phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây diệp hạ châu (phyllanthus amarus l.) mọc hoang tại tỉnh vĩnh long
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.95 MB, 110 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH Ở
CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.)
MỌC HOANG TẠI TỈNH VĨNH LONG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS. TS: NGUYỄN HỮU HIỆP
SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THỊ THANH THẢO
MSSV: 3103987
LỚP : VSVH K36
Cần Thơ, Tháng 12/2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH Ở
CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.)
MỌC HOANG TẠI TỈNH VĨNH LONG
Cần Thơ, Tháng 12/2013
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS. Ts Nguyễn Hữu Hiệp
Nguyễn Thị Thanh Thảo
XÉT DUYỆT CỦA BỘ MÔN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng
năm 2013
TRƯỞNG BỘ MÔN
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nổ lực của bản thân tôi, còn nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và các bạn sinh viên cùng thực hiện đề
tài.
Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi học tập,
nghiên cứu, nâng cao kiến thức trong những năm qua.
Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt những kiến thức bổ ích và những kỹ năng thao tác
nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian qua. Đặc biệt là thầy Phó giáo sư –Tiến sĩ
Nguyễn Hữu Hiệp đã hướng dẫn tận tình, cho tôi những lời khuyên hữu ích trong suốt
thời gian thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp.
Bên cạnh đó tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các anh chị cán bộ các phòng thí
nghiệm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi
tận tình. Tất cả các bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 luôn bên cạnh ủng hộ, động viên
và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian theo học ở trường, nhất là khoảng thời gian thực
hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất tới cha mẹ tôi, người đã tạo điều
kiện tốt nhất cho tôi trong những năm học xa nhà.
Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị quản
lí phòng thí nghiệm và tất cả những người bạn của tôi.
Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2012
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thanh Thảo
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
ii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
TÓM LƯỢC
Hai mươi mốt dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân, lá và trái của
cây Diệp Hạ Châu ở ấp Mỹ Yên và ấp Tầm Vu, huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long. Đa số
khuẩn lạc có dạng tròn đều, màu trắng đục, một số khuẩn lạc có dạng không đều, màu
vàng, hầu hết các dòng vi khuẩn có dạng hình que và có khả năng chuyển động. Tất cả
các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng cố định, sinh tổng hợp IAA, 8 dòng
vi khuẩn có khả năng hòa tan lân.
Trong hai mươi mốt dòng vi khuẩn được phân lập, có sáu dòng vi khuẩn có khả
năng kháng khuẩn là R2, R1A1B, L1, L2, L4 và TR9. Các dòng vi khuẩn có khả năng
kháng vi khuẩn Escherichia coli là L4, R1A1B, R2 và TR9, trong đó dòng R2 có khả
năng kháng vi khuẩn Escherichia coli mạnh nhất. Các dòng vi khuẩn có khả năng
kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila là L1, L2, L4 và R2, dòng L2, L4 và R2 là ba
dòng có khả năng kháng Aeromonas hydrophila mạnh hơn so với dòng L1. Hai dòng
có khả năng kháng tốt Escherichia coli và Aeromonas hydrophila là R2 và L4. Ba
dòng vi khuẩn vừa có khả năng kháng khuẩn tốt, vừa có khả năng cố định đạm, sinh
tổng hợp IAA và hòa tan lân được chọn để nhận diện bằng phương pháp giải trình tự
đoạn gen 16S – rDNA là TR9, L4, R2. Dựa trên cơ sở dữ liệu gen NCBI, kết quả định
danh dòng TR9 có tỉ lệ đồng hình là 99% với dòng Bacillus subtillis, dòng L4 có tỉ lệ
đồng hình là 99% với dòng Bacillus amylolifaciens và dòng R2 có tỉ lệ đồng hình là
97% với dòng Bacillus sp..
Từ khóa: Amonium, cây Diệp Hạ Châu, hòa tan lân , IAA, kháng khuẩn, vi khuẩn
nội sinh..
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
i
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC................................................................................................................i
MỤC LỤC..................................................................................................................ii
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................vii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... ix
TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................... x
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU........................................................................................1
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................2
2.1 Vị trí địa lý tỉnh Vĩnh Long..……………………………...……………………2
2.2 Giới thiệu cây Diệp Hạ Châu………………………………………………... ..2
2.2.1 Đặc điểm thực vật:.....................................................................................3
2.2.2 Tính vị, tác dụng:.......................................................................................3
2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh..........................................................................3
2.4 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp ........................................................4
2.4.1 Vi khuẩn Azotobacter.................................................................................4
2.4.2 Vi khuẩn Azospirillum................................................................................4
2.4.3 Vi khuẩn Bacillus.......................................................................................5
a.
Bacillus amyloliquefaciens.........................................................................6
b.
Bacillus cereus...........................................................................................6
c.
Bacillus polymyxa ......................................................................................6
d.
Bacillus subtillis ........................................................................................7
2.4.4 Vi khuẩn Burkholderia...............................................................................7
2.4.5 Vi khuẩn Klebsiella....................................................................................8
2.4.6 Vi khuẩn Enterobacter ...............................................................................8
2.4.7 Vi khuẩn Pseudomonas..............................................................................9
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
ii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
2.5 Khả năng cố định đạm của vi khuẩn. .............................................................9
2.6 Khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)của vi khuẩn......................... 10
2.7 Khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn. ................................................. 11
2.8 Đối kháng sinh học của vi khuẩn. ................................................................ 11
2.9 Một số dòng vi khuẩn gây bệnh thường gặp:................................................ 12
2.9.1 Vi khuẩn Escherichia coli ........................................................................ 12
2.9.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila .............................................................. 13
2.10 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới............................................... 14
2.10.1 Tình hình nghiên cứu trong nước: ............................................................ 14
2.10.2 Tình hình nghiên cứu thế giới: ................................................................. 14
CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 16
3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................... 16
3.1.1 Địa điểm-thời gian:.................................................................................. 16
3.1.2 Nguyên liệu: ............................................................................................ 16
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm: ................................................................... 16
3.1.4 Hóa chất và môi trường:........................................................................... 17
a.
Hóa chất dùng để khử trùng mẫu: ............................................................ 17
b.
Hóa chất dùng để phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn: ........... 17
3.2 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 20
3.2.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu:........................................................ 20
3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn: .............................................................. 21
3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn:............................................................................ 22
a. Mục đích: .................................................................................................... 22
b. Các bước tiến hành: ..................................................................................... 22
3.2.4 Quan sát, mô tả hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn .............. 23
a.
Mục đích:................................................................................................. 23
b.
Nguyên tắc:.............................................................................................. 23
c.
Các bước tiến hành: ................................................................................. 23
3.2.5 Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn nội sinh:................................. 24
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
iii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
3.2.6 Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn phân
lập được .............................................................................................................. 25
a.
Nguyên tắc:.............................................................................................. 25
b.
Chuẩn bị mẫu........................................................................................... 25
c.
Xây dựng đường chuẩn, ........................................................................... 26
d.
Xác định nồng độ NH4+có trong mẫu vi khuẩn:........................................ 26
e.
Đo lượng NH4+ ........................................................................................ 27
3.2.7 Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn
phân lập............................................................................................................... 27
a.
Chuẩn bị. ................................................................................................. 27
b.
Xây dựng đường chuẩn ............................................................................ 28
c.
Xác định lượng IAA có trong mẫu vi khuẩn:............................................ 29
d.
Đo lượng IAA.......................................................................................... 29
3.2.8 Thử nghiệm xác định khả năng hòa tan lân .............................................. 30
3.2.9 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được.31
a.
Chuẩn bị vi khuẩn gốc và giấy thấm: ....................................................... 31
b.
Tiến hành thí nghiệm: .............................................................................. 31
3.2.10 Thực hiện phản ứng PCR và định danh các dòng vi khuẩn triển vọng:..... 31
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 34
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ........................................................................... 34
4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn......................................................... 34
4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn:............................................. 34
4.2 Đặc điểm hình thái và khả năng chuyển động .............................................. 36
4.2.1 Kết quả nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn ........................................... 36
4.2.2 Đặc điểm hình thái và khả năng chuyển động của các dòng vi khuẩn....... 38
4.3 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn:......................................... 39
4.3.2 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2: ........................ 40
4.3.3 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3: ........................ 41
4.4 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn. .......................................... 42
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
iv
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
4.5 Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn:............................................... 44
4.6 Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn............................................. 46
4.6.1 Các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn E.coli............................. 46
4.6.2 Các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila... 48
4.7 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn: ......................................................... 49
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 56
5.1 Kết luận:...................................................................................................... 56
5.2 Đề nghị:....................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 57
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả
1. Bảng 11: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được
2. Bảng 12: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 ngày 2.
3. Bảng 13: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 ngày 4.
4. Bảng 14: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 ngày 6.
5. Bảng 15: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 ngày 8.
6. Bảng 16: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn
nhóm 1.
7. Bảng 17: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 ngày 2.
8. Bảng 18: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 ngày 4.
9. Bảng 19: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 ngày 6.
10. Bảng 20: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 ngày 8.
11. Bảng 21: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn
nhóm 2
12. Bảng 22: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 ngày 2.
13. Bảng 23: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 ngày 4
14. Bảng 24: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 ngày 6.
15. Bảng 25: OD và lượng NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 ngày 8.
16. Bảng 26: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
v
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
nhóm 3.
17. Bảng 27: OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở lá và rễ ngày 2.
18. Bảng 28: OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở lá và rễ ngày 4.
19. Bảng 29: OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở lá và rễ ngày 6.
20. Bảng 30: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn ở
lá và rễ
21. Bảng 31:OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở thân và trái ngày 2.
22. Bảng 32: OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở thân và trái ngày 4.
23. Bảng 33:OD và lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở thân và trái ngày 6.
24. Bảng 34: Sự khác biệt về khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn ở
thân và trái.
25. Bảng 35: Đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng halo trong thử nghiệm
khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn nội sinh:
26. Bảng 36: Mật số, đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng kháng khuẩn
của các dòng vi khuẩn kháng E.coli
27. Bảng 37: So sánh sự khác biệt về khả năng kháng E.coli của các dòng vi
khuẩn
28. Bảng 38: Mật số, đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng kháng khuẩn
của các dòng vi khuẩn
Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê
1. Kết quả phân tích lượng đạm của các dòng vi khuẩn nhóm 1.
2. Kết quả phân tích lượng đạm của các dòng vi khuẩn nhóm 2.
3. Kết quả phân tích lượng đạm của các dòng vi khuẩn nhóm 3.
4. Kết quả phân tích lượng IAA của các dòng vi khuẩn.
5. Kết quả phân tích khả năng kháng khuẩn
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
vi
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Cây Diệp Hạ Châu ..........................................................................................1
Hình 2: Cây Diệp Hạ Châu ở tỉnh Vĩnh Long ..............................................................1
Hình 3 : Đường chuẩn đo đạm .....................................................................................1
Hình 4: Sơ đồ minh họa pha loãng dung dich chứa IAA ..............................................1
Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước xây dựng đường chuẩn IAA....................................1
Hình 6: Đường chuẩn đo IAA ......................................................................................1
Hình 7: Vi khuẩn phát triển hình thành vòng pellice sau 2-3 ngày chủng .....................1
Hình 8: Một số dạng khuẩn lạc ....................................................................................1
Hình 9: Hình nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn đã phân lập ....................................1
Hình 10: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 1 theo thời gian trong
môi trường NFB lỏng...................................................................................................1
Hình 11: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 2 theo thời trong môi
trường NFB lỏng..........................................................................................................1
Hình 12: Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn nhóm 3 theo thời gian sau
khi chủng trong môi trường NFB lỏng .........................................................................1
Hình 13:Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn theo thời gian sau khi chủng
trong môi trường NFB lỏng .........................................................................................1
Hình 14: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn theo thời gian sau khi chủng
trong môi trường NFB lỏng .........................................................................................1
Hình 15: Vòng Halo của dòng R7 trên môi trường NBRID………………..…………45
Hình 16: Khả năng kháng vi khuẩn E.coli của các dòng vi khuẩn ................................1
Hình 17: Vòng kháng khuẩn của dòng R2 kháng vi khuẩn E.coli.................................1
Hình 18: Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn ......1
Hình 19: Vòng kháng khuẩn của dòng L4 kháng Aeromonas hydrophila .....................1
Hình 20: Phổ diện điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn RNA của các
dòng vi khuẩn TR9, L4, R2..........................................................................................1
Hình 21:Mức độ tương đồng của dòng TR9 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
vii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
NCBI ...........................................................................................................................1
Hình 22: Mức độ tương đồng của dòng L4 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu
NCBI ...........................................................................................................................1
Hình 23: Mức độ tương đồng của dòng R2 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu
NCBI ...........................................................................................................................1
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
viii
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Thành phần hóa chất môi trường PDA.......................................................... 17
Bảng 2: Thành phần hóa chất môi trường NFb lỏng................................................... 19
Bảng 3: Thành phần hóa chất môi trường NBRIP ...................................................... 20
Bảng 4: Thành phần môi trường LB........................................................................... 20
Bảng 5: Đặc điểm của khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ........ 35
Bảng 6: Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn ...................................................... 37
Bảng 8 : Độ hữu hiệu hòa tan lân của các dòng vi khuẩn ........................................... 45
Bảng 9: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP đặc....... 46
Bảng 10: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn............................................ 46
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
ix
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
TỪ VIẾT TẮT
BLAST: Basic Local Alignment Seach Tool.
DNA: Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxy-nucleotide triphosphates
ĐKKL: Đường kính khuẩn lạc
ĐKVS:Đường kính vòng sáng
E: Độ hữu hiệu hòa tan lân
IAA: Indole-3-acetic acid
LB Luria - bertani
NBRIP: National Botanical Research Institute’s Phosphate
OD: Optical Density
PDA: Potato Dextro Agar
PCR Polymerase Chain Reaction
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
x
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU
Y học cổ truyền một số nước đã sử dụng Diệp Hạ Châu làm thuốc lợi tiểu, trị phù
thũng. Ở Việt Nam, Diệp Hạ Châu được dùng sớm nhất tại Viện Đông y Hà Nội
(1967) trong điều trị xơ gan cổ trướng. Một nghiên cứu của trường Đại học Dược
Santa Catarina (Brazil-1984) đã phát hiện một alkaloid của Diệp Hạ Châu có tác dụng
chống co thắt cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích
hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật của cây thuốc.
Theo một báo cáo tổng hợp của Lê Minh Khôi - Bệnh viện Trung Uơng Huế
nghiên cứu thực hiện năm 2010, 40% người thường xuyên sử dụng bia rượu (trong
nhóm được tổng hợp) mắc chứng gan nhiễm mỡ; 10% số đó tiến triển thành ung thư
gan. Việc sử dụng các biện pháp bảo vệ gan từ sớm rất cần thiết. Hiện nay, xu hướng
sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu đang được ưa chuộng vì tính an toàn và
có thể sử dụng thường xuyên, lâu dài. Các dược liệu tốt cho gan như actiso, hoàng bá,
vọng cách, nhân trần, cà gai leo… trong đó, cây Diệp Hạ Châu đắng được đánh giá
cao.
Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây dược liệu nhưng phần lớn chỉ
tập trung vào việc khảo sát dược tính của cây dược liệu thông qua điều trị lâm sàng,
Khi canh tác cây dược liệu phần lớn sử dụng phân bón hoá học hay phân bón hữu cơ
mà chưa quan tâm nhiều đến vai trò của các tập đoàn vi sinh vật sống nội sinh trong
cây. Chúng có khả năng kích thích cây phát triển tốt thông qua khả năng cố định đạm,
hòa tan lân, sản xuất hoocmon tăng trưởng giúp cây phát triển tốt, giảm chi phí sản
xuất. Đặc biệt là khả năng tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội
sinh trong cây dược liệu chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu các tập
đoàn vi sinh vật sống nội sinh trong cây dược liệu có khả năng tổng hợp các chất có
hoạt tính kháng khuẩn đóng vai trò quan trọng giai đoạn hiện nay. Đề tài “Phân lập vi
khuẩn nội sinh ở cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) mọc hoang tại tỉnh Vĩnh
Long” để tuyển chọn những dòng vi khuẩn nội sinh có ích cho sự phát triển của cây
đặc biệt là đặc tính kháng khuẩn ứng dụng trong lĩnh vực y học.
Mục tiêu của đề tài: Phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh sống trong
cây Diệp Hạ Châu ở tỉnh Vĩnh Long có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA, hòa
tan lân và có khả năng kháng khuẩn.
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1
Vị trí địa lý tỉnh Vĩnh Long
Tỉnh Vĩnh Long có dạng địa hình khá bằng phẳng với độ dốc nhỏ hơn 2 độ, có
cao trình khá thấp so với mực nước biển. Với dạng địa hình đồng bằng ngập lụt cửa
sông, tiểu địa hình của Tỉnh có dạng lòng chảo ở giữa trung tâm Tỉnh và cao dần về 2
hướng bờ sông Tiền, sông Hậu, sông Mang Thít và ven các sông rạch lớn. Trên từng
cánh đồng có những chỗ gò hoặc trũng cục bộ. Vĩnh Long nằm trong vùng nhiệt đới
gió mùa, quanh năm nóng ẩm, có chế độ nhiệt tương đối cao và bức xạ dồi dào thuận
lợi cho sản xuất nông nghiệp. ( 24/11/2013).
Vĩnh Long tuy có diện tích đất phèn lớn, tầng sinh phèn ở rất sâu, tỉ lệ phèn ít,
song đất có chất lượng cao, màu mỡ vào bậc nhất so với các tỉnh trong vùng. Đặc biệt
tỉnh có hàng vạn ha đất phù sa ngọt ven sông Tiền và sông Hậu, đất tốt, độ phì nhiêu
cao, trồng được hai vụ lúa trở lên, cho năng suất cao, sinh khối lớn lại thuận lợi về
giao thông kể cả thuỷ và bộ. Ở Vĩnh Long có 4 loại đất chính: đất phèn có 90.779,06
ha, chiếm 68,94% diện tích đất toàn tỉnh; đất phù sa có 40.577,06 ha, chiếm 30,81%;
đất giồng cát có 212,73 ha, chiếm 0,16%; đất xáng thổi có 116,14 ha, chiếm 0,09%.
( />anh?view=introduction&provinceId=1388, 24/11/2013)
2.2
Giới thiệu cây diệp hạ châu
Hình 1: Cây Diệp Hạ Châu
(* Nguồn: ngày 5/8/2013. )
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
2
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
2.2.1 Đặc điểm thực vật:
Diệp Hạ Châu (chó đẻ thân xanh) có tên khoa học là Phyllanthus amarus L.
Thuộc họ Thầu dầu ( Euphorbiaceae). Diệp Hạ Châu là cây cỏ mọc hằng năm cao từ
0,2m -0,3m, toàn thân nhẵn, có màu xanh. Lá thuôn nhỏ hình trứng, mọc so le, trông
giống lá kép. Hoa đơn tính cùng gốc, mọc ở kẽ lá. Quả hình cầu nhỏ treo ở mặt dưới
cành lá.
Diệp Hạ Châu là loài cây của vùng nhiệt đới. Ở nước ta cây mọc khắp nơi. Diệp
Hạ Châu sử dụng được toàn cây, dùng tươi hay khô, thu hái vào mùa hè, rửa sạch,
phơi khô trong mát. Thành phần hóa học: chất đắng (phyllanthin, hypophyllanthin,
niranthin, nirtetralin, phyllteralin), alkaloid (nirurine, epibubialin). Ngoài ra còn có
flavonoid (4- methyl- nor quercetin), saponin và tanin (Trần Hùng et al., 2009).
2.2.2 Tính vị, tác dụng:
Theo tổng kết của Patel et al., (2011), các hợp chất có hoạt tính trong Diệp Hạ
Châu đắng là các lignan, Ellagitannins viz. geraniin, amariin, furosin, geraniinic acid,
amariinic acid, amarulone, repandusinic acid, corilagin, isocorilagin, elaeocarpusin,
phyllanthin D gallic acid, repandusinic acid A etc., triterpenes, alkaloids, sterol….Các
lignin liên quan đến hoạt tính kháng viêm như nirtetralin, phyltetralin và niranthin.
Phyltetralin, nirtetralin và niranthin ức chế carrageenan tạo ra trong quá trình viêm và
sự lan tràn bạch cầu trung tính. Elllagitanins geraniin, corilagin, niranthin và henokinin
có vai trò kháng virus viêm gan. Các phức chất phenol trong dịch chiết với nước của
Diệp Hạ Châu có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất là phyllanthin, amariin,
repandusinic acid và phyllanthusiin D. Hoạt tính chống ung thư cũng được thử nghiệm
trên chuột với hỗn hợp phyllanthin và hypophyllanthin (1:1). Phyllanthin được chứng
minh vai trò bảo vệ tế bào gan chuột gây độc với ethanol hoặc CCl4.
Diệp Hạ Châu còn được sủ dụng để trị bệnh gan giúp phục hồi tế bào gan và điều
trị viêm gan siêu vi B (Trần Hùng et al., 2009).
2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian của chu kỳ
sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà ngược lại những loại
vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Kobayashi và Palumbo, 2000; Bandara, 2006). Nó
có giá trị trong nông nghiệp như một công cụ thực hiện cải tiến mùa màng
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
3
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
(Muthukumarasamy et al., 2002).
Vi khuẩn nội sinh có thể hình thành các mối quan hệ khác nhau với cây chủ bao
gồm cộng sinh, hỗ sinh. Đa số vi khuẩn nội sinh có nguồn gốc từ vùng rễ, tuy nhiên,
một số có thể được truyền qua hạt giống, qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương
của lá (Roos và Hattingh, 1983).
Hiện nay các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh có
đặc tính tốt như vi khuẩn có khả năng cố định nitơ trong không khí (Xu et al., 1998),
tổng hợp IAA (Barbieri et al., 1986), giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường
(Rosenblueth và Martinez, 2006), hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất
dinh dưỡng ( Lăng Ngọc Dậu et al., 2007). Một trong những khám phá mới về vi
khuẩn nội sinh là chúng khả năng tổng hợp ra những hợp chất chống lại mầm bệnh
như vi nấm, nấm, tuyến trùng… gây bệnh cho cây trồng , có thể xem những hợp chất
này như là hợp chất kiểm soát sinh học (phytopathogenes) hay đối kháng (biocontrol
agents)(Berg et al., 2005). Ngoài ra, chúng còn có khả năng tổng hợp ra những hợp
chất tự nhiên phân hủy các hóa chất độc hại như thuốc bảo vệ thực vật, dung môi hữu
cơ…….(Siciliano et al.,2001; Germaine et al., 2004, 2006) góp phần trong việc xây
dựng nền nông nghiệp bền vững.
2.4
Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp
2.4.1 Vi khuẩn Azotobacter
Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ
đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra
vi khuẩn Azotobacter paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh.
Đây là loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên, khi Brown
(1976) theo dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspanum notatum
cũng được cộng sinh với sự có mặt của Azotobacter paspali ở vùng rễ. Bà cho rằng
Azotobacter paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspanum notatum chủ yếu bằng việc
tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm.
2.4.2
Vi khuẩn Azospirillum
Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn
và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về
sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
4
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum
(Tarrand et al., 1978).
Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có dạng hình que
ngắn, cong hoặc hình chữ S (như Azospirillum lipoferum). Azospirillum xâm nhập vào
bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan,
tổng hợp IAA và các chất dinh dưỡng khác (Bial et al.,1990; Seshadri et al., 2000
Somers et al.,2005; Lăng Ngọc Dậu et al.,2007), sản xuất kích thích tố thực vật (Broek
và Vanderleyden, 1995), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng
(Rangaraijan et al., 2003). Vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ vùng rễ của nhiều
loại cỏ, mía đường và ngũ cốc trên khắp thế giới, ở vùng khí hậu nhiệt đới cũng như
ôn đới (Enrique và Caceres, 1982; Reinhold-Hurek et al.,1986).
2.4.3
Vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có
khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh
nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí
hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong
thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể
phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,...
nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N. Tất cả
các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp
chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men
carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì
không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B.
Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oC, nhưng
cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC (Rosovitz et al., 1998). Đa số
Bacillus sinh trưởng ở pH =7, một số phù hợp với pH= 9-10 như
Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…). Do
đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, … Sau
đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
5
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
a. Bacillus amyloliquefacien
Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn gram dương, hình que, di động, kích
thước 0,7-0,9 x1,8-3µm, nội bào tử ( 0,6-0,8 x 1-1,4µm), là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ
khí, phát triển tối ưu ở pH=7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ giới
hạn 15-50o C, nhiệt độ tối ưu 30-40oC.
Bacillus amyloliquefaciens là một vi sinh vật an toàn (GRAS) do đó Bacillus
amyloliquefaciens được biết đến với nhiều ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm
thương mại như sản xuất enzyme công nghiệp. Bacillus amyloliquefaciens có thể dùng
như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoặc nước uống nhằm cân bằng hệ vi sinh
đường ruột. Phytase của các chủng thuộc loài Bacillus amyloliquefaciens là β propeller
phytase với trung tâm hoạt động có vị trí ái lực cao với Ca2+. Đây là loại phytase khá
bền nhiệt, có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với phytate nhưng lại biểu hiện rất ít hoặc
không có hoạt tính đối với các loại cơ chất esters phosphate khác. Sự có mặt của Ca2+
cũng làm tăng tính bền nhiệt của phytase loại này. (Theo dẫn liệu Phan Thị Thu Mai,
2012).
b. Bacillus cereus
Đây là loài có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides,
Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí…
Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm
cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh. Tế bào Bacillus
cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)µm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay
xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 –1,5)µm nằm lệch tâm, tế bào
chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuyếch tán,
hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn Lân Dũng, 1983).
c.
Bacillus polymyxa
Bacillus polymyxa là vi khuẩn gram dương, có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi,
trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa
có kích thước (0,6 –1) x (2 –7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi
hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài,
trên bề mặt cắt ngang như hình sao.Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 –
2,6) µm, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
6
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
cây, chúng còn có khả năng cố định đạm và thường sinh trưởng phát triển trên thực vật
đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem
và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn
để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích,
chủ yếu là cho công nghiệp dược.( Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009).
d. Bacillus subtillis:
Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand
Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 .Chúng được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân
bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Chúng phân hủy
pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bịu.
Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các
vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis. Chúng
là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 –5) x 0,6 µm. Chúng phát triển
riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi. Khuẩn lạc khô, không màu hay
xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch,
mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis
sinh trưởng tốt nhất ở 36oC –50oC, tối đa khoảng 60oC. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử
của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước
0,6–0,9µm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có
thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200-300 năm (Nguyễn Thành
Đạt, 1990).
Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính
tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất
enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin,
subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại
bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV). Đặc biệt, B.subtilis
được sử dụng trong lên men Natto của Nhật –một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng
cho sức khỏe (Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007).
2.4.4
Vi khuẩn Burkholderia
Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, dạng hình que ngắn,
đường kính khoảng 1 µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
7
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
(Caballero- Mellado et al., 2004). Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ
khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất. Trong môi trường
nuôi cấy, chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng
2-4 mm, tròn, phẳng hoặc lài (Caballero – Mellado et al., 2004; 2007).
Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu
nhiệt đới (Mounlin et al, 2001). Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng
và có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ
và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella et al., 2003; Chen et al.,
2006).
Hiện nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia ( Martinez –
Aguilar et al., 2008) bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, rễ cây, đẩy mạnh các
giai đoạn phát triển của cây (Coenye và Vadnamme, 2003; Osulliva và
Mahenthiralingam, 2005). Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy trong rễ lúa
trồng ở miền Nam Việt Nam (Van et al., 1994; Gillis et al.,1995) giúp tăng khả năng
đâm chồi, tăng số lượng rễ, tăng bề mặt lá và tăng năng suất.
2.4.5
Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc Gram âm, dạng hình que, ít chuyển động, có khả năng
kết nang thành bào xác, kỵ khí không bắt buộc, sống tự do trong đất hoặc có khả năng
xâm nhập và nội sinh trong cây trồng. Có hai loài quan trọng là Klebsiella oxytoca và
Klebsiella pneumoniae ( Klebsiella).
Ở Ấn Độ, Klebsiella oxytoca được phân lập từ thân và rễ của cây cỏ đuôi mèo
(Typha austrlis) có khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan là 30µg/mg trọng
lượng khô, khả năng hòa tan lân khó tan là 31,5µg/mg trọng lượng, mức độ biểu hiện
hoạt tính của nitrogenase trong phản ứng khử acetylene là khá cao. Ngoài ra, dòng vi
khuẩn này còn có khả năng giúp cây lúa tăng toàn bộ chiều dài cây, tăng hàm lượng
chlorophyll-a, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho
cây (Jha và Kumar, 2007).
2.4.6
Vi khuẩn Enterobacter
Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ – Proteobacteria , hầu hết là vi
khuẩn Gram âm, có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi
khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
8
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
đạm,
là
vi
khuẩn
Trường ĐHCT
kích
thích
sự
sinh
trưởng
thực
vật
( 2008).
Enterobacter intermedium được phân lập từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Triều
Tiên, chúng có khả năng hòa tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ
chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2 – ketogluconic acid (Hwangbo et al, 2003).
2.4.7 Vi khuẩn Pseudomonas
Vi khuẩn Pseudomonas spp. Phân bố rộng rãi và đa dạng nhiều chủng loài
(Rangarajan et al.,2001; 2002). Vi khuẩn Pseudomonas spp. thường là vi khuẩn Gram
âm, hình que, có chiên mao ở cực nên có khả năng lội tốt trong nước, không có khả
năng tạo bào tử. Chúng hiện diện khắp nơi như trong đất, trong nước, thực vật, động
vật, một số làm hư thực phẩm. Pseudomonas có thể hô hấp trong hiếu khí hay kỵ khí
trong môi trường không có oxy, nhiệt độ thuận lợi cho chúng phát triển là 30- 37o C,
một số chủng có thể sống ở 40oC.
Một số chủng Pseudomonas có khả năng thúc đẩy sự phát triển thực vật như tổng
hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển
của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài
như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae (
Glickmann et al., 1998; Suzuki et al., 2003; Xie et al., 1996). Pseudomonas putida,
Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis có khả năng hòa tan lân
(Cattenlla et al., 1999).
Pseudomonas có khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây hại cho cậy trồng
như: Pseudomonas jluorescens HP72, Pseudomonas putida (Suzuki et al.,2003). Theo
Sivamani el al., 1987 cho rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể được dùng
như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây bệnh héo
moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris. Trong số các loài Pseudomonas sp.,
P.fluorescens được chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại
mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng
(Nguyễn Trọng Thể, 2004).
2.5 Khả năng cố định đạm của vi khuẩn.
Đạm là chât dinh dưỡng rất cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của thực vật.
Trong không khí có rất nhiều đạm (78%) nhưng cây trồng không hấp thụ trực tiếp
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
9
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
được. Các dòng vi khuẩn cố định đạm có khả năng chuyển hóa đạm từ dạng cây trồng
không hấp thụ được (N2) thành dạng đạm cây trồng có thể sử dụng được nhờ sự xúc
tác của enzym nitrogenase (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Phản ứng khử N2 dưới sự xúc tác của enzym nitrogenase được viết tóm tắt như
sau:
N2 + 6e- +12ATP+12H2O à 3NH4+ + 12ADP +12Pi + 4 H+
Quá trình khử này gồm nhiều phản ứng khử kế tiếp nhau:
N2 + 2H+ à [NH=NH] + 2H+ à [NH2-NH2] + 2H+ à 2NH3
Amonia được tạo ra trong chu trình tiếp tục đồng hóa tạo thành những acid amin
cung cấp cho cây trồng (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)
2.6 Khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)của vi khuẩn.
Indole-3-acetic acid hay còn gọi là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực
vật. Tác động của IAA phụ thuộc vào dạng tế bào, nồng độ như IAA kích thích đồng
thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi
đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001).
Vi khuẩn nội sinh đã được phát hiện là có khả năng tổng hợp indole -3-acetic
acid từ tiền chất L- tryptophan (Sergeeva et al., 2002). Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho
sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như
sau:
o Lộ trình indole- 3-pyruvic acid
Tryptophan à indole- 3-pyruvic acidà indole- 3-acetaldehydeàIAA
o Lộ trình tryptamine
Tryptophanà tryptamine à indole- 3-acetaldehyde à IAA
o Lộ trình indole-3-acetamide
Tryptophanà indole- 3-acetaldehyde à IAA
Nhiều loài vi sinh vật cố định đạm sống tự do, vi sinh vật sống cộng sinh, và
những vi sinh khác có cơ chế tổng hợp IAA với tiền chất L-tryptophan (Ten et al.,
2000; Sridevi và Mallaiah, 2007).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
10
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2013
Trường ĐHCT
2.7 Khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn.
Nhiều dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa dạng lân khó tan trong đất như
CaHPO4, CaHPO4.2H2O, Ca3PO4 thành dạng lân dễ tan để cây trồng sử dụng. Đặng
Thị Huỳnh Mai và Cao Ngọc Điệp (2002) đã phân lập được vi khuẩn và nấm có khả
năng chuyển hóa lân khó tan trong các loại đất ở Đồng bằng sông Cửu Long.
Kucey et al., (1989), Rashid et al., (2004) giải thích sự hòa tan lân trong đất là do
sự bài tiết các acid hữu cơ và xác định tác nhân này làm giảm pH đất, điều này rất
quan trọng trong cơ chế hòa tan lân dạng khó tan trong đất. Sự khoáng hóa của những
hợp chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là
phosphohydrolase). Có hai loại phosphohydrolase là phosphohydrolase kiềm và
phosphohydrolase kiềm.
2.8 Đối kháng sinh học của vi khuẩn.
Vi khuẩn nội sinh có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các sinh vật
gây hại, điều này có thể dẫn đến hiện tượng gia tăng tính kháng bệnh hay kích kháng.
Nhiều giống vi khuẩn nội sinh như Pseudomonas, Burkhoderia và Bacillus được biết
là những loài trong những giống vi khuẩn tổng hợp ra nhiều sản phẩm thứ cấp bao
gồm các kháng sinh, chất kháng ung thư, hợp chất hữu cơ thơm, kháng nấm, kháng
virus, kháng sâu (Lodewyckx et al., 2002; Ryan et al., 2008). Chất kháng sinh đã được
tìm thấy từ vi khuẩn nội sinh phân lập từ khoai tây chống lại nấm Fusarium
sambucinum, F. avenaceum, F. oxysporum, Rhizotonia solani và từ bắp chống lại nấm
Fusarium miniliformis (Hinton và Bacon, 1995). Theo nghiên cứu của Đặng Ngọc
Phương Uyên năm 2007, Bacillus subtilis chủng L211 có khả năng đối kháng cao với
E. coli O157:H7.
Những thí nghiệm với dòng B. amyloliquefaciens FZB42 trong phòng thí
nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng cho thấy có khả năng đối kháng với nhiều nấm bệnh
và vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Nấm bệnh được ngăn chặn bởi B. amyloliquefacien
FZB42 như Rhizoctonia solani, Fusarium graminearum, Sclerotinia sclerotiorum,
Phytophthora erythrospetica (Gnanamanickam et al., 2008).
Dòng B. amyloliquefaciens FZB24 còn ngăn chặn được vi khuẩn gây héo rủ ở cà
chua (Ralstonia solanacearum) và vi khuẩn gây thối các chồi non ở táo (Erwinia
amylovora) (Gnanamanickam et al., 2008; Aldwinckle et al., 2008).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học
11
Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học
