Sự biến động hoạt độ catalaza, peroxidaza ở mầm đậu tương DT84 trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===***===

LÙ THỊ DUYÊN

SỰ BIẾN ĐỘNG HOẠT ĐỘ CATALAZA,
PEROXIDAZA Ở MẦM ĐẬU TƢƠNG DT84
TRONG PHA GÂY MẶN VÀ PHA PHỤC HỒI
SAU NHIỄM MẶN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI - 2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===***===

LÙ THỊ DUYÊN

SỰ BIẾN ĐỘNG HOẠT ĐỘ CATALAZA,
PEROXIDAZA Ở MẦM ĐẬU TƢƠNG DT84
TRONG PHA GÂY MẶN VÀ PHA PHỤC HỒI
SAU NHIỄM MẶN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS.TS. NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu
sắc tới thầy hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Văn Mã đã tận tình hƣớng
dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới khoa Sinh- KTNN, Trung tâm Hỗ
trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội 2
đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện đề tài này.
Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không
tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc sự chỉ bảo, góp ý kiến của các
thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Xuân Hòa, ngày…tháng…năm
Sinh viên
Lù Thị Duyên


LỜI CAM ĐOAN
Tôi đã thực hiện đề tài: "Sự biến động hoạt độ catalaza, peroxidaza ở
mầm đậu tương DT84 trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm
mặn”.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả
nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực,
không trùng lặp với các tác giả khác.
Xuân Hòa, ngày…tháng…năm
Sinh viên
Lù Thị Duyên

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ĐC:

Đối chứng

TN:

Thí nghiệm

GM:

Gây mặn

PH:

Phục hồi

NXB:

Nhà xuất bản

CAT:

Catalaza

POD:

Peroxidaza

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn
Bảng 2: Hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi
Bảng 3: Hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn
Bảng 4: Hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi
Bảng 5: Tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tƣơng
Bảng 6: Chiều dài mầm


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn
Hình 3.2. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi
Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn
Hình 3.4. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của mặn đến tỷ lệ nảy mầm
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của mặn đến sự sinh trƣởng của mầm


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................Error! Bookmark not defined.
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................... 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................... 3
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................. 3
NỘI DUNG ................................................................................................ 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................... 4
1.1. Sự nảy mầm và đặc điểm sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng. ................. 4
1.2.Tác hại của mặn đối với thực vật. ....................................................... 5

1.3. Vai trò của catalaza và peroxidaza trong chống chịu stress ở thực vật. ...... 7
1.3.1. Vai trò của enzym catalaza .......................................................... 7
1.3.2. Vai trò của enzym peroxidaza ...................................................... 7
1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của catalaza và peroxidaza đối với thực
vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng. ....................................................... 8
1.4.1. Trên thế giới. ............................................................................. 8
1.4.2. Ở Việt Nam ................................................................................. 9
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 11
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu...................................................................... 11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. ................................................................ 11
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm .................................................. 11
2.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ........................... 12
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu. ........................................................ 16
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................... 17


3.1. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây
mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. ..................................................... 17
3.1.1. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tương trong pha gây
mặn. .................................................................................................. 17
3.1.2. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tương trong pha
phục hồi sau nhiễm mặn. .................................................................... 19
3.2. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây
mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. ..................................................... 20
3.2.1. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tương trong pha
gây mặn. ............................................................................................ 20
3.2.2. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tương trong pha
phục hồi sau nhiễm mặn. .................................................................... 21
3.3. Khả năng nảy mầm và sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng trong pha
gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. ............................................... 22

3.3.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương. ...................................... 22
3.3.2. Sự sinh trưởng chiều dài mầm đậu tương ................................... 24
KẾT LUẬN.............................................................................................. 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 28


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây đậu tƣơng (Glicine max L.Merrill) là loài cây họ Đậu (Fabaceae),
có nguồn gốc từ Châu Á và đƣợc trồng cách đây 5000 năm. Các phân tích hóa
sinh cho thấy rằng hạt đậu tƣơng chứa từ 38-40% protein. Hơn nữa đậu tƣơng
còn chứa đầy đủ và cân đối những axit amin cần thiết (trong đó có những axit
amin không thay thế nhƣ lyzin, tryptophan) và nhiều loại vitamin B1, B2, A,
C, D, E, K. Trong đậu tƣơng cũng chứa 12-25% lipit, 10-15% gluxit, các
muối khoáng Ca, Mg, Fe, P, K, Na, S; các enzym, sáp, nhựa, có giá trị dinh
dƣỡng cao, có tác dụng tốt với sức khỏe con ngƣời.
Đậu tƣơng là loài cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, khó có thể
tìm thấy loại cây nào có tác dụng nhiều mặt nhƣ cây đậu tƣơng. Sản phẩm của
nó làm thực phẩm cho con ngƣời, thức ăn gia súc, nguyên liệu cho các ngành
sản xuất công nghiệp nhất là công nghiệp thực phẩm. Hạt đậu tƣơng là sự kết
hợp độc đáo các đặc tính làm cho chúng trở thành loại thực phẩm đa năng
nhất trong các loại thực phẩm. Sản phẩm hạt đậu tƣơng đƣợc sử dụng trực
tiếp dạng hạt thô hay dùng để chế biến các sản phẩm khác nhƣ: sữa đậu nành,
bánh kẹo, đậu phụ. Ngoài ra đậu tƣơng còn đƣợc dùng trong sản xuất dƣợc
liệu với nhiều vị thuốc có giá trị ở nƣớc ta.
Cùng với sự ấm dần lên của Trái Đất, cây trồng cũng phải thích nghi với
điều kiện môi trƣờng. Cây trồng có sức chống chịu tốt mới có thể tồn tại và
nâng cao năng suất. Để nâng cao năng suất của cây đậu tƣơng một trong các
biện pháp là làm tăng khả năng chống chịu của chúng với điều kiện ngoại
cảnh bằng cách cải tiến kĩ thuật, chọn giống mới hoặc lựa chọn những nơi có

điều kiện ngoại cảnh thích hợp.
Ở nƣớc ta diện tích đất mặn tƣơng đối lớn, xấp xỉ 2 triệu hecta, chiếm
gần 6% tổng diện tích đất tự nhiên. Mặn ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và
phát triển của cây trồng. Mặn ảnh hƣởng đến một số nhân tố hạn chế sinh

1


trƣởng nhƣ: nƣớc , cytokinin, phosphate…, ảnh hƣởng đến sự vận chuyển vật
chất trong cây.
Vì vậy, nghiên cứu ảnh hƣởng của muối đối với thực vật để tìm ra loại
cây trồng phù hợp cho vùng đất nhiễm mặn là một yêu cầu cấp thiết. Những
nghiên cứu về khả năng chịu mặn đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế
giới với nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có đậu tƣơng.
Ngày nay, các nghiên cứu về khả năng chịu mặn của cây trồng nói
chung, của đậu tƣơng nói riêng ngày càng đƣợc mở rộng vì tính ứng dụng cao
của cây trồng họ Đậu. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật các nhà
khoa học có điều kiện để tìm hiểu về cơ chế sinh lý, sinh hóa chịu mặn ở thực
vật nhƣ: Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã[16], Trần Thị Phƣơng
Liên, Nông Văn Hải[10]; Bates L.S. (1973)[19]; Naylor A.W(1996)[21];
Gerelet J và cộng sự (2005)[26] …, nghiên cứu về tình hình chịu hạn, chịu
mặn và chịu lạnh ở lúa, lúa mì, đậu tƣơng và thực vật nói chung.
Nghiên cứu sự biến động của các enzym chống oxi hóa trong mầm đậu
tƣơng khi nhiễm mặn để thấy đƣợc sự hoạt động và vai trò của chúng đối với
quá trình nảy mầm của hạt đậu tƣơng dƣới điều kiện stress.
Hiện nay, ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới đã có những nghiên cứu
về enzym chống oxi hóa, tuy nhiên chƣa có các công trình nghiên cứu về
động thái hoạt độ của chúng ở 2 pha gây mặn và phục hồi đối với đậu tƣơng,
nhất là đối với giống DT 84; một giống có tiềm năng năng suất cao đang đƣợc
gieo trồng rộng rãi ở nƣớc ta.

Cây ở những giai đoạn khác nhau cũng có những phản ứng khác nhau
với nồng độ muối, đặc biệt giai đoạn nảy mầm rất mẫn cảm với nồng độ
muối. Giai đoạn nảy mầm là thời điểm quan trọng trong chu trình sống của
thực vật nói chung và của đậu tƣơng nói riêng. Những biến đổi của giai đoạn
này sẽ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây về sau. Xuất phát
từ các nội dung nêu trên, chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Sự biến động hoạt độ
catalaza, peroxidaza ở mầm đậu tương DT84 trong pha gây m ặn và pha
phục hồi sau nhiễm mặn”.
2


2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu sự biến động hoạt độ catalaza và peroxidaza ở mầm đậu
tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Động thái hoạt độ enzym catalaza, peroxidaza trong 2 pha sinh trƣởng
của đậu tƣơng (pha gây mặn và pha phục hồi ).
- Xác định một số chỉ tiêu sinh trƣởng nhƣ: tỷ lệ nảy mầm, chiều dài mầm
ở pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng: Giống đậu tƣơng DT84
Phạm vi nghiên cứu: giai đoạn nảy mầm của đậu tƣơng.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Bổ sung nguồn tƣ liệu về ảnh hƣởng của muối tới quá trình nảy mầm
đậu tƣơng và vai trò của enzym chống oxy hóa trong quá trình này.
- Kết quả nghiên cứu đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm các thông tin, các dữ
liệu khoa học làm tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa
học.

3

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sự nảy mầm và đặc điểm sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng.
Nảy mầm là giai đoạn quan trọng trong chu trình sinh trƣởng và phát
triển của thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng. Giai đoạn nảy mầm diễn
ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa nên ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng
của cây sau này.
Khả năng nảy mầm của hạt giống là một trong những chỉ tiêu quan
trọng để đánh giá tiêu chuẩn một giống tốt. Giống có sức nảy mầm khỏe , tỷ
kệ nảy mầm cao, tập trung là giống tốt. Đối với các loại cây trồng nói chung
và cây đậu tƣơng nói riêng, nảy mầm là giai đoạn khởi đầu của quá trình sinh
trƣởng. Thời kì mọc mầm đƣợc tính từ khi gieo hạt đến khi xuất hiện mầm
trên mặt đất.
Tỷ lệ mọc mầm cao hay thấp, thời gian mọc mầm nhanh hay chậm đều
liên quan tới tốc độ sinh trƣởng của giống và sự đồng đều của các giống cây
trong quần thể. Giai đoạn nảy mầm của cây đậu tƣơng thƣờng kéo dài 5-7
ngày, thời gian nảy mầm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng
nhất là nhiệt độ và độ ẩm. Nhiêt độ thích hợp để đậu tƣơng nảy mầm là 26280C, trên 300C hạt nảy mầm nhanh nhƣng mầm yếu. Phạm vi nhiệt độ tối
thiểu và tối đa thời kì mọc mầm là 100C-400C. Trên 400C hạt không nảy mầm
đƣợc và dƣới 100C sự vƣơn dài của trục dƣới lá mầm bị ảnh hƣởng đáng kể.
Điều kiện nhệt độ cao có thể rút ngắn quá trình sinh trƣởng sinh dƣỡng (Ball
RA và các cs 2000 [18], Board J.E và cs, 1996 [22]). Độ ẩm không khí
khoảng 81-85%.
Đậu tƣơng thuộc cây hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các đặc
trƣng của cây hai lá mầm, cũng gồm các pha nhƣ sự nảy mầm của cây hai lá

4

mầm, đó là: pha trƣơng hạt, pha hình thành và hoạt hóa enzim, pha tích lũy
chất dinh dƣỡng, pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ
đặc biệt cho cơ thể.
Sự nảy mầm của đậu tƣơng cũng bắt đầu bằng sự hấp thụ nƣớc nhờ cơ
chế hút nƣớc của hạt làm hạt trƣơng lên, rễ mọc ra, thân vƣơn lên đội hai lá
mầm lên khỏi mặt đất, lá mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân
chính.
Trong giai đoạn này, cây non sống chủ yếu vào nguồn chất dinh dƣỡng
dự trữ ở trong hai lá mầm, đến khi hết chất dinh dƣỡng các lá mầm này
chuyển sang màu vàng rồi rụng và đồng thời cũng là lúc mà bộ rễ phát triển
đủ để có khả năng hút nƣớc và các chất dinh dƣỡng từ trong đất lên để nuôi
cây.
Giai đoạn này dài hay ngắn tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Nếu gieo
vào vụ hè, giai đoạn này ngắn hơn vụ đông. Thông thƣờng thời gian này
khoảng 15-20 ngày sau khi gieo. Thời kì này sẽ quyết định mật độ cây non
cũng nhƣ sức sinh trƣởng của cây đậu tƣơng sau này.
1.2.Tác hại của mặn đối với thực vật.
Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng muối cao, đặc biệt là NaCl, điều đó
đã hạn chế khả năng hút nƣớc và chất dinh dƣỡng của cây. Đất bị nhiễm mặn
sẽ gây nên hai tác hại đối với thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng.
Tác hại thứ nhất, mặn gây ra hiện tƣợng hạn sinh lý. Đất nhiễm mặn
chứa hàm lƣợng muối cao nên áp suất thẩm thấu môi trƣờng lớn. Nếu áp suất
thẩm thấu nội bào không thắng nổi áp suất môi trƣờng thì cây sẽ bị khô héo
do nƣớc từ trong tế bào ra ngoài. Thiếu nƣớc nhẹ làm giảm tốc độ sinh
trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo chất nguyên sinh
làm tăng quá trình già hóa tế bào. Khi bị khô kiệt nƣớc nguyên sinh chất bị
đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thƣơng và chết.

5

Tác hại thứ hai liên quan đến tính gây độc của các ion đối với thực vật.
Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng cao các ion đặc biệt là Na + và Cl-, ngoài ra
còn có các ion khác: SO 42-, HCO3-, Li+…hàm lƣợng cao các ion này đều gây
hại cho sự sinh trƣởng và phát triển ở thực vật.
Khi cây hút các ion độc vào trong tế bào sẽ gây rối loạn trao đổi chất của
tế bào. Các ion độc sẽ ức chế hoạt động các enzym, dẫn đến làm rối loạn hoạt
động trao đổi chất-năng lƣợng, các hoạt động sinh lý bình thƣờng của tế bào.
Các chất độc còn ảnh hƣởng theo chiều hƣớng bất lợi đến nguyên sinh chất
nhƣ làm giảm độ nhớt, tính thấm của nguyên sinh chất tăng mạnh nhất là tăng
ngoại thẩm làm cho tế bào mất chất dinh dƣỡng. Các hoạt động sinh lý của tế
bào cũng bị ảnh hƣởng: qúa trình quang hợp giảm mạnh do lá kém phát triển,
sắc tố ít do các chất độc ức chế quá trình tổng hợp sắc tố, các quá trình xảy ra
trong quang hợp bị giảm sút do ảnh hƣởng của chất độc và thiếu nƣớc. Qúa
trình hô hấp lúc đầu tăng mạnh, các cơ chất bị phân hủy mạnh nhƣng hiệu quả
năng lƣợng thấp, phần lớn năng lƣợng của các quá trình phân hủy đều thải ra
dƣới dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu ATP. Qúa trình phân hủy mạnh, tổng
hợp lại yếu nên không đủ bù lƣợng vật chất do phân hủy, chất dự trữ dần hao
hụt, cây không sinh trƣởng đƣợc dẫn đến còi cọc, năng suất thấp. Nếu cây bị
mặn nặng hoặc mặn kéo dài sẽ dẫn đến chết.
Về khả năng chịu mặn của thực vật trƣớc hết phải nói đến cơ chế tích
lũy và duy trì nồng độ cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sự
cạnh tranh nƣớc với môi trƣờng nhiễm muối và chống lại hiện tƣợng hạn sinh
lý. Hàm lƣợng NaCl cao trong đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống
thƣờng xuyên trên đất phải có khả năng thu nhận và tích trữ Na +, Cl- cao hơn
nhiều, đồng thời phải có những thay đổi về hoạt động sinh lý nhƣ: hô hấp,
quang hợp, thoát hơi nƣớc của lá để phù hợp với điều kiện thiếu nƣớc của
cây. Đồng thời với quá trình biến đổi sinh lý, cây cũng có những biến đổi sinh
hóa cụ thể nhƣ khi gặp môi trƣờng mặn, trong cây lập tức tổng hợp các chất

6


hữu cơ để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu của chính mình. Các chất tích lũy
chủ yếu là các axit hữu cơ, axit amin, các đƣờng. Ngoài ra, các hợp chất
proline, betaine, putressin cũng đƣợc hình thành khi bị mặn.
1.3. Vai trò của catalaza và peroxidaza trong chống chịu stress ở thực vật.
1.3.1. Vai trò của enzym catalaza
Catalaza là enzym chủ yếu loại bỏ H2O2 đƣợc tạo ra nhiều trong
peroxisom bởi quá trình quang hô hấp. Hoạt động của enzym này giảm xuống
khi bị ức chế, chẳng hạn khi nồng độ CO 2 cao.
Catalaza thực vật đƣợc mã hóa bởi một họ gen nhỏ, thƣờng gồm 3 gen
isozym, có mô hình biểu hiện rất khác nhau về không gian cũng nhƣ thời gian
trong suốt đời sống của thực vật. Khi thực vật bị stress nƣớc, ở mức độ nội
bào sẽ tạo ra oxi gây hại chẳng hạn nhƣ gốc supeoxit (O 2.-), H2O2 và gốc .OH
tự do, đây là nguyên nhân gây hƣ hại cho màng sinh chất. Và một trong
những cơ chế giải độc của thực vật đó là hệ thống enzym chống oxi hóa:
superoxit dismustaza chuyển gốc supeoxit thành O 2 và H2O2, sau đó H2O2
đƣợc giải độc nhờ enzym catalaza và ascorbat peroxidaza.
CAT đƣợc tìm thấy trong peroxisome, bào tƣơng và ty thể, kết hợp hoạt
động của catalaza và superoxide dismutaza là rất quan trọng trong giảm nhẹ
tác động của stress oxy hóa.
1.3.2. Vai trò của enzym peroxidaza
Peroxidaza có rất nhiều dạng trong thực vật. Khi cây bị stress thì hoạt độ
peroxidaza tăng lên. Peroxidaza đƣợc coi nhƣ một thông số sàng lọc với các
stress sinh lý khác nhau. Hoạt động của enzym này tăng khi cây bị cảm ứng
với lạnh, hạn, muối và thiếu oxi. Hoạt động của enzym này cũng đƣợc dùng
nhƣ là chỉ thị cho các kiểu ô nhiễm khác nhau.

7

1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của catalaza và peroxidaza đối với
thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng.
1.4.1. Trên thế giới.
Nghiên cứu về tính chịu mặn của thực vật có ý nghĩa không những về
mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn bởi lẽ nƣớc biển và đại dƣơng
chứa 3-4% muối. Biển và đại dƣơng chiếm khoảng 75% bề mặt hành tinh
chúng ta, 25% mặt đất bị nhiễm mặn, còn 1/3 đất canh tác đƣợc tƣới nƣớc
trên toàn thế giới tích tụ muối do kém tiêu nƣớc. Ảnh hƣởng độc hại của nồng
độ cao các muối có thể xuất hiện kể cả khi bón phân với liều lƣợng cao. Vì
vậy, nghiên cứu ảnh hƣởng của muối đối với thực vật để tìm ra loại cây trồng
phù hợp cho vùng đất nhiễm mặn là một yêu cầu cấp thiết. Những nghiên cứu
về khả năng chịu mặn đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới với nhiều
loại cây trồng khác nhau trong đó có đậu tƣơng.
Những nghiên cứu về tác động của muối lên sự sinh trƣởng và phát triển
của cây trồng nhƣ lúa mạch, tế bào cam nuôi cấy, về trao đổi ion ở lúa cho
thấy cây trồng có khả năng thích ứng trong một giới hạn nhất định với các tác
động của muối trong môi trƣờng đất, nƣớc. Tuy nhiên mức độ đó phụ thuộc
vào loại cây trồng nghiên cứu.
Trên thế giới đã có khá nhiều những nghiên cứu về hoạt tính catalaza và
peroxidaza ở thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng nhƣ:
Chkhubianishvili và cs, nghiên cứu hoạt tính peroxidaza, catalaza và hàm
lƣợng protein tổng số trong lá một số cây thân thảo vùng núi cao
Caucasus[24]; Almeselmani và cs đã nghiên cứu vai trò bảo vệ của các enzym
chống oxy hóa dƣới stress nhiệt độ cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ
catalaza (CAT), superoxide dismutaza (SOD), ascorbate peroxidaza (APX)
tăng dƣới stress nhiệt độ cao, tuy nhiên glutathione reductase (GR) và
peroxidaza (POD) hoạt động giảm so với cây trồng bình thƣờng [27];
Poodeetip và cs, hydrogen peroxide và hoạt độ peroxidaza nhƣ chỉ thị tiềm

8


năng về khả năng thích ứng của cây trong điều kiện stress mặn[29]; ( Glycine
max L.), những thay đổi trong các enzym chống oxy hóa và khả năng chống
chịu stress mặn và kẽm ứng dụng trong đậu tƣơng; Çelik và cs, nghiên cứu về
ảnh hƣởng của từ trƣờng đến hoạt độ của superoxide dismutaza và catalaza
trong Glycine max (L.) Merr [23] …
Nhiều nghiên cứu đã gợi ý rằng SOD, POD, và CAT tăng lên đáng kể ở
một số thực vật khi chịu mặn (Gao et al.,2008[25]; Azooz et al., 2009[17] ).
Những phát hiện này gợi ý rằng một hệ thống enzym chống oxy hóa hiệu quả
trong các loài thực vật đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiệt hại
oxy hóa do căng thẳng muối.
Báo cáo trƣớc đó cho rằng cây bảo vệ khỏi bị hƣ hại oxy hóa do muối
căng thẳng bằng cách tăng SOD, POD và CAT ở Jatropha curcas, ngô và các
loài thực vật khác (Parvaiz và Satyawati, 2008[28]; Gao et al, 2008. Azooz et
al., 2009)[31]. Những kết quả này gợi ý rằng stress muối có thể dẫn đến thay
đổi đáng kể trong SOD, POD và CAT các hoạt động tham gia vào quá trình
loại bỏ ROS[31].
1.4.2. Ở Việt Nam
Các nghiên cứu về đậu tƣơng trong những năm qua chủ yếu đi sâu về
phƣơng diện hình thái, di truyền, chọn giống, sinh học phân tử, một số nghiên
cứu về sinh lý học, khả năng cộng sinh cố định đạm của một số dòng vi khuẩn
ở đậu tƣơng. Những năm gần đây nhờ sự trợ giúp của các thiết bị hiện đại,
nhiều nghiên cứu sâu hơn về tính chịu mặn đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu
tính chống chịu của cây trồng ở Việt Nam đƣợc tiến hành sâu rộng ở các đối
tƣợng lúa, đậu tƣơng, lạc, thuốc lá, nhãn…trong đó đậu tƣơng là cây trồng
đƣợc chú trọng khá nhiều. Chẳng hạn nhƣ nghiên cứu đặc điểm di truyền và
khả năng chịu hạn ở đậu tƣơng ( Nguyễn Huy Hoàng) [5], nghiên cứu mối
quan hệ giữa tính chịu hạn với thành phần điện di của protein đậu tƣơng (Trần

Thị Phƣơng Liên, Nông Văn Hải)[10], sự biến đổi hoạt độ enzym protein,
9


amilaza và hàm lƣợng prolin của đậu tƣơng khi gặp hạn ở thời kì ra hoa (
Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã)[16], khả năng chịu hạn của một
số giống đậu tƣơng (Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Văn Đính, Nguyễn Thị Thùy
Dƣơng, Nguyễn Thị Hồng Thắm (1999)[12]…Các kết quả nghiên cứu đã
đƣợc ứng dụng trong sản xuất và chọn tạo đƣợc nhiều giống cây trồng mới có
năng suất cao, phẩm chất tốt phù hợp với điều kiện khí hậu và canh tác ở Việt
Nam.
Đã có những nghiên cứu về sự biến đổi hàm lƣợng catalaza và
peroxidaza ở lá muồng trâu, cây nha đam, cây chè xanh, cây cà chua,
lúa…[4], [6], [7], [8], [9], [13], Ngô Thành Trí và cs nghiên cứu về diễn biến
hoạt tính của catalaza và peroxidaza trong kích thích kháng bệnh lƣu dẫn của
clorua đồng, acibenzolar-s-metyl và nấm colletotrichumsp đối với bệnh đạo
ôn lúa (Pyriculariagrisen)[15].
Theo nghiên cứu của Võ Minh Thứ (1999), về khả năng chịu mặn của
cây lúa cho thấy những giống lúa chịu mặn khi bị xử lí NaCl hoặc KClO 3 thì
có hiện tƣợng gia tăng nhiều chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh: khả năng hút nƣớc,
hàm lƣợng nƣớc, hàm lƣợng nito, axit hữu cơ, diệp lục, hoạt tính catalaza,
peroxidaza, amilaza.
Ở đậu tƣơng cũng đã có một số nghiên cứu về 2 enzym này nhƣ: Nguyễn
Văn Mã[11], Phạm Thị Trân Châu[1], Mai Văn Chung và cs nghiên cứu về
phản ứng siêu nhạy cảm ở rễ cây đậu tƣơng Nam Đàn đối với chì[3] và về các
gốc oxy tự do trong phản ứng bảo vệ của cây đậu đối với rệp hại [2]; Vũ
Thanh Trà, nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tƣơng có
khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau[14].

10

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Giống đậu tƣơng DT 84, là giống đậu tƣơng đƣợc chọn tạo bằng phƣơng
pháp xử lý đột biến dòng 8-33 (DT80 x ĐH4) bằng tia Gamacol 18Kr, áp
dụng chọn lọc 3 hoặc 1 hạt đến M8 thì chọn đƣợc DT 84 ổn định. Đây là
giống ngắn ngày, thích ứng rộng có nhiều tiềm năng.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa
học và Chuyển giao công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật - Trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, tiến hành gieo hạt trong dung dịch
muối theo phƣơng pháp của Volcova có cải tiến.
Chọn hạt giống đều, chắc, không bị sâu bệnh. Khử trùng khay bình,
dụng cụ… bằng cồn. Giâý lọc đƣợc sấy ở 1300 trong vòng 1 giờ, hạt đƣợc
khử trùng bằng dung dịch KMnO 4 5% trong 5 phút.
Dung dịch NaCl chọn 3 nồng độ để đạt tỷ lệ nảy mầm 60-70%
Khay cho hạt nảy mầm, giấy thấm, nƣớc cất…
Hạt giống có khả năng nảy mầm cao.
Cách tiến hành:
Chọn hạt khỏe cho vào túi vải màn rồi xử lý bằng dung dịch KMnO 4 5%
trong 5 phút làm khô nhẹ rồi đặt vào khay. Trƣớc đó khay đƣợc khử trùng
bằng cách sấy khô 1050 trong vòng 1 giờ cùng với giấy thấm.
Gieo trên khay có giấy thấm, chia thành 2 phần:
Phần 1: Lô đối chứng cho hạt nảy mầm trong nƣớc cất.
Phần 2: Lô thí nghiệm cho hạt nảy mầm trong dung dịch muối với các
nồng độ 0,4; 0,6; 0,8 (%) và đặt tên tƣơng ứng là các mẫu thí nghiệm M0,4;
M0,6; M0,8. Chúng tôi tiến hành chọn 3 nồng độ muối này để nghiên cứu là

11


do chúng nằm trong khoảng nảy mầm tƣơng đối tốt ( khoảng 60-70%). Đồng
thời ở các nồng độ này thấy rõ ảnh hƣởng của mặn đến các chỉ tiêu cần
nghiên cứu.
Hạt nảy mầm trong dung dịch muối NaCl và trong nƣớc cất phải thƣờng
xuyên bổ sung lƣợng nƣớc hoặc lƣợng dung dịch muối với các nồng độ tƣơng
ứng ở các lô nhƣ nhau.
Đƣa các khay có hạt vào buồng sinh trƣởng ở nhiệt độ 26-280C.
Đo kết quả từ ngày thứ 2 sau gieo, mỗi ngày đo 1 lần, liên tiếp trong 3
ngày. Chú ý đo vào một thời điểm nhất định. Quy ƣớc 3 ngày đo trong pha
gây mặn lần lƣợt là: GM1, GM2, GM3. Sau đó lô TN rửa bằng nƣớc cất rồi
đƣa vào nảy mầm trong nƣớc cất và đo các chỉ tiêu đó trong 3 ngày liền. Quy
ƣớc 3 ngày đo trong pha phục hồi là: PH1, PH2, PH3.
2.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.2.2.1. Xác định tỷ lệ nảy mầm
Tỷ lệ nảy mầm đƣợc xác định theo phƣơng pháp volcova(1984)[30].
Đếm số hạt nảy mầm trong các mẫu từ khi hạt đầu tiên nảy mầm cho đến khi
không còn có thêm hạt nào nảy mầm mới. Những hạt nảy mầm là những hạt
có chiều dài rễ mầm đạt 3mm trở lên.
Tỷ lệ nảy mầm (N) trong dung dịch muối NaCl đƣợc tính theo công
thức:

a
N= .100%
b
Trong đó:
N: Tỷ lệ nảy mầm của hạt
a: Số hạt nảy mầm trong lô thí nghiệm

b: Số hạt nảy mầm trong lô đối chứng

12


2.2.2.2. Xác định chỉ tiêu sinh trƣởng của mầm
Chiều dài mầm (mm): Sử dụng thƣớc đo chia đơn vị đến mm để đo chiều
dài mầm vào 2 ngày cuối của pha gây mặn và pha phục hồi.
2.2.2.3. Xác định hoạt độ emzym catalaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ
(theo Nguyễn Quang Vinh và cộng sự)[11].
* Nguyên tắc thí nghiệm:
Catalaza xúc tác cho phản ứng:
Catalaza
2H2O2

O2 + 2H2O

Để định lƣợng catalaza có thể dùng KMnO 4 0,1N để xác định lƣợng H2O2
trƣớc và sau khi enzym tác dụng, từ đó tính lƣợng H2O2 bị chuyển hóa.
5H2O2 + 2KMnO4

3H2SO4, 8H2O

2MnSO4 + K2SO4 + 5O2

* Cách tiến hành:
a, Pha hóa chất
-Đệm photphat 50mM (pH7,0); (a) hòa tan 6,81g KH2PHO4 trong
1000ml nƣớc cất; (b) hòa tan 11,41g K2HPO4.3H2O trong 1000ml nƣớc cất;
trộn dung dịch a với b cho đến khi đạt pH 7,0.

-KMnO4 0,1N, H2SO4 10%, H2O2 0,1% trong đệm photphat 50mM (pH 7).
b, Quy trình
-Cân 200mg mầm, nghiền trong 10ml đệm photphat (pH 7,0) 50mM, sau
đó ly tâm lạnh ở 17000g/15 phút/20C.
-Lấy 2 bình nón dung tích 100ml:
Bình thí nghiệm:
Dung dịch H2O2 0,1%: 10ml
Dịch chiết enzym: 10ml
Giữ ở 300C trong 30 phút
Axit H2SO4 10%: 5ml
Chuẩn độ H2O2 dƣ thừa bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền.
13


Bình đối chứng:
Dịch chiết enzym: 10ml
Đun sôi cách thủy trong 5 phút để biến tính enzym, lấy ra để nguội.
Dung dịch H2O2 0,1%: 10ml
Giữ ở 300C trong 30 phút
Axit H2SO4 10%: 5ml
Chuẩn độ H2O2 dƣ thừa bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền.
* Tính hoạt độ enzym:
-Tính số mg H2O2 bị phân giải dƣới tác dụng của enzym có trong a (g) mẫu:
X=
Trong đó, A: số ml KMnO 4 0,1N dùng chuẩn độ H2O2 dƣ thừa trong bình đối
chứng
B: số ml KMnO4 0,1N dùng chuẩn độ H2O2 dƣ thừa trong bình thí
nghiệm
V1: số ml dịch chiết enzym từ mẫu (10ml)
V2: số ml dịch chiết enzym dùng cho phản ứng (5ml)

a: khối lƣợng (g) mẫu (200mg = 0,2g)
Số đơn vị catalaza trong 1g mẫu (số µmol H2O2 bị phân giải trong 1 phút):
C(U/mg) =
Trong đó, 30: thời gian enzym tác dụng; 0,034:1 µmol đƣơng lƣợng H2O2
2.2.2.4. Xác định hoạt độ enzym peroxidaza bằng phƣơng pháp so màu
dùng pyrogallol làm cơ chất[20].
* Hóa chất.
-NaOH, H2O2, KH2PO4, pyrogallol.

14


* Pha hóa chất.
-NaOH 2M: Cân 8g NaOH pha với 90ml nƣớc sau đó dâng nƣớc đến
vạch 100ml (bảo quản ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 tháng).
-Đệm photphat (pH=6) 0,1M: Hòa 6,8g KH2PO4 vào 450ml nƣớc cất,
sau đó thêm NaOH 2M để đạt pH=6 rồi dâng nƣớc đến vạch 500ml.
-H2O2: Pha 0,66ml H2O2 30% với 5ml nƣớc cất (chuẩn bị mới mỗi
ngày, cho vào bình tối).
-Pyrogallol 5,33%: Hòa 1,333g pyrogallol trong 20ml nƣớc cất, sau đó
dâng lên vạch 25ml (bảo quản lạnh trong lọ tối và pha mới mỗi ngày).
* Cách tiến hành
Nghiền mẫu với đệm pH 6 theo tỷ lệ 1 phần mẫu:5 phần đệm. Ly tâm
dịch nghiền 10000 vòng ở 00C trong 15 phút.
Tách lấy dịch chiết đo quang phổ ở bƣớc sóng 420nm.
Thành phần các chất ở blank và ống thí nghiệm.
Blank

TN

Đệm pH6 0,1M

2,5ml

2,4ml

Pyrogallol 5,33%

0,3ml

0,3ml

H2O2

0,2ml

0,2ml

Dịch chiết enzym

0ml

0,1ml

Tổng

3ml

3ml

Đo kinetis ở bƣớc sóng 420nm trong khoảng 3 phút, 20s nghi lại 1 lần để
tính toán.
* Tính hoạt độ enzym
U/ml=X =ΔE420/20s x 2,5 x df
U/mg = X/mg mẫu.

15

5
df=
= 50
0,1


2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu.
Kết quả thí nghiệm đƣợc tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft
Excel 2003 theo các tham số : giá trị trung bình ( ), sai số trung bình (m), sai
số của hiệu các trung bình số học (md), độ chính xác của thí nghiệm (m%), độ
tin cậy của hai số trung bình (td) đƣợc tính theo các công thức sau :

=

m% =

md =

m=

td =

Trong đó: Xi: là giá trị đo đƣợc qua mỗi lần đo
N: là số lần nhắc lại

(trong đó

: trung bình thí nghiệm,

mẫu đối chứng, m2: sai số mẫu thí nghiệm).

16

: trung bình đối chứng, m1: sai số