Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn phần chiết tách từ khương hoạt ( notoptrygium incisum ting ex h t chang họ hoa tán apiaceae )

m
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM NGỌC QUẾ
NGHIÊN CỨU MỘT s ố TÁC DỤNG Dược LÝ CỦA
HỖN HỢP COUMARIN TOÀN PHẦN CHIẾT TÁCH
TỪ KHƯƠNG HOẠT
(NOTOPTERYGIUMINCISƯM TING
EX H. T. CHANG HỌ HOA TÁN APIACEAE)
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1998- 2003 )
Người hướng dẫn : PGS.TS. Mai Tất Tô
TS. Vũ Thị Trâm
Nơi thực hiện : Bộ môn Dược Lý
Bộ môn Dược Liệu
Thời gian thực hiện: 2/20003 - 5/2003.
L Ờ I CAM Ơ N
Trong quá trình thực hiện khoá luận tố t nghiệp, tô i d ã nhận dư ợc sự hướng
dẫn và g iú p đ õ tận tình của :
P C S.T S. Mai Tất Tố.
P G S.T S. Dế Thị Thuấn.
TS. Vũ Thị Trầm.
D S. Nguỵễũ Quỷnh Chi.
Tôi xin b ả / tổ lòng b iế t ơn sâu sắ c tó i các thẩỵ c ô hướng dẫn cùng tập
th ể th ổ / cô g iá o và k ỹ thuật viên ổ hai b ộ môn D ược lực và D ược liệu. D ồng thờ i
tô i cũng xin cảm ơn ban giấm hiệu và cốc p hò ng chức nầng trường đ ại họ c D ược
Hà Nội d ã tạ o diều kiện ch o tô i hoàn thành khoá luận nả /.
C uối cùng, tô i xin dư ợc gử i lờ i cảm ơn đến gia đỉnh, bạn b è đ ã kh u/êh
khích, dộng viên tô i trong su ố t th ời gian vừa qua.
Hà Nội tháng 5 năm 2 0 0 3
Sinh viên
PUfK ẠíỷOù Q a í

MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
1. PHẦN 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Vị thuốc khương hoạt 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Đặc điểm vị thuốc 2
1.1.3. Thu hái, chế biến 3
1.1.4. Thành phần hoá học 3
1.1.5. Tác dụng, công dụng 4
1.2. Sơ bộ về coumarin và tác dụng dược lý của chúng 4
1.2.1. Sơ bộ vê coumarin 4
1.2.2. Tác dụng dược lý của nhóm chất coumarin 5
1.2.3. Coumarỉn có trong khương hoạt và những tác dụng dược lý đã 9
được nghiên cứu
2. PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 11
2.1. Nguyên vật liệu, động vật thí nghiệm và phương pháp nghiên 11
V
cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu. 11
2.1.2. Động vật thí nghiệm. 11
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 11
2.1.3.1. Chiết tách hỗn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương 11
hoạt
2.1.3.2. Thử một số tác dụng sinh hoc của hổn hợp coumarin toàn phần 12
chiết tách được
2.2. Thực nghiệm, kết quả và nhận xét. 13
2.2.1. Chiết tách hổn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương 13
hoạt
2.2.1.1. Chiết tách 13

2.2.1.2. Các phản ứng định tính và sắ kỷ lớp mỏng 15
2.2.2. Thử sơ bộ một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn 17
phần chiết tách từ khương hoạt
22.2.1 .Tác dụng chống loạn nhịp tim 17
2.2.2.2. Tác dụng chống viêm cấp 21
2.2.2.3. Tác dụng chống viêm mạn 26
2.2.2.4.Tác dụng giảm đau 29
3. PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 36
3.1. Kết luận 36
3.2. Đê nghị 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỂ
Những sản phẩm làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên rất đa dạng và phong
phú. Gắn liền với lịch sử phát triển của loài người thì nguồn gốc tự nhiên của
những sản phẩm làm thuốc không những được mở rộng từ thực vật, động vật,
khoáng vật đến vi nấm, vi khuẩn, mà còn được sử dụng ngày càng tinh chất
hơn. Nhiều thuốc mới được phát hiện dựa trên những bài thuốc hay vị thuốc
cổ truyền đã khẳng định tính ưu việt về tác dụng điều trị qua thời gian tồn tại
như morphin, quinine, artemisinin, ephedrin. Phát huy nền y học cổ truyền và
những kinh nghiệm dùng thuốc trong dân gian, việc nghiên cứu sàng lọc sâu
hơn về các nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên nhằm làm sáng tỏ về
tác dụng cũng như hoạt chất, tiến tới việc nghiên cứu để tạo ra những chế
phẩm mới là một hướng đi đang dần được khẳng định.
Khương hoạt là một vị thuốc đã được sử dụng trong y học cổ truyền để
điều trị các bệnh cảm lạnh, đau đầu, và đặc biệt là điều trị phong tê thấp.
Nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định và làm sáng tỏ một số tác dụng
điều trị của vị thuốc này như tác dụng giảm đau, tác dụng chống viêm, tác
dụng chống ung thư. Ngoài ra theo một nhóm tác giả Trung Quốc thì nước sắc
khương hoạt còn có tác dụng chống loạn nhịp tim. Để góp phần tìm hiểu hoạt
chất của khương hoạt tiến tới sử dụng dược liệu này ngày một tốt hơn chúng

tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của hỗn hợp
coumarin toàn phần chiết tách từ khương hoạt (Notopterygium incisum
Ting ex H.T. Chang)” với các mục tiêu sau:
- Chiết tách hỗn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương hoạt
- Thử sơ bộ một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn phần:
Tác dụng chống viêm cấp, tác dụng chống viêm mạn, tác dụng giảm đau và
tác dụng chống loạn nhịp tim.
1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. VỊ thuốc khương hoạt
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Vị thuốc khương hoạt được chế biến từ rễ và thân rễ đã phơi khô của
hai loài:
Notopterygium incisum Ting ex H.T. Chang (Khương hoạt)
Notopterygium forbesii Boiss (Khương hoạt lá rộng)
Họ hoa tán Apiaceae [4]
Khương hoạt lưu hành trên thị trường Việt Nam hiện nay được chế biến
từ rễ và thân rễ đã phơi khô của cây khương hoạt (N. insisum) [7].
Theo Đỗ Tất Lợi [5] khương hoạt là một cây sống lâu năm, toàn cây có
mùi thơm đặc biệt, thân rễ to khô, có đốt. Thân cây cao từ 0,5 - lm không
phân nhánh, thân phía dưới hơi có màu tím. Lá mọc so le, kép lông chim,
phiến lá chia thuỳ, mép có răng cưa tù, mặt trên màu tím nhạt, mặt dưới màu
xanh nhạt, phía dưới cuống lá phát triển thành bẹ ôm lấy thân. Hoa rất nhỏ,
màu trắng, lập thành hình tán kép. Quả bế đôi hình thoi dẹp, màu nâu đen, hai
mép và ở lưng phát triển thành dìa.
1.1.2. Đặc điểm vị thuốc
Dược điển Việt Nam III [4] đã mô tả hình thái vị thuốc khương hoạt:
Thân rễ hình trụ, hơi cong queo, dài 4 - 13 cm, đường kích 0,6 - 2,5 cm,
đầu rễ có sẹo gốc thân cây. Mặt ngoài màu nâu đến nâu đen. Nơi bị tróc vỏ
ngoài màu vàng, khoảng giữa các đốt ngắn, có vòng mấu nhỏ gần liền nhau

tựa như hình con tằm (quen gọi là Tàm khương), hoặc khoảng giữa các đốt
kéo dài dạng đốt tre (quen gọi là Trúc tiết khương). Trên đốt có nhiều sẹo rễ
2
con dạng điểm hoặc dạng bướu và vẩy màu nâu. Thể nhẹ, chất giòn xốp, dễ bẻ
gẫy. Mặt bẻ không phẳng, có nhiều kẽ nứt. vỏ màu từ vàng nâu đến nâu tối,
có chất dầu, có điểm chấm dầu màu nâu. Gỗ màu trắng vàng, tia ruột xếp theo
hướng xuyên tâm rõ. Lõi (ruột) màu vàng đến vàng nâu. Mùi thơm, vị hơi
đắng và cay.
ẢNH 1:VỊ thuốc khương hoạt (Notopterygium incỉsum Ting ex H.T. Chang)
1.1.3. Thu hái, chế biến
Trồng hai đến ba năm thì thu hoạch. Thường thu hoạch vào mùa thu,
đào về, rửa sạch, làm mềm, cắt thành miếng dày, phơi hoặc sấy khô.
1.1.4. Thành phần hoá học
Một số nghiên cứu cho thấy trong khương hoạt có tinh dầu, coumarin
phytosterol, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, acid amin và một số thành phần
khác như falcarindiol, các ferulat, methylcafeic este, pregnenolone [7, 25].
3
1.1.5. Tác dụng, công dụng
Theo y học cổ truyền [3] khương hoạt được xếp vào nhóm thuốc tân ôn
giải biểu: Vị cay, tính ấm, quy kinh bàng quang, can, thận có tác dụng tán hàn
giải biểu dùng khi cảm mạo, phong hàn, sốt không có mồ hôi, đau đầu, toàn
thân đau mỏi, có tác dụng trừ thấp, chỉ thống để điều trị bệnh phong thấp. Đặc
biệt khương hoạt có tác dụng tốt trong các chứng đau nhức xương cốt, thần
kinh từ lưng trở lên.
Theo một số tác giả Trung Quốc [34] thì nước sắc khương hoạt còn có
tác dụng chống loạn nhịp tim. Các tác giả Nhật Bản [32] cho biết dịch chiết
methanol của thân rễ khương hoạt có tác dụng ngăn cản sự hình thành các sản
phẩm ôxy hóa.
1.2. Sơ bộ vê coumarỉn và tác dụng dược lý của chúng
1.2.1. Sơ bộ về coumarin

Benzo a-pyron là chất coumarin đơn giản nhất tồn tại trong thực vật
được biết đến từ năm 1820 trong cây Dipteryx odoreta Willd thuộc họ Đậu
(Fabaceae) [1]. Cây này mọc ở Brazil, có trồng ở Venezuela và có tên địa
phương là "Coumarou" do đó nhóm chất này có tên là coumarin. Các chất
coumarin tan tốt trong cồn 90° và dung môi hữu cơ như ethylacetat, tan trong
nước nóng, không hoặc ít tan trong nước lạnh .
Cho đến nay người ta đã phát hiện khoảng hơn 200 chất coumarin khác
nhau, có thể phân thành 3 nhóm chính:
Nhóm 1: Coumarin đơn giản là các coumarin chỉ có nhân Benzo a-
pyron gắn với các nhóm thế khác như nhóm hydroxy, alkoxy, alkyl
Nhóm 2: Nhóm furanocoumarin là các coumarin có vòng furan liên kết
với nhân Benzo- a- pyron có thể ở vị trí 6, 7 hoặc vị trí 7, 8.
4
Nhóm 3: Nhóm pyranocoumarin là những coumarin có vòng pyran liên
kết với nhân Benzo- a-pyron có thể ở vị trí 5, 6, vị trí 6, 7 hoặc vị trí 7, 8.
1.2.2. Tác dụng dược lý của nhóm chất coumarin
Nhóm chất coumarin có rất nhiều tác dụng dược lý như : Tác dụng giảm đau,
hạ nhiệt, tác dụng chống viêm, tác dụng chống đông máu, tác dụng chữa bệnh
vẩy nến, tác dụng kháng khuẩn, tác dụng chống ung thư [8, 14, 20, 22, 23,
25, 26]. Dưới đây là một số tác dụng dược lý của nhóm chất coumarin đã được
biết đến:
I.22.1. Tác dụng chống đông máu
Đây là một tác dụng kinh điển của các dẫn chất coumarin như
acenocoumarol, dicoumarol, ethylbicoumacetat, warfarin. Tác dụng này được
biết đến từ năm 1941, sau khi Link tìm ra chất dicoumarol. Các dẫn chất
coumarin chống đông máu tác dụng theo cơ chế kháng vitamin K, chúng ức
chế sự tổng hợp 1 số yếu tố đông máu quan trọng như các yếu tố II
(prothrombin), vn (proconvertin), IX (PTC), X (Stuart) ở gan nên cản trở quá
trình đông máu. Sau khi dùng các chất chống đông kể trên, nồng độ các yếu tố
II, VII, IX, X trong huyết tương giảm hẳn do đó quá trình đông máu bị kéo

dài.
1.2.2.2. Tác dụng chống viêm
Quá trình viêm là phản ứng tại chỗ mang tính bảo vệ với sự huy động
của các yếu tố tế bào, thể dịch nhằm loại trừ và khu trú ổ viêm. Phản ứng viêm
được nhận biết bởi bốn triệu chứng chính là sưng, nóng, đỏ, đau [6]
Rất nhiều chất coumarin đã được ghi nhận có tác dụng chống viêm trên
các mô hình thử nghiệm gây viêm bằng carrageenin.
Carrageenin là tác nhân gây viêm theo cơ chế kích thích giải phóng một
số yếu tố trung gian hoá học của quá trình viêm như histamin, serotonin
bradykinin và prostaglandin. Trong một thí nghiệm khác người ta đã phát hiện
5
tác dụng chống viêm của coumarin và umbelliferone theo cơ chế giống như
các thuốc chống viêm phi steroid với chất gây viêm là carrageenin tác dụng
kéo dài ít nhất sau 3 giờ, đó cũng là thời gian mà carrageenin có tác dụng
mạnh nhất [22].
Coumarin cũng có tác dụng chống phù nề trong thử nghiệm gây phù
chân chuột bởi dextran. Theo Garcia-Argaez [14] coumarin còn có tác dụng
như một tác nhân gây viêm: Liều thấp của psoralen và imperatorin có tác dụng
chống viêm nhưng liền cao chúng lại có tác dụng gây viêm .
1.2.2.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của nhóm chất coumarin đã được
rất nhiều tác giả ghi nhận. Điển hình là công trình nghiên cứu về tác dụng
kháng khuẩn của dịch chiết cây Pealargonium sidoides và cây Pealargonium
reniforme của hai tác giả người Đức Kayser và Kolodziej [17]. Bằng phương
pháp thạch pha loãng hai tác giả đã cho thấy một số thành phần coumarin
trong dịch chiết có tác dụng kìm khuẩn. Kết quả được tóm tắt ở bảng 1
Bảng 1: Tác dụng kháng khuẩn của coumarỉn
Tên vi khuẩn
Coumarin
Staphylococus aureus

6,8-dihydroxy-5,7dimethoxycoumarin
Scopoletin
Umekalin
Streptococus pneumoniae
6,8 -dihy droxy-5,7dimethoxy coumarin
5,6,7-trimethoxy coumarin
Umekalin
Escherichia coli
Scopoletin
Haemophilus influenzae
5,6,7-trimethoxy coumarin
Klebsiella pneumoniae
Scopoletin
Proteus mirabilis
Scopoletin
Pseudomonas aeruginosa
Scopoletin
6
Kwon và cộng sự [20] đã ghi nhận 5,8-di-(2,3-đihdroxy-3-
methylbuthoxy)-psoralen và Byakangelicin có tác dụng kháng nấm Asperilus
sp. và Clodosporium sp.
1.2.2.4. Tác dụng chống ung thư
Trên tế bào ung thư, coumarin và dẫn chất của nó làm thay đổi đáng kể
sự điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, sự phát triển của tế bào và quá trình phân
bào [27]. Coumarin có thể tác động trực tiếp lên tế bào ung thư hay gián tiếp
qua sự điều chỉnh hệ thống miễn dịch của vật chủ, bằng cách đó kích thích hệ
thống miễn dịch hoạt động lại, chỉ huy hệ thống bảo vệ chống lại sự tái phát
của tế bào ung thư. Trong một nghiên cứu của Fujioka [12] thì dịch chiết của
rễ cây Angelica japonica (gồm các thành phần: Scopoletin, japoangelone,
oxypeucedanin, xanthotoxin, bergapten) có tác dụng chống lại sự phát triển

của tế bào ung thư dạ dày MK-1.
1.2.2.5 Những tác dụng dược lý khác và độc tính
Tác dụng ức chế cytocrom P450 ở gan của coumarin đã được Koenigs
và cộng sự [18] ghi nhận do đó nó có thể gây ra tương tác thuốc đối với các
thuốc chuyển hoá phần lớn qua enzym này.
Trong một công trình nghiên cứu của Woo và đồng sự [29] đã cho thấy
tác động của imperatorin, isoimpertorin, oxypeucedanin và isooxypeucedanin
trong dịch chiết methanol của cây Angelica koreana làm chậm chuyển hoá
thuốc cả trên invitro và invivo.
Praeruptorin A, xanthotoxin, psoralen và bergapten trong dịch chiết
cloroform của rễ cây Peucedanum japonicum có tác dụng ức chế monoamine
oxidase ở não chuột [16].
7
về độc tính của nhóm chất coumarin chưa thưc sự rõ ràng, tuy nhiên
hiêp hội thuốc, thực phẩm và viện ung thư quốc gia của Mỹ đã cảnh báo về
độc tính và khả năng gây ung thư của một số chất coumarin [28].
Bảng2 : Một sô tác dụng dược lý của coumarin đã được ghi nhận
Tác dụng dược lý
Tác giả
ị
Tác dụng chống viêm irivitro và
inịivo
CHEN, Y.F. và cộng sự (1995)
LINO, c.s. và cộng sự (1997)
GARCIA-ARGAEZ và cộng sự
(2000)
Tác dụng ức chế 5-lipoxygenase
inịvitro
HOULT, J.R.S. và cộng sự (1994)
LIU, J.H. và cộng sự (1998)

Tác dụng giảm đau
LINO, c.s. và cộng sự (1997)
OKUYAMA, E. va cộng sự (1993)
Tác dụng chống loạn nhịp tim
ZHU, X. và cộng sự (1990)
Tác dụng chống đông máu
LINK (1941)
Tác dụng kháng khuẩn
KAYSER, 0. và cộng sự (1997)
Tác dụng kháng nấm
KWON, Y.s. và cộng sự (1997)
Tác dụng chống ung thư inỊdtro
SELIGER, B. (1997 )
KOFINAS, c. và cộng sự (1998)
FUJIOKA, T. và cộng sự (1999)
NAM, N. H. (2002)
Tác dung chống ký sinh trùng sốt
rét inỵivo và inyitro
YANG, U.Z. và cộng sự (1992)
Tác dụng chống virut invitro
FULLER, R.W. và cộng sự (1994)
Tác dụng đối kháng calci invitro và
invivo
YAMAHARA, J. và cộng sự (1989 )
CHIU, K.W. và cộng sự (1997 )
Tác dụng ức chế hoạt động men gan
invitro
KOENIGS, L.L. và cộng sự (1997 )
Tác dụng ức chế mono amin oxidase
HUONG, D.T. và cộng sự (1999 )

Tác dụng ức chế protein kinase
invitro
YANG, E.B. và cộng sự (1999 )
Tác dụng chữa bệnh vảy nến
LEWIS, H.M. (1994)
McNEELY, w . và cộng sự (1998)
8
1.2.3. Coumarin có trong khương hoạt và những tác dụng dược lý đã
được nghiên cứu
Theo một nhóm tác giả Trung Quốc và Nhật Bản [9] thì họ đã phát hiện
ra 15 coumarin được chiết và phân lập từ khương hoạt (N.incisum), dựa trên
quang phổ cơ bản và khối phổ (UV, IR, MS, NMR và 2D- NMR).Những
coumarin đó là: Notoptolide, ethylnotopterol, anhydronotoptoloxide,
bergapten, isoimperatorin, demethylfuropinaein, bergaptol, notoptol,
notopterol, anhydronotoptol, xanthoxol, bergamottin, 7 isopentonyloxy -6-
methoxy-courmarin, 7-(3,7-dimethyl-2,6-octadenyloxy)-6-methoxy-coumarin
và nodakenin.
Năm 1993, các tác giả Nhật bản [26] đã công bố notopterol là thành
phần có tác dụng giảm đau của N.incisum trên thí nghiệm gây quặn đau bởi
acid acetic trên chuột. Bằng thử nghiệm trên tính thấm thành mạch các tác giả
cũng xác định đây là một trong số những thành phần có tác dụng chống viêm
của khương hoạt.
Theo một số tác giả người Đức [23] thì notopterol, isoimperatorin, và
phellopterin là 3 thành phần coumarin có tác dụng ức chế 5- Lipoxygenase (5-
LOX) và cyclooxygenase (COX) là các enzym xúc tác quá trình chuyển acid
arachidonic thành prostaglandin và leucotrien (các chất trung gian hoá học
gây viêm và đau).
Theo Nguyễn Hải Nam [25], nhóm chất coumarin được chiết từ khương
hoạt Notopterygium incisum còn có tác dụng chống ung thư. Công trình
nghiên cứu này đã chiết xuất, phân lập các chất coumarin từ khương hoạt và

thử hoạt lực chống ung thư của từng chất, có so sánh với một số chất như 5
Fluorouracil, Etoposide, Adriamycin cụ thể kết quả đã được tác giả ghi nhận ở
bảng 3.
9
Bảng 3 : Tác dụng chông ung thư của coumarin chiết tách từ khương
hoạt
Nhóm chất
Nồng độ ức chế tế bào ung thư(Jếg/ml)
B16 P388
A549
SK -C V 3
Bergamottin
11,59
10,27 24,50
21,37
Isoimperatorin >30
>30
>30
>30
Notopterol >30
>30 >30
>30
5 Fluorouracil 3,98
0,20 5,47 4,67
Etoposide 0,86
2,12
1,17
1,21
Adriamycin
0,1

0,06
0,09
0,15
Chú thích:
B16: Tế bào sắc tố của chuột
P388: Tế bào ung thư bạch cầu của chuột
A549: Tế bào ung thư phổi của người
SK-OV3: Tế bào ung thư buồng trứng của người
10
PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u
2.1. Nguyên vật liệu, động vật thí nghiệm và phương pháp nghiên
cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
- Vị thuốc khương hoạt mua ở phố Lãn Ông - Hà Nội được rửa sạch,
sấy khô ở nhiệt độ 40°c sau đó tán thành bột (kích thước < 0,8 mm) để chiết
suất.
-Thuốc Aspégic (Sanofi synthelabo Vietnam) gói bột pha dung dịch
uống 100 mg. Thành phần: Acétylsalicylate de lysine 180 mg, tương ứng acid
acétylsalicylique 100 mg.
- Máy cất quay thu hồi dung môi dưới áp lực giảm Biichi 461 (Thuỵ sỹ).
- Máy đo điện tim Cardiofax của hãng Nihonkohden (Nhật Bản).
- Máy 7280 Hot plate của hãng Ugobasile (Italia)
2.1.2. Động vật thí nghiệm
- Thỏ cả 2 giống đực và cái khoẻ mạnh có trọng lượng 1,8-2,3 kg do
phòng giáo tài trường Đại học Dược cung cấp.
- Chuột cống trắng cả 2 giống đực và cái, khoẻ mạnh, có trọng lượng
130-150 (g) do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp.
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss trọng lượng từ 20 - 22 (g) do Viện vệ
sinh dịch tễ cung cấp.
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu

2.1.3.1 Chiết tách hỗn hợp coumarin toàn phần từ vị thuốc khương hoạt
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết nóng bằng cồn 90° sau đó
tách bằng dung môi ethylacetat [7, 25].
11
Sau đó dùng các phản ứng định tính coumarin kết hợp với sắc ký lớp
mỏng để chứng minh sản phẩm chiết tách được là hỗn hợp coumarin toàn
phần.
2.1.3.2 Thử một số tác dụng dược lý của hổn hợp coumarin toàn phần
chiết tách được
2.1.3.2.1. Tác dụng chống loạn nhịp tim
Tiến hành thí nghiệm trên 2 lô thỏ : Một giờ sau khi cho thỏ uống
thuốc, gây loạn nhịp bằng dung dịch BaCl2 2% tiêm tĩnh mạch vành tai. Theo
dõi điện tim của thỏ trên ba chuyển đạo
Dị, D2, D3 cho đến khi nhịp tim trở lại
bình thường, ghi thời gian loạn nhịp, so sánh giữa lô thử và lô chứng [7].
2.1.3.2.2. Tác dụng chống viêm cấp
Thí nghiệm trên 3 lô chuột cống trắng:
Lô thử, lô chứng và 1 lô cho uống Aspégic để đối chiếu. Gây viêm bằng
(Carrageenin 1 %) tiêm dưới da gan bàn chân chuột, đo thể tích bàn chân chuột
trước sau khi gây viêm, so sánh tỷ lệ phù chân chuột giữa 3 lô.
2.1.3.2.3. Tác dụng chống viêm mạn
Tiến hành thí nghiệm trên 3 lô chuột cống trắng như thí nghiệm chống
viêm cấp. Gây viêm theo phương pháp Donop Jonlon bằng cách cấy vào mỗi
bên nách chuột một viên amian đã nhúng carrageenin 1% Cho chuột uống
thuốc liên tục trong 5 ngày. Ngày thứ 6 bóc tách u hạt, so sánh trọng lượng u
hạt giữa 3 lô.
2.1.3.2.4. Tác dụng giảm đau
- Phương pháp gây quặn đau bằng acid acetic:
12
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng, gây quặn đau bằng

acid acetic 1%. Theo dõi và ghi số lần quặn đau của chuột trong từng 5 phút
một đến phút thứ 30.
- Phương pháp mâm nóng:
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng, theo dõi thời gian
chuột phản ứng với nhiệt độ trước và sau khi uống thuốc.
2.2. Thực nghiệm, kết quả và nhận xét
2.2.1. Chiết tách hỗn hợp coumariỉt toàn phần từ vị thuốc khương
hoạt
22.1.1. Chiết tách
Cân chính xác khoảng 500 (g) bột dược liệu khô. Chiết nóng bằng 1,5
(1) cồn 90° với sinh hàn hồi lưu. Sau 3 giờ rút dịch chiết và lọc qua giấy lọc.
Bã dược liệu được chiết tiếp lần hai và ba. Gộp dịch chiết cồn, cất thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay thu được dịch chiết đậm đặc,
cô cách thuỷ đến dạng cao mềm. Hoà tan cao mềm bằng nước nóng trên nồi
cách thuỷ, lọc nóng qua giấy lọc (và bình gạn, lắc nhiều lần với ethylacetat cho
đến khi lớp nước không còn màu với thuốc thử diazo. Gộp dịch chiết
ethylacetat, rửa lại bằng nước cất, cất thu hồi dung môi thu được 5,8 (g) hỗn
hợp coumarin toàn phần.
Vậy tỷ lệ phần trăm hỗn hợp coumarin toàn phần thu được từ dược liệu
khô, theo phương pháp chiết tách của chúng tôi là:
5,80/500 X 100% = 1,16%
13
Hình 1:
Sơ đồ quy trình chiết tách hổn hợp coumarin toàn phần từ khương hoạt
14
2.2.1.2. Các phản ứng định tính và sắc kí lớp mỏng
Lấy 0,1 (g) cao (hỗn hợp coumarin toàn phần) hoà tan trong 10ml cồn
90° để tiến hành các phản ứng định tính sau:
*Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống lml dịch chiết cồn 90° .

Ống nghiệm 1: Thêm 0,5ml NaOH 10%
Ống nghiệm 2: Thêm 0,5ml nước cất.
Đun cách thuỷ cả hai ống khoảng 5 phút sau đó để nguội, thêm vào mỗi
ống 4ml nước cất, thấy ống nghiệm 1 trong hơn ống nghiệm 2. Thêm vào mỗi
ống lml HC110% thấy cả 2 ống đều vẩn đục. Chứng tỏ phản ứng dương tính.
*Phản ứng diazo hoá:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết cồn 90°, thêm vài giọt NaOH 10%.
Sau đó cho vào ống nghiệm 2 giọt thuốc thử diazo thấy xuất hiện màu đỏ sẫm
chứng tỏ phản ứng dương tính.
*Huỳnh quang tăng lên ở môi trường kiềm khi soi dưới ánh đèn tử
ngoại:
Nhỏ một giọt dịch chiết cồn 90° lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó 1 giọt
NaOH 5%, sấy nhẹ. Che một nửa vết với đồng xu rồi chiếu tử ngoại trong vài
phút sau đó cất đồng xu đi. Kết quả nửa vòng không che sáng hơn nửa vòng
tròn bị che. Tiếp tục chiếu thấy nửa bị che sáng dần lên.
* Sắc kỷ lớp mỏng:
Chúng tôi đã tiến hành chấm sắc ký dịch chiết ethylacetat đối chiếu với dịch
chiết cồn ban đầu trên bản mỏng silicagen G60F254 tráng sẵn. sắc ký được khai
triển trên hệ dung môi cloroform : ethylacetat (1:1). Sau khi triển khai, bản
15
sắc ký được để ngoài không khí cho bay hết dung môi, quan sát các vết trên
sắc ký bằng huỳnh quang dưới ánh sáng u v ở bước sóng X = 254 nm và X =
366 nm.
7
Kết quả sắc ký lớp mỏng
?
« •
« •
0 •
C Ó N 1 A

CỒN EA
ẢNH 2 : Sắc ký đồ
dịch chiết EA đối chiếu với
dịch chiết cồn ở bước sóng
(Ã = 254 nm)
ẢNH 3 : Sắc k ý đồ
dịch chiết EA đối chiếu với
dịch chiết cồn ở bước sóng
( Ả = 366 nm)
Nhân xét: Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy số vết chất có trong dịch
chiết ethylacetat hoàn toàn tương ứng với số vết chất có trong dịch chiết cồn
ban đầu cả về màu sắc lẫn giá trị Rf, kết hợp với kết quả của các phản ứng
định tính đã khẳng định sản phẩm chiết tách được là hỗn hợp coumarin toàn
phần có trong khương hoạt.
16
2.2.2. Thử sơ bộ một số tác dụng dược lý của hỗn hợp coumarin toàn
phần chiết tách từ khương hoạt
2.22.1. Tác dụng chống loạn nhịp tim
Để đánh giá tác dụng chống loạn nhịp tim của hỗn hợp coumarin toàn
phần, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đo điện tim thỏ bằng máy Cardiofax của
Nhật Bản.
Thỏ thí nghiệm cả hai giống đực và cái khoẻ mạnh, cân nặng từ 1,8 đến
2,3 kg chia làm 2 lô: Lô chứng và lô thử, mỗi lô 6 con.
Lô chứng: Cho thỏ uống nước muối sinh lý 0,9% vào trong 3 ngày, mỗi
ngày 2ml/kg. Ngày thứ 3, một giờ sau khi cho uống, đo điện tim thỏ, ghi xuất
phát điểm. Sau đó, gây loạn nhịp tim thỏ bằng dung dịch Bariclorid 2% tiêm
tĩnh mạch vành tai thỏ với liều 0,2ml/kg. Đo điện tim thỏ sau tiêm 2 phút, 5
phút, 10 phút và cứ sau 5 phút đo một lần đến khi điện tim trở về xuất phát
điểm.
Lô thử : Làm tương tự như đối với lô chứng, thay nước muối sinh lý

bằng hỗn dịch coumarin toàn phần 1,16% pha trong nước muối sinh lý với liều
2ml/kg/ngày, tương đương với liều khương hoạt 2g/kg/ngày.
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4 và hình 2, 3 c íkv
o l Jk-Ì
C\J*W*
p
t o
- o
MMMMậ
ỉr*
^ 0
if*
£
ÍT '
K h ỉ
Ằ, j M — ^
rs ị
X
ì
u . t
CO
O J
¥=;
o
* ■ 0
p
Mọ
( f ì
ứ
r

U-—-J
•ị ■ *""' 1l
< t ỉ ^ '
H
o f\
/ £
X
*v£
< 0
^ 5
lẫ
c u
«ạ
í
20
Bảng 4: Thời gian loạn nhịp tim của thỏ
Thỏ
Thòi gian ỉoạn nhịp (phút)
Lô chứng
Lô thử
1
25 10
2
10 10
3 20
5
4 15
5
5
20 5

6 25 10
Trung bình (TB)
19,17 ±5,85 7,50 ± 2,74
p
0,002
Nhân xét: Qua kết quả thực nghiệm thu được ở trên cho thấy hỗn hợp
coumarin chiết tách từ khương hoạt có tác dụng rút ngắn rõ rệt thời gian loạn
nhịp tim thỏ so với lô chứng có ý nghĩa thống kê sinh học.
222.2. Tác dụng chống viêm cấp
Thực nghiệm tiến hành thử trên chuột cống trắng cả hai giống đực và cái
khoẻ mạnh, cân nặng 130 - 150g. Chuột được chia làm 3 lô, mỗi lô 6 con cho
uống thuốc hoặc dung dịch nước muối sinh lý 0,9% trong 3 ngày:
* Lô chứng: Cho chuột uống nước muối sinh lý 0,9%, lml/chuột/ngày.
21