Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè ngọc thanh

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
----------

ĐINH THỊ TUYẾT

TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN KOMBUCHA
TỪ CHÈ NGỌC THANH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS.
Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trƣờng Đại
hoc Sƣ phạm Hà Nội 2, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời
gian học tập và nghiên cứu đề này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà
Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh

vật trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân,
những ngƣời luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài.
Hà Nội, ngày

tháng
Sinh viên
Đinh Thị Tuyết

năm 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây
là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều
đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử ly thống kê, không có số liệu sao chép
hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung.
Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi
xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Xin trân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng
Sinh viên
Đinh Thị Tuyết

năm 2015


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ....................................................................... 2
4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................. 2
5. Điểm mới của đề tài ................................................................................................... 2
NỘI DUNG. CHƢƠNG 1 ................................................................................................. 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3
1.1.1. Quá trình lên men kombucha ........................................................................ 4
1.2.2. Thành phần và công dụng của kombucha ..................................................... 5
1.2.1. Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc ....................................................... 6
1.2.1.1. Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè................................................ 6
1.2.1.2. Thành phần hóa học của lá trà ............................................................... 7
1.2.2. Hệ vi sinh vật ............................................................................................... 8
1.2.2.1. Giống vi khuẩn Acetobacter .................................................................. 9
1.2.2.2. Giống vi khuẩn lên men lactic ........................................................... 10
1.2.2.3. Nấm men ............................................................................................ 11
1.3.1. Trên thế giới............................................................................................... 12
1.3.2. Ở Việt Nam ................................................................................................ 14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 17
2.1.1. Mẫu thực vât .............................................................................................. 17
2.1.2. Mẫu vi sinh vật........................................................................................... 17
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 17
2.1.4. Hóa chất và các loại môi trƣờng ................................................................. 17

2.1.5. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................... 18
2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .................................................................. 18
2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh ................................................................................... 18
2.2.1.1. Phƣơng pháp phân lập ......................................................................... 18
2.2.1.2. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram, nhuộm đơn. ....... 19
2.2.1.3. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào sống trên thạch đĩa. ........................ 20


2.2.1.4. Bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng............................................ 20
2.2.1.5. Phƣơng pháp hoạt hóa giống................................................................ 20
2.2.1.6. Phƣơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men ......................... 21
2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh ................................................................................ 21
2.2.2.1. Phƣơng pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH
có phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị ....................................................... 21
2.2.2.2. Đo hàm lƣợng chất khô bằng khúc xạ kế ............................................. 21
2.2.2.3. Phát hiện hoạt tính catalaza.................................................................. 22
2.2.2.4. Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic ................................................ 22
2.2.2.5. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose ................................................. 22
2.2.3. Phƣơng pháp cảm quan .............................................................................. 23
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích thống kê................................................................. 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................... 26
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè
Ngọc Thanh ....................................................................................................... 26
3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic ............. 26
3.1.1.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter............................................................. 26
3.1.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha tốt .......... 34
3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men ......................................................... 35
3.1.2.1. Phân lập các chủng nấm men ............................................................... 35
3.1.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha tốt ......... 36
3.2. Động thái sinh trƣởng chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 ..................... 39

3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến lên men kombucha.......................... 40
3.3.1. Nhiệt độ lên men ........................................................................................ 40
3.3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men kombucha ............ 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 45
1. Kết luận .................................................................................................................. 45
2. Kiến nghị ................................................................................................................ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 46


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá trà ............................................................................. 8
Bảng 2.1. Công thức của các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ...... 18
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha ................. 24
Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu................................................. 25
Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ........................ 23
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng phân lập đƣợc .......... 28
Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính 9 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ
dịch trà Kombucha từ chè Ngọc Thanh ....................................... 34
Bảng 3.3. Bảng hàm lƣợng acid tổng số và chất lƣợng cảm quan sản
phẩm của 9 chủng vi khuẩn ........................................................ 35
Bảng 3.4. Kết quả phân lập các chủng nấm men ........................................... 36
Bảng 3.5. Hoạt lực lên men của các chủng nấm men .................................... 37
Bảng 3.6. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm
men M1 ........................................................................................ 39


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sản phẩm trà Kombucha ................................................................. 3
Hình 1.2. Lá chè tƣơi...................................................................................... 7
Hình 3.1. Lá chè thu mẫu ............................................................................. 27

Hình 3.2. Dịch kombucha lên men tự nhiên từ chè Ngọc Thanh ................... 27
Hình 3.3. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A7 (x1000) ................................ 29
Hình 3.4. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A5 (x1000 ) ................................ 29
Hình 3.5. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A1 (x1000) ................................ 30
Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn A4 (x1000) ................................ 30
Hình 3.7. Khả năng oxy hóa acetate của chủng vi khuẩn A1 ........................ 30
Hình 3.8. Định tính acid acetic ..................................................................... 31
Hình 3.9. Thử hoạt tính catalaza ................................................................... 32
Hình 3.10. Mẫu màng thử hoạt tính phát hiện khả năng tổng hợp cellulose .. 33
Hình 3.11. Hình thái tế bào học chủng nấm men M1 (x1000) ....................... 37
Hình 3.12. Hình thái tế bào học chủng nấm men M2 ( x1000) ...................... 37
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn chiều cao cột kết lắng của các chủng nấm
men........................................................................................... 38
Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn
A1 và chủng nấm men M1 .......................................................... 39
Hình 3.15. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót ở các nhiệt
độ lên men .................................................................................. 40
Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ở các
nhiệt độ lên men ......................................................................... 41
Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 9
ngày lên men ở các nhiệt độ khác nhau ....................................... 41


Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót phụ thuộc
vào hàm lƣợng đƣờng ................................................................. 42
Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số phụ
thuộc vào hàm lƣợng đƣờng ....................................................... 43
Hình 3.20. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha ở các
hàm lƣợng đƣờng khác nhau....................................................... 43

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
1. ATP

Adenozin triphotphat

2. STT

Số thứ tự

3. SCOBY

Symbiotic colony of Bacteria and Yeast

4. NADP

Nicotiamide adenine

5. Nxb

Nhà xuất bản

6. TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cùng với xu hƣớng phát triển mới, khi vấn đề sức khỏe con ngƣời đƣợc

đặt lên hàng đầu, thì các loại thực phẩm gần gũi với thiên nhiên ngày càng
đƣợc ƣa chuộng. Trong đó dòng sản phẩm lên men đang dần chiếm ƣu thế.
Đối với ngƣời Việt Nam, trà đã trở nên khá quen thuộc và gần gũi. Đã có
nhiều loại thức uống đƣợc chế biến từ trà nhƣng sản phẩm trà lên men thì hầu
nhƣ còn mới với ngƣời Việt Nam.
Trà lên men Kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở các
nƣớc Đông Âu, nó đƣợc biết đến là một loại đồ uống có lợi cho sức khỏe.
Kombucha là một cấu trúc có dạng nhƣ thạch màu xám do sự cộng sinh giữa
nấm men và vi khuẩn. Trên thế giới, kombucha đƣợc sản xuất trên quy mô
công nghiệp và đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu liên quan. Ở Việt
Nam đã có bán các loại kombucha dƣới dạng đóng chai, đồ hộp, nƣớc giải
khát nhập khẩu từ nƣớc ngoài.... Lên men kombucha tại các hộ gia đình mới
chỉ manh nha xuất hiện với các nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ trà đƣờng,
lipton, trà xanh....
Chất lƣợng và thành phần kombucha phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong
đó việc lựa chọn chủng giống là yếu tố đầu tiên và có vai trò quan trọng cho
quá trình sản xuất kombucha. Ở Việt Nam, các nghiên cứu khoa học về lên
men kombucha vẫn còn rất hạn chế, đặc biệt là về các vi sinh vật lên men
kombucha trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ
chè Ngọc Thanh”.

1


2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men
kombucha từ chè Ngọc Thanh thơm ngon, bổ dƣỡng.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ

chè Ngọc Thanh
3.2. Động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến lên men kombucha
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm ra một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men
kombucha thơm ngon, bổ dƣỡng trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng Ngọc
Thanh.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng lá chè xanh khu vực xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh
Vĩnh Phúc lên men kombucha phục vụ cho đời sống nhân dân, góp phần
nâng cao giá trị cây chè. Tạo ra sản phẩm mới góp phần làm đa dạng các sản
phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngƣời tiêu dùng. Tận dụng
đƣợc nguồn nguyên liệu rẻ tiền, lên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng,
có lợi cho sức khỏe con ngƣời.
5. Điểm mới của đề tài
Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 có thể
dùng cho lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh tốt. Nghiên cứu ảnh hƣởng
của nhiệt độ và hàm lƣợng đƣờng bổ sung cho dung dịch nƣớc chè Ngọc
Thanh lên men kombucha.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về sản phẩm kombucha
Trà “thủy sâm” kombucha là một loại nƣớc uống có lợi cho sức khỏe.
Đây là một cấu trúc có dạng nhƣ thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm

men và vi khuẩn [15].
Nấm kombucha là một khối vi sinh vật đƣợc phân loại theo tên khoa
học là “Zoogleal mat” liên kết với nhau thành màng phủ kín trên bề mặt nƣớc
trà đƣờng. Trong quá trình lên men, màng nấm kombucha lớn dần tạo thành
khối dày giống nhƣ một cái bánh, thƣờng đƣợc gọi là “nấm”, “cái dấm” hoặc
bằng các từ viết tắt SCOBY (Symbiotic colony of Bacteria and Yeast: khối
cộng sinh của vi khuẩn và nấm men). Các vi khuẩn và nấm men trong nấm
kombucha làm chuyển hóa đƣờng trong dung dịch nƣớc trà đƣờng thành rƣợu
và axit hữu cơ, và có thể một số chất tan từ trà cũng đƣợc chuyển hóa trong
quá trình lên men, tạo thành một loại nƣớc giải khát có độ cồn thấp, vị chua
ngọt, chát nhẹ. Các vi sinh vật biến đổi đƣờng thành gluconic acid, đồng thời
sản xuất ra một lƣợng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acetic
acid. Thành phần trà sau cùng chứa: acid folic, gluconic, cacbonic, glucuronic,
malonic... và lƣợng lớn vitamin B.

Hình 1.1. Sản phẩm trà Kombucha

3


1.1.1. Quá trình lên men kombucha
Quá trình lên men kombucha gồm hai quá trình xảy ra đồng thời là lên
men rƣợu và lên men acetic với sự tham gia của nấm men và vi khuẩn acetic [9].
Nấm men có khả năng chuyển hóa đƣờng thành etanol và CO 2 trong
điều kiện yếm khí. Đầu tiên, đƣờng cùng các chất dinh dƣỡng khác của môi
trƣờng lên men đƣợc hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men, khuếch tán qua
màng bán thấm vào trong tế bào. Đƣờng bị chuyển hóa qua một chuỗi phản
ứng theo con đƣờng đƣờng phân để tạo pyruvate, pyruvate bị decarboxyl dƣới
tác dụng xúc tác của enzim pyruvate decarboxylase tạo thành acetaldehyde
giải phóng CO2, acetaldehyde nhận H+ từ NADH tạo ethanol. Trong quá trình

lên men ethanol, nhiều axit hữu cơ đƣợc tạo thành. Một số axit hữu cơ đƣợc
sinh tổng hợp từ chu trình krebs nếu nhƣ quá trình lên men không diễn ra
trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các axit hữu cơ chiếm hàm lƣợng cao
nhất trong dịch lên men là: axit citric, axit malic, axit acetic, axit lactic.....
Quá trình chuyển hóa ethanol thành axit acetic trong điều kiện hiếu khí
dƣới tác dụng của enzim oxy hóa của vi khuẩn gọi là lên men acetic. Lên men
acetic là quá trình oxy hóa tuần tự ethanol chuyển thành acetaldehyde dƣới
tác dụng của enzim alcohol dehydrogenase, rồi acetaldehyde đƣợc chuyển hóa
thành hydrate acetaldehyde và sau cùng hydrate acetaldehyde bị oxy hóa
thành axit acetic.
Lên men lactic đƣợc thực hiện bởi hệ enzim của các vi khuẩn họ
Lactobacteriaceae (vi khuẩn này là vi khuẩn yếm khí hoặc vi khuẩn hiếu khí).
Phụ thuộc vào hệ enzim của từng nòi vi khuẩn trong môi trƣờng lên men hoặc
chỉ có axit lactic (lên men đồng hình) hoặc ngoài axit lactic còn có các sản
phẩm khác và CO2 (lên men dị hình).

4


1.2.2. Thành phần và công dụng của kombucha
Trà kombucha chứa nhiều loài vi sinh vật khác nhau cùng với các axit
hữu cơ thông thƣờng, enzim có lợi, amino axit và polyphenol. Phụ thuộc vào
các vi sinh vật, trà kombucha có thể chứa các thành phần nhƣ: acid acetic,
acid butyric, acid gluconic, acid glucuronic, acid lactic, acid malic, acid
oxalic,... nhiều enzyme có lợi và vitamin nhóm B ( B1, B2, B3, B6, B12).
Trong quá trình lên men yếm khí, trà kombucha chứa một lƣợng cồn khác
nhau từ 0,5 – 1,5% phụ thuộc vào thời gian lên men yếm khí và vi sinh vật.
Trà kombucha giúp tăng sức chịu đựng dẻo dai của cơ thể, làm giảm đau cơ,
triệu chứng mệt mỏi. Nhờ sản sinh axit lactic, giúp tăng lƣợng vi khuẩn có lợi
cho đƣờng ruột, tăng nhanh quá trình lên men trong ruột, ngừa táo bón, nhiễm

trùng đƣờng ruột, kiết lị, rối loạn tiêu hóa....Trà kombucha tăng tính đàn hồi
cho da, làm màu da tƣơi sáng hơn. Acid glycuronic kết hợp với các độc tố
trong gan làm chúng dễ tan trong nƣớc, sau đó bài tiết qua nƣớc tiểu giúp giải
độc cơ thể. Ngoài ra, kombucha còn có tác dụng kháng sinh, chống trầm cảm,
chữa thiếu ngủ, giúp gia tăng thị lực....[47].
Nhiều nghiên cứu cho thấy, sản phẩm trà kombucha có lợi cho sức
khỏe hơn so với những sản phẩm lên men từ sữa và có khả năng nhƣ một
chất kháng sinh, kháng virut, kháng nấm. Ngoài ra, còn giúp giảm stress và
phục hồi chức năng gan. Nhiều báo cáo cho biết uống trà kombucha làm
giảm cao huyết áp, chống lại bệnh viêm khớp, xơ cứng động mạch, bệnh hen
suyễn, bệnh viêm phế quản, tăng hệ miễn dịch cho cơ thể và chữa bệnh ung
thƣ…. Sử dụng kombucha có lợi cho dạ dày, ruột và các hoạt động của hệ nội
tiết, giúp bài tiết độc tố, ngăn ngừa xơ cứng động mạch, giảm căng thẳng và
các vấn đề về lão hóa. Nó cũng có thể có tác dụng nhƣ thuốc nhuận tràng, làm
giảm nguy cơ mắc các bệnh thấp khớp, bệnh gút, bệnh trĩ [15]. Trong những

5


nghiên cứu gần đây còn chỉ ra rằng kombucha có khả năng liên kết với các
gốc tự do và chống oxy hóa [24].
Trà thủy sâm kombucha là loại nƣớc uống có lịch sử lâu đời ở nhiều
nƣớc và thấy có lợi cho sức khỏe. Tuy nhiên chƣa thấy tài liệu khoa học chính
thức nào công bố về hiệu quả chữa bệnh. Sử dụng kombucha không có phản
ứng phụ và nên uống sau mỗi bữa ăn, mỗi lần 100ml, ngày 2 lần.
1.2. Tổng quan về nguyên liệu, đối tƣợng nghiên cứu
1.2.1. Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
Cây chè Camellia sinensis (L.) có nguồn gốc ở khu vực gió mùa Đông
Nam Á và có lịch sử phát triển cách đây gần 5000 năm. Việt Nam là nƣớc có
điều kiện khí hậu, địa lí, đất đai phù hợp cho sự sinh trƣởng, phát triển của

cây chè. Từ lâu, cây chè và các sản phẩm từ chè đã rất gần gũi, phổ biến trong
đời sống của ngƣời dân Việt Nam.
Ngọc Thanh là xã miền núi duy nhất của thị xã Phúc Yên tỉnh Vĩnh Phúc.
Với địa hình trung du miền núi Bắc bộ, Ngọc Thanh tập chung vào gieo trồng
các loại cây có hiệu quả kinh tế cao. Trong đó, cây chè là một trong những cây
đƣợc chú trọng. Toàn xã có 470 mẫu chè, cho 500 tấn chè mỗi năm.
1.2.1.1. Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè
Thời vụ
Vụ Xuân (tháng 3-4): Hái chừa 2 lá và lá cá, tạo tán bằng những búp
cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.
Vụ Hè Thu (tháng 5 - 10): Hái chừa 1 lá và lá cá, tạo tán bằng những
búp cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.
Vụ Thu Đông (Tháng 11): hái chừa lá cá , tháng 12 hái cả lá cá.
Với các giống chè có dạng thân bụi, sinh trƣởng đỉnh đều có thể hái
kéo hay hái bằng máy để nâng cao năng suất lao động.

6


Chu kỳ phát triển
Chu kỳ của một cây chè bao gồm ba giai đoạn. Giai đoạn đầu tiên là
giai đoạn cây non hay giai đoạn thiết kế cơ bản. Các bụi chè phải trồng 3-4
năm kể từ khi gieo trồng mới phát triển thành cây trƣởng thành. Sau đó là giai
đoạn cây lớn và giai đoạn cuối là giai đoạn chè già cỗi. Giai đoạn chè lớn kéo
dài 20 – 30 năm, tuỳ giống, điều kiện đất đai, dinh dƣỡng và khai thác. Chăm
sóc kém và khai thác nhiều sẽ làm cho cây chè bị suy thoái, già trƣớc tuổi.
Đây là giai đoạn chè cho năng suất cao nhất. Sau đó là giai đoạn chè già cỗi,
cây chè suy yếu dần, lá nhỏ, búp ít, chóng mù xoè, hoa quả nhiều, cành tăm
hƣơng nhiều, chồi gốc mọc nhiều.

Hình 1.2. Lá chè tƣơi
1.2.1.2. Thành phần hóa học của lá trà
Trong lá chè tƣơi có chứa nhiều thành phần hóa học nhƣ: tinh dầu, các
dẫn xuất polyphenolic (flavonoid, catechol, tannin), alkaloid là cafein,
theophyllin, theobromin, xanthin, và các vitamin C, B1, B2, B3.
Các thành phần trong nƣớc chè xanh có tác dụng lớn đối với sức khỏe.
Chất catechin có tác dụng giảm nguy cơ gây ung thƣ, giảm kích thƣớc khối u,
chống phóng xạ, giảm lƣợng đƣờng máu, giảm cholesterol, diệt khuẩn, diệt
virut cúm.... Chè xanh chứa chất cafein có tác dụng chống buồn ngủ, giảm
mệt mỏi và lợi tiểu. Vitamin C làm tăng sức đề kháng, vitamin nhóm B giúp

7


cho quá trình trao đổi cacbon hydrat. Flavonoid có tác dụng giảm huyết áp,
tăng độ bền vững thành mạch....[45].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá trà [9]
Thành phần

Hàm lƣợng (% chất khô)

Nƣớc

75 - 80

Tổng polyphenol

25 - 30

Flavanols

(-) Epigallocatechin gallate (EGCG)

8 - 12

(-) Epicatechin gallate (ECG)

3-6

(-) Epigallo catechhin (EGC)

3-6

(-) Epicatechin

1–3

(+) Catechin (C)

1-2

(+) Gallocatechin (GC)

3–4

Caffeine

3–4

Axit hữu cơ ( ctric, malic, oxalic,...)

0,5 – 0,6

Đƣờng ( glucose,

4–5

fructose,saccharose..)
Xơ ( cellulose, hemicellulose, lignin)

4-7

1.2.2. Hệ vi sinh vật
Kombucha đƣợc tạo thành do sự cộng sinh của các loài vi khuẩn thuộc
giống Acetobacter và các loài nấm men khác nhau. Do sự công sinh giữa
Acetobacter xylium, A. xylinoides, A. aceti ,A. pasteurianus, gluconicum [2],
[40], và nấm men nhƣ Schizosaccharomyces pombe, Kloeckera apiculata,
Saccharomycodes ludwigii, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomycea
bailii, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces lambicus, Brettanomyces
custersii và Pichiaspecies [2].

8


1.2.2.1. Giống vi khuẩn Acetobacter
Vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Acetobacteriaceae, phân bố rộng rãi
trong tự nhiên và có thể phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không khí, đất,
nƣớc, lƣơng thực thực phẩm, đặc biệt là các loại thực phẩm, hoa trái, nƣớc
trái cây và các sản phẩm lên men tự nhiên chứa ethanol nhƣ rƣợu, bia, giấm
tự nhiên…
Các phƣơng pháp truyền thống trong phân loại và định danh họ

Acetobacteriaceae chủ yếu dựa vào các đặc điểm kiểu hình bao gồm các đặc
điểm hình thái, sinh lý, dinh dƣỡng và đặc điểm sinh thái.
Đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái thƣờng đƣợc khảo sát gồm màu sắc, hình dạng
khuẩn lạc, trạng thái nhuộm Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thƣớc tế
bào. Ngoài ra, số lƣợng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong
định danh vi khuẩn acetic.
Đặc điểm sinh thái
Giống vi khuẩn Acetobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể
phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không khí, đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm,
dấm, rƣợu, bia, hoa quả …. Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã đƣợc
phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế.
Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thƣờng gắn liền với các nguồn
dinh dƣỡng chứa đƣờng hay alcohol nhƣ các loại hoa, quả, bia, rƣợu và các
nơi sản xuất giấm. Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp, đặc điểm sinh thái
đƣợc đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài. Cụ thể nhƣ
Acidomonas chỉ có thể phân lập đƣợc trong bùn hoạt tính có methanol;
Granulibacter đƣợc tìm thấy trong cơ thể ngƣời bị u hạch.

9


Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Vi khuẩn Acetobacter có thể di động (có tiêm mao đơn hoặc chu mao)
hoặc không di động (không có tiêm mao), không sinh nha bào tử, hiếu khí bắt
buộc, chịu đƣợc độ axit cao.
Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hóa nhiều nguồn thức ăn
cacbon khác nhau nhƣng không sử dụng đƣợc tinh bột. Có khả năng tạo váng
trên môi trƣờng lỏng.
Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton.

Một số loài đòi hỏi một số axit amin nhất định nhƣ axit pantothenic và các
chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S,…. ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất
hữu cơ. Do đó bia, nƣớc mạch nha, nƣớc trái cây….là nguồn dinh dƣỡng rất
tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter [9].
Ngoài khả năng oxy hóa ethanol thành axit acetic, một số loài
Acetobacter còn tổng hợp đƣợc vitamin B1, vitamin B2, oxy hóa a.sorbic thành
đƣờng sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)….[9].
Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid đƣợc phân
biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa nhƣ: Oxy hóa acetate tạo CO 2 và H2O;
phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau; phát
triển sinh khối trong các môi trƣờng chứa D - glucose 30%; acetic acid 0,35%
...[6]; phản ứng catalase dƣơng tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men;
không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer;

chuyển hóa glucose thành

gluconic; không sinh sắc tố nâu, tổng hợp cellulose; chuyển hóa glycerol
thành dihydroxyaceton.
1.2.2.2. Giống vi khuẩn lên men lactic
Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực
khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đƣờng đơn và đƣờng đôi nhƣng không

10


có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó
cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu
đặc biệt về chất dinh dƣỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Nhiệt
độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C. Tuy nhiên mỗi loài có

khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn
lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [6].
1.2.2.3. Nấm men
Hình thái và cấu tạo tế bào
Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ… kích
thƣớc rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thƣớc trung bình: Chiều
dài: 9 – 10μm, chiều rộng: 2 – 7μm. Hình dạng và kích thƣớc tế bào thay đổi,
không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện
nuôi cấy khác nhau.
Sự sinh sản của nấm men
Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản
bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh
sản đơn tính).
Phân loại nấm men
Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi
imporfecti).
Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; Giống
Endomyces; Giống Schizosaccharomyces.
Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococus (toscula, tornlopsis);
Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã đƣợc xếp vào lớp nấm mốc);
Rhodotorula [7].

11


Phần lớn các loài nấm men thuộc về ngành nấm túi (Ascomycota), một
số ít loài thuộc ngành nấm đảm (Basidimycota). Saccharomyces là một chi
nấm men đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm. Trên 1000 loài nấm
men đã đƣợc miêu tả, loài nấm men đƣợc con ngƣời sử dụng nhiều nhất là

Saccharomyces cerevisiae trong sản xuất rƣợu vang, bánh mì, bia… từ hàng
nghìn năm trƣớc.
Saccharomyces cerevisiae phổ biến trong quá trình lên men nƣớc quả,
chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nƣớc quả khi lên men.
Nguồn dinh dƣỡng cacbon của loại này là đƣờng, acid hữu cơ và những tác
nhân sinh trƣởng là acid pantotinic, biotin, thiamin, piridoxin…
Trong sản xuất kombucha, nấm men Saccharomyces sẽ biến đổi đƣờng
thành rƣợu và vi khuẩn Acetobacter sẽ tiếp tục chuyển hóa rƣợu thành acid.
Nấm men và vi khuẩn tiếp tục cộng sinh tạo nên sinh khối SCOBY. Trong
thời gian lên men, SCOBY sẽ tăng sinh khối cùng với sự hoạt động của nấm
men và vi khuẩn. Quá trình này tạo cho sản phẩm có mùi vị đặc trƣng [9].
1.3. Tình hình nghiên cứu về kombucha trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
Từ 1928, Hermann đã ghi nhận việc định danh 2 chủng nấm men
Bacterium xylinum và B. xylinoides và một vi khuẩn B. gluconicum (đƣợc đặt
tên do có khả năng chế tạo gluconic acid). Các nhà nghiên cứu sau đó đã xác
định Kombucha là một sự hợp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum với
những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối nhƣ
tổ chim. Những chủng vi khuẩn và nấm men đƣợc tìm thấy trong kombucha
nhƣ: Acetobacter ketogenum, Pichia fermentans, Saccharomyces apiculatus,
S. ludwigii, B. xylinoides, Schizosaccharomyces pombe và Acetobacter
ketogenum (theo List, P.H & L. Horhammer. 1973 Hagers Hand buck der
Pharmazcutischen Praxis. New York: Sprin ger – verlag) [44].

12


Năm 1965, Hesseltine đã phân lập đƣợc chủng vi khuẩn

sp

Acetobacter. (NRRL B-2357) và 2 loại men (NRRL YB-4810, NRRL YB4882) từ mẫu Kombucha có nguồn gốc từ Thụy Sĩ và sử dụng các vi sinh vật
này để sản xuất trà Kombucha [22].
Hầu hết các vi khuẩn lên men kombucha thuộc chi Acetobacter và
Gluconobacter. Đa số là các vi khuẩn Acetobacter xylinum (Danielova 1954;
Konovalov và Semenova 1955; Sievers và những ngƣời khác 1995; Roussin
1996) [14], [25], [36], [38]. Chúng tạo ra một màng nổi cellulosic trên bề mặt
dịch lên men (Markov và et al 2001) [29]. Năm 1995, Sievers và cộng sự đã
công bố các chủng vi sinh vật trong lớp cellulose là cộng sinh của A. xylinum
và một sp Zygosaccharomyces [38]. Đa số các vi khuẩn acid acetic đƣợc tìm
thấy trong các loại nấm trà là A. xylium, A. pasteurianus, A. aceti, và
Gluconobacter oxydans (Liu và cộng sự 1996) [28]. Trong đó,
Gluconacetobacter sp. A4 (G. sp. A4), có khả năng tạo ra D-saccharic axit1,4-lactone (DSL) mạnh, là loài vi khuẩn đƣợc phân lập chủ yếu từ
Kombucha trong báo cáo của Yang và cộng sự (2010) [42]. Dutta và Gachhui
(2006, 2007) đã phân lập đƣợc vi khuẩn cố định đạm Acetobacter
nitrogenifigens sp, chủng có khả năng sản xuất cellulose mạnh là
Gluconacetobacter kombuchae sp. từ trà kombucha [16], [17].
Năm 2014, một cuộc điều tra của Marsh và cộng sự chỉ ra rằng các
chủng vi khuẩn chiếm ƣu thế trong 5 mẫu Kombucha (hai mẫu từ Canada,
một mẫu từ Ireland, một mẫu từ Mỹ và một mẫu từ Anh) là
Gluconacetobacter (trên 85% trong hầu hết các mẫu) và Lactobacillus (lên
đến 30%) loài. Acetobacter chỉ chiếm số lƣợng rất nhỏ (dƣới 2%) [30].
Ngoài vi khuẩn acid acetic có nhiều loài nấm men trong Kombucha.
Một loạt các nấm men đã đƣợc báo cáo bao gồm các loài thuộc chi
Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces,

13


Brettanomyces/Dekkera, Candida, Torulospora, Koleckera, Pichia, Mycotorula,

và Mycoderma. Các loài nấm men Saccharomyces đã đƣợc xác định là
Saccharomyces sp. (Konovalov và cộng sự 1959; Kozaki và cộng sự 1972)
[25], [26] và Saccharomyces cerevisiae (Herrera và Calderon-Villagómez
1989; Liu và cộng sự 1996; Markov và cộng sự 2001; Safak và cộng sự 2002)
[21], [28], [29], [37], Saccharomyces bisporus (Markov và cộng sự 2001)
[29], Saccharomycoides ludwigii (Reiss 1987 [34]; Markov và cộng sự 2001
[29]; Ramadani và Abulreesh 2010 [33]), Schizosaccharomyces pombe (Reiss
1987 [34]; Teoh và cộng sự 2004 [41]), Zygosaccharomyces sp. (Sievers và
cộng sự 1995 [38]; Markov và cộng sự 2001 [29]; Marsh và cộng sự 2014
[30]), Zygosaccharomyces rouxii (Herrera và Calderon-Villagómez 1989), và
Zygosaccharomyces bailii (Herrera và Calderon-Villagómez 1989; Liu và
cộng sự 1996; Jayabalan và cộng sự 2008) [21], [28], [23].
Một cuộc kiểm tra 2 sản phẩm Kombucha thƣơng mại và 32 sản phẩm
tự lên men từ các hộ gia đình ở Đức (Mayser và cộng sự, 1995 [31]) thấy rằng
các loài nấm

men chủ yếu là Brettanomyces, Zygosaccharomyces, và

Saccharomyces spp. Roussin (1996) [36] xác định Zygosaccharomyces và S.
cerevisiae là các loại nấm men điển hình trong Kombucha Bắc Mỹ. Kurtzman
và cộng sự (2001) [27] đã phân lập đƣợc chủng nấm men ascosporogenous,
Zygosaccharomyces kombuchaensis sp. n. (Loại chủng NRRL YB-4811, CBS
8849), từ Kombucha.
Năm 2010, Ramadani và Abulreesh đã phân lập và xác định đƣợc 4 loại
men: Candida guilliermondi, Candida colleculosa, Candida kefyr, và
Candida krusei từ mẫu Kombucha địa phƣơng ở Saudi Arabia [33].
1.3.2. Ở Việt Nam
Hiện nay, các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn khá mới mẻ,
các công trình nghiên cứu về kombucha có rất ít, đặc biệt là các nghiên cứu về

14


hệ vi sinh vật lên men kombucha. Đa phần các nghiên cứu tập chung vào thành
phần và công dụng của kombucha. Theo tác giả Lê Kim Phụng, lợi ích từ trà
thủy sâm rất nhiều. Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm (nấm men) phát
triển dƣới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi
nhanh trong môi trƣờng nƣớc chè (trà) pha đƣờng. Thành phần trà kombucha
có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ [43]. Tuy nhiên theo
tác giả Hà Văn Hùng, Phó Viện trƣởng Viện Y dƣợc học dân tộc thành phố Hồ
Chí Minh thì cho đến nay Viện cũng chƣa có công trình nào nghiên cứu về
thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó [46].
Năm 2010, tác giả Thạc sĩ Trần Thị Ngọc Mai, trƣờng đại học Kỹ thuật
Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sản xuất
kombucha”. Trong nghiên cứu tác giả đã khảo sát điều kiện cộng sinh giữa vi
khuẩn và nấm men, các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly trà trong
nƣớc, quá trình thuần hóa hệ cộng sinh vi khuẩn, nấm men và các yếu tố ảnh
hƣởng tới quá trình lên men kombucha [9]. Năm 2013, tác giả Ngô Xuân
Cƣờng, Nguyễn Thị Bích Ngọc thực hiện đề tài “Nghiên cứu phƣơng pháp
lên men nƣớc giải khát từ chè xanh”. Trong đề tài, tác giả so sánh phép đo
nồng độ của chất tan trong một dung dịch chứa các chất tan của chè và đƣờng
saccharose cho thấy rằng phƣơng pháp làm bay hơi nƣớc sau đó cân cho kết
quả chính xác hơn so với đo bằng khúc xạ kế. Cấy thử nghiệm một chủng vi
khuẩn Komagatabacter kết hợp với 3 chủng nấm men Zygosaccharomyces
fermentati, Hanseniaspora pseudoguilliermondii, Dekkera bruxellensis vào
dung dịch chè và đƣờng saccharose, lên men ở nhiệt độ 25 – 27oC, thời gian
lên men 3-6 ngày, thu đƣợc dung dịch có độ chua – ngọt tƣơng tự kombucha [1].
Các công trình nghiên cứu về hệ vi sinh vật kombucha còn khá ít. Năm
2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự, Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh
đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả

15


tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột”. Trong đề tài, hệ vi sinh vật trong
kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời
khảo sát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột nhƣ:
cân nặng, tổng lƣợng hồng cầu, tổng lƣợng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí
nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức. Kết luận: sản phẩm trà kombucha có tác
dụng tăng cƣờng sức khỏe, không gây ảnh hƣởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý
của chuột [46].
Năm 2013, tác giả Lê Thị Huệ, đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, thực hiện đề
tài “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà
Thái Nguyên” đã phân lập đƣợc 20 mẫu vi khuẩn, tuyển chọn sơ bộ 9 mẫu vi
khuẩn Acetobacter, định loại gồm 3 chủng: A. xylinus, A. aceti, A.
pasteurianus [6]. Cùng năm 2013, tác giả Lâm Thị Hồng Liên, đại học Sƣ
phạm Hà Nội 2, thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men
kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang” đã phân lập đƣợc 25 mẫu nấm men,
sơ bộ định loại 5 chủng nấm men Saccharomyces M1; Saccharomyces M2;
Schizosaccharomyces M3; Schizosaccharomyces M4; Saccharomyces M5.
Tuyển chọn 2 chủng nấm men M1 và M2 phù hợp cho quá trình lên men
kombucha [7].
Năm 2014, tác giả Phạm Hồng Quang và cộng sự đã thực hiện đề tài
“Phân lập, tuyển chọn nấm men và vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men
trà thủy sâm (kombucha)”. Nghiên cứu này đã phân lập đƣợc 23 dòng nấm
men và 33 dòng vi khuẩn acid acetic, trong đó dòng nấm men và vi khuẩn lên
men tốt nhất đƣợc xác định thuộc loài Saccharomyces cerevisiae và
Acetobacter aceti với điều kiện lên men pH ban đầu 5,5, ủ ở nhiệt độ 30 oC,
chủng giống với mật độ 105 tế bào/ml, nồng độ đƣờng 15 oBx trong thời gian 7
– 9 ngày [8]. Nhƣ vậy, các nghiên cứu về hệ sinh vật lên men kombucha ở

Việt Nam còn khá ít. Các nghiên cứu chủ yếu ở quy mô nhỏ.

16