Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 21 123

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
•

•

•

•

NGUYỄN THỊ HẢI VÂN

GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u LÊN MEN SINH TồNG HỢP
KHÁNG SINH TỪ CHỦNG STREPTOMYCES 21.123
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC SỸ KHOÁ 2002-2007)

Ngưă hướng dẫn : PGS-TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện

: Bộ môn Vi sinh-Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội

Thời gian thực hiệm 02-05/2007

HÀ NỘI, THÁNG 05/2007

SSI


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến thầy giáo POS­

TS Cao Văn Thu đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khoá
luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên tại
Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Vi sinh- Sinh học và Phòng thí nghiệm
trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm
thực nghiệm.
Cũng nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng các
thầy giáo, cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Tôi xin cảm fn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và ủng hộ tôi trong quá
0

trình học tập và thực hiện khoá luận tốt nghiệp.
Vứi điều kiện và thcú gian tiến hành thực nghiệm còn nhiều hạn chế,
chắc chắn khoá luận này còn nhiều thiếu sót. Tôi mong nhận được đóng
góp ý kiến của các thầy cô và bạn bè để khoá luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2007
Sinh viên
NGUYỄN THI HẢI VÂN


MỤC LỤC
Trang
ĐẠT VAN ĐE
PHAN I: TONG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh

1

2

2

1.1.1. Định nghĩa kháng sinh

2

1.1.2. Phân loại kháng sinh

2

1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh

2

1.1.4. Nguyên tắc sử dụng kháng sinh

3

1.1.5. ứ ig dụng của kháng sinh

3

1.2. Đại cương về xạ khuẩn
1

.2. . Lớp xạ khuẩn ( Actinomycetes )
1

1.2.2. Đặc điểm xạ khuẳn chi Streptomyces
l.S.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phưoíig pháp chọn lọc
ngẫu nhiên
1.3.2. Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn
1,4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.4.1. Giống v s v
1.4.2. Lẽn men
1.5. Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1. Chiết xuất

4
4
5
6

6

6

7
8

8

8

9
9

1.5.2. Tách sản phẩm

1 0

1.5.3. Tinh chế

1 0

1.6. Quang phổ hồng ngoại (IR)

1 1

1.7. Một số nghiên cứu mới về công nghệ sinh học

1 1


1.7.1. ốn định Penicillin G acyclase tự nhiên bằng các dung
dịch ion
1.7.2. Sự biến đổi sinh học được cải thiện 15- Pluoro- deoxyerythronolid B thành 15- Pluoro- erythromycin A do sự biểu
hiện quá mức của gen eryK trong Saccharopolyspora erythraea.

1 1

6

PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm

1 2

14
14

2.1.1. Nguyên vật liệu

14

2.1.2. Các phương pháp thưc nghiêm

17

2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét

2

2

2.2.1. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên

23

2.2.2. Kết quả đột biến cải tạo giống

24

2.2.3. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh

28

2.2.4. Kết quả chiết xuất kháng sinh

30
30

2.2.5. Hoạt tính KS của Streptomyces 21.123 trên một số chủng
VK kiểm định
2.2.6. Kết quả sắc ký lớp mỏng

31

2.2.7. Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh thô

32

2.2.8. Kết quả sắc ký cột

33

2.2.9. Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh tinh chế

35

2.2.10. Sự tương quan giữa nồng độ kháng sinh và đường kính
vòng vô khuẩn
2.2.11. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại

37
39

PHAN 3: KET LUẠN VA ĐE XUAT

40

3.1. Kết luận

40

3.2. Đề xuất

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

42


CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

E. coli

Escherichia coli ACTC 25922

B. cereus

Bacilus cereus A T ^ 9946

B. pumilus

Bacilus pumilus AT^C 10241

B. subtilis

Bacilus subtilis ATạC 6633

P. aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa

P. mirabilis

Proteus mirabilis BV 108

S. typhi

Salmonella typhi D/T 220

S. lutea

Sarcina lutea A T Ì^ 9341

S. flex

Shigella flexneri DT 112

S. aureus

Staphylococcus aureus A T ^ 1128

Gr(-)

Gram âm

Gr(+)

Gram dương

KS

Kháng sinh

MT

Môi trường

MTdd

Môi trường dung dịch

SK

Sắc ký

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

VSV

Vi sinh vật

VK

Vi khuẩn


ĐẶT VẤN ĐỂ
Hiện nay trên thế giói đã phát hiện được hơn 10.000 chất kháng sinh,
trong đó hơn

1 0 0

chất đã được nghiên cứu sâu và đưa vào áp dụng trong lĩnh

vực Y học và một số lĩnh vực khác. Việc tìm ra và ứng dụng một chất kháng
sinh mới là hết sức khó khăn, trong khi đó kháng sinh có một tầm quan trọng
hàng đầu không thể thay thế được để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, ung thư
và ngày càng có nhiều v s v gây bệnh kháng lại thuốc kháng sinh. Vì vậy, việc

nghiên cứu phát minh các chất kháng sinh mới luôn là vấn đề thời sự hấp dẫn
các nhà kinh tế, các nhà nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau: v s v học,
Hoá sinh học, Dược lý học,...
Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên hoặc được tổng hợp và bán tổng
hợp. Trong tổng số các kháng sinh đã phát hiện được có đến hơn 60% là do
v s v sinh tổng hợp và đặc biệt là chi Streptomyces thuộc lớp Xạ khuẩn. Tại
Việt Nam đã có nhiều đề tài tiến hành phân lập các chủng Streptomyces nhằm
tìm kiếm những kháng sinh mói, cải tạo nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp
kháng sinh, và nghiên cứu phát triển để đưa vào ứng dụng trong điều trị và sản
xuất quy mô công nghiệp.
Từ cơ sở trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Góp phần
nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 21.123 ”
với những mục tiêu sau:
- Tiến hành nghiên cứu cải tạo giống trong quy mô phòng thí nghiệm
để nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Tiến hành lên men sinh tổng hợp, chiết xuất và tinh chế kháng sinh
do Streptomyces 21.123 tạo ra.
- Sơ bộ xác định một số nhóm chức trong cấu trúc phân tử kháng sinh
do Streptomyces 21.123 sinh tổng hợp.


PHẦN I
TỔNG QUAN
1.1.

ĐẠI CƯƠNG VỂ KHÁNG SINH

1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [5], [14]
Theo định nghĩa kinh điển của Waksman (1942): Kháng sinh là những
sản phẩm trao đổi chất tự nhiên, được các v s v tạo ra, có tác dụng ức chế phát

triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các v s v khác.
Hiện nay các nhà nghiên cứu cho rằng: Kháng sinh là những sản phẩm
đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác, có hoạt tính
sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một
nhóm vi sinh vật xác định( vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật,...) hay tế
bào ung thư ở nồng độ thấp.
1.1.2. Phân loại kháng sinh [5]
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: Phân loại theo nguồn gốc, theo cấu
tạo hoá học, theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng,...
Phân loại theo cấu trúc hoá học:
- Nhóm có cấu trúc ß- lactam( Penicillin, Cephalosporin)
- Nhóm có chứa nhân thơm( Cloramphenicol)
- Nhóm có cấu trúc Aminoglycosid ( Streptomycin, Gentamycin)
- Nhóm có cấu trúc 4 vòng ( các Tetracyclin)
- Nhóm Polypeptid ( E^myxin, Bacitracin)
- Nhóm Macrolid ( Erythomycin, Spiramycin)
- Nhóm Polyen ( Nystatin, Amphotericin B)
- Nhóm Anthracyclin chống ung thư ( Daunorubicin)
- Nhóm Actinomycin chống ung thư ( Dactinomycin D)
1.1.3. Cơ ché tác dụng của kháng sỉnh [14]
- ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn


- úc chế tổng hợp protein của vi khuẩn
- ức chế tổng hợp acid nucleic
- Thay đổi tính thấm của màng
- Úc chế tổng hợp acid folic
- Úc chế trao đổi chất hô hấp
1.1.4. Nguyên tắc sử dụng kháng sinh [5]
- Phân lập chủng VSV gây bệnh và thử độ nhạy của chúng vói các

kháng sinh( lập kháng sinh đồ) bằng phuofng pháp khoanh giấy lọc, v.v...
- Chọn kháng sinh có hoạt tính mạnh nhất.
- Quyết định liểu dùng, cách đưa kháng sinh vào cơ thể và điều trị một
cách hợp lý.
- Phối hợp kháng sinh vói các chế phẩm khác( coiticoid, enzym) làm
tăng tác dụng và giảm phản ứng phụ.
1.1.5. ứng dụng của kháng sinh [1], [5], [12], [14]
• Trong lĩnh vực y học:
Trong lĩnh vực y học kháng sinh được ứng dụng khá rộng rãi để phòng
và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Từ nửa cuối thế kỷ 20 cùng vói việc phát
minh ra kháng sinh, tuổi thọ con ngưòd đã tăng lên rõ rệt từ 35 đến 70 tuổi.
• Trong nông nghiệp:
-

Trong trồng trọt: KS dùng để diệt nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây

trồng. KS còn kích thích hạt nảy mầm: ngâm hạt trong dung dịch KS trước khi
gieo vừa để kích thích nảy mầm vừa diệt mầm bệnh trong hạt. Có thể phun
dung dịch KS cho cây trồng đang bị bệnh hoặc trộn các VSV sinh kháng sinh
vào trong đất để tiêu diệt mầm bệnh có trong đất.
Những KS thường dùng trong trồng trọt là:
+ Griseofulvin: chống các bệnh do Botrytis gây ra( bệnh ri sắt ở lúa
mỳ).


+ Blastixidin s, Kasugamycin: chống bệnh vàng lụi ở lúa.
+ Validamycin : diệt nấm gây bệnh khô vằn hại lúa.
+ Trichotexin : diệt nấm gây bệnh cho bông.
• Trong chăn nuôi:
+ KS dùng để điều trị các bệnh do v s v gây ra cho động vật: KS

griseoviridin chữa bệnh viêm phổi cấp , viêm vú của trân bò. Metimycin hoặc
Cloramphenicol dùng điều trị các bệnh do Brucella gây ra,...
+ KS được sử dụng làm chất kích thích tăng trọng cho đàn gia súc, gia
cầm, giảm chi phí thức ăn, kích thích tăng sản lượng trứng ở gà, vịt
Chế phẩm Biovit (Biomycin + B12), Teưavit (Teramycin + B12) là chất
kích thích tăng trọng lợn, gà, vịt, phòng bệnh ỉa chảy.
• Trong công nghiệp thực phẩm:
Trong thực phẩm đóng hộp: sử dụng KS để bảo quản thực phẩm tưoi và
đóng hộp được lâu hơn. KS nisin thường được dùng để bảo quản thực phẩm
đóng hộp như: cà chua, đậu xanh, bắp cải, phomat,...
1.2.

Đại cương về xạ khuẩn

1.2.1. Lớp xạ khuẩn ( Actìnomycetes) [4], [8], [14]
Xạ khuẩn là một nhóm Vi khuẩn nhân thật ( Eubacteria), phân bố rất
rộng rãi trong tự nhiên. Đa số xạ khuẩn là các v s v Gr(+), hiếu khí, hoại sinh,
có cấu tạo dạng sợi phân nhánh.
Xạ khuẩn được quan tâm nghiên cứu vì có thể tổng hợp được nhiều sản
phẩm trao đổi chất quan trọng. Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh hiện đã
được biết đến trẽn thế giới thì trên

6

6

% là do xạ khuẩn sinh ra.

Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzym: amylase,
protease, cellulase,v.v,,. và nhiều chất khác.

Một số rất ít xạ khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí có thể gây bệnh cho
người, động vật và cây trồng.


• Đặc điểm hình thái
Xạ khuẩn có cấu tạo dạng scri nhỏ, dài, phân nhánh gọi là khuẩn ty. Hệ
sợi gồm khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất phát triển sau
1

thời gian thì dài ra thành khuẩn ty khí sinh( khuẩn ty thứ cấp).
Khuẩn ty xạ khuẩn đa số không có vách ngăn, màu sắc phong phú:

vàng, đỏ, trắng, da cam, lục lam,...
Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố: sắc tố
tan trong nước, sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ, có loại phụ thuộc pH,...
Tập hợp 1 khóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ
khuẩn.
Khuẩn lạc xạ khuẩn có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có
các nếp gấp toả ra theo hình phóng xạ.
• Đặc điểm cấu tạo tế bào
- Thành tế bào: dạng lưới, dày khoảng 10-12nm.
- Màng tế bào chất: chủ yếu là phospholipid và protein, dày 7,5-lOnm.
- Mexosom: hình phiến, hình bọng hay hình ống.
- Các thể ẩn nhập trong tế bào chất: gồm các hạt polyphosphat, các hạt
polysaccarid.
1.2.2. Đặc điểm xạ k h i ^ chi Streptomyces [4], [14], [16]
• Đặc điểm hình thái: có các đặc điểm của lớp xạ khuẩn Actinomycetes.
Khuẩn ty khí sinh sau 1 thòi gian phát triển trên đỉnh sẽ xuất hiện các
chuỗi bào tử mọc đơn hay mọc vòng có nhiều hình dạng: thẳng, uốn cong,
móc đofn, xoắn lò xo,...

Sinh sản bằng bào tử trần. Bào tử trần có các hình dạng: hình cầu, hình
trụ, hình bầu dục, hình que,...Bề mặt bào tử : nhẵn, xù xì, có gai hoặc có tóc.
• Đảc điểm sinh lý:
Streptomyces là loại v s v dị dưỡng. Nguồn cacbon thường dùng là
đường, tinh bột, rượu và nhiều hợp chất hữu cơ khác. Nguồn Nitơ hữu cơ là


protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn Nitơ vô cơ là nitrat, muối
amon,...
Streptomyces là loài Xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ phát triển tối
ưu là 25°C-35®C, một số loài có nhiệt độ phát triển cao hơn, pH môi trường tối
ưu thường từ ,8-7,5.
6

Khả năng tạo sắc tố: sắc tố tạo thành từ Streptomyces chia thành 4 loại:
sắc tố hoà tan, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố của khuẩn ty cơ chất và sắc
tố melanoid.
1.3.

Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp chọn lọc ngẫu
nhiên [5], [6]
Các VSV có sự đột biến tự phát theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn

1 0

-

2

0

% những các

thể khác. Cần phải chọn lấy những các thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu
tiếp.
1.3.2. Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh [4], [5], [9]
Các chủng xạ khuẩn mới phân lập, kể cả sau chọn lọc ngẫu nhiên
thưcmg có hoạt tính kháng sinh thấp và hiệu suất tổng hợp không cao. Do đó
để đáp ứng nhu cầu của sản xuất công nghiệp cần cải tạo giống VSV.
*Mục đích:
- Tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn, rút ngắn thời
gian lên men, ít tạo bọt hơn,v.v...
- Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết, tách, tinh chế thuận lợi hơn.
- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tao các liên kết mới, nhóm
chức mới,v.v...
*Tác nhân gây đột biến có thể là:
- Tác nhân hoá học: hydroxylamin, nitrozoguanidin, nitrit...


- Tác nhân vật lý: ánh sáng u v , tia Rơnghen...
Đột biến bằng ánh sáng u v được sử dụng phổ biến trong di truyền chọn
giống v s v . Ánh sáng u v tác dụng chủ yếu lên acid nucleic, mạnh nhất là
vùng 260nm, dãn đến hiện tượng đimer hoá tymin:

2

tymin gần nhau được

liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử C và Q . Hậu quả là sao chép bị sai
5

lầm vì ADN-polymerase dễ lắp nucleotid không chính xác vào vị trí trên. Do
1

tác dụng của ánh sáng u v , trên sợi ADN xuất hiện 1 dimer pyrimidin khác
gọi là quang sản phẩm 6-4, ở đây Q của pyrimidin 5’ (T hoặc C) được liên kết
vói C của pyrimidin 3’ (thường là C). Đây là các sản phẩm chủ yếu của quá
4

trình đột biến bằng ánh sáng u v .
* Các yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng gây chết và tần số phát sinh
đột biến:
- Liều lượng chiếu: được đặc trưng bởi 3 tham số là thời gian chiếu,
khoảng cách chiếu và độ pha loãng bào tử.
- Ánh sáng thường: sau khi đột biến bằng tia u v , nếu đem chiếu bằng
ánh sáng thường thì sẽ có khoảng 50 đến 80% tế bào được phục hồi do tác
dụng của enzym photolyase. Hiện tượng này được gọi là quang phục hoạt.
- Các yếu tố khác: nhiệt độ. pH, thành phần môi trường, trạng thái sinh
lý cuả v s v bị gây đột biến cũng ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình đột
biến.
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn [4]
* Mục đích:
- Duy trì hoạt tính, giữ giống v s v có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di
truyền ổn định.
- Chủng giống không bị tạp nhiễm bỏfi các v s v khác và phage.
* Có nhiều phương pháp khác nhau để giữ giống v s v . Trong quy mô

phòng thí nghiệm, giống xạ khuẩn thường được giữ trên môi trưòfng thạch
nghiêng trong tủ lạnh sâu (từ 2 - 4°C), định kỳ 3 -

6

tháng cấy truyền.


1.4.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [2], [5], [6], [9]
Là giai đoạn nuôi v s v để chúng tạo ra sinh khối hoặc các sản phẩm

trao đổi chất bậc , thường lên men với các điều kiện tốt nhất về dinh dưỡng,
1

2

pH, nhiệt độ, thòd gian...để v s v sinh trưởng và phát triển tốt, tạo ra được tối
đa các sản phẩm mong muốn.

1.4.1. Giống v s v
Giống v s v trước khi đem cấy vào các bình lên men phải được tuyển
chọn cẩn thận. Chỉ những cá thể có hoạt tính như mong muốn mới được
truyền giống và nhân lên trong các bình giống cấp 1, 2, 3.
1.4.2. Lên men
Có 2 kiểu lên men chính là lên men bề mặt và lên men chìm;
- Lên men bề mặt: v s v được nuôi cấy trên bề mặt môi trường dịch thể
hoặc môi trường bán rắn, rắn. v s v sẽ hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường
và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt của MT.

+ ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp.
+ Nhược điểm: đòi hỏi mặt bằng lớn, khó cơ khí hoá và tự động hoá, giá
thành cao.
- Lên men chìm: là kiểu lên men mà v s v phát triển trong không gian 3
chiều của môi trường lỏng. Trước khi lên men cần có giai đoạn tạo giống. Tỷ
lệ giống trong môi trường lên men thường từ 1 - 10%. Trong quá trình lên
men có thể phải cho thêm các chất phá bọt, chất điều chỉnh pH nhằm đảm bảo
điều kiện cho quá trình lên men. Tuỳ thuộc vào sản phẩm mà thời gian lên
men từ 50 - 120 giờ. Tuy nhiên, hiệu quả lên men tăng khi thời gian lên men
được rút xuống.
+ ưu điểm: sử dụng triệt để môi trường dinh dưỡng, hiệu xuất cao, tiết
kiệm mặt bằng, dễ cơ giới hoá và tự động hoá.
+ Nhược điểm: Đòi hỏi trang bị chịu áp cao, có nguy cơ bị nhiễm trùng
toàn bộ.


Lên men chìm được chia thành các kiểu sau:
+ Lên men gián đoạn (hay lên men có chu kỳ): trong suốt thời gian lên
men không có bất cứ một tác động bổ sung nào vào hệ thống ngoại trừ việc
thông khí, dùng đệm điều chỉnh pH, chất phá bọt. VSV sẽ phát triển qua 4 giai
đoạn được gọi là các pha: pha tiềm tàng, pha log, pha dừng và pha suy tàn. Kết
thúc quá trình ở giai đoạn nào là tuỳ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất bị
đình chỉ ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của VSV hoặc việc sinh tổng hợp
đã chậm lại và việc duy trì quá trình lên men không còn kinh tế nữa. Phương
pháp này được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như acid
amin, kháng sinh...
+ Lên men có bổ sung: Thực chất là kỹ thuật kéo dài chu kỳ phát triển
của VSV khi cho thêm môi trường mới vào dịch lên men một cách ổn định,
thay đổi hay định kỳ nhưng không lấy bớt dịch lên men ra.
+ Lên men liên tục: trong quá trình lên men môi trường dinh dưỡng

được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lấy ra đồng thể tích dịch
lên men.
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men việc rút bớt dịch lên
men và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng không xảy ra liên tục và định kỳ
sau những khoảng thời gian xác định.
1.5.

Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men [11], [13]
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp do đó kết thúc quá trình lên

men, kháng sinh có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men, đồng
thời có thể có nhiều thành phần kháng sinh khác nhau và lẫn nhiều tạp chất, vì
vậy phải chiết, tách, tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết.
1.5.1. Chiết xuất
tách lấy

Định nghĩa: chiết là phương pháp dùng 1 hoặc hỗn hợp dung môi để
1

chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.


- Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa 2 pha không hoà lẫn
được vào nhau.
- Các phương pháp chiết:
+ Chiết bằng dung mồi hữu cơ,
+ Chiết bằng phương pháp kết tủa,
+ Chiết bằng nhựa trao đổi ion.
1.5.2. Tách sản phẩm
- Định nghĩa: Tách là một nhóm các phương pháp hoá học, vật lý, hoá

lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn
hợp đơn giản tách riêng ra từng chất.
- Phương pháp tách hỗn hợp thường dùng là phương pháp chuyển pha:
chuyển một chất hay một số chất từ pha này sang pha khác bằng một dung
môi thích hợp.
* Sắc ký : Sắc ký là

1

nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành

phần của một hỗn hợp. Quá trình tách sắc ký thường qua 3 giai đoạn chính:
đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và phát hiện các
chất.
SKLM : tiến hành trên 1 bản kim loại hay thuỷ tinh mỏng có tráng một
lớp mỏng Silicagel mịn( pha tĩnh), chất lỏng( pha động) sẽ thấm và chạy trên
bản mỏng và kéo theo các chất hoà tan nhờ lực mao dẫn.
1.5.3. Tinh chế
Mục đích: thu lấy kháng sinh tinh khiết để tiến hành các nghiên cứu
tiếp theo.
Sắc ký cột: là 1 phưorng pháp sắc ký trong đó chất hấp phụ hoặc chất
làm nền cho pha tĩnh được nhồi trong ống hình trụ gọi là cột. Trong phòng thí
nghiệm cột là những ống thuỷ tinh hình trụ dài từ 30-70cm, đường kính từ 13cm, đầu dưới có vòi và một khoá điều chỉnh tốc độ.


Chất nhồi cột: Cellulose, oxid nhôm, Silicagel, Cephadex,...Các chất
nhồi cột phải được chuẩn hoá để sử dụng một cách thuận lợi.
1.6. Quang phổ hồng ngoại( IR) [13]
Quang phổ hồng ngoại là phương pháp đo quang phổ hấp phụ phân tử.
Phân tử hấp phụ năng lượng của bức xạ hồng ngoại và bị thay đổi trạng thái

dao động. Trong phân tử, khi một nhóm nguyên tử nào đó hấp thu năng lượng
và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ (đỉnh hấp thụ) trên
phổ IR. Như vậy có sự tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ. Người
ta có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào
đó.
1.7.

Một số nghiên cứu mới về công nghệ sinh học

1.7.1. ổ n định Penicillin G acyclase tự nhiên bằng các dung dịch ỉon [17]
Penicillin G acyclase ( PGA) là một enzym chủ yếu được sử dụng trong
công nghiệp sản xuất các chất kháng sinh penicillin nhóm ß- lactam. Enzym
này thuỷ phân mạch bên của penicillin G và các kháng sinh nhóm ß- lactam
liên quan, giải phóng ra -APA là khung cơ bản được sử dụng trong ngành sản
6

xuất bán tổng hợp các penicillin. PGA cũng được sử dụng để bán tổng hợp các
kháng sinh nhóm ß-lactam, trong đó enzym xúc tác cho phản ứng ngưng tụ

1

gốc acyl và 1 phân tử -APA.
6

Việc sử dụng các dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp nước-dung môi đồng
tan đã làm tăng hiệu suất tổng hợp ß- lactam từ enzym. Tuy nhiên các dung
môi dễ bay hơi lại có hại đến môi trường.
Nghiên cứu cho thấy rằng PGA tự nhiên ổn định trong dung dịch ion
hơn rất nhiều so với dung môi hữu cơ: toluen, diclomethan, propanol-2, ... Ví
dụ: thời gian chu kỳ bán huỷ đạt được trong dung dịch [ emim‘^][Tf N ] là 23h

2

, cao gấp

2

0

0

0

lần so vói trong propanol- .
2

Cũng thấy rằng sự có mặt của cơ chất làm cải thiện rất lớn tính ổn định
của enzym trong dung dịch ion, trên cơ sở có mặt của các anion tetrafluoborat


và hexafluorphosphat, Kết quả là thời gian chu kỳ bán huỷ tăng cao nhất trong
dung dịch [ bmim'^liPFg ] cao hơn gấp 9 lần so vói các dung dịch không có cơ
chất. Theo đó những lợi ích tiềm năng của những dung môi mới này, cùng vói
sự hiệu quả ổn định duy nhất trên PGA có thể mở ra khả năng phát ụển cắc
quá trình xúc tác sinh học mới cho sản xuất bán tổng hợp các kháng sinh
nhóm p- lactam và tách các hỗn hợp racemic, đặc biệt trong sản xuất các amin
tinh khiết bất đối.
Các dung dịch ion được sử dụng:
- [emim'^liTfjN ]: l-ethyl-3-methylimidazolium bis
(trifluormethyl) sulfonyl} imid
- [bmim‘^][Tf N ]: l-butyl-3-methylimidazolium bis

2

{ trifluormethyl} sulfonyl} imid
- [bmim^^líPPé lrl-butyl-S-methylimidaTolium hexafluorphosphat
- [omim^^líPPé ]: l-octyl-3-methylimidazolium hexafluorphosphat
- [bmim'^li BF4 ]: l-butyl-3-methylimidazolium tetrafluorborat
1.7.2. Sự biến đổi sinh học được cải thiện 15- Fluor- 6- deoxyerythronolid
B thành 15- Fluor- erythromycin A do sự biểu hiện quá mức của gen eryK
trong Saccharopolyspora erythraea [18]
Erythromycin là sản phẩm do xạ khuẩn Saccharopolyspora erythraea
trong quá trình lên men và đã được phổ biến sử dụng như một kháng sinh. Sự
phát triển các chất tương tự erythromycin dẫn đến thế hệ thứ

2

của các chất

kháng sinh nhóm macrolid chư clarithromycin và azithromycin.
Quá trình biến đổi sinh học 1 chất mới tương tự dEB thành chất tương
6

tự erythromycin A tương ứng với nó đã được cải thiện bằng cách thêm vào
một bản sao ngoại lai của gen eryK vào chủng

s. erythraea K39-

14V, một

chủng đã được sử dụng từ lâu cho sự biến đổi sinh học một vài chất tương tự
6

dEB. Sự quá biểu hiện của eryK thành K301- 105B dẫn đến có ít nhất thay


đổi gấp 5 lần trong luồng hướng đến sản phẩm mong muốn là 15F- EryA. Sản
lượng của chất tương tự erythromycin tăng lên 4 lần trong chủng K301- 105B,
trong khi đồng thời cải thiện lượng mol do quá trình cung cấp tiền chất. Mặc
dù quá trình được cải thiện đã được nghiên cứu rộng rãi đối với sự biến đổi
sinh học 15F- dEB, thử nghiệm với các chất tương tự dEB khác cũng có kết
6

6

quả giống vói sự biến đổi sinh học R- EryA tưcfng ứng. Cung cấp nhiều loại
chất tương tự erythromycin tạo bởi chủng s. erythraea. Có thể khái quát được
rằng sự quá biểu hiện của eryK cho sự biến đổi sinh học bất kỳ chất tương tự
6

dEB nào như thế có thể biến đổi thành chất tưofng tự erythromycin A tương

ứng với nó. Sự cải thiện sản lượng cao, năng suất cao này trong quá trình biến
đổi sinh học R- dEB sẽ có tác động to lớn trong sự phát triển các chất mới
6

tương tự erythromycin.


PHẦN II

THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

2.1.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

2.1.1. Nguyên vật liệu
• Giống xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 được phân lập và tuyển chọn có
khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng trên vi khuẩn, có đặc
tính di truyền ổn định. Chủng giống do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trưòfng Đại
học Dược Hà Nội cung cấp.
• Giống vi sinh vật kiểm định
Giống v s v kiểm định do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học
Dược Hà Nội cung cấp.
VK Gr(+)

^

Bacillus cereus

VK Gr(-)
9946

Escherichia coli

25922

Bacillus subtillis ATịC
6633
I

Proteus mirabilis BV 108

Bacillus pumỉlus AT^C 10241

Pseudomonas aeruginosa

Sarcina lutea AT^C 9341

Salmonella typhi DT 220

Staphylococcus aureus AT^C1128

Shigella flexneri DT 112

Môi trường
- Các môi trường nuôi cấy v s v kiểm định: (bảng )
1

Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy v s v kiểm định
'\T T iành phần
NaCl
m t

\

v

Cao thịt Pepton

Thạch

pH

(%)

(%)

(%)

(%)

Canh thang

0,5

0,3

0,5

-

6

,8-7,2

Thạch thường

0,5

0,3

0,5

1 , 8

6

,8-7,2


- Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (MT):

-

Các môi trường lên men( MTdd): có thành phần tương ứng vói môi

trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng bỏ thạch.
Các môi trưcmg đều được tiệt trùng bằng hoi nước ở latm/30 phút


Dụng cụ hoá chất
Các dung môi đã sử dụng( bảng 3):
Bảng 3: Các dung môi hữu cơ
Dung môi

Khối luợng riêng

Nhiệt độ sôi

(g/cm^)

(°C)

Aceton

0,79

56

Cloroform

1,47-1,48

60-62

n-Butanol

0,81

116-118

0 , 8 8

117-118

Butylacetat
Etanol

0,78-0,79

78,3

Dimetylformamid

0,95

153

NH4ƠH25%
Trietylamin

0 , 8 8

0,72

Vật liệu dùng cho sắc ký:
+ Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60F254, Merck
+ Hạt Silicagel 60 F254, Merck, cỡ hạt 0,06- 0,2mm
+ Dung môi chạy sắc ký: các dung môi trong bảng 3
+ Bình chạy sắc ký
+ Buret 25ml, 50ml, mao quản.
Máy móc thiết bị dụng cụ:
+ Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030
+ Tủ cấy Sanyo Clean Bench
+ Tủ sấy, tủ lạnh, tủ lạnh sâu
+ Tủ ấm Trung Quốc 30°c, 37°c
+ Cân kỹ thuật, cân phân tích

90

+ Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV(/1=254 nm), nguồn phát
Toshiba 60W-220V
+ Máy lắc Taitec Bio-Shaker BR 300LF
+ Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer- Phòng thí nghiệm trung tâm
trường Đại học Dược Hà Nội
+ Máy cất quay Buchi WaterBath B480- Phòng tổng hợp Hoá Dược, bộ
môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.2. Các phương pháp thực nghiệm
• Phương pháp nuôi cấy và giữ giống
Giống Streptomyces 21.123 được cấy trên ống thạch nghiêng MTl, để
trong tủ ấm 30°c từ 5-7 ngày, sau khi phát triển tốt được cất giữ trong tủ lạnh
sâu định kì cấy truyền 3-

6

tháng 1 lần.

• Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên
- Tạo hỗn dịch bào tử: Chuẩn bị 1 ống nghiệm chứa lOml, 5 ống nghiệm
chứa 9ml nước cất vô trùng và 1 pipet Iml. Lấy 1 vòng que cấy bào tử
Streptomyces 21.123 từ ống giống cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô
trùng được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng quy ước là
thành

1 0

-2

1 0

1 0

*.Sau đó pha loãng

-.
6

- Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử có
độ pha loãng từ 10 '^-10'^ nhỏ lên bề mặt MTl đã được tiệt trùng trong đĩa
Petri. Dùng que trang vô trùng giàn đều giọt hỗn dịch này. Mỗi nồng độ tiến
hành làm 3 đĩa song song. Sau đó để trong tủ ấm 30°c trong

6

ngày để xuất

hiện các khuẩn lạc.
Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát

-

triển tốt, mọc riêng rẽ, cấy ziczac lên bề mặt MTl đã tiệt trùng trong đĩa Petri.
Sau ngày ủ trong tủ ấm 30°c đem thử hoạt tính kháng sinh.
6


• Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán
Nguyên tắc: Mẫu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v
kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử sẽ khuyếch tán vào môi trường và ức chế sự

phát triển của v s v kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Tiến hành :
- Qiuẩn bị môi trường cấy v s v kiểm định: VK kiểm định được cấy vào
MT canh thang, sau 18h- 24h nuôi cấy ờ nhiệt độ 37°c sẽ tạo thành nhũ dịch
VK có nồng độ 10^-10* tế bào/ml.
Đưa nhũ dịch này vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và làm nguội
đến 45-50®C với tỷ lệ 2,5:100. Lắc đều, đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích
20ml/đĩa. Để nguội ở nhiệt độ phòng trước khi đưa mẫu thử vào đĩa.
- Đưa mẫu thử vào đĩa vào đĩa Petri chứa môi trường đã cấy VK kiểm
định: có 3 phương pháp:
+ Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch có chứa xạ khuẩn đường kính
6

mm lên bề mặt môi trường đã cấy VK kiểm định.
+ Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc đưcmg kính mm đã tẩm
6

3 lần dịch chiết chứa mẫu thử và sấy khô ở nhiệt độ dưói 50°c được đặt lên bề
mặt môi trường đã cấy VK kiểm định.
+ Phương pháp giếng thạch: Nhỏ dịch nước chứa mẫu thử vào các giếng đã
được đục trên bề mặt môi trường đã cấy VK kiểm định, mỗi giếng nhỏ
0,05ml.
Nuôi cấy: Các đĩa Petri chứa môi trường đã cấy VK kiểm định và mẫu
thử được ủ trong tủ ấm 37°c trong 16-24h.
- Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer
có độ chính xác đến 0,02mm. Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn được xử lý
theo công thức:


ẺA

D = ^ ---n

Ỳ (.D ,-D ỹ
S = \ ^ -----------

y

n-1

D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
D, : Đường kính vòng vô khuẩn thứ i
s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
n : Số thí nghiệm làm song song.
• Phương pháp đột biến bằng ánh sáng u v
Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 21.123

-

cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng, lắc đều để tạo thành hỗn
dịch bào tử có độ pha loãng quy ước là 10'^ Lấy Iml hỗn dịch này pha loãng
đến độ pha loãng 10‘^ để làm mẫu chứng, 9ml còn lại đổ vào đĩa Petri vô
trùng.
Đột biến bằng ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10 *
trong đĩa Petri vô trùng được chiếu bằng ánh sáng ư v vói khoảng cách 60cm,
thời gian chiếu 5phút, sau đó để tối 2h rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến
độ pha loãng độ

1 0

'^.

- Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml mẫu chứng 10'^ và
0 , 1

ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các độ pha loãng lo '*, '^ nhỏ lên bề mặt
1 0

MTl đã tiệt trùng trong đĩa Petri. Dùng các que trang vô trùng giàn đều các
giọt hỗn dịch bào tử. Mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa cho vào
tủ ấm 30°c trong

6

ngày xuất hiện các khuẩn lạc. Đếm số khuẩn lạc, xác định

%sống sót theo công thức:
% sống sót = =
: Số khuẩn lạc sau đột biến.
Nq : Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.

X 100


- Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc đột biến tương tự phép sàng lọc ngẫu
nhiên. Làm song song với mẫu chứng, sau

6

ngày ủ ở 30°c , đem thử hoạt tính

kháng sinh bằng phương pháp khối thạch.
- Xác định % biến đổi hoạt tính theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = = X
Do

1 0 0

D ị: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột
biến.
Dq: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Các biến chủng nào có % biến đổi hoạt tính kháng sinh (+) cao nhất sẽ
được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
• Phương pháp lên men gián đoạn
- Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 21.123 nuôi cấy trên MT
thạch nghiêng ở 30°c sau

6

ngày được cấy vô trùng sang bình nón 250ml

MTdd bằng lOml nước cất vô trùng, sau đó đem lắc trên máy lắc ở nhiệt độ
30°c, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
- Lên men: Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa
MTdd với tỷ lệ V giôngi

trưcmg= I-IO- Các bình lên men được lắc trên máy lắc

ở nhiệt độ 30°c, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h.
• Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối, dịch lọc được chỉnh về pH

trung tính rồi chiết bằng dung môi n-butanol trong bình gạn với tỷ lệ Vdịcj, lọc:
^dung môi = 5 - » lắc kỹ trong
1

1

phút để

2

pha tiếp xúc với nhau, để yên cho

phân lớp tách riêng phần dịch chiết và phần nước.
Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của dịch chiết và dịch nước bằng phương
pháp giếng thạch và phương pháp khoanh giấy lọc.