GÓP PHẦN NGHIÊN cứu lên MEN TỔNG hợp KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173 113

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 173.113

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SI

HÀ NỘI - 2012


MỤC LỤC
MỤC LỤC........................................................................................................................2
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................................1
Chương 1 : TỔNG QUAN.................................................................................................2
1.1 Đại cương về kháng sinh..................................................................................................2
1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh.........................................................................................................2
1.1.2 Định nghĩa kháng sinh........................................................................................................................2
1.1.3 Phân loại kháng sinh..........................................................................................................................3
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh........................................................................................................3
1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh............................................................................................................4

1.2 Đại cương về xạ khuẩn....................................................................................................4
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.......................................................................................................4
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces.........................................................................................5

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh (Hình 6)...................................................................7
1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn...............................................................8
1.4.1 Mục đích............................................................................................................................................8
1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên................................................................8

1.4.3Đột biến cải tạo giống.........................................................................................................................8
1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn...................................................................................................................9

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh...................................................................................9
1.5.1 Khái niệm lên men.............................................................................................................................9
1.5.2 Các phương pháp lên men...............................................................................................................10
1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men...........................................................................11

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men..........................................................11
1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh..................................................................................11
1.6.2 Các phương pháp chiết tách............................................................................................................12

1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng.............................................................................12
1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến....................................................................................................................12
1.7.2 Phổ hồng ngoại................................................................................................................................13
1.7.3. Khối phổ (MS).................................................................................................................................13

1.8 Một số nghiên cứu liên quan.........................................................................................13
1.8.1 Sản xuất 4,5-epoxy–8-demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces
hygroscopicus [18]....................................................................................................................................13
1.8.2 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces sp.[19]..............14

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................15
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị.............................................................................................15
2.1.1 Nguyên vật liệu................................................................................................................................15
2.1.2 Máy móc thiết bị..............................................................................................................................16


2.2 Nội dung nghiên cứu.....................................................................................................17
2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống.....................................................................................................................17

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh.......................................................................................................17
2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được.............................................................18

2.3 Phương pháp thực nghiệm............................................................................................18
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn........................................................................................................18
2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán......................................................18
2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên.........................................................................................................................19
2.3.4 Phương pháp đột biến.....................................................................................................................19
2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh.................................................................................................21
2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc...............................................................................22
2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ...............................................................22
2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng........................................................22
2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không...............................................................................23
2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột.......................................................................................23
2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được.............................................................................24

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT........................................................24
3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên...........................................................................................24
3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1................................................................................25
3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2................................................................................26
3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3................................................................................27
3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh.....................................................................28
3.6 Kết quả chọn chủng lên men..........................................................................................29
3.7 Kết quả thử độ bền pH..................................................................................................30
3.8 Kết quả chọn dung môi và pH chiết................................................................................30
3.9 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi....................................................................31
3.10 Kết quả sắc ký cột........................................................................................................31
3.11 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết..................................35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................................................36

1. Kết luận.......................................................................................................................... 36
2. Kiến nghị......................................................................................................................... 37


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÊT TẮT
S. aureus

Staphylococcus aureus

P. mirabilis

Proteus mirabilis

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

DMHC

Dung môi hữu cơ

ĐB1

Đột biến lần 1

ĐB2

Đột biến lần 2

G(-)

Gram âm

G(+)

Gram dương

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IR

Hồng ngoại - Infrared

KS

Kháng sinh


MC

Mẫu chứng

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

TB

Tế bào

TĐC

Trao đổi chất

UV

Tử ngoại – Ultraviolet

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn............................................................15
Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.................................................16
Bảng 3: Các dung môi đã sử dụng..........................................................................16
Bảng 4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên....................................................25
Bảng 5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1..............................................................26
Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2..............................................................27
Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3..............................................................28
Bảng 8: Kết quả chọn môi trường lên men.............................................................29
Bảng 9: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt.................30
Bảng 10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày.........31
Bảng 11: Kết quả chiết kháng sinh bằng 4 DMHC ở 5 pH khác nhau..................31
Bảng 12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký...................................................32
Bảng 13: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1......................33


Bảng 14: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........34
Bảng 15: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2......................34
Bảng 16: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........35
Bảng 17: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3............36
Bảng 18: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-4 (hiện hình bằng P. mirabilis)..........36
Bảng 19: Biện giải các nhóm chức của phổ IR.......................................................37

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Hình 2: Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh lên tế bào vi khuẩn.

Hình 3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn.
Hình 4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn.
Hình 5: Sự phát triển của khuẩn ti ở xạ khuẩn.
Hình 6: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh.
Hình 7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn.
Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc.


Hình P3: Phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV.
Hình P4: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn 3 lần 1.
Hình P5: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.
Hình P6: Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.
Hình P7: Phổ MS của kháng sinh tinh khiết thu được.


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh ngay từ khi ra đời đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sử
ngành y - dược. Hiện nay, kháng sinh đã trở thành một nhóm thuốc thiết yếu trong
nền y học hiện đại. Nhờ nhóm thuốc này mà nhân loại đã chống lại được các dịch
bệnh nguy hiểm đã từng cướp đi sinh mạng của hàng trăm ngàn người trên thế giới
như : dịch hạch, tả, viêm phổi… Đặc biệt, nhóm thuốc này giữ 1 vị trí hết sức quan
trọng ở những nước đang phát triển khi mức sống thấp, điều kiện vệ sinh yếu
kém… nên thường xuất hiện và có nguy cơ bùng phát các dịch bệnh nhiễm khuẩn
hô hấp, nhiễm khuẩn tiêu hóa. Không dừng lại ở điều trị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm,
ngày nay phạm vi điều trị của kháng sinh còn đang được mở rộng trong cả điều trị
ung thư và HIV/AIDS và cũng cho nhiều kết quả khả quan.
Bên cạnh đó, tình hình sử dụng kháng sinh chưa hợp lý dẫn tới tình trạng

VSV kháng thuốc diện rộng, kháng cả với những kháng sinh thế hệ mới. Đặc biệt,
hiện nay xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng chéo với nhiều loại
kháng sinh có cấu trúc tương tự nhau.Vì vậy, đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất kháng
sinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấp
thiết trong công cuộc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Do đó, bên cạnh việc
nghiên cứu sản xuất kháng sinh bằng phương pháp tổng hợp, bán tổng hợp thì việc
tìm kiếm những kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên cần được chú trọng hơn nữa.
Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có
nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi
lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ
Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp. Khóa luận mong muốn đạt được
các mục tiêu sau đây:
-

Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

-

Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất.

-

Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.


2

Chương 1 : TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh

Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander
Fleming tình cờ phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum.
Năm 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey đã đề nghị được hợp tác với
Fleming để tiếp tục nghiên cứu về penicilin. Năm 1941, nhóm đã chọn được chủng
Penicilliumchrysogenium ưu việt nhất để chiết penicillin. Từ 1943, Anh và Mỹ đã
sản xuất penicilin với quy mô công nghiệp. Đến năm 1945, giáo sư Fleming được
tặng giải thưởng Nobel về y học, cùng với Chain và Florey [21].
Penicillin xuất hiện đã mở đầu một kỷ nguyên mới trong lịch sử ngành y –
dược: kỷ nguyên kháng sinh. Trong vòng 20 năm tiếp theo đó (1940 – 1960) là thời
kỳ “hoàng kim” trong lịch sử nghiên cứu kháng sinh với sự ra đời của hàng loạt các
kháng sinh liên tiếp: streptomycin (1944), cloramphenicol – neomycin (1949)…Tuy
nhiên, ngay sau khi kháng sinh được đưa vào ứng dụng điều trị trong thực tế không
lâu thì bắt đầu phát hiện các chủng VSV kháng thuốc. Năm 1953, trong một trận
dịch bệnh tả ở Nhật, lần đầu tiên xuất hiện hiện tượng vi khuẩn đề kháng với
cloramphenicol, tetracycline. Đến năm 1955, các nhà khoa học phát hiện vi khuẩn
lao kháng streptomycin… (Tham khảo phụ lục - Hình 1)
Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc
tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện.
Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn có
cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của cloramphenicol và
cephalosporin…
1.1.2 Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn tự
nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách
chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …)
hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.[10]


3

1.1.3 Phân loại kháng sinh
Danh sách các chất KS được phát minh đang ngày càng dài thêm (Tham
khảo Phụ lục 1) và việc phân loại chúng trở nên thật sự cần thiết.
Có nhiều cách phân loại KS: theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng…Tuy
nhiên phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì người nghiên
cứu có thể nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới
phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó [10].
 Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm sau đây [8]:
- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin…).
- Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol…).
- Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin…).
- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin…).
- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…).
- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…).
- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…).
- Các kháng sinh nhóm antracyclin (daunorubicin…).
- Các kháng sinh nhóm actinomycin (actinomycin D…).
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào vi sinh
vật, làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác
dụng lên các đích khác nhau. [4]
 Có 6 kiểu chủ yếu: (Tham khảo phụ lục - Hình 2) [17]
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất
- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein (Tham khảo phụ lục - Hình P3)
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian

4

1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh
Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực khác nhau [10]:
- Trong chăn nuôi: kháng sinh dùng để chữa bệnh cho động vật:
Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được
sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn,
tăng sản lượng trứng ở gà, vịt.
- Trong trồng trọt: Hiện nay có khoảng 30 chất kháng sinh đã được sử dụng
để đấu tranh với các bệnh của cây trồng do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.Ví dụ:
Herbicidin A và B là kháng sinh do S.saganonensis tạo ra kìm hãm sự phát triển của
Xanthomonas oryzae gây bệnh cho lúa.
- Trong công nghiệp thực phẩm: KS cũng được sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp: kháng sinh subtilin (do Bacillus
subtilis tạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis).
1.2 Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomcetes) là những vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng
rãi trong tự nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có
cấu tạo dạng sợi phân nhánh có G + C > 55%.[4]
Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như
KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym....nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất
nhiều.[4]
Xạ khuẩn được sử dụng để sản xuất kháng sinh và nhiều loại enzyme
(amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.[4]
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
- Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ
sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ
khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô

ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[6]


5

- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3
μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết
sức phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu, trắng, …[7]

Actinomycetes

Actinomycetales

Actinoplanaceae

Streptoverticulum

Streptomycetaceae

Streptomyces

VSV giống xạ khuẩn

Actinomycetaceae

…

Themostreptomyces

…

Hình 4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Bên cạnh những đặc điểm chung của xạ khuẩn, Streptomyces cũng có những
đặc điểm riêng:
- Đặc điểm hình thái:
Khuẩn lạc:
+ Tạo thành cụm, bề mặt khô, xù xì, được bao phủ bởi một lớp bột mịn hoặc
bởi những sợi nhỏ bông như lông tơ.
+ Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách rời khỏi môi trường nuôi cấy.
+ Hệ sợi của khuẩn lạc: Khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
• Khuẩn ty cơ chất: Mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt
trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi.


6

• Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không
khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất
hiện các chuỗi bào tử. (Hình 5) [7]
Chuỗi bào tử: Có thể mọc đơn hoặc mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như
thẳng, cong, móc câu, xoắn đơn hoặc kép, xoắn lò xo.Chuỗi bào tử phân cắt tạo
thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có
thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp).[4]

`Hình 5: Sự phát triển của khuẩn ty ở xạ khuẩn
- Đặc điểm sinh lý:Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để
phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng
lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat
thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của

chúng là 25-30°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5.[11]
- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:
sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố
melanoid.[11]


7

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh (Hình 6)
Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí
nghiệm
Nhân giống quy mô thí nghiệm
Nhân giống trong thiết bị nhân giống
Lên men tổng hợp kháng sinh
Dịch lên men
Sinh khối

Dịch lọc

Sinh khối thô

Dịch chiết kháng sinh

Dịch chiết sinh khối

Dịch chiết đậm đặc

Sản phẩm tinh chế

Sản phẩm tinh chế

Sản phẩm đã kiểm nghiệm
Sản phẩm được đóng gói
Hình 6: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh


8

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.4.1 Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước,
mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó,
để thu được các chủng có HTKS và hiệu suất sinh tổng hợp cao đưa vào sản xuất
đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu
điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[14]
1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20 - 30 % so với những cá thể khác.
Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có
khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến
nhân tạo.[10]
1.4.3 Đột biến cải tạo giống
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột
biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp cân hữu
tính, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.
 Phương pháp: Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:[12]
- Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitroro (HNO 2), hydroxylamin,
dimethylsulphat…

- Tác nhân vật lý:
+ Ánh sáng UV, tia X, tia

hay electron.

+ Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Ánh sáng
UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích thước
nhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới nhân.


9

+ Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu,
cường độ bức xạ.
+ Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục hoạt
(photoreactivation) : Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài ánh sáng
thường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được phục hồi.
- Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu.
1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn
Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái
hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ
thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi
và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ.[15]
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng
VSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang
môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ
phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm
khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông
lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).[13]
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi

cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong
tủ lạnh và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[13]
1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.5.1 Khái niệm lên men
Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong các điều kiện tối thích để sản xuất
ra các sản phẩm TĐC nhờ chính các VSV hoặc các thành phần tế bào của chúng.
[10]
Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn.
Cụ thể hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết


10

thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha cân
bằng.[16]

Hình 7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn
1.5.2 Các phương pháp lên men
- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn
hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không
khí để hô hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn
giản, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng,
hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng
phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[5]
- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3
chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng
đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.[5]
Có 4 kiểu lên men chìm như sau:
+ Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men
với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết

thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm. Trong lên men sinh tổng hợp kháng sinh
hay sử dụng phương pháp này.[10]


11

+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường
dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả
sử dụng bình lên men.
+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát
triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và bổ sung
thêm MT mới vào bình.
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh
dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những
khoảng thời gian nhất định.
1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
- pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực
tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc
là tác dụng gián tiếp.[13]
- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử
dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh
trưởng, rút ngắn pha tiếm phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai
đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ
hòa tan oxy lớn nên thông khí vừa phải là tốt.[13]
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi
nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn.
1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá
trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men
đôi khi thấp. Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế


12

sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn dược điển. Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyết
định tới giá thành của sản phẩm.[10]
1.6.2 Các phương pháp chiết tách
- Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp giấy lọc
(hoặc bông), bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chui qua do chênh lệch áp suất
trên và dưới lớp lọc.[15]
- Ly tâm: là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhau,
thường là tách pha rắn khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm.[15]
- Chiết bằng dung môi hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách (đang hòa tan
trong dịch lọc) sang pha dung môi hữu cơ không đồng tan.[15]
- Các phương pháp sắc ký:
+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên
khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn
(chất hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số R f.[1]
+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự
phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo
thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt
nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.[1]
1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng
1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi
mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa

cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối
quan hệ chặt chẽ [9] (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự
hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử
có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng
lượng ánh sáng UV-VIS. [1]


13

1.7.2 Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái
năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử. Phổ
IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước sóng
hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.[2]
1.7.3. Khối phổ (MS)
Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của
ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng
chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở
chân không cao (10-6mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá
vỡ thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một
số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ. [1]
Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất)
xác định cấu trúc và định lượng các chất.

1.8 Một số nghiên cứu liên quan
1.8.1 Sản xuất 4,5-epoxy–8-demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú
từ Streptomyces hygroscopicus [18]
Gendanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu hút
bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế enzym
sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư… với nồng độ

ức chế tối thiểu (IC50) là 13nM khi tiến hành test với dòng tế bào NCI. Đặc tính
kháng ung thư của gendanamycin do ức chế mạnh ATP, làm bất hoạt sinh tổng hợp
protein của tế bào gây ung thư. Các nghiên cứu cũng cho thấy sử dụng
gendanamycin để điều trị ung thư sẽ tăng tính hiệu quả của phương pháp điều trị
đồng thời như xạ trị. Hiện nay, gendanamycin đang ở trong giai đoạn 2 giám sát
lâm sàng.
Gendanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus
var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-epoxy-8-demethyl


14

gendanamycin, được tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu
năng cao.
Gendanamycin và 4,5-epoxy-8-demethylgendanamycin là những kháng sinh
có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinh tổng hợp từ
Streptomyces sp.
1.8.2 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces
sp.[19]
Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym

lipoxygenase gồm

tetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), D(4, C28H36NO10) từ
Streptomyces sp. USF – 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp
tetrapetalone A. HLO (Human lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là những
enzym xúc tác đầu tiên tương ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh ra một loạt
các chất gây bệnh cho người như leukotrien, lipoxin, prostaglandin. Nghiên cứu
được tiến hành trên lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean Lipoxygenase)
Streptomyces sp. USF – 4727 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp,

dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa giải
bằng MeOH và aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau đó tinh
chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan: ethylacetate
=3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4).
Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó sắc
khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giải là MeOH, tinh chế
phân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2 lit môi trường. Tetrapetalone A
có IC50 là 190 (µM)


15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học
trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh họctrường ĐH
Dược Hà Nội cung cấp:
Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633
Vi khuẩn Gram(-): Proteus mirabilis BV 108
 Môi trường: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, VSV kiểm định
+ Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (Bảng 1)
Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
MT

MT1
Thành phần
Tinh bột
2

Glucose
Bột đậu tương
Cao thịt
Pepton
KNO3
0,1
CaCO3
(NH4)2SO4
K2HPO4
0,05
MgSO4.7H2O
0,05
NaCl
0,05
Cao nấm men
Thạch
1,8
Nước máy (ml)
100
pH
Chú thích: - Đơn vị tính theo gram.

MT5

MT6

2,4
1

2

1,5

0,3
0,3
0,4
0,2

2
100
6,8-7,2

0,1
0,5
2
100

- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút.
- Các môi trường lên men dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng như
môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.


16

+ Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (Bảng 2):
Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần
(%)

NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

pH

0,5
0,5

0,3
0,3

0,5
0,5

0
1,8

7,0-7,4

Môi trường
MT canh thang
MT thạch thường
 Dung môi

Bảng 3: Các dung môi đã sử dụng
Dung môi
Aceton

Acetonitril
n-Butanol
Butylacetat
Cloroform
Diclorometan
Ethanol
Ethylacetat
NH4OH 25%
Methanol
Triethylamin

Khối lượng riêng (g/ml)
0,79
0,782-0,783
0,81
0,880-0,885
1,470-1,480
1,32
0,789-0,791
0,889-0,901
0,880
0,791-0,793
0,726-0,728

Nhiệt độ sôi (°C)
56
80-82
116-118
117-118
60-62

40
78,3
70,4
64,5
90

 Vật liệu chạy sắc ký
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck.
- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 4 ở trên.
- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1mm.
2.1.2 Máy móc thiết bị
- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W,
điện thế 220V.
- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf
- Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc


17

- Tủ lạnh Samsung
- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48
- Tủ sấy SL shellab
- Lò vi sóng Whirlpool
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030
- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210
- Cân phân tích Sartorius BP 121 S
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt
- Máy cất quay Buchi Waterbath B480
- Kính hiển vi điện tử
- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm

- Hộp Petri đường kính 9cm
- Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong,
cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn,
đũa thủy tinh, kim mũi mác…

2.2 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội
dung nghiên cứu cụ thể như sau:
2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống
- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất.
- Đột biến bằng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn.
2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh.
- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất.
- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn
biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.
- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất
- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất


18

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ
2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được
- Xác định nhiệt độ nóng chảy
- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS.
2.3 Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích
hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C.

- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh
bảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.
2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm
định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của
VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
- Tiến hành:
+ Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml
MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch
VSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml.
+ Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội
đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô
trùng với thể tích 20ml/đĩa.
+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:
• Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được
tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50 oC,
sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định. (Xem hình P5 ở phụ lục)
• Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV
sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định. (Xem hình P3)