Khoá luận tốt nghiệp ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình tạo màng BC cho chủng gluconacetobacter

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
====== oOo ======

NGUYỄN THỊ HÀ

ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON TỚI
QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG BC CHO CHỦNG
GLUCONACETOBACTER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh yật
Ngưòi hướng dẫn khoa học PGS.TS.
Đinh Thị Kim Nhung
HÀ NỘI-2015

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS. Đinh Thị Kim
Nhung, Giảng viên chính, tố Thực vật - Vi sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà Nội 2, người đã tận
tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu đề tài này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật - Vi
sinh, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt
kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.


Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN,
Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận này.

CẢM
Cuối cùng, Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, LỜI
bạn bè
và người thân, những người luôn

quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và
hoàn thiện đề tài.

Hà Nội, ngày .... Tháng... nẫm 2015 Sinh viên

Nguyễn Thị Hà

Em xin khẳng định đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất cả các số liệu đều
được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lí thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép. Đe tài
nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên cứu cửa tác giả khác. Những kết quả nghiên
cứu của các tác giả ác đưa vào trong đề tài đều có trích dẫn đầy đủ chính xác.
Hà Nội, ngày.... Tháng.... Năm 2015 Tác giả

Nguyễn Thị Hà


LỜI CAM


MỤC


TÙ VIÉT TẮT

Được ĐỌC LÀ

BC

Bacterial Cellulose

Cs

Cộng sự

MTi

Môi trường giữu giống

MT

2

Môi trường nhân giống

MT

3

Môi trường lên men taọ màng

GK

Glucokinase

PGM

Phosphoglucomutase

PC

Plant Cenlulose

UGP

Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase

cs

Cellulose synthase

g

gam

STT

Sô thứ tự

MỞ ĐÀU
1. Lý do chọn đề tài
Hiện nay các sản phấm sinh học ngày càng chiếm ưu thế, dần thay thế các sản
phẩm hóa học. Màng BC được tạo thành nhờ nuôi cấy vi khuẩn là một sản phấm sinh
học có nhiều ứng dụng thiết thực như trong bảo quản thực phẩm thay thế cho túi ni
lông thân thiện với môi trường, ứng dụng trong trị bỏng, làm mặt nạ đắp da....Màng
BC đã được nghiên cứu trên vi khuấn Acetobacter xylinum. Trong những năm gần
đây, tại phòng thí nghiệm Vi sinh-khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2, đã
phân lập được chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng tạo màng BC.
Màng BC

(Bacterial cellulose)

Gluconacetobactercỏ cấu trúc đặc tính gần

được

tạo ra

giống

với thực

từ vi khuẩn
vật, màng này


không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicenllulose, peptin, sáp nến. Do
đó chúng cóđặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc, khả năng polymer hóa cao.
Trên thế giới Màng BC đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ khác
nhau: dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lý nước, làm môi trường cơ chất
cho sinh học, làm màng bảo quản thực phẩm...
Ở Việt Nam hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ
khiêm tốn, các kết quả ứng dụng Màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí
nghiệm.

phát

Nguồn dinh dưỡng có vai trò quan trọng đến

quá trình

sinh trưởng và

triển của vi khuẩn Gluconacetobacte, đồng

thời ảnh

hưởng tới chất

lượng màng BC. Trong đó nguồn cacbon có vai trò quyết định. Xuất phát từ lý do đó,
tôi chọn đề tài: “Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình tạo màng BC cho vi

khuẩn Gluconacetobacter
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men tạo màng BC cho
chủng Gluconacetobacter.
3. Nội dung của đề tài
3.1.Khả năng lên men tạo màng BC chủng vỉ khuẩn Glunacetobacter.
3.2.Anh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình tạo màng BC từ chủng
Gluconacetobacter.
3.2.1.

Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men tạo

màng BC từ chủng Gluconacetobacter.
3.2.2.

Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới quá trình lên men

tạo màng BC tử chủng Gluconacetobacter.
3.2.3.

Ánh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình lên men tạo màng

BC từ chủng Gluconacetobacter.


4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4.1.Ỷ nghĩa khoa học
Nghiên cứu được nguồn cacbon phù hợp đối với quá trình lên men tạo màng
BC từ chủng vi khuẩn Glunacetobacter BHN 2 .
4.2.Ỷ nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu góp phần rút ngăn được thời gian tạo màng BC từ chủng vi khuẩn

Glunacetobacter BHN 2 .
5. Phương pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp vi sinh
5.2. Phương pháp hóa sinh
5.3. Phương pháp toán học
6. Điểm mới của đề tài
Đã tạo được màng BC từ chủng Gluconacetobacter sau thời gian 4 ngày
trên môi trường nước dừa thích hợp.
CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Đại cương về vi khuấn Gluconacetobacter và màng BC

1.1.1.

Phân loại vi khuấrt Gluconacetobacter

Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter

thuộc

họ

vi

khuẩn

,Gluconacetobacter,

Acetobacterceae.

Họ

này

Gluconobacter,

gồm

6 chi:

Acetobacter

Acidomonas,Asaia,Kozakia.

Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuấn acetic.[20]
1.1.2.

Hình thái tế bào học của vi khuẩn Gluconacetobacter

Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di


động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm, có thế xếp
thành chuỗi hay đứng riêng lẻ. Te bào vi khuẩn này thường tìm thấy trong dịch, giấm,
dịch hoa quả, đất....[17]
1.1.3.

Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, chủng Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc

có kích thước nhỏ đường kính từ l- 2 mm, nhẵn hoặc xù xì, rìa mép của khuẩn lạc
bằng phang hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt. Chủng Gluconacetobacter
BHN 2 khi nuôi cấy trên môi trường lỏng tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi
trường một lớp màng BC. Khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, sợi cenlulose hình thành
ở dạng hạt nhỏ với kích thước không đều và phân tán trong môi trường dinh dưỡng
có hình thái khác so với sợi cenlulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.
1.1.4.

Đặc điểm sình lý, sinh hóa của chủng Gluconacetobacter
Đặc điểm sinh lý của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng, phát

triến ở điều kiện nhiệt độ 25°c - 35°C; pH 4-6. Các chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter sinh trưởng được trong điều kiện pH thấp, vì vậy có thế
bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn
Iạ.[ 8 ]

Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter bao gồm:
Oxy hóa ethanol thành acetic, CƠ 2 H 2 O; Phản ứng catalase dương tính; Chuyến
hóa glucose thành acid; Không sinh sắc tố nâu; Tống hợp cenlulose, không tăng
trưởng trong môi trường Hoyer.[3]


Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuấn Gluconacetobacter

STT
Đặc điểm
Hiện tượng
Kết quả
1 Oxy hoá ethanol thành Chuyến hoá môi trường chứa Brom
+
phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang
acid acetic
màu vàng
2 Hoạt tính catalase
Hiện tượng sủi bọt khí
+
—
3 Sinh trưởng trên môi Sinh khối không phát triến
4
5
6
7

trường Hoyer
Chuyển hoá glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau
thành dihydroxyaceton lên men

Chuyển hoá glucose Vòng sáng xuất hiện xung quanh
thành acid
khuấn lạc trên môi trường chứa
CaCƠ3
Kiểm tra khả năng sinh Không hình thành sắc tố nâu
sắc tố nâu
Kiếm tra khả năng tổng Váng vi khuấn xuất hiện màu lam
hợp cellulose

+
+
—
+

Đặc điểm màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter

1.2.

Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn

Gluconacetobacter BHN 2 hình thành nên lớp màng có bản chất là cenlulose,
được tập hợp bởi nhiều bó sợi cenlulose liên kết với nhau được gọi là màng
Bacterial cellulose hay màng BC.
1.2.1.

Cấu trúc của màng BC

Màng BC có đường kính bằng 1/100 đường kính cellulose của
thực vật (PC - plant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi
một chuỗi polymer Pl,4glucopynanose, có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu

trúc, đặc tính thì khác xa nhau[17]
Chuỗi polymer P"1,4glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành
sợi nhỏ( subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo thành sợi lớn(
microfibril) , những sợi nhỏ này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo
thành dải ribbon . Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1- 9nm. Những rải ribbon


được keeos ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng
liên kết Hidro bằng hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp
màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy[ 20 ].

Hình 1.1. Sợi cellulose của cellulose thực vật và màng BC (SEM)
1.2.2. Một số tính chất của màng BC
Brown

A.J

(1886),

đã

nghiên

cứu

lớp

màng

đặc

do

vi

khuẩn

Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất
hemicelluloses. Hemicellulose là những polysaccharide không tan trong nước nhưng
tan trong dung dịch kiềm tính [18]
Một số tính chất của màng BC:
Độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose
khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thế cao, sức căng lớn, trọng lượng
thấp, on định về kích thước.
Tính hút nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kế( trên 90%), có tính
sốp. độ ẩm cao.
1.2.3. Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter
Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như một lớp
bảo vệ các tế bào vi khuẩn Gỉuconacetobacter trước các nhân tố có hại của môi
trường. Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng


khỏi ta cực tím. Khoảng 25% số tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter được bao bọc
bởi màng BC sống sót sau 1 giờ xử lý bằng tia cực tím. Khi tách màng BC ra khỏi tế
bào, khả năng sống sót của chúng giảm đáng kế, chỉ còn 3%[2].
Ngoài ra màng BC còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi khuẩn đồng thời
giúp chúng lấy các dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ dàng hơn so với khi ở
trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose
1.3.

Ánh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC từ vi

khuẩn Gluconacetobacter
Nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo màng gồm Nguồn
cacbon, nguồn nitơ, phospho. Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tôi đề cập chủ yếu
ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình lên men tạo màng BC. Cacbon có trong tế
bào chất, thành tế bào, thành phần enzim, acid nucleic và các sản phẩm trao đổi chất
đổi chất. Do vậy hợp chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa quyết định trong đời
sống vi sinh vật. Trong đó hàm lượng đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuấn.
Đế tránh ở nhiệt độ cao và trong môi trường kiềm bị chuyển hóa khi khử trùng môi
trường có chưá đường, người ta chỉ hấp thanh trùng môi trường ở điều kiện áp suất
0.5atm,

110°c.
Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia khác, nguồn nguyên liệu chủ yếu để
sản xuất màng BC là nước dừa. Tùy theo giống dừa mà hình dạng và kích thước và
trọng lượng trái dừa khác nhau, trong đó nước dừa chiếm 21 -


25% trọng lượng trái dừa, trung bình trọng lượng trái dừa chiếm khoảng 300ml
nước. Trong nước dừa già chứa nhiều carbohydrate, vitamin, axit amin, các chất kích
thích sinh trưởng... do đó nước dừa là môi trường thuận lợi cho sư phát triển của vi
khuẩn G.BHN 2 . thành phần hóa học của nước dừa được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của nước dừa già

Thành phần
Tổng hàm lượng chất rắn(%)
Đường khử(%)
Chất khoáng(%)

Protein(%)
Chất béo(%)
Ph
K(mg%)
Na(mg%)
Ca(mg%)
Mg(mg%)
P(mg %)
Fe(mg%)
Cu(mg%)

Hàm lượng
5.4
2
0.5
0.1
0.1
5.2
247
48
40
15
6.3
79
26

Nguồn: Satyavati Krishnankutty(1987) Bảng 1.3. Thành phần
vitamin có trong nước dừa

Thành phần

1. Vitamin nhoms Bi(|ug/ml)
Axitnicotinic
Axitpantothenic
Biotic
Riboflavin
Axitfolic
Piridoxin(B6)
Thiamin(Bi)
2. vitamin(mg/ml)
Nguồn: the wealth ò Indiaị1950)

Hàm lượng(%)
0.64
0.52
0.02
0.01
0.003
Vêt
Vêt
23-3.1


Bảng 1.4. Thành phần axỉtamỉn của nước dừa

Thành phần
Lanine
Arginine
Axit Aspatic
Cystine
Axit Glutamic

Histidine
Leucine
Lycine
Proline
Phenylalanine
Serine
Tyrosine

Hàm lượng (%)
2.41
10.75
3.60
0.97- 1.17
9.76-14.5
1.95-2.05
1.95-4.18
1.95-4.57
1.21 -4.12
1.23
0 59-0.91
2.83-3.00

Nguồn: Pradera và cộng sự nấm 1442
Như vậy nước dừa già là nguyên liệu tự nhiên chứa nhiều yếu tố quan trọng
cho sự tạo màng BC.
1.4.

Cơ chế tổng hợp màng BC

Khi nuôi cấy vi khuấn Gluconacetobacter trong môi trường có

nguồn dinh dưỡng đầy đủ( chủ yếu là cacbonhidrate, vitamin
Bi, B ,Bi2--- và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ
thực hiên quá trình trao đối chất của mình bằng cách hấp
thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào bên trong tế
bào, một phần nguồn dinh dưỡng này được sử dụng cho quá
trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, một phần để
tổng hợp cellulose và thải ra môi trường các sợi tơ nhỏ
phát triến ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi
trương nuôi cấy[22]. Theo tác giả Thiaman (1962) giải
thích cách hình thành cenlulose như sau: các tế bào vi
khẩn Gỉuconacetobacter khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực
hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ
đường glucose, kết hợp đường với axit đế tạo tiền chất nằm
ở màng tế bào.
2


Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm trên màng tế bào cùng với
enzyme có the polymer hóa glucose thành cellulose.
Theo đó, quá trình sinh tống hợp màng BC là một tiến trình bao gồm nhiều
bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzym phức hợp xúc tác và các protein điều hoà.
Theo tác giả Alina Krystynowicz và cộng sự cho rằng có 4 enzym tham gia xúc
tác tống hợp cellulose ở vi khuấn Gluconacettìbacteĩ: Glucokinase (GK),
Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase (UDPG
pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó UGP là enzym có
vai trò quan trọng nhất.
CELLULOSE
▲
cs

UDPGlc

Glucose

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp cellulose của chủng
Gluconacetobacter.



1.5. Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Gluoconacetobacter
1.5.1.

Độ

pH

Vi khuẩn Gluconacetobacter phất triển thuận lợi trên môi trường có độ pH
thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ xung thêm axit acetic nhằm axit hóa
môi trường, đồng thời axit acetic còn có tác dụng sát khuấn, giúp ngăn chặn sự phát
triển của các vi sinh vật có hại [19] .
1.5.2.

Nhiệt độ
Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuấn Gluconacetobacter vào khoảng

25 - 30 độ. Ớ nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và khả năng sinh sản của tế bào vi
khuẩn và hiệu suất lên men bị giảm [ 22 ].
1.5.3.

Độ

thông khí

Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc [22]. Do đó điều
kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí.
1.5.4.

Thòi gian nuôi cay
Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn sẽ xuất hiện

một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36-48 giờ
hình thành lớp màng trong và ngày càng dày.
1.6. ứng dụng của màng BC
Màng BC đã thu sự hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học
dung màng BC làm màng phân tách đế xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và
tế bào năng lượng Brown.E.(2007), Jonas và Farad(l 998)[18] đã dùng màng như một
chất đặc biệt đế biến đổi độ nhớt, làm các sơi truyền quang, màng BC được sử dụng
để sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao... Trong công nghệ thực phấm màng BC
được sử dụng đế sản xuất thạch dừa, bảo quản thực phẩm thay thế túi nilon. Trong y
học màng BC được xem như là một nguồn polymer sinh học mới, được sử dụng đẻ


che phủ vết thương nhờ khả năng bền trong môi trường ấm, thấm hút dịch, không gây
kích ứng da[23].
1.7.

Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới

1.7.1. Trên thế giới

Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1999, dùng màng
BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt
cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown, Jonas và Farad, dùng màng như là một
chất đế biến đối độ nhớt, đế làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown đã dùng BC làm
vải đặc biệt, Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006)
Sirlene M.Costa, dùng màng BC đế sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất đế cố
định protein hay cho sắc kí [21]. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo các phức
chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan hoặc cellulose và
polyvinyl, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá
trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu điều trị các bệnh tim mạch [18].
Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong phẫu
thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ dưỡng da cho
phụ nữ, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạo màn hình
điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ gia, làm cơ chất đế cố định
protein hay cho sắc kí, ....
Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của
nguồn cacbon đến khả năng hình thành cellulose. Nghiên cứu chế tạo màng từ vi
khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy
điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng
trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchanska


(2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs, (2006) sử dụng
màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác
giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm màng BC từ Acetobacter

xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã

dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [23].
1.7.2.

Ỡ Việt Nam
Ở Việt Nam những nghiên cứu về Gluconacetobacter và màng BC là khá

mới mẻ, các nghiên cứu, công bố liên quan đến Gluconacetobacter, Acetobacter,
sự hình thành BC và ứng dụng màng BC còn rất khiêm tốn. Năm 1997 có công trình
của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trường nước giá đỗ thay thế
nước dừa trong sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn Acetobacter xỵlinum. Năm 19952000 các công trình nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter và khả năng lên men sinh
acid acetic của nhóm tác giả Lê Văn Nhương, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim
Nhung, Nguyễn Văn Cách. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình
sinh acid acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [3],[6],[7]; gần
đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào
vi khuẩn. Năm 2000 nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương,
Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của
môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuấn Acetobacter xylinum ứng
dụng vào làm thạch dừa. Năm2003 có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thuý
Hường và Phạm Thành Hố về chọn lọc dòng Acetobacter xylinum thích hợp cho các
loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn. Năm 2006 nghiên cứu của
nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự về màng BC từ

Acetobacter xylinum tấm dầu mù u dùng trong điều trị bỏng. Năm 2008, có nghiên
cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã chọn được 1 chủng vi khuấn Acetobacter xylinum

NH], khảo sát khả năng tạo tạo màng của chủng này. [5].
Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày
càng được nhiều tác giả quan tâm.. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ

môn Vi Sinh - Ký Sinh, Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công
màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng phương pháp lên men. Màng BC có khả năng
thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh
học, có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn
đều có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích
ứng da. Chính vì vậy dùng màng sinh học đế ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết
thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều
trị và giảm thiếu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu[4].
Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận màng
BC từ vi khuẩn A.Xylinum, ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng. Công tác điều trị
bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc dùng một số màng
trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitossan, sử dụng các chất có
nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng . Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan,
màng trị bỏng sinh học BC với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuấn đều có
nguồn gốc thiên nhiên. Vì thế, nó không chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố
trực tiếp, không gây dị ứng, không có yếu tố lây lan mầm bệnh, không giải phóng
chất lạ vào vết thương. Màng có khả năng diệt 100% vi khuấn thường gây ra các
nhiễm trùng vết thương hở da như vết bỏng... Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và
không cần sử dụng bất cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thời,
làm vết mau lành do thúc đấy quá trình tạo mô hat[ 6 ].
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.

Thiết bị và hóa chất

2.1.1.

Hóa chất
-

Nguồn đường: glucose, saccarose, fructose.

-

Nguồn nitơ:

-

Nguồn nitơ vô cơ: (NH 4 ) 2 SƠ 4

-

Nguồn nitơ hữu cơ: pepton


-

Một số hóa chất vô cơ: KH 2 PO 4 , MgSƠ 4 . 7 H 20 .

-

Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch

lugol
2.1.2.

Nước dừa, agar, ...
Dụng cụ, thiết bị
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm tôi đã sử dụng những dụng cụ thiết bị

như:
Nồi hấp khử trùng
Kính hiển vi quang học (olympus CX 41 , Nhật)
Tủ sấy (Haraeus, Đức)
Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức)
Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ) Micropipep (Gilson, Pháp): Nồi
hấp khử trùng
Kính hiến vi quang học (olympus CX 41 , Nhật)
Tủ sấy (Haraeus, Đức)
Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức)

Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ) Micropipep
(Gilson, Pháp)


2.1.3.

Môi trường nghiên cửu

Acid

2.1.4.1. Môi trường giữ giong ( M T ] )

acetic 2%

Glucose: 20g/l

Nước Dừa:

Pepton:5g/l

1000 ml
Rượu etylic 2%

MgS0 4 .7H 2 0: 2g/l
Agar: 20g/l

2.2.

2.1.4.2. Môi trường nhân giốngịMTĩ)

Phươ
ng

pháp

Glucose: 20g/l

nghiên

Pepton: 5g/l

cứu

(NH4)2S04:3g/

2.2.1.

l Acid acetic

vỉ sinh

2%

2.2.1.1. Phương

2.1.4.3. Môi trường lên menchuấn(MT3)

Glucose: 20g/l

Phương pháp

pháp phân biệt
tế bào vi khuân

(NH 4 ) 2 S0 4 : 3g/l KH 2 PO 4 : 2g/l Nước máy: 1000

Gluconacetobac

ml

ter BHN 2 bằng
phương pháp
nhuộm Gram

KH 2 PO 4 : 2g/l MgS0 4 .7H 2 0: 2g/l Nước Dừa: 1000
ml Rượu etylic 2%

Vi

khuấn

Gluconacetobacter
BHN 2 là các

KH 2 PO 4 : 2g/l

vi khuấn Gram âm,
do

(NH 4 ) 2 S0 4 :3g/l

đó
có

thể phân biệt với vi
MgS0 4 .7H 2 0: 2g/l

khuẩn

Gram
dương


nhờ phương
pháp nhuộm

Gram

(nhuộm kép).
Tiến

hành:

Lấy

chủng

vi

khuẩn

Gluconacetobacter BHN2 đem nhuộm tiêu bản
theo phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới
vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus
với độ phóng đại 1000 lần.


Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là
để phân biệt vi khuẩn Gram âm với vi khuấn Gram

2.2.1.3.

Phương

pháp hoạt hoá giong

dương. Neu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu

Giống từ ống

hồng thì đó là vi khuấn Gram âm. Ngược lại nếu tế

nghiệm

bào bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương.

quản trong tủ lạnh,

Khả năng bắt màu của vi khuẩm Gram âm và

trước

Gram dương khác nhau là do chất nguyên sinh của

dụng phải hoạt hoá

tế bào vi khuấn Gram dương được cấu tạo từ một

giống,

loại protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie có

đảm bảo đủ số lượng

khả năng tạo màu tím với gentian và lugol tạo ra

tế bào vi sinh vật cho

một phức chất bền, khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi

quá trình lên men.

quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi khuẩn Gram

Phương

dương bắt màu tím của gentian trong khi đó những

hoá giống sử dụng

vi khuẩn Gram âm không có khả năng tạo phức

môi

chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên dễ

chuẩn

bị rửa trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ íucshin lên tế

thạch agar, đem hấp

bào vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng - màu của

thanh trùng ở 121°

fucshin [3], [4], [5].

trong 20 phút. Sau

2.2.7.2.

đó đem xử lý trong

Phương pháp bảo quản chủng giong

trên thạch nghiêng

được

khi

bảo

đem

nhân

pháp

trường
không

sử

giống

hoạt

tiếu
có

đèn tím 15 phút, cấy

Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ

chuyến giống từ ống

bộ xác định là Gluconacetobacter BHN2được

thạch nghiêng vào và

cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ

nuôi

ấm ở 30°c. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4°c

vòng/phút

dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và

24giờ [4], [5].

giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một
lần [4], [5].

lắc

135
trong


2.2.1.4.

Phương pháp lên men tạo màng

ngày trong điều kiện

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem

thích hợp.Quan sát

hấp thanh trùng ở 110°c trong 20 phút đế tránh

hiện tượng nếu xung

phân rã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím

quanh khuẩn lạc có

trong 15 phút. Bố sung vào môi trường dịch giống

vòng phân giải canxi

đã được hoạt hoá. Nuôi cấy ỏ’ điều kiện tĩnh theo

là phản ứng dương

dõi sự tạo màng BC.

tính (acetat bị oxỉ

2.2.2.
2.2.2.1.

hóa, calcium giải

phương pháp hóa sinh

phóng ra tạo màu

Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ một giọt H 2 O 2 3% lên bề mặt khuẩn

trắng sữa) , ngược

lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi

lại là âm tính [1 ].

khuấn đó được coi là có hoạt tính catalase

2.2.2.3. Phát

(catalase +). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không

hiệnkhả năng chuyến

có hoạt tính catalase (catalase -) [1]

hoá glycerol thành

2.2.2.2.

Phát hiện khả năng oxy hoá acỉd acetỉc

dihydroaceton

Sử dụng môi trường sau để thử khả năng
oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn.

khả năng hình thành

Thành phần (g/1): Cao nấm men : lOg

dihydroxyaceton

từ

Canxi

glycerol. Chúng tôi

acêtat:

tiến hành trên môi

lOg
Thạch

Đe phát hiện

: 20 g :

p
7,0-7,2
Phân phối môi trường vào bình tam giác

đem khử trùng ở nhiệt độ 121°c trong 20 phút, để
nguội khoảng 40 - 45°c đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn
tuyến chọn mới hoạt hóa (18-24 giờ) nuôi từ 6 -7

trường

bao

gồm

Nước máy: lOOOml
thành phần
sau:

Gl
yce
rol:
4%
(g/

1)

C
ao
nấ
m
m
en
:

pH :


0,3 % (g/1) Cao
ngô: 3% (g/1)

CaCƠ 3 : 0,3%
(g/1) (NH 4 ) 2 S0 4 :
0,1% (g/1) H 2 Ơ:
lOOOml