các màng
có nhiều lỗ siêu nhỏ
53 Chất mang không tan
Pha lỏng
Khuôn có lỗ xốp
■ ■ ■ ■ ■ Màng có nhiều lỗ siêu nhỏ
W Ê ỄÊ Ê ÊÊ ÊH Ê ÊỄ Ễ m t ạ o liên kết ngang
(A): bất động trên bề mặt chất mang rắn
(B): bẫy trong khuồn có lỗ xốp
(C): kết tụ tế bào
(D): giam giữ cơ học trong màng ngăn
ỉ Ũ Ế Ỉ Lực liên kết ion
CZZ3 CZZ3 c = 3 CZZ2 CZZ3
11
1.3.2. Các ứng dụng của phương pháp bất động tế bào
1.3.2.1. Sản xuất kháng sinh bằng phương pháp bất động tế bào
Kháng sinh rất cần thiết cho cuộc sống con ngưòi, hầu hết các kháng sinh được sản
xuất bằng con đường vi sinh vật học. Theo phương pháp truyền thống, kháng sinh
thường được sản xuất bằng phương pháp lên men mẻ trong các bình lên men. Để nâng
cao năng suất, người ta tìm cách chuyển từ lên men mẻ sang lên men liên tục kháng
sinh. Tuy nhiên, khó có thể thực hiện được điều này với các tế bào tự do. Khi đó, bất

động tế bào đã trở thành giải pháp hiệu quả cho vấn đề này. Nhiều kháng sinh đã được
nghiên cứu sản xuất bằng con đường bất động tế bào như oxytetracyclin, penicillin,
bacitracin, neomycin, candicidin, cephalosporin, erythromycin, actinomycin D. Trong
số đó, các kháng sinh bán tổng hợp của Penicillin như Amoxicillin, Ampicillin là các
kháng sinh có vai trò quan trọng được tổng hợp từ 6 - APA. 6 - APA được sản xuất
rộng rãi ở qui mô công nghiệp bằng cách bất động tế bào E. coli và Bacillus
megatherìum có hoạt tính enzym Penicillinamidase cao trên những chất mang khác
nhau, cho Penicillin G (V) chảy qua ta thu được sản phẩm vói hiệu suất đạt tói 99,5%,
cao hơn rất nhiều so với phương pháp truyền thống sử dụng tế bào tự do. Phần lớn các
kháng sinh được sản xuất trong điều kiện hiếu khí cao, khi đó cần lưu ý đến việc cung
cấp oxy cho các khung gel bởi đây là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tạo thành
sản phẩm. [5], [16]
13.2.2. Sản xuất các acid hữu cơ bằng phương pháp bất động tế bào
Nhiều acid hữu cơ có ứng dụng trong ngành thực phẩm và làm thuốc, trong đó acid
citric có vai trò rất quan trọng. Aspergillus niger là vi sinh vật chủ yếu được sử dụng để
tổng hợp acid citric theo phương pháp lên men mẻ. Tuy nhiên, điểm bất lợi của phương
pháp này là khó có thể cung cấp đầy đủ oxy cho tế bào nên các tế bào tạo ra tính nhớt
trong quá trình phát triển, để khắc phục thì cần phải thông khí trong suốt thời gian nuôi
cấy. Sử dụng phương pháp bất động tế bào, việc vận chuyển oxy thuận lọi hơn nên hoạt
động của bình lên men không bị ảnh hưởng bởi tính nhót này. Để sản xuất acid citric,
A. nỉger được bất động bằng gel alginat, agarose và polyacrylamid; hoặc còn có thể hấp
phụ lên cột bọt polyurethan, bẫy vào các sợi rỗng và dùng các chất mang cellulose xốp.
Bất động tế bào làm tăng đáng kể hiệu suất sản xuất acid citric.
12
Hai acid hữu cơ quan trọng khác cũng hay được lên men bằng kỹ thuật bất động
tế bào là acid lactic và acid acetic. Các chủng vi sinh vật thường được sử dụng là
Lactobacillus helveticus, Streptococus salivarius, L. casei, Rhyzopus oryzae và
Pedioccus halophilus để sản xuất acid lactic; và Acetobacter. sp để sản xuất acid
acetic. Phương pháp bất động phổ biến là bẫy vào trong gel Ca - alginat hoặc k -
carrageenan và hấp phụ lên các chất mang ceramic.

Lên men bằng bất động tế bào còn được ứng dụng để sản xuất một số acid hữu cơ
khác như: acid itaconic, acid propionic, acid gluconic, acid fumaric, acid succinic và
acid butyric. [16]
1.3.2.3. Sản xuất enzym bằng bất động tế bào
Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất ra các enzym và bất động tế bào là kỹ
thuật thích hợp để sản xuất các enzym ngoại bào.
Trong số các enzym của vi sinh vật thì enzym thủy phân tinh bột a - amylase và
glucoamylase được nghiên cứu nhiều nhất. Trong phương pháp bất động tế bào, các
tế bào vi sinh vật được bẫy vào trong polyacrylamid, Ca - alginat, agar và vài
polymer khác. Bất động Bacillus cereus vào Ca - alginat và nhồi vào thiết bị phản
ứng tầng sôi để sản xuất liên tục a - amylase chịu nhiệt cho hiệu suất phản ứng tăng
gấp 24 lần so với lên men mẻ bằng tế bào tự do. Ngoài ra, còn có thể sản xuất a -
amylase từ các tế bào biến đổi của E. coli bất động trong k - carrageenan có bổ xung
thêm glycin.
Vài enzym quan trọng khác như cyclodextrin - glycosyl - transferase (CGTase),
cellulase, lipase, protease, ß - galactadase, xylanase, dextron sucrase và invertase
cũng được nghiên cứu sản xuất bằng bất động tế bào. [10], [16]
1.3.2.4. Sản xuất alcol bằng bất động tế bào
Các vi sinh vật được sử dụng phổ biến để sản xuất alcol bằng bất động tế bào là
s. cerevỉsiae hoặc Zymomonas mobilis. Tuy nhiên, một trong số các vấn đề thường
xuyên gặp phải trong lên men alcol là sự phát sinh C02 với lượng lớn, kết quả của hô
hấp kị khí trong lên men liên tục. Các khí phát sinh này làm tăng áp suất trong các
hạt gel nên làm nứt vỡ các hạt gel. Để khắc phục nhược điểm này, một số chất mang
thay thế đã được đưa vào sử dụng thử nghiêm là: khung giả ceramic cấu tạo bằng
13
nhôm silicat để bất động tế bào nấm men, bọt Polyurethan để bẫy z. mobiỉis, các
chất dẻo có nhiều liên kết ngang
Nhiều chất đã được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào như:
sorbitol, glycerol, propane - diol, 2,3 - butanediol, các dung môi tan trong nước
(aceton, butanol, ethanol), manitol và xylitol. Trong đó, lên men sản xuất ethanol là

một trong số các hệ thống nghiên cứu được phát triển và đưa vào ứng dụng rộng rãi
nhất trong thực tế. [16]
Lên men sản xuất ethanol bằng bất động tế bào thường dùng phương pháp bẫy
s. cerevisiae trong gel Ca - alginat. Phương pháp này cho phép lên men nhanh với
dung dịch đường nồng độ cao. Các tế bào nấm men được giữ trong mạng lưói gel để
không bị khuếch tán vào môi trường, trong khi đó glucose vẫn xâm nhập được vào
trong gel để biến đổi thành alcol ethylic và c o 2 đi ra ngoài. Ưu điểm của phương
pháp này là: hiệu suất lên men đạt được cao hơn do có thể tăng số lượng tế bào sống
gói trong các hạt tạo mật độ tế bào cao; duy trì xúc tác tự nhiên của các enzym trong
tế bào; tế bào ít chịu ảnh hưởng có hại của môi trường. Bên cạnh đó, alginat lại được
sản xuất với sản lượng lớn ở nhiều nước trên thế giới tạo nên nguồn nguyên liệu khá
dồi dào. Bởi vậy nên nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu sâu về alginat để có thể phục
vụ tốt hơn cho kỹ thuật bất động tế bào và để đưa kỹ thuật này vào sản xuất ethanol
ở qui mô công nghiệp. [13], [16]
1.4. ALGINAT
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic có trong các
loài tảo nâu, rong mơ Sargassum polycystum,
s.
kjellmanianum tồn tại chủ yếu ở
dạng muối với các ion kim loại như Ca2+, Ba2+, Mg2+, Na+ [7], [17]
1.4.1. Cấu trúc của alginat
Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic
là acid a- L- guluronic (G) và acid ß- D- mannuronic (M) nối với nhau bằng liên kết
1- 4 - glucosid. Tuy nhiên, hai monome này không liên kết một cách ngẫu nhiên mà
tạo thành ba loại block: block homopolymeguluronic gồm các gốc acid guluronic
nối tiếp nhau GGGG, block homopolymemannuronic gồm các gốc acid mannuronic
nối tiếp nhau MMMM, và block liên hợp MGMG.
14
Tuỳ theo nguồn gốc của alginat mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài
của mỗi block và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau. Điều này làm

cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng. [12], [17]
Hình 2: Cấu trúc của phân tửalgỉnat
1.4.2. Tính chất của alginat:
+ Độ hoà tan:
Các muối kim loại hoá trị I (Na+, K+ ), muối amoni và muối của các amin phân
tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước. Còn các muối của acid alginic
với các kim loại đa hoá trị (Ca2+, Ba2+ ) thì không tan được (trừ muối của Mg2+).
Các muối alginat hoà tan được trong các dung mối thân nước như alcol, ceton và
hoà tan dễ dàng hơn khi đun nóng.
+ Độ nhớt:
Na- alginat khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt dao động trong
khoảng từ 10 - 3.500 cps. Độ nhớt này tăng tỷ lệ thuận vói khối lượng phân tử trung
bình của alginat, với nồng độ của alginat sử dụng và giảm đi khi tăng nhiệt độ. Khi
duy trì nhiệt độ ở 50°c trong nhiều giờ alginat sẽ bị cắt mạch và giảm độ nhớt.
Nhưng khi hạ thấp nhiệt độ đến đông đặc rồi làm rã băng thì độ nhớt của dung dịch
alginat hầu như không có sự thay đổi đáng kể. Độ nhớt của dung dịch alginat còn bị
ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion kim loại có trong dung dịch.
M M M
OH -ooc rtu
M
M
M
G G
G
-ooc
M G
M
15
+ Độ ổn định:
Alginat khô giống như các polysaccharid tự nhiên khác rất không bền với oxy,

nhiệt độ và ion kim loại ; khi có mặt các tác nhân này alginat sẽ bị rã ra. Độ ổn
định của các muối alginat xếp theo thứ tự: Na- alginat > amoni alginat > acid
alginic; càng xếp cuối các muối càng kém ổn định. Alginat có độ nhớt cao nhanh bị
rã hơn alginat có độ nhớt trung bình hoặc thấp. Ở nhiệt độ thường bột Na- alginat
khô chỉ bảo quản được trong vài tháng nhưng nếu hạ nhiệt độ và bảo quản nơi tối sẽ
duy trì được lâu hơn. Còn nếu đông sâu thì có thể bảo quản vài năm mà không giảm
đáng kể khối lượng phân tử. Các dung dịch alginat ổn định ở pH 5,5 - 10 và chuyển
thành dạng gel ở pH< 5,5. Ngoài ra, thêm một lượng nhất định ion Ca2+ vào cũng có
thể làm tăng độ ổn định của các dung dịch alginat.
+ Sự gel hoá:
Dung dịch Na- alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hoá
trị II, III. Các gel này được hình thành ở các mức nhiệt độ < 100°c và cả ở nhiệt độ
phòng, chúng cũng không tan chảy khi đun nóng. Các nhà khoa học giải thích khả
năng tạo gel này bằng mô hình cấu trúc phân tử của alginat - mô hình “vỉ trứng”:
đoạn mạch của acid polyguluronic (GGGG) có dạng gấp nếp, còn các sợi acid
polymannuronic (MMMM) là các dải dẹp. Khi có mặt các ion hoá trị II, III ở nồng
độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra, các phân tử alginat sắp xếp lại song song vói nhau,
các phần gấp nếp của đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt
quả trứng. Các ion Ca2+ khớp vào khoảng trống này, liên kết vói các nhóm carboxyl
và các nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song, khi đó gel alginat được hình thành.
[12], [17]
16
Hình 3: Quá trình tạo gel của các phân tử calci alginat [16]
A/VWVN . Đoạn GGGG block
: Đoạn MMMM block
Khả năng tạo gel của các muối alginat cũng phụ thuộc vào kích thước của ion
kim loại. Ion Strontium có kích thước lớn hơn ion Ca2+ nên liên kết mạnh hơn và sẽ
được ưu tiên giữ lại hơn nếu có sự cạnh tranh giữa Ca2+ và Sr2+. Còn ion Mg2+ có kích
thước nhỏ nên không thể tạo gel vói Na - alginat. Ái lực của các ion kim loại đối với
alginat xếp theo thứ tự như sau: Pb2+> Cu2+> Cd2+> Ba2+> Sr2+> Ca2+> Co2+.

Khi nghiên cứu gel Ca- alginat người ta thấy môđun đàn hồi phụ thuộc mạnh mẽ
vào thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc uronat. Alginat có block G nhiều và
dài sẽ cho gel bền hơn. Môđun đàn hồi còn phụ thuộc vào loại ion tạo liên kết ngang
và ái lực giữa các cation liên kết ngang. Ngoài ra, độ bền của gel còn phụ thuộc vào
các yếu tố môi trường, về ảnh hưởng của cấu trúc phân tử tới độ bền gel: đoạn M-
block thể hiện đặc tính đàn hồi, còn đoạn G- block thể hiện mức độ cứng rắn của gel.
Các đặc tính này được quan tâm trong nhiều ứng dụng của alginat. [12], [17]
1.4.3. ứng dụng của alginat
Sản lượng acid alginic trên toàn thế giới vào khoảng 32000 - 39000 tấn/ năm.
Những nước sản xuất alginat nhiều nhất là Scotlen, Nhật, Mỹ, Tây Ban Nha, Trung
Quốc Ở Việt Nam, chúng ta có nguồn rong mơ phong phú thích hợp cho việc sản
xuất alginat, và thực tế là chúng ta đã sản xuất được alginat thương phẩm đạt chất
lượng ở Nha Trang, Khánh Hòa.
Các alginat có ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như dệt, thực phẩm, giấy
và dược phẩm Ngành công nghiệp dệt sử dụng alginat nhiều nhất (chiếm 50%
tổng lượng alginat sử dụng), chủ yếu dùng trong các loại sọi tổng hợp. Ngành công
nghiệp thực phẩm cũng dùng tới 30% tổng lượng alginat để làm kem, bánh, kẹo dẻo
và nhiều loại sản phẩm được ưa dùng khác. Alginat còn được sử dụng trong công
nghiệp giấy, công nghiệp cao su và có trong thành phần của nhiều loại mỹ phẩm
như son môi, dầu gội
Trong công nghiệp dược phẩm, alginat dùng chỉ chiếm 5% tổng lượng alginat sử
dụng. Alginat dùng làm tá dược rã viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng dược chất;
dùng để đóng nang, bao phim. Alginat còn được dùng để làm trơn, ngăn trào ngược
dịch dạ dày và là yếu tố ổn định nhũ tương, huyền phù. [16]
Ngày nay, khi kỹ thuật bất động tế bào ngày càng phát triển và được đưa vào sử
dụng rộng rãi trong thực tế thì vai trò của alginat cũng ngày càng được nâng cao.
Trong kỹ thuật này, alginat được sử dụng để cố định tế bào như một gel có nhiều ưu điểm.
18
PHẦN II - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.1.1. Nguyên yật liệu
-Vi sinh vật: chủng nấm men
s.
cerevisiae (Bộ môn Công nghiệp Dược)
í - Natri alginat (Trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang)
- Các môi trường:
Môi trường thạch nghiêng giữ giống: %(kl/tt)
Glucose : 5,0
Cao ngô : 0,5
(NH4)2S04 : 0,3
MgS04.7H20 : 0,1
KH2P04 : 0,2
Thạch : 2,0
Nước vừa đủ : 100 ml
pH : 6 ,5 -7
Môi trường nhân giống: %(kl/tt)
Glucose : 5,0
Cao ngô : 0,5
(NH4)2S04 : 0,3
MgS04.7H20 : 0,1
KH2P04 : 0,2
Nước vừa đủ : 100 ml
pH : 6,5-7
- Dung dịch glucose 10%.
- Tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, máy khuấy từ
- Các hóa chất, dụng cụ cần dùng trong thực nghiệm.
19
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm
2.1.2.1. Phương pháp tạo hạt calci aỉginat
- Nguyên tắc: dựa vào tính chất tạo gel của alginat với ion calci:

2Na - alginat + Ca2+ —► Ca - alginatị + 2Na+
- Cách tiến hành:
Pha các dung dịch sau:
+ Dung dịch CaCl2 2%
+ Dung dịch Na - alginat 2,5%; 3%
Dùng pipet Pasteur nhỏ dung dịch Na - alginat vào cốc đựng dung dịch CaCl2 2%
sự gel hóa sẽ xảy ra, hạt gel Ca - alginat được tạo thành. [1], [14]
2.1.2.2. Phương pháp giữ giôhg trên thạch nghiêng:
Pha môi trường thạch, đun cho tan thạch rồi chia đều vào các ống nghiệm, mỗi
ống 5 - 6 ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 0,6 at/ 20 phút, để cho nguội bớt rồi đặt
nghiêng. Cấy giống vào ống thạch nghiêng, để trong tủ 30°c trong 48h. [2]
2.1.2.3. Phương pháp tạo dịch tế bào
Pha 100 ml môi trường nhân giống vào bình nón dung tích 250 ml, nút kín bằng
nút bông, hấp tiệt trùng ở 0,6 at/ 20 phút. Để nguội rồi cấy giống và ủ trong tủ 30°c
sau 24h ta được dung dịch giống tế bào.
2.1.2.4. Phương pháp gói nấm men trong hạt calci alginat:
Pha các dung dịch sau:
+ 500ml dung dịch CaCl2 2%
+ 500ml dung dịch NaCl 0,9%
+ 50ml dung dịch Na — alginat 4%; 5% hoặc 6%
Pha 50ml dung dịch natri alginat 4%, 5% hoặc 6% vào bình nón lOOml, đem hấp
tiệt trùng ở 0,6at/ 20 phút. Để nguội, thêm 50ml dịch tế bào, lắc đều, đem khuấy từ
với tốc độ khoảng 400 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút để tạo
thành hỗn dịch đồng nhất. Dùng pipet Pasteur nhỏ hỗn dịch này vào cốc đựng 500ml
dung dịch CaCl2 2% đã tiệt trùng hạt sẽ nhanh chóng được tạo thành, để 30 phút cho
hạt ổn định rồi rửa hạt 3 lần bằng 500ml dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng hoặc
20
nước cất vô trùng . Ngay sau khi thu được hạt tiến hành đếm số lượng tế bào gói
được trong hạt, nhồi cột để lên men liên tục và đem nuôi cấy tĩnh.
Trong quá trình gói tế bào nấm men vào gel calci alginat chúng tôi nhận thấy

một số điểm cần lưu ý:
- Khi khuấy từ phải khuấy đủ thời gian để tạo hỗn hợp đồng nhất. Khuấy xong để
khoảng 5 phút cho thoát hết bọt khí rồi mới đem tạo hạt.
- Trong quá trình tạo hạt giữ cố định khoảng cách khoảng 2cm từ đầu pipet đến
mặt thoáng của dung dịch calci clorid để hạt có thòi gian vừa phải rơi trong không
khí tạo hình cầu.
- Lúc ban đầu hạt còn nổi trên mặt nước do phần bên trong hạt chưa thấm ion
Ca2+ nên khi tạo hạt cần chú ý nhỏ vào phần mặt thoáng không có hạt để tránh các
hạt dính vào nhau.
- Do bề mặt của hạt được bao bọc bởi lớp gel calci alginat nên phần trong sẽ
thấm ion Ca2+ chậm hơn, để đảm bảo độ chắc của hạt phải ngâm hạt trong dung dịch
CaCl2 khoảng 30 phút. Sau đó vớt hạt ra, rửa sạch ion Ca2+ và tế bào bám bên ngoài
hạt để tránh các sai số cho các thực nghiệm tiếp theo.
- Thời gian tạo hạt nên tiến hành nhanh, không nên kéo dài vì tế bào nấm men
sống bên ngoài nhiều có thể giảm hoạt tính, ảnh hưởng tói hoạt độ lên men sau này.
[1], [7], [14]
2.1.2.5. Phương pháp tính số lượng tế bào gói trong 1 gam hạt calci alginat
Cân chính xác 1 gam hạt có chứa tế bào, hòa tan hoàn toàn trong 20 ml dung
dịch natri citrat 2% (pH 6) bằng cách khuấy từ liên tục ở tốc độ 400 - 500 vòng/
phút trong khoảng 20 - 30 phút ở nhiệt độ phòng được dung dịch A. Để xác định số
lượng tế bào nấm men có trong lg hạt calci alginat này ta dùng phương pháp pha
loãng liên tục.
- Tiến hành:
Chuẩn bị 8 - 10 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất đã hấp tiệt trùng ở
0,6at/ 20 phút, để nguội. Hút chính xác lml dung dịch A đem pha loãng đều trong
ống nghiệm thứ nhất, sau đó lại hút chính xác lml địch trong ống nghiệm thứ nhất
pha loãng đều trong ống nghiệm thứ hai Làm như vậy cho đến ống nghiệm cuối
21
^ >
7

cùng. Nhỏ lml dich ở ống chứa dung dịch có nồng độ cần khảo sát vào đĩa thạch,
dùng que trang dàn đều. Đem ủ trong tủ 30°c trong 48h, lấy ra đọc kết quả và lấy
kết quả trung bình.
2.1.2.6. Phương pháp tính số lượng tế bào có trong lml dịch lên men
Dùng phương pháp pha loãng liên tục:
Chuẩn bị 6 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất đã hấp tiệt trùng ở 0,6at/ 20
phút, để nguội. Hút chính xác lml dịch lên men pha loãng trong ống nghiệm thứ
nhất. Sau đó lại hút chính xác lml dịch trong ống nghiệm thứ nhất này pha loãng
trong ống nghiệm thứ hai Làm như vậy cho đến ống nghiệm cuối cùng. Nhỏ lml
dịch ở ống nghiệm thứ 4, 5 và 6 vào đĩa thạch, dùng que trang dàn đều. Đem ủ trong
tủ 30°c trong 48h, lấy ra đọc kết quả và lấy kết quả trung bình. [2]
2.1.2.7. Phương pháp lên men sẩn xuất alcol ethylic bằng tế bào bất động
Hạt gel sau khi được tạo thành, rửa sạch bằng nước cất hoặc dung dịch NaCl
0,9% vô trùng. Nhồi hạt vào cột, tiến hành lên men sản xuất alcol ethylic với các
thông số sau:
- Chiều dài cột : 50 cm
- Đường kính trong của cột : 2 cm
- Khối lượng hạt dùng : khoảng 30 gam
- Thể tích làm việc của cột lên men : khoảng 80ml
- Tốc độ chảy của dịch lên men : khoảng 10 - 15 giọt/phút
- Thời gian chạy cột : 24h.
Trước hết, điều chỉnh tốc độ chảy của dịch lên men. Sau đó điều chỉnh tốc độ
chảy của dung dịch đường vào cột sao cho dung tích làm việc của cột luôn ổn định.
Sau các khoảng thòi gian nhất định lấy hạt và dịch để xác định số lượng tế bào.
Trước khi sử dụng, cột được rửa kỹ bằng nước sạch, tiệt trùng bằng alcol ethylic 96°,
sau đó tiến hành nạp hạt vào cột. Dung dịch glucose 10% chảy từ trên đỉnh cột xuống,
duy trì mức thể tích dung dịch glucose trong cột hằng định. Đầu trên của cột có lắp lưới
bằng thép không gỉ để ngăn không cho hạt nổi lên và đầu dưói cũng có lưói thép này để
hạt không làm tắc cột ở đầu nhỏ giọt. Nhiệt độ lên men duy trì ở 30°c.
22