Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ đến quá trình lên men rượu vang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
----------

MAI THỊ THU THẢO

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢƠNG CỬA NITƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN
MEN RƢỢU VANG NHO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. Phạm Quang Thảo

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS.
Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phạm Quang Thảo ngƣời đã tận tình chỉ bảo và
giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu đề này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà
Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơnBan Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh
vật trƣờngĐại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
thành khóa luận này.

Cuối cùng, Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân,
những ngƣời luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài.

Hà Nội,

tháng

năm 2015

Sinh viên

Mai Thị Thu Thảo


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây
là kết quả của riêng Em. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều
đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử ly thống kê, không có số liệu sao chép
hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung.
Trong đề tài, Em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác,
em xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai Em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội,

tháng
Sinh viên

Mai Thị Thu Thảo

năm 2015


BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

CHỮ VIẾT TẮT
1. CNS

: Chất nguyên sinh

2. ĐHSP

: Đại học sƣ phạm

3. HL

: Hàm lƣợng

4. Nxb

:Nhà xuất bản

5. S.cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae
6. SLTB

: Số lƣợng tế bào

7. TĐC

: Trao đổi chất

8. TG

: Thời gian

10. VSV

: Vi sinh vật


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài...................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 2
3.Nội dung của đề tài................................................................................... 3
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài ..................................................... 3
5.Điểm mới của đề tài ................................................................................. 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Tổng quan về đối tƣợng. ....................................................................... 4
1.1.1.Thành phần của rƣợu nho ................................................................ 4
1.1.2. Phân loại vang ................................................................................ 4
1.1.3. Tình hình sản xuất rƣợu vang ......................................................... 5
1.2. Tổng quan về cây nho........................................................................... 5
1.2.1. Sơ lƣợc về cây nho ......................................................................... 5
1.2.2. Thành phần cấu tạo quả nho ........................................................... 6
1.3. Các hệ sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang...... 6
1.3.1. Nấm men ........................................................................................ 6
1.3.2. Vi khuẩn ......................................................................................... 7

1.3.3. Nấm mốc ........................................................................................ 7
1.3.4. Vi sinh vật làm hỏng vang .............................................................. 7
1.3.5. Bệnh vang ...................................................................................... 7
1.4.Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của
nấm men ............................................................................................... 8
1.4.1. Nguồn nitơ ..................................................................................... 8
1.4.2. Nguồn Photpho............................................................................... 9
1.4.3. Nguồn nguyên tố khoáng ................................................................ 9
1.4.4. Nguồn oxi....................................................................................... 9


1.4.5. Nguồn cacbon............................................................................... 10
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men ...................................... 10
1.5.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng và men giống .......................... 10
1.5.2. Ảnh hƣởng của độ pH và nồng độ cồn .......................................... 10
1.5.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................... 11
1.5.4. Ảnh hƣởng của thời gian lên men ................................................. 12
1.6. Những biến đổi sinh lý, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men
rƣợu vang ........................................................................................... 12
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 14
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất ........................................................ 14
2.1.1. Nguyên liệu chính ........................................................................ 14
2.1.2. Hóa chất và thiết bị....................................................................... 14
2.1.3. Các loại môi trƣờng ...................................................................... 14
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 16
2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh ...................................................................... 16
2.3. Địa điểm thực hiện đề tài .................................................................... 18
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 19
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men S.cerevisiae ............................. 19
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho ........ 22

3.2.1. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S. ceresvisiae M1
trong quá trình nhân giống ..................................................................... 24
3.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ở các hàm lƣợng khác nhau đến quá trình
lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon ............................................... 28
3.3.1. Ảnh hƣởng của ni tơ hữu cơ ......................................................... 28
3.3.2. Ảnh hƣởng của ni tơ vô cơ ........................................................... 29
3.4.3. Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến sự
phát triển của nấm men .......................................................................... 31


3.5. Lên men vang nho cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm ...... 32
3.5.1. Lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm ............................... 32
3.5.2. Quy trình công nghệ lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm 34
3.5.3. Thuyết minh công nghệ ................................................................ 35
KÊT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 39


DANH MỤC BẢNG – HÌNH

BẢNG
Bảng 3.1. Thử hoạt lực lên men của 3 chủng nấm men................................. 22
Bảng 3.2. Khả năng lên men của các chủng nấm men .................................. 23
Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng M trong môi trƣờng
nhân giống .................................................................................... 24
Bảng 3.4. Sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng và hàm lƣợng cồn trong quá trình
lên men vang nho cabernet sauvignon .......................................... 26
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng pepton trong quá trình phát triển
của nấm men ................................................................................ 28
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của các nguồn ni tơ vô cơ đến sự sinh trƣởng,

phát triển của nấm men. ................................................................ 30
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 hợp với sự phát triền
của nấm men ................................................................................ 31
Bảng 3.8. Kết quả phân tích quá trình lên men rƣợu vang nho
cabernet sauvignon ....................................................................... 33

HÌNH
Hình 3.1. Nấm men S.cerevisiae M1 phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa ..... 20
Hình 3.2 Cấy truyền chủng nấm men M1, M2, M3 thu đƣợc từ
môi trƣờng thạch nghiêng ............................................................. 21
Hình 3.3 Hình ảnh tế bào của chủng nấm men S.cerevisiae M1 độ phóng
đại 1000 lần ................................................................................. 21
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn HL đƣờng sót và HL cồn
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh trƣởng phát triển của nấm men


trên môi trƣờng nhân giống. ......................................................... 25
Hình3.6. Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng và hàm lƣợng
cồn trong quá trình lên men vang nho ......................................... 27
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hƣởng của pepton ở hàm lƣợng 4-5g/l
các tế bào nấm men sinh trƣởng và phát triển tốt ........................ 29
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của ni tơ vô cơ đến sự sinh trƣởng,
phát triển của nấm men ............................................................... 30
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 hợp
với sự phát triền của nấm men .................................................... 32


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đềtài
Khác với các loại rƣợu trắng hay các loại rƣợu đƣợc pha chế khác,

rƣợu vang là loại rƣợu có độ cồn nhẹ đƣợc lên men trực tiếp từ dịch ép trái
cây mà không cần qua quá trình trƣng cất, là một đồ uống có giá trị dinh
dƣỡng cao, có hƣơng vị thơm ngon và rất có lợi cho sức khỏe khi
dùngmộtcách điều độ, rƣợu vang có thể giúp giảm béo, kích thích ăn ngon
miệng, có lợi cho tiêu hóa, tuần hoàn và timmạch. Đặc biệt rƣợu vang có thể
ngăn ngừa ung thƣ vú [4].
Trên thế giới đặc biệt là các nƣớc châu Âu rƣợu vang đã có từ lâu đời.
5000 năm về trƣớc ngƣời Ai Cập và Babilon đã sử dụng đồ uống lên men từ
dịch trái nho, nhƣng công nghệ sản xuất rƣợu vang chỉ thực sự đƣợc thế giới
biết đến khi nhà khoa học ngƣời Pháp Luispasteur công bố kết quả nghiên cứu
về quá trình lên men rƣợu vào năm 1857 và chỉ ra vai trò của nấm men trong
sản xuất rƣợu. Hiện nay quy trình và mô hình sản xuất rƣợu vang ngày càng
hiện đại bởi nhu cầu của ngƣời tiêu dùng ngày càng lớn, không chỉ đƣợc
ngƣờiÂu -Mỹ ƣa chuộng mà ngƣời châu Á cũng đã làm quen với rƣợu vang
trong mỗi bữa ăn.
Ở Việt Nam ngành sản xuất rƣợu vang mới thực sự bắt đầu vào
những năm 80 của thế kỷ 20 với một số nhãn hiệu nhƣ vang Thăng Long,
vang Đà Lạt…
Nguồn sản xuất rƣợu vang rất phong phú và đa dạng, rƣợu vang không
chỉ đƣợc làm từ nho mà còn đƣợc làm từ nhiều loại quả khác nhƣ dâu, mơ, táo
mèo, vải, mận vv… các loại quả này đều chứađƣờng, axitamin, vitamin,
khoáng, tại nƣớc ta những loại quả này đƣợc trồng rất phổ biến, cho sản
lƣợng lớn. Tuy nhiên trong số đó nho là loại quả thích hợp nhất, nho vốn là

1


nguồn nguyên liệu phổ biến, rộng rãi nhất trong lên men rƣợu vang. Bởi trong
trái nho chứa hàm lƣợng đƣờng rất cao từ 15% - 20% ở dạng dễ lên men. Nho
còn chứa nhiều muối khoáng nhƣ K, P, Mg… thích hợp cho quá trình lên men

dễ dàng tạo độ rƣợu cao, ức chế hoạt động của vi sinh vật có hại, rƣợu bảo
quản đƣợc lâu. Nho đƣợc phân bố ở các vùng cận nhiệt và nhiệt đới. Ở Việt
Nam nho đƣợc trồng nhiều với diện tích lớn chủ yếu ở các tỉnh Ninh Thuận
và Bình Thuận với sản lƣợng cao, chất lƣợng tốt.
Giống nho Cabernet sauvignon là một trong những giống nho làm
rƣợu vang đỏ nổi tiếng, có nguồn gốc từ vùng thung lũng sông Rhôme, đƣợc
lai tạo từ hai dòng nho là Dumit (đỏ) và Mondeuse Blanche (trắng) cây sinh
trƣởng khỏe, năng suất cao, cho chất lƣợng rƣơụ tốt, phù hợp với khí hậu
của những vùng có diện tích trông nho lớn của nƣớc ta, nho Cabernet
sauvignon là hƣớng đi mới cho nghành trồng nho và sản xuất rƣợu vang khi
nhu cầu tiêu thụ rƣợu vang ngày càng lớn.
Nitơ là một nguyên tố quan trọng tham gia vào cấu trúc protein,
axitamin. Nấm men sử dụng nitơ tổng hợp tế bào mới và các enzim proteaza
trong quá trình sinh trƣởng và sinh sản. Trong quá trình lên men việc cung
cấp đủ lƣợng nitơ để nấm men có thể đồng hóa là rất cần thiết. Nó ảnh hƣởng
tới tốc độ chuyển hóa đƣờng thành rƣợu và khả năng chịu cồn của nấm men.
Vì vậy nitơ đóng một vai trò quan trọng đối với sự sinh trƣởng và phát triển
của nấm men trong lên men rƣợu vang, do đó chúng tôi quyết định nghiên
cứu đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ đến quá trình lên men rượu vang
nho cabernet sauvignon’’
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng nitơ đến quá trình lên men rƣợu
vang nho cabernet sauvignon.

2


3. Nội dung của đề tài
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp để lên men rƣợu
vang nho carbernet sauvignon.

3.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae
M1 trong môi trƣờng nhân giống và môi trƣờng lên men
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các nguồnnitơ ở nồng độ khác nhau đếnquá
trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon.
3.4. Lên men vang nho cabernet sauvignon quy trình lên men vang nho
quy mô phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
4.1.Ý nghĩa lý luận
Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng
lên men vang nho cabernet sauvignon. Kết quả nghiên cứu này là giữ liệu góp
phần bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của nấm men trong đời sống.
4.2.Ý nghĩa thực tiễn
Nhằm sản xuất một loại vang từ nho cabernet sauvignon đáp ứng đƣợc
nhu cầu của ngƣời tiêu dùng góp phần phát triển ngành công nghiệp sản xuất
rƣợu vang, đem lại giá trị kinh tế cho nông nghiệp và công nghiệp, mang lại
nguồn lợi nhuận nông sản cho bà con nông dân.
4. Điểm mới của đề tài
Tuyển chọn đƣợc chủng nấm men S.cerevisiae M1 có khả năng lên
men vang nho cabernet sauvignon. Tìm đƣợc nguồn nitơ thích hợp cho quá
trình sinh trƣởng và phát triển của chủng nấm men M1cerevisiaelên men vang
nho cabernet sauvignon.

3


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về đối tƣợng.
1.1.1.Thành phần của rượu nho
Cồn etanol: do lên men tƣn nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn

andehit, este. Độ cồn trong rƣợu vang từ 10-12 nên nhiều ngƣời uống đƣợc.
Đƣờng: đƣờng đơn, đƣờng kép lànguyên liệu để tạo nên các loại rƣợu
trong quá trình lên men rƣợu vang, đƣờng trong vangkhoảng 62- 132 (g/l).
Axit hữu cơ, axit vô cơ: axit malic, axit xi tric… rƣợu vang là loại đồ
uống có độ chua cao. Hl axit tổng số từ 4-7 (g/l). Độ pH của vangtừ 3-4.Các
axitamin và vitamin: có vai trò quan trọng đối với sự sản và phát triển của
nấm men đồng thời làm cho vang có vị đặc trƣng.
1.1.2. Phân loại vang
Có nhiều cách phân loại rƣợu vang khác nhau dựa vào màu sắc, đặc
điểm chủng trái cây, nhà sản xuất, công nghệ sản xuất.
Theo màu sắc:
Vang trắng ( Aliwen trắng)
Vang đỏ (Aliwen đỏ)
Vang hồng (Aliwen hồng)
Vang xám
Theo hàm lƣợng đƣờng trong rƣợu:
Vangchát hay vang khô ( hết đƣờng)
Vang ngọt ( còn đƣờng)
Vang bán khô
Vang mềm
Theo xu hƣớng chung vang đƣợc chia thành hai nhóm chính:

4


Vang không có gas: tức là trong vang thành phần không có co2.
Vang có gas: trong vang thành phẩm có co2 vang bọt, sâm banh[10].
1.1.3. Tình hình sản xuất rượu vang
1.1.3.1. Tình hình sản xuất rượu vang trên thế giới
Rƣợu vang có một lịch sử phát triển rất lâu đời, trong đó châu Âu đứng

đầu thế giới về sản xuất rƣợu vang với 80% tổng sản lƣợng rƣợu vang trên
toàn thế giới, châu Mỹ 14%, châu Phi 5%, châu Á - Úc 0.5%[13], [14].
Nho cabernet sauvignon là một trong sáu dòng nho đƣợc trồng phổ biến
trên thế giới, là nguyên liệu đƣợc nhiều nhà sản xuất sử dụng,tạo nên nhiều
thƣơng hiệu rƣợu nổi tiếng nhƣ Trinity Gold Cabernet sauvignon, Chateau
Reynella Cabernet sauvignon.
1.1.3.2. Tình hình sản xuất rượu vang trong nước
Tại Việt Nam rƣợu vang đã trở thành thức uống phổ biến. Theo thống
kê của hiệp hội rƣợu bia và nƣớc giải khát Việt Nam, hiện cả nƣớc có hơn 15
doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rƣợu vang với sản lƣợng tăng hàng chục
triệu lít mỗi năm, các sản phẩm buắt đầu đƣợc xuất khẩu đến một số nƣớc trên
thế giới, vang Đà Lạt, Anh Đào, Sao Lala là những sản phẩm đƣợc yêu thích
ở Việt Nam bởi mùi vị và chất [4].
1.2. Tổng quan về cây nho
1.2.1. Sơ lược về cây nho
Nho là một từ chỉ các loại quả mọc trên các cây dạng dây leo thân gỗ
hoặc để chỉ chính các loại cây này. Các loại cây này thuộc về họ Vintaceae.
Vitis Vinifera là thuật ngữ la tinhcổ cho những cây nho giống, chúng có
nguồn gốc từ vùng Cận Đông, khi con ngƣời thuần hóa những cây nho dại,
nhƣng rất nhiều chủng và dòng vô tính của nó đƣợc tồng rộng rãi ở châu Âu
nơi sản xuất vang nhiều nhất thế giới.
Nho Cabernet sauvignon lá có màu xanh, phân thùy sâu, cuống lá, cành

5


non có màu xanh, quả hơi tròn, khi chín có màu đỏ tím, thời gian từ khi cắt
cành đến khi ra hoa khoảng 25 ngày, từ cắt cành đến thu hoạch khoảng 90
ngày, số quả/chùm khoảng 100 quả, khối lƣợng của một quả/1,5g. Kháng sâu
bệnh rất tốt, thích hợp cắt cành 3 vụ/ năm.

1.2.2. Thành phần cấu tạoquả nho
Quả nho mọc thanh chùm, quả nho có nhiều màu sắc nhƣ lam, tím, vàng,
lục, đỏ tía hay trắng, khi chín nho đƣợc ủ rƣợu, sấy khô, hạt ép thành dầu.
1.3. Các hệ sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang
1.3.1. Nấm men
Nấm men (yeast) là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo tế bào, sinh sản
chủ yếu bằng phƣơng pháp nảy chồi, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên
nhƣ trong đất, nƣớc, vỏ các loại quả.
Nấm men có hình trứng, hình ovan, hình dạng có thể thay đổi điều
kiện nuôi cấy và tuổi tế bào, nấm men có hình trắng đục, vàng nhạt bề mặt
khô và căng.
Thành phần tế bào của nấm men:Thành tế bào của nấm men đƣợc cấu
tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là hợp chất glucan và mannan, phần còn
lại là protein, lipit, và glucozamin. Glucan là hợp chất cao phân tử của Dglucoza, mannan là hợp chất cao phân tử của D-Manoza. Trên thành tế bào có
nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dƣỡng đƣợc hấp thu và các quá trình trao đổi
chất đƣợc thải ra.
Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men dày
khoảng 8nm có cấu tạo tƣơng tự nhƣ màng nguyên sinh chất của vi khuẩn.
Tế bào chất: nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là
chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Cũng nhƣ nhân tế bào của vi sinh vật bậc
cao, nhân tế bào có ADN còn có protein và nhiều loại men.
Ty thể: khác với vi khuẩn, nấm men đã có ty thể giống tế bào bậc cao,
đó là cơ quan sinh trƣởng của tế bào, ty thể nấm men có hình bầu dục, đƣợc

6


bao bọc bởi hai lớp màng.
Riboxom: Tế bào nấm men có hai loại là loại 80s
Sinh sản của nấm men

Nấm men sinh sản bằng hai hình thức sinh sản vô tính và hữu tính.
Các tế bào nấm men nói chung và nấm men thuộc chi S,cerevisiae nói
riêng sinh sản chủ yếu theo lối nảy chồi. Khi tế bào phát triển đến một mức độ
nhất định thì trên cơ thể nó xuất hiện mầm hay chồi. Khi một chồi xuất hiện
thì enzim thủy phân phân giải một phần polysacarit của thành tế bào làm cho
chồi chui ra khỏi tế bào mẹ. Ở mỗi chồi nhận đƣợc phần CNS và chất nhân
của tế bào mẹ. Sau khi nảy chồi tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ mà lại
tiếp tục nảy mầm tạo ra một tập hợp tế bào nấm men có hình cành cây. Trong
điều kiện thuận lợi một chồi nấm men trở thành một tế bào con và tách khỏi tế
bào mẹ khoảng 20-30 phút.
Ngoài ra chúng còn một hình thức sinh sản khá phổ biến đó là sinh sản
bằng bào tử túi [4], [7].
1.3.2. Vi khuẩn
Trong dịch nho cũng nhƣ trong rƣợu vang có rất nhiều vi khuẩn.
Những loại này có thể làm cho rƣợu vang ngon hơn hoặc cũng có thể làm xấu
đi hƣơng vị hoặc làm hỏng rƣợu vang. Do đó chúng ta phải tạo điều kiện cho
các loài vi khuẩn có lợi phát triển, hạn chế các loài có hại phát triển.
1.3.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở vỏ quả, bã của quá trình sản xuất, thùng chứa.
1.3.4. Vi sinh vật làm hỏng vang
Có khá nhiều vi sinh vật làm vang bị đục, chua, gắt, làm hỏng vang nhƣ
acetobactexylium, acetobacter aceti.
1.3.5. Bệnh vang
Hiện tƣợng bệnh vang của lên men rƣợu vang đƣợc Pasteur nghiên cứu

7


và khám phá. Đó là hiện tƣợng rƣợu bị chua đi và chất lƣợng rƣợu bị giảm rất
nhanh. Hiện tƣợng trên là nguyên nhân rƣợu vang tiếp xúc với không khí và

do vi khuẩn axetic phát triển đã biến cồn thành axetic. Ngoài ra bệnh vang
cũng có thể do các vsv lên men kỵ khí gây ra
Bệnh vang dính
Đặc điểm: Vang không chảy đều, lỏng nhƣ nƣớc mà dính lại. Bệnh này
thƣờng kéo theo bệnh chua và đắng.
Nguyên nhân: do vi khuẩn lactic tiết ra một loại đƣờng riêng là dextran.
Bệnh vang đắng
Đặc điểm: rƣợu bị chua và có vị đắng
Nguyên nhân: do vi khuẩn lac tic phá hủy glixerin tạo thành các acrolin.
Vang chua lactic
Đặc điểm: rƣợu có vị chua khó chịu.
Nguyên nhân: khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đƣờng, kỹ
thuật lên men thấp, làm cho nấm men ngừng hoạt động, hoặc do cấy men
chƣa đủ, nhiệt độ cao, thiếu oxy,... vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa đƣờng khử
thành đƣờng manit và axit bay hơi.
Vang bị đục
Đặc điểm: vang có màu đục, không trong.
Nguyên nhân: Do xuất hiện những kết tủa trong rƣợu hay sự oxy hóa
của thành phần polyphenol có trong nguyên liệu làm rƣợu, hoặc do sự tạo
thành kết tủa bông protein của thành phần tanin trong rƣợu và một số dạng kết
tủa khác [11].
1.4.Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của
nấm men
1.4.1. Nguồnnitơ
Ni tơ rất cần cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men, nó là một

8


trong những nguyên tố cấu thành nên acid nucleic. nấm men không có men

ngoại bào để phân giải protid nên không thể phân cắt abumin của môi trƣờng
mà phải cung cấp nito ở dạng hòa tan,có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng
hữu cơ thƣờng dùng là axitami, pepton, amid, ure,. Đạm vô cơ là các muối
amon khử nitrat, sunlfat…
1.4.2. NguồnPhotpho
Có vai trò quan trọng đối với tế bào nấm men, là nguyên liệu tổng hợp
axit nucleic, các enzim, các hợp chất cao năng ATP.
1.4.3. Nguồn nguyên tố khoáng
Trong môi trƣờng dinh dƣỡng cần có một lƣợng khoáng để đảm bảo
cho sự phát triểncủa tế bào nấm men. Lƣu huỳnh tham gia vào thành phần của
một số acid amin, albumin, vitamin, và enzim. Magie tham gia vào nhiều
phản ứng trung gian của sự lên men, sắt tham gia vào thành phần của enzim,
sự hô hấp và quá trình khác.Kali chứa nhiều trong nấm men, thúc đẩy sự phát
triển của nấm men, tham gia vào quá trình lên men rƣợu và góp phần phục hồi
photphorin hóa của axitpyruvic.
Ni tơ rất cần cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men, nó là một
trong những nguyên tố cấu thành nên acid nucleic. nấm men không có men
ngoại bào để phân giải protid nên không thể phân cắt abumin của môi trƣờng
mà phải cung cấp nito ở dạng hòa tan,có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng
hữu cơ thƣờng dùng là axitami, pepton, amid, ure,. Đạm vô cơ là các muối
amon khử nitrat, sunlfat…
1.4.4. Nguồn oxi
Hầu hết các chủng nấm men trong lên men trong lên men rƣợu vang
thuộc chủnggiống saccharomyces. Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện.
Khi trong môi trƣờng đủ lƣợng oixi nấm men phân huỷ đƣờng dùng làm

9


nguồn năng lƣợng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối.

1.4.5. Nguồn cacbon
Hợp chất cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men.
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim và
sản phẩm trao đổi chất.
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men
1.5.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường và men giống
Đƣờng là yếu tố trực tiếp đến hoạt động của nấm men và quá trình lên
men. Môi trƣờng có nồng độ đƣờng từ 10 – 25% thuận lợi cho sự lên men,
khi nồng độ đƣờngtừ 25% trở lên thì sự lên men khó khăn hoặc chậm.Dung
dịch đƣờng có nồng độ rất cao sẽ tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây phá hủy
trạng thái sinh lý bình thƣờng của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài, sự
dụng đƣờng không triệt để, hiệu suất tạo thành rƣợu từ một đơn vị đƣờng
giảm, lƣợng đƣờng tạo ra không nhiều, đồng thời nồng độ rƣợu tạo thành lớn
sẽ ức chế sự hoạt động của nấm men. Ngƣợc lại môi trƣờng lên men có nồng
đƣờng quá thấp sẽ không đủ cơ chất cho nấm men hoạt động. Đối với đa số
nấm men vang, khi tăng nồng độ đƣờng trong môi trƣờng hơn 30% thì hiệu
suất cồn etylic tạo ra giảm dần [9].
Hàm lƣợng men giống đóng vai trò quan trọng đến quá trình sinh
trƣởngcũng nhƣ quá trình lên men của nấm men. Hàm lƣợng tế bào nấm men
có trong dịch lên men càng thấp thì quá trình lên men càng kéo dài hơn, dễ bị
nhiễm vi khuẩn. ngƣợc lại hàm lƣợng men giống trong dịch lên men càng cao
thì thời gian lên men ngắn hơn. Nhƣng hàm lƣợng men giống quá cao sẽ làm
thay đổi thành phần môi trƣờng lên men, sẽ không có lợi cho quá trình lên
men, ảnh hƣởng đến chất lƣợng rƣợu. Nhìn chung hàm lƣợng men giống thích
hợp cho quá trình lên men khoảng 10%.
1.5.2.Ảnh hưởng của độ pH và nồng độ cồn
pHcủa môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình phát triển của nấm

10

men. Tuy nhiên, pH tối ƣu cho sự phát triển và lên men rƣợu của nấm men
không cố định, pH này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, chủng nấm men.
Thành phần của môi trƣờng lên men, điều kiện lên men. Đối với các loại nấm
men rƣợu vang pH tối ƣu vào khoảng 4 – 5. Tuy nhiên ở pH = 3 – 3.5 nhiều
chủng vẫn phát triển tốt, vì vậy khi lên men rƣợu vang ngƣời ta thƣờngchọn
những chủng nấm men hoạt động và phát triển tốt ở pH:3.2 – 4, đồng thời ở
pH này sẽ hạn chế sự phát triển của vi sinh vật làm hỏng vang[5].
Cồn là sản phẩm quan trọng của quá trình lên men rƣợu vang, thƣờng
chứa từ 10- 14%. Tuy nhiên nó có thể ức chế hoạt động của nấm men. Khi độ
cồn bằng 1.5% thể tích thì bắt đầu ức chế sự phát triển và sinh sản của nấm
men. Khi hàm lƣợng cồn tăng đến 5%thể tích thì bắt đầu ức chế sự sinh sản
của nấm men. Nồng đọ cồn lên 7-8% thể tích thì quá trình lên men giảm dần.
Ảnh hƣởngcủa nồng độ cồn lên các loại nấm men không giống nhau. Đa số
các loại nấm men ở điều kiện tối ƣu chịu đƣợc nồng độ cồn khoảng 14 – 16%
thể tích [9].
1.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của môi trƣờng lên men có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự
phát triển của quá trình lên men và chất lƣợng sản phẩm. mỗi loài vi sinh vật
có nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men
Sacharomyces nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm men là từ
28oC– 32oCNếu nhiệt độ thấp hơn 32oC thì nấm men sinh trƣởng phát triển
kém, thời gian lên men kéo dài. Nếu nhiệt độ cao hơn 32oCtốc độ sinh trƣởng
phát triển của nấm men mạnh nhƣngdễ bị nhiễm khuẩn vì đây là nhiệt độ
thích hợp cho vi khuẩn phát triển. Sự lên men ở nhiệt độ thấp sẽ tốt hơn lên
men ở nhiệt độ cao vì rƣợu sẽ trong hơn, giúp quá trình tạo hƣơng, mùi vị hài
hòa. Ngoài ra ở nhiệt độ cao nấm men phát triển càng nhanh thì sự chuyển
hóa đƣờng thành rƣợu càng kém, đồng thời nấm sẽ tiết nhiều chất phụ.nên giữ
nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình lên men do nhiệt độ ảnh hƣởng đến quá

11


trình lên men và các chất hình thành.
1.5.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian lên men là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản
phẩm vang. Trong thời gian lên men chính, nếu thời gian lên men quá ngắn,
có thể lƣợng cồn tạo ra quá ít. Trong thời gian lên men phụ, nếu thời gian lên
men không đủ để hƣơng hình thành, mùi vang sẽ không đặc trƣng. Đối với đa
số nấm men, thời gian lên men chính tốt nhất là 7-20 ngày.Thời gian lên men
phụ và tàng trữ ít nhất phải vài tháng trở lên.
1.6. Những biến đổi sinh lý, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men
rƣợu vang
Nấmmen S.cerevisiae đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất.
Chủng nấm men này có khả năng lên men này có khả năng lên men dịch có
HL đƣờng cao và tạo đƣợc 20 % - 30 % V cồn. Sự lên men rƣợu đƣợc biểu
diễn bằng PTTQ:
CHO → 2CH CH OH + 2CO + 33 Kcal
Quá trình lên men đƣờng thành rƣợu là một dãy oxy hóa khử nhờ hệ
thống enzim trong tế bào nấm men. Tốc độ lên men còn phụ thuốc tùy từng
loại nấm men thuộc chủng nấm men sacharomyces, tùy thuộc từng loại đƣờng.
Quá trình lên men đƣờng thành rƣợu trải qua một chuỗi phản ứng hóa học,
chia 5 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Biến đổi glucozơ thành fructozơ – 1,6 điphotphat dƣới tác
dụng của enzim hexokinaza và isomeraza.
Giai đoạn 2: Từ fructozơ – 1,6 diphotphat biến đổi thành 3 –
photphoglixeraldehit và photphodiosiaxeton dƣới tác dụng của enzim
andolaza.
Giai đoạn 3: Trƣớc hết là 3 – photphoglyxerat nhờ xúc tác của của các
enzim photphoglyxeratmutaza. Sản phẩm cuối cùng của giai đoạn này là sự

biến đổi 2 – photphoglyxerat thành axit piruvic dƣới tác dụng của enzim

12


aldolaza và kinaza.
Giai đoạn 4: Axit pyruvic phân cách thành axetaldehit đồng thời giải
phóng CO2 dƣới tác dụng enzim decacboxylaza.
Giai đoạn 5: Tạo etanol từ axetandehit nhờ tác dụng của enzim
alcoldehidrogennaza [2].
Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men vì lƣợng đƣờng còn lại ít
trong môi trƣờng lên men, nấm men đã sử dụng glycogen đã đƣợc tích lũy
trong đó, do đó HL glycogen trong tế bào giảm dần.
Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces là khác nhau đối với
mỗi loại đƣờng. Tốc độ lên men với đƣờng glucoza và fructoza nhanh hơn
đƣờng saccaroza. Tốc độ lên men với đƣợc xác định bằng lƣợng co2 bay ra từ
thể tích môi trƣờng nhất định.
Kết quả của quá trình lên men rƣợu là một sản phẩm có thành phần
phức tạp,những vật chất cơ bản của dịch quả khi lên men đã chịu những biến
đổi lớn, ngoài sự biến đổi của đƣờng, đạm cũng chịu nhiều biến đổi hóa học,
từ axitamin tƣơng ứng tạo ra các rƣợu bậc cao nhƣ: amylic, propyonic,
izobutylic.

13


CHƢƠNG 2
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất
2.1.1.Nguyên liệu chính

Dịch siro nho cabernetsauvignon
Chủng nấm mennghiên cứu phân lập từ dịch siro quả nho có vị trí phân
loại theo Yelinv N.P ( 1996) sau đây:
Lớp: Hemiascomycetes
Bộ: Endomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Chi: Saccharomyces
Loài: cerevisiae
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất: MgSO4, agar, pepton, các loại muối, các loại đƣờng.
2.1.2.2. dụng cụ va thiết bị
Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, hộp lồng, que trang, phễu thủy tinh,
đèn côn,que cấy.
Thiết bị:tủ sấy, nồi hấp, buồng cấy vô trùng, cân phân tích, kính hiển vi,
đƣờng kế, cồn kế
2.1.3. Các loại môi trường

14


2.1.3.1. Môi trường Hansen (MT1)
Hóa chất

g/l

Đƣờng glucoza

50

Pepton

5

MgSO4.7H2O

0,5

K2HPO4

1

(NH4)2SO4

1

Thạch agar

20ml

Nƣớc

1000ml

2.1.3.2. Môi trường nhân giống ( MT2)
Hóa chất

g/l

Đƣờng glucoza

50

Pepton

5

MgSO4.7H2O

0,5

K2HPO4

1

(NH4)2SO4

1

Thạch agar

20ml

Nƣớc

1000ml

2.1.3.3 Môi trường lên men (MT3)
Hóa chất

g/l

Dịch siro hoa quả

200ml

MgSO4.7H2O

0.5

K2HPO4

1

(NH4)2SO4

1

Thạch agar

1000ml

15


2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp tuyển chọn nấm men trên môi trường thạch đĩa
Để chọn một tập hợp tế bào nấm men ta sử dụng phƣơng pháp phân lập
trên hộp petri. Môi trƣờng để tuyển chọn các lạc khuẩn nấm men là môi

trƣờng Hansen
2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống trước khi lên men
Để có những tế bào tokhỏe ta tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi
trên môi trƣờng thạch nghiêng 28-30 C trong 24h. Sau đó đem cấy vào dịch
nhân giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên men [8].
2.2.1.3. Phương pháp xác định hoạt lức lên men của nấm men
Để xác định hoạt lực lên men của nấm men so sánh giữa các chủng ta
dùng các phƣơng pháp sau:
Phƣơng pháp cân trọng lƣợng bình: Dịch lên men trong các bình cùng
thể tích 250ml môi trƣờng, cùng có một lƣợng trung bình nấm men của các
giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng khi chênh lệch giữa
hai lần là 0,1 thì dừng lại [5].
Phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào bằng buồng đếm Goriaev
2.2.1.4. Phương pháp quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
Tế bào nấm men đƣợc nhuộm đơn bằng cách: lấy một lƣợng nhỏ tế bào
từ ống thạch nghiêng, dàn đều trên lam kính có chứa một giọt nƣớc cất rồi cố
định trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhỏ 1-2 giọt xanh metylen lên vết bôi, để
trong 2-3 phút rồi rủa bằng nƣớc cất. Làm khô tiêu bản rồi quan sát trên kính
hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần.
2.2.1.5. Phương pháp phân tích
2.2.5.1. Xác định hàm lƣợng đƣờng bằng khúc xạ kế
2.2.5.2. Xác định độ cồn bằng ancol kế và phƣơng pháp hóa học

16