Ảnh hưởng của hàm lượng đường, nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo và mơ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
----------

LÊ THỊ HUỆ

ẢNH HƢỞNG CỦA HÀM LƢỢNG ĐƢỜNG,
NHIỆT ĐỘ TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
VANG TÁO MÈO VÀ MƠ

UẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên nghành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

TS. Phƣơng Phú Công

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự thành kính, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS.
Phƣơng Phú Công, Cục Khảo thí - Bộ Giáo dục và Đào tạo, ngƣời đã gợi ý đề
tài và tận tình hƣớng dẫn động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của của các thầy cô trong tổ Vi
sinh cùng các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN đã giúp đỡ em trong quá trình
học tập và hoàn thành khóa luận. Em cũng cảm các bạn sinh viên trong nhóm
Vi sinh đã cùng em học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt
thời gian em thực hiện khóa luận.

Hà Nội, ngày

tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Lê Thị Huệ


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây
là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều
đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép
hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dƣới sự
hƣớng dẫn của TS. Phƣơng Phú Công.
Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi
xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Nếu
sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Xin trân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Lê Thị Huệ


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Đọc là

Viết tắt
ĐHSP

Đại học sƣ phạm

HL

Hàm lƣợng

H

Giờ

Nxb GD

Nhà xuất bản giáo dục

Nxb KHKT

Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật

T1,2,3

Tập 1, tập 2, tập 3

SLTB

Số lƣợng tế bào

Tb

Tế bào

STT

Số thứ tự

V

Thể tích


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2
4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tế ........................................................................................ 3
5. Điểm mới ................................................................................................... 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1. Tổng quan về rƣợu vang .......................................................................... 4
1.1.1. Thành phần chủ yếu của rƣợu vang ...................................................... 4
1.1.2. Phân loại rƣợu vang .............................................................................. 4
1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rƣợu vang ........................................................... 5

1.1.4. Tàng trữ rƣợu vang ............................................................................... 7
1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rƣợu vang và bệnh vang .... 7
1.2.1. Nấm men .............................................................................................. 7
1.2.2. Vi khuẩn ............................................................................................... 9
1.2.3. Nấm mốc .............................................................................................. 9
1.2.4. Bệnh vang .......................................................................................... 10
1.3. Những biến đổi sinh lí, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men rƣợu
vang ....................................................................................................... 10
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng, phát triển của nấm
men .................................................................................................. 11


1.4.1. Nguồn cacbon ..................................................................................... 11
1.4.2. Nguồn nito vô cơ ................................................................................ 11
1.4.3. Nguồn photpho vô cơ ......................................................................... 11
1.4.4. Nguồn nguyên tố khoáng khác ........................................................... 12
1.4.5. Nguồn oxi ........................................................................................... 12
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men rƣợu vang......................... 12
1.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 12
1.5.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cồn và pH..................................................... 13
1.5.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng ...................................................... 13
1.5.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng men giống ................................................ 13
1.6. Tình hình sản xuất rƣợu vang ............................................................... 13
1.6.1. Trên thế giới ....................................................................................... 13
1.6.2. Ở Việt Nam ........................................................................................ 14
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 15
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 15
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .............................................................. 15
2.1.3. Các loại môi trƣờng .......................................................................... 15

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 16
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn và bảo quản, nhân giống nấm men
theo phƣơng pháp Pasteur trên môi trƣờng thạch đĩa ......................... 16
2.2.2. Phƣơng pháp hoạt hóa giống .............................................................. 17
2.2.3. Phƣơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men ........................ 18
2.2.4. Phƣơng pháp quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học
(  1000 lần) ......................................................................................... 18
2.2.5. Phƣơng pháp xác định nồng độ pH bằng giấy thử pH và máy đo pH ....... 18
2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng bằng khúc xạ kế và xác định
độ cồn bằng cồn kế ............................................................................. 18
2.6.7. Phƣơng pháp xử lí kết quả thu đƣợc bằng thống kê toán học .............. 18


2.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 19
2.4. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 19
2.5. Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 19
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 20
3.1. Phân lập, tuyển chọn và xác định tên khoa học của chủng nấm men
lên men vang táo mèo và mơ ................................................................. 20
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo
mèo và mơ ......................................................................................... 20
3.1.2.Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo và mơ
........................................................................................................... 23
3.2. Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo và mơ .............................. 27
3.2.1. Động thái phát triển của chủng S.ceresiviae P2 .................................................... 27
3.2.2. Động thái lên men vang táo mèo và mơ của chủng S.cerevisiae P2 ..... 29
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men
vang táo mèo và mơ .............................................................................. 31
3.3.1. Khả năng lên men với các loại đƣờng khác nhau ................................ 31
3.3.2. Khả năng lên men ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau ........................ 33

3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình lên men táo mèo và
mơ ........................................................................................................ 34
3.5. Ứng dụng lên men vang táo mèo và mơ với quy mô phòng thí nghiệm . 35
3.5.1. Lên men quy mô phòng thí nghiệm ................................................... 35
3.5.2. Quy trình sản xuất rƣợu vang táo mèo và mơ quy mô phòng thí
nghiệm................................................................................................ 37
3.5.3. Thuyết minh quy trình sản xuất vang táo mèo và mơ .......................... 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 39
1. Kết luận .................................................................................................... 39
2. Kiến nghị .................................................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 40


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của các loại quả thƣờng dùng để lên
men rƣợu ............................................................................................ 5
Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản của dịch quả táo mèo ........................ 6
Bảng 1.3. Thành phần hóa học cơ bản của dịch quả mơ ............................... 6
Bảng 3.1. Các tỉ lệ phối hợp 2 nguyên liệu táo mèo và mơ ......................... 22
Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của ba chủng nấm men ................................... 24
Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của 3 chủng nấm men trong môi
trƣờng lên men ................................................................................ 25
Bảng 3.4. Hoạt lực lên men của của 3 chủng nấm men ở các độ pH
khác nhau ......................................................................................... 25
Bảng 3.5. Khả năng kết lắng của 3 chủng nấm men ................................... 26
Bảng 3.6. Khả năng tạo hƣơng thơm và độ trong sản phẩm của 3
chủng nấm men ................................................................................ 26
Bảng 3.7. Khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng S.ceresiviae P2
trong môi trƣờng nhân giống ............................................................ 28
Bảng 3.8. Sự biến đổi của nồng độ cồn, hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng

CO2 giải phóng trong dịch lên men rƣợu vang của chủng
S.cerevisiae P2 trong 8 ngày.............................................................. 30
Bảng 3.9. Khả năng lên men các loại đƣờng của chủng S.cerevisiae P2 ...... 32
Bảng 3.10. Khả năng lên men đƣờng của chủng S.ceresiviae P2 ở các
mức khác nhau ................................................................................. 33
Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo
mèo và mơ........................................................................................ 34
Bảng 3.12. Kết quả phân tích rƣợu thành phẩm .......................................... 36


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Ảnh chụp chủng S.cerevisiae P2 trên môi trƣờng thạch đĩa ......... 21
Hình 3.2. Ảnh chụp ba chủng nấm men P1, P2, P3 trên môi trƣờng
thạch nghiêng ................................................................................... 22
Hình 3.3. Hình dạng tế bào nấm men quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi quang
học x1000 lần) ............................................................................ 23
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn động thái phát triển của chủng nấm men
S.cerevisiae P2 trong môi trƣờng nhân giống .................................... 28
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn động thái quá trình lên men vang táo mèo
và mơ của chủng S.cerevisiae P2 ...................................................... 30
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng CO2 trong
dịch lên men sau 8 ngày lên men của chủng S.cerevisiae P2 ............. 31
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn khả năng lên men các loại đƣờng của
chủng S.ceresiviae P2 ....................................................................... 32
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn khả năng lên men đƣờng của chủng
S.ceresiviae P2 ở các mức khác nhau ................................................ 33
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên
men vang táo mèo và mơ .................................................................. 35
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn kết quả phân tích rƣợu thành phẩm ............... 36

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Vang là loại đồ uống đã xuất hiện từ lâu ở nhiều quốc gia trên thế giới
nhƣng chỉ mới đƣợc du nhập vào nƣớc ta trong những năm gần đây, tuy vậy
nó đã nhanh chống có chỗ đứng vững chắc trên thị trƣờng và trở thành một
loại đồ uống không thể thiếu trong những bữa tiệc hay trong gói quà ngày lễ
tết. Nhƣng vang ngoại nhập vẫn là một mặt hàng xa xỉ và đắt đỏ với đối tƣợng
khách hàng có thu nhập thấp. Do đó, đòi hỏi chúng ta phải đào sâu nghiên cứu
để cho ra sản phẩm rƣợu vang có thể cạnh tranh đƣợc với vang ngoại và phục
vụ cho nhiều tầng lớp đối tƣợng khách hàng từ ngƣời có thu nhập thấp đến
ngƣời có thu nhập cao.
Nƣớc ta là một nƣớc nhiệt đới ẩm gió mùa, đƣợc thiên nhiên ƣu đãi với
bốn mùa hoa trái xanh tƣơi. Đặc biệt là trái cây, rất phong phú và đa dang về
chủng loại, đó thực sự là một thế mạnh mà chúng ta có đƣợc. Bên cạnh đó,
những thách thức đặt ra cũng không ít, thực trạng đƣợc mùa mất giá vẫn xảy
ra triền miên gây lao đao cho ngƣời nông dân. Để góp phần giải quyết đầu ra
cho nguyên liệu cũng nhƣ công ăn việc làm cho ngƣời lao động thì việc đƣa
mặt hàng trái cây vào dây truyền sản xuất với quy mô công nghiệp là một
trong những giải pháp hữu hiệu nhất.
Ngoài nho, nƣớc ta còn có rất nhiều loại trái cây : dâu, mơ, vải, táo
mèo… cũng thích hợp để lên men sản xuất rƣợu vang. Táo mèo là loại quả có
chứa nhiều vitamin, khoáng chất, ít béo, không chứa các chất độc hại… và
đƣợc trồng chủ yếu ở các tỉnh vùng Tây Bắc nhƣ Yên Bái, Lào Cai, Sơn La…
rất thích hợp để lên men. Trên thị trƣờng đã có rƣợu vang táo mèo, nhƣng mỗi
loại quả khi lên men sẽ cho ra một loại vang có hƣơng vị đặc trƣng. Tuy
nhiên, nếu ta biết kết hợp khéo léo giữa các loại hoa quả khác nhau (táo mèo
và mơ) thì có thể tạo ra những loại vang mới có chất lƣợng cao và hƣơng vị

1

độc đáo.
Mặt khác, nhiệt độ cũng có ảnh hƣởng rất lớn đến đời sống nấm men,
đến quá trình lên men và chất lƣợng sản phẩm. Nếu nhiệt độ quá thấp, không
chỉ quá trình lên men diễn ra chậm chạp, các cấu tử có lợi cho rƣợu vang
đƣợc hình thành ít mà sinh trƣởng của tế bào nấm men cũng giảm. Nếu nhiệt
độ quá cao, quá trình lên men sẽ ngừng lại ảnh hƣởng đến việc chuyển hóa
đƣờng thành cồn và CO2. Ngoài yếu tố nhiệt độ, pH, độ cồn thì nồng độ
đƣờng cũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hƣởng đến quá trình lên men. Khi
nồng độ đƣờng quá cao, môi trƣờng sinh axit sẽ làm rƣợu bị chua. Khi nồng
độ đƣờng quá thấp thì quá trình lên men không xảy ra.
Chính vì những lí do trên nên tôi đã quyết định chọn và tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Ảnh hưởng của hàm lượng đường, nhiệt độ tới quá trình lên men
vang táo mèo và mơ”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm đƣợc hàm lƣợng đƣờng, nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men
vang táo mèo và mơ.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
và mơ
3.2. Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo và mơ
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men vang
táo mèo và mơ
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men vang táo mèo
và mơ
3.5. Đề xuất quy trình lên men rượu vang táo mèo và mơ quy mô phòng thí
nghiệm

2

4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng
lên men vang hỗn hợp táo mào và mơ. Đây là dẫn liệu góp phần bổ sung cho
các nghiên cứu về nấm men và ứng dụng của nấm men trong đời sống.
4.2. Ý nghĩa thực tế
Tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn của địa phƣơng nhằm nâng cao thu
nhập cho đồng bào dân tộc vùng cao, sản xuất ra loại rƣợu vang phù hợp với
nhu cầu thị trƣờng, tạo chỗ đứng cho thị trƣờng vang trong nƣớc.
5. Điểm mới
Phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng nấm men S.cerevisiae P2 có khả năng
lên men vang táo mèo và mơ.
Tìm ra hàm lƣợng đƣờng ban đầu 25%, nhiệt độ 26 - 280C là thích hợp
cho quá trình lên men vang táo mèo và mơ từ chủng S.cerevisiae P2.

3


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về rƣợu vang
1.1.1. Thành phần chủ yếu của rượu vang
Rƣợu vang là loại thức uống có cồn truyền thống, đƣợc lên men từ nƣớc
ép các loại hoa quả nhƣ nho, dâu, mơ, táo mèo…
Thành phần chủ yếu của rƣợu vang bao gồm:
Cồn etanol: độ cồn của rƣợu vang từ 10% - 13%V.
Chất bổ sung: đƣờng trong rƣợu vang từ 6,2 – 13,2 g/l; chủ yếu là đƣờng
fructozo, glucozo và một ít galactozo.

Axit vô cơ và axit hữu cơ: axit tatric, axit malic, axit citric…
Rượu vang giàu vitamin: vitamin có trong nƣớc hoa quả không bị quá
trình lên men phân hủy.
Trong rƣợu vang có chứa một lƣợng muối đƣợc sinh ra từ các axit
khoáng hoặc axit hữu cơ, thêm vị tƣơi mát vào hƣơng vị của rƣợu vang.
1.1.2 Phân loại rượu vang
Rƣợu vang có rất nhiều loại, chúng rất đa dạng và phong phú tùy theo
dòng sản phẩm, tùy nguyên liệu và công nghệ khác nhau.
Căn cứ vào màu sắc: vang trắng và vang đỏ.
Căn cứ vào lượng đường tự nhiên: Vang khô (dƣới 2g đƣờng/lít rƣợu),
Vang bán khô (từ 2g-30g đƣờng/lít rƣợu), Vang mềm (từ 30g-50g đƣờng/lít
rƣợu), Vang ngọt (trên 50g đƣờng/lít rƣợu).
Theo xu hƣớng chung hiện nay thì vang đƣợc phân thành hai nhóm chính
là: vang không có gas (trong thành phẩm không có CO2) và vang có gas
(trong thành phẩm có CO2) [1], [2], [4].

4


1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
1.1.3.1. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Nguyên liệu sản xuất rƣợu vang là các loại trái cây có chứa nhiều đƣờng,
vitamin, axit hữu cơ, các chất khoáng protein… chẳng hạn nhƣ: mơ, mận,
dâu, nho, táo … Quả chín sau khi thu hoạch chọn loại quả tƣơi có chất lƣợng
tốt đem ép lấy nƣớc, nghiền nát hoặc ngâm với đƣờng để thu đƣợc dịch quả
dùng cho lên men.
Các nhà khoa học đã chứng minh rằng: 60% chất lƣợng rƣợu vang là do
nguyên liệu quyết định, 40% còn lại la do kĩ thuật. Nhƣ vậy, nguyên liệu có
vai trò quan trọng trong sản xuất rƣợu vang.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của các loại quả thường dùng

để lên men rượu [5]
Thành phần hóa học
Tên quả

Nƣớc

Đƣờng

Nho ngọt

73,1

9,88

Dâu

84,74

Vải

Axit tổng

Pectin

Talin

0,56

0,92

0,07

9,19

0,49

0,31

0,035

84,28

16,1  0,39

5,16  0,01

-

0,83

Dứa

54,3

3,9

0,6

-

-

Táo

84,6

4,81

1,47

-

-

Mơ

73,8

9,0

1,1

-

-

số

Trong đề tài nghiên cứu của mình, tôi lựa chọn hai loại quả đó là: mơ và
táo mèo.

1.1.3.2. Thành phần hóa học của dịch táo mèo và dịch mơ
Dịch quả táo mèo: quả táo mèo sau khi mua về, ta tiến hành lựa chọn
những quả vừa chín tới, không non quá, loại bỏ quả hỏng (quả bị thối, nát).

5


Quả đƣợc chọn đem rửa sạch, để ráo nƣớc, khía múi. Sau đó, cho quả vào
bình (đã đạt tiêu chuẩn vệ sinh) ngâm triết li đƣờng theo tỉ lệ 1:1. Sau 1 tháng
ta thu đƣợc dịch quả táo mèo dùng trong lên men.
Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản của dịch quả táo mèo [9]
STT Thành phần hóa học

Đơn vị

1

Đƣờng tổng số

2

Axit tổng số

3

Vitamin C

4

Nơi thu mẫu

Trung bình

Yên Bái

Sơn La

%

4,8

4,82

4,81

%

1,45

1,48

1,47

mg/l

11,0

11,4

11,2

Nƣớc

%

84,0

84,0

84,0

5

Protein toàn phần

%

0,92

0,92

0,92

6

pH

2,8

3,0

2,9

Dịch quả mơ: (Tƣơng tự nhƣ chế biến dịch táo mèo) mơ sau khi mua về,
ta tiến hành lựa chọn những quả vừa chín tới, không non quá, loại bỏ quả
hỏng (quả bị thối, nát). Quả đƣợc chọn đem rửa sạch, để ráo nƣớc, khía múi.
Sau đó, cho quả mơ vào bình (đã đạt tiêu chuẩn vệ sinh) ngâm triết li đƣờng
theo tỉ lệ 1:1. Sau 1 tháng ta thu đƣợc dịch quả mơ dùng trong lên men.
Bảng 1.3. Thành phần hóa học cơ bản của dịch quả mơ [9]
STT

Đơn vị

Thành phần hóa học

Nơi thu mẫu
(Hà Tây)

1

Đƣờng tổng số

%

9,0

2

Axit tổng hợp

%

1,10

3

Vitamin C

mg/l

6

4

Nƣớc

%

73,80

5

Protein toàn phần

%

0,80

6

pH

3,40

6


Từ bảng 1.2 và bảng 1.3. Do đó tôi quyết định chọn quả táo mèo và quả
mơ làm nguyên liệu để lên men rƣợu vang.
1.1.4. Tàng trữ rượu vang
Không giống với những dòng sản phẩm rƣợu cao độ khác, rƣợu vang sau
khi có dịch rƣợu đem đi tàng trữ thì vẫn xảy ra quá trình biến đổi sinh hóa
thông thƣờng, do vẫn còn một lƣợng nấm men trong đó và lƣợng đƣờng cũng
nhƣ cơ chất cho nấm men sử dụng. Chính giai đoạn tàng trữ và bảo quản tạo
cho rƣợu có độ ổn định đồng nhất và hƣơng vị độc đáo.
Quá trình tàng trữ rƣợu vang đƣợc bảo quản trong những thùng gỗ sồi,
những hóa chất có sẵn trong gỗ sồi có ảnh hƣởng sâu sắc tới chất lƣợng rƣợu
vang. Chất phenol có trong gỗ sồi khi tác dụng với rƣợu vang sẽ tạo ra mùi
vanilla và vị ngọt chát của trà hay vị ngọt của hoa quả. Gỗ sồi cũng tác dụng
đến màu sắc của rƣợu. Vì thế rƣợu vang càng để lâu thì rƣợu càng ngon và
càng có giá trị cao.
1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rƣợu vang và bệnh vang
1.2.1. Nấm men
Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào và sinh sản
bằng cách nảy chồi. Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi: đất trồng nho, nơi
trồng hoa quả, bề mặt trái cây chín, nơi sản xuất rƣợu vang.
1.2.1.1. Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men
Hình dạng: hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình elip,… tùy từng loài
nấm men [4].
Kích thước: Tế bào nấm men có kích thƣớc khoảng 2,5  10m  5  21m

[4].
Tuy nhiên, hình dạng và kích thƣớc của nấm men không ổn định mà còn
phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh.

7


1.2.1.2. Cấu tạo của tế bào nấm men
Khác với vi khuẩn và xạ khuẩn, nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp,
gần giống nhƣ tế bào thực vật. Có đầy đủ cấu tạo: thành tế bào, màng nguyên
sinh chất, nguyên sinh chất, ti thể, riboxom, nhân tế bào, không bào và các hạt
dự trữ.
Thành tế bào: cấu tạo chủ yếu bằng hemixenlulozo, chiếm 70% trọng
lƣợng khô (trong đó 31% mannan, 29% glucan) ngoài ra còn chứa 1 – 3%
kitin, 6 – 10% protein, 8 – 8,5% lipit, 7% chất khoáng.
Màng nguyên sinh chất: có kết cấu 3 tầng khác nhau. Cấu tạo chủ yếu là
protein (chiếm 50% khối lƣợng khô), phần còn lại là lipit (40%) và một ít
polisaccarit [4].
Ti thể: có hình bầu dục, kích thƣớc khoảng 0,2m  0,6m, đƣợc bao bọc
bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lƣợc hoặc nhiều
ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên. Ti thể đƣợc cấu
tạo chủ yếu bằng hợp chất protein, lipit trong đó chiếm một lƣợng lớn
nucleoprotein, photpholipit.
Riboxom: có 2 loại: loại 80S gồm 2 tiểu thể 60S và 40S nằm trong tế bào
chất, một số khác gắn với màng tế bào chất. Loại 70S là loại riboxom có trong
ti thể.
Nhân: là nhân thật, nhân đã có sự phân hóa, có kết cấu ổn định và có
màng nhân. Nhân có hình tròn hay hình bầu dục. Màng nhân gồm hai lớp có
nhiều lỗ thủng, trong có chất nhân, hạch nhân và các nhiễm sắc thể. Thành
phần hóa học quan trọng nhất của nhân là nucleoprotein và các enzim.

Ngoài các cơ quan trên, nấm men còn có không bào và các hạt dự trữ
nhƣ hạt volutin, hạt này không những mang vai trò chất dự trữ mà còn dùng
làm nguồn năng lƣợng cho nhiều quá trình sinh hóa học của tế bào. Ngoài
volutin trong tế bào còn có các hạt dự trữ khác nhƣ glycozen và lipit.

8


1.2.1.3. Sinh sản của tế bào nấm men
Trong điều kiện bình thƣờng, tế bào nấm men sinh sản bằng cách nảy
chồi. khi gặp điều kiện không thuận lợi một số tế bào có thể chuyển sang hình
thức sinh sản bằng bào tử.
Nảy chồi ở nấm men là hình thức sinh sản phổ biến nhất. Khi tế bào phát
triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi
là mầm. Mầm đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một đầu của tế bào mẹ. Cùng một
lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều chồi, mỗi chồi sẽ nhận đƣợc một phần chất
nhân và chất nguyên sinh của tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm, tế bào con có thể
tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập hoặc có thể không tách để tạo thành một tập
hợp tế bào nấm men có dạng hình cành cây.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử, bào tử túi sinh
ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang, mỗi túi nang chứa từ 1 – 8 bào tử.
Những bào tử này đƣợc hình thành theo lối sinh sản vô tính.
1.2.2. Vi khuẩn
Trong nƣớc hoa quả và rƣợu vang có thể tồn tại những dạng vi khuẩn có
ảnh hƣởng sâu sắc tới chất lƣợng rƣợu vang. Đó thƣờng là các loài vi khuẩn
Acetobacter xylnium, Acetobacter aceri. Pasteur đã phát hiện ra cơ chế làm
hỏng rƣợu vang của các vi sinh vật khi rƣợu vang tiếp xúc với không khí
nhiễm vi khuẩn Bacillus [5], [15]. Từ đó, ông đã đƣa ra phƣơng pháp thanh
trùng Pasteur [4], nhƣng phƣơng pháp này lại làm giảm chất lƣợng của rƣợu.
Do đó trong thực tế sản xuất, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp vi lọc hoặc dùng

một số chất bảo quản phổ biến nhƣ SO2 (75- 120ml).
1.2.3. Nấm mốc
Nấm mốc tồn tại và phát triển ở vỏ quả, chất bã của quá trình sản xuất
rƣợu vang, thùng chứa, thiết bị hoặc do bụi không khí đƣa đến. Chủ yếu là
các nấm mốc thuộc chi Rhizopus, Aspergillus [9], [12], [15].

9


1.2.4. Bệnh vang
Bệnh vang là vấn đề thiết yếu cần quan tâm của các nhà sản xuất rƣợu
vang. Vấn đề này đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Pasteur. Bệnh vang làm cho
vang bị chua,bị đục, mùi khó chịu và chất lƣợng rƣợu giảm nhanh [5], [13].
Nguyên nhân gây nên bệnh vang là do rƣợu vang tiếp xúc với không khí chứa
vi khuẩn axetic. Do hoạt động trao đổi chất của nhóm vi khuẩn này đã làm
biến đổi rƣợu thành axit axetic. Ngoài ra, bệnh vang còn do các nhóm vi sinh
vật lên men kỵ khí gây ra.
1.3. Những biến đổi sinh lí, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men
rƣợu vang
Lên men là quá trình sinh hóa phức tạp, đƣợc diễn ra dƣới tác dụng xúc
tác bởi hàng loạt các enzim khác nhau của tế bào nấm men. Trong đó từ các
đƣờng đơn và đƣờng đôi (glucozo, fructozo, galactozo, saccarozo…) sẽ đƣợc
biến đổi thành rƣợu etylic và CO2.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men:
C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 → 2C2H5OH + 2ATP + H2O
Quá trình lên men rƣợu bao gồm 5 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Là giai đoạn hoạt hóa phân tử hecxozo. Biến đổi glucozo
thành fructozo_1,6 điphotphat dƣới tác dụng của enzym hexokinaza và
isomeraza.
Giai đoạn 2: Đây là giai đoạn cắt mạch cacbon. Từ fructozo_1,6

điphotphat biến đổi thành 3_photphoglixeraldehit và photphodioxiaxeton dƣới
tác dụng của enzim andolaza.
Giai đoạn 3: Giai đoạn oxi hóa. Trƣớc hết là 3_photphoglixeraldehit
sẽ

biến đổi thành photphoglyxerat

và

tiếp tục

biến đổi thành

2_photphoglyxerat nhờ xúc tác của các enzim photphoglyxeratmutaza. Sản

10


phẩm cuối cùng của giai đoạn này là sự biến đổi 2_photphoglyxerat thành axit
piruvic dƣới tác dụng của enzim andolaza và kinaza.
Giai đoạn 4: Axit piruvic phân cắt thành axetaldehit đồng thời giải
phóng CO2 dƣới tác dụng của enzimdecacboxylaza.
Giai đoạn 5: Tạo thành etanol từ axetandehit nhờ tác dụng của enzim
alcoldehydrogenaza.
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng, phát triển của
nấm men
1.4.1. Nguồn cacbon
Cacbon là thành phần quan trọng trong các hợp chất hữu cơ tham gia vào
cấu trúc và hoạt động sống của tế bào (trong tất cả các phản ứng enzim, axit
nucleic và các sản phẩm trao đổi chất). Nguồn cacbon cung cấp chủ yếu cho

nấm men Saccharomyces cerevisiae đƣợc lấy chủ yếu các nguồn đƣờng:
Glucoza, saccharoza, fructoza. Nguồn cacbon đáp ứng đƣợc ba yêu cầu cơ
bản của nấm men: sản sinh ra năng lƣợng, tạo thành những tiền chất, tham gia
vào các quá trình oxi hóa khử để biến tiền chất thành những sản phẩm trung
gian hoặc cuối cùng để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trƣờng
1.4.2. Nguồn nito vô cơ
Giống nhƣ tất cả các cơ thể sống khác, nấm men cũng cần nito để xây
dựng tế bào, vì vậy môi trƣờng nuôi cấy nấm men phải cung cấp đầy đủ các
hợp chất chứa nito mà nấm men có thể đồng hóa đƣợc nhƣ (NH4)2SO4 [3].
1.4.3. Nguồn photpho vô cơ
Hợp chất photpho có vai trò quan trọng trong hoạt động sống của tế bào
nấm men. Nếu thay đổi nồng độ photpho trong môi trƣờng sẽ dẫn đến sự thay
đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho
nhƣ tế bào chất và chất nhân. Trong tế bào nấm men thƣờng gặp các hợp chất
photpho nhƣ polyphotphat…, đó là các hợp chất có mối liên kết giàu năng

11


lƣợng. Chức năng của polyphotphat là tham gia vào sự vận chuyển glucozo
qua màng tế bào, vì vậy trong môi trƣờng phân lập cũng nhƣ môi trƣờng nuôi
cấy ngƣời ta thƣờng bổ sung KH2PO4.
1.4.4. Nguồn nguyên tố khoáng khác
Trong môi trƣờng dinh dƣỡng cần có một lƣợng khoáng nhất định để
đảm bảo cho sự phát triển của tế bào nấm men. Lƣu huỳnh tham gia vào các
thành phần của một số axit amin, albumin, vitamin và enzim. Magie tham gia
vào nhiều phản ứng trung gian của quá trình lên men. Sắt tham gia vào thành
phần của enzim, sự hô hấp và các quá trình khác…
1.4.5. Nguồn oxi
Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rƣợu vang thuộc nhóm vi sinh

vật hiếu khí tùy tiện. Trong môi trƣờng đủ oxi, hệ men sẽ phân hủy đƣờng để
cung cấp năng lƣợng và tham gia vào cấu tạo tế bào làm tăng sinh khối.
Nhƣng khi không có oxi hòa tan trong môi trƣờng, trong tế bào nấm men sẽ
diễn ra quá trình lên men rƣợu để tạo rƣợu.
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men rƣợu vang
1.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ lên men có ảnh hƣởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình
lên men và chất lƣợng của sản phẩm. Nhiệt độ < 100C không diễn ra quá trình
lên men. Nhiệt độ > 100C nhƣng nhỏ hơn 200C sự lên men chậm chạp, độ
rƣợu tạo thành thấp, nhiệt độ 350C nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm
men không chết nhƣng mất tác dụng. Nhiệt độ trên 350C quá trình lên men
ngừng lại, lƣợng đƣờng sót cao, vi khuẩn hoạt động. Nhiệt độ thích hợp nhất
cho nấm men phát triển là khoảng từ 26 – 280C [10].
1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cồn và pH
Khả năng chịu cồn cao và lên men trong môi trƣờng có nồng độ cồn hợp
lí là một trong những yêu cầu của chủng nấm men lên men rƣợu vang vì trong

12


quá trình lên men luôn sinh ra cồn. Nếu nồng độ cồn quá cao sẽ làm tê liệt
hoạt động sống của tế bào nấm men, ức chế làm kìm hãm quá trình đồng hóa
hydratcacbon và nito.
pH của môi trƣờng lên men ở các mức độ khác nhau thì quá trình lên
men cũng diễn ra với tốc độ khác nhau: pH = 2 – 3 quá trình lên men yếu,
pH = 6,5 – 7,5 quá trình lên men ngừng lại, pH thích hợp cho lên men là từ
3,5 – 4,5.
1.5.3. Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Đƣờng là yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến hoạt động của nấm men và quá
trình lên men. Hàm lƣợng đƣờng phù hợp cho quá trình lên men vang là 22 –

25%V. Hàm lƣợng đƣờng 30%V sẽ ức chế quá trình lên men. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy, khi hàm lƣợng đƣờng trong dịch lên men tăng thì hàm
lƣợng axit trong vang cũng tăng.
1.5.4. Ảnh hưởng của hàm lượng men giống
Men giống là tác nhân của quá trình lên men. Vì vậy nó ảnh hƣởng rất
lớn đến quá trình lên men. Nếu hàm lƣợng giống quá ít sẽ dễ nhiễm khuẩn
hoặc quá trình lên men không mạnh. Nếu hàm lƣợng giống quá cao thì thời
gian lên men sẽ đƣợc rút ngắn lại và hạn chế đƣợc khả năng nhiễm khuẩn
nhƣng do có sự cạnh tranh về cơ chất nên hiệu suất kinh tế thấp. Hàm lƣợng
giống thích hợp nhất cho lên men là từ 8 – 12% (khoảng 4 – 6 triệu tế bào/
1ml dịch lên men).
1.6. Tình hình sản xuất rƣợu vang
1.6.1. Trên thế giới
Vang là loại đồ uống đã xuất hiện từ lâu ở nhiều quốc gia trên thế giới.
Hiện nay trên thị trƣờng có rất nhiều loại vang đƣợc sản xuất lên men từ các
loại hoa quả khác nhau. Trong đó, các nƣớc sản xuất vang đứng đầu thế giới:
Pháp, Ý, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Mỹ, Nam Phi, Thổ Nhĩ Kỳ…
Sản lƣợng rƣợu vang toàn cầu đã đạt mức đỉnh vào năm 2004, khi cung
vƣợt cầu khoảng 600 triệu thùng (1 thùng gồm 12 chai, tƣơng đƣơng với 9 lít)

13


và đang trên đà giảm sút kể từ đó đến nay. Điều này đồng nghĩa với việc thế
giới đang đối mặt với nguy cơ thiếu rƣợu vang trong bối cảnh nhu cầu đã
vƣợt hơn nhiều so với nguồn cung [16]. Theo khảo sát mới đây của công ty
nghiên cứu Austraylia thuộc tập đoàn tài chính Morgan Stanley (Mỹ), nhu cầu
đối với rƣợu vang đã vƣợt nguồn cung hơn 300 triệu thùng vào năm 2012.
Đây là mức chênh lệch cung cầu lớn nhất trong 40 năm qua [16].
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu và sản xuất các

loại vang khác nhau: vang nho, vang táo mèo...
1.6.2. Ở Việt Nam
Rƣợu vang là một loại đồ uống có từ rất lâu ở nhiều quốc gia trên thế
giới nhƣng chỉ mới đƣợc du nhập vào nƣớc ta trong những năm gần đây, tuy
nhiên nó đã nhanh chóng có chỗ đứng vững chắc trên thị trƣờng. Từ những
năm cuối thập niên 90 trở về trƣớc, ở Việt Nam vẫn chƣa có một nhà sản xuất
rƣợu vang nào trong nƣớc sản xuất ra những loại rƣợu vang chính thống, theo
công nghệ Châu Âu, rƣợu vang trong nƣớc chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ các
nƣớc Châu Âu. Hiện nay, ngoài nguồn hàng nhập khẩu từ các nƣớc về, Việt
Nam đã và đang xây dựng các nhà máy sản xuất rƣợu vang lớn, tiêu biểu là ở
Đà Lạt. Việt Nam còn xuất khẩu rƣợu vang đi các nƣớc để chia sẻ thị trƣờng
rƣợu vang trên thế giới.
Ở Việt Nam, các tỉnh Ninh Thuận, Đà Lạt là những nơi sản xuất rƣợu
vang lớn nhất cả nƣớc. Đặc biệt ở Đà Lạt, đã có những đầu tƣ lớn về rƣợu
vang, khi mà vào năm 2007 nhà máy sản xuất rƣợu nho cao cấp đầu tiên tại
Việt Nam do công ty cổ phần Rƣợu- Bia nƣớc giải khát Đà Lạt (Dalat Beco)
khai trƣơng với công suất 1 triệu lít/ năm và sẽ đƣợc nâng dần lên 3 triệu lít
trong những năm tiếp theo.

14


Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Quả táo mèo (Docynia india) [6], [7] đƣợc thu nhận từ các tỉnh Lạng
Sơn, Yên Bái và Sơn La. Quả mơ (Aronus armeniac L.) [6], [7] đƣợc thu
nhận từ tỉnh Lạng Sơn và tỉnh Hà Tây.
Chủng nấm men đƣợc phân lập từ dịch siro táo mèo.

2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Các loại đường: Saccarozo, fructozo, glucozo.
Một số chất vô cơ và hữu cơ: MgSO4.7H2O, KH2PO4, (NH4)2SO4,
(NH4)2HPO4, NaOH, HCl, rƣợu etylic, pepton, agar, phenolphthalein.
2.1.2.2. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ: hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn chang thủy tinh, phễu thủy
tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thủy tinh.
Thiết bị: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng vô trùng, tủ sấy, cân kỹ
thuật, kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần, buồng đếm hồng cầu.
2.1.3. Các loại môi trường
2.1.3.1. Môi trường Hansen (MT1) (g/l)
Hóa chất

g/l

Đƣờng glucoza

50

Pepton

5

MgSO4.7H2O

0,5

KH2PO4

1

(NH2)4SO4

1

Agar

20

Nƣớc

1000 ml

15


2.1.3.2. Môi trường nhân giống (MT2) (g/l)
Hóa chất

g/l

Đƣờng glucoza

50

Pepton

5

MgSO4.7H2O

0,5

KH2PO4

1

(NH2)4SO4

1

Nƣớc

1000 ml

2.1.3.3. Môi trường lên men (MT3) (g/l)
Hóa chất

g/l

Dịch siro hoa quả
MgSO4.7H2O

200 ml
0,5

KH2PO4

1

(NH2)4SO4

1

Nƣớc

1000 ml

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập tuyển chọn và bảo quản, nhân giống nấm
men theo phương pháp Pasteur trên môi trường thạch đĩa
Để tuyển chọn khuẩn lạc tôi dùng phƣơng pháp phân lập trên hộp petri,
môi trƣờng phân lập là môi trƣờng Hanxen.
Cách tiến hành: Đầu tiên, tôi cho vào 9 ống nghiệm mỗi ống 9 ml nƣớc
muối (đã hấp khử trùng). Tôi dùng pipet lấy 1ml dịch táo mèo cho vào ống
nghiệm thứ nhất rồi đem lắc với tốc độ 30 vòng/phút trên máy vontech, trong
vòng 2 phút đƣợc dịch pha loãng ở 10-1. Tiếp theo, tôi lấy 1ml dịch trong ống
nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ 2 (đã có sẵn nƣớc muối) rồi đem lắc

16