Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men trên thể tích đến khả năng tạo màng BC cho vi khuẩn gluconacetobacter

TRƯỜNG ĐẠI HỌC su PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN

HOÀNG THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DIỆN TÍCH
BÈ MẶT DỊCH LÊN MEN TRÊN THẺ TÍCH ĐÉN KHẢ
NĂNG TẠO MÀNG BC CHO VI KHUẨN
GLUCONACETOBACTER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Ngưòi hưóng dẫn khoa học TS.
PHƯƠNG PHÚ CÔNG

HÀ NỘI - 2015
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Đinh Thị Kim Nhung và TS.
Phương Phú Công người đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo trong tổ Thực Vật- Vi
Sinh Khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá
trình em thực hiện đề tài.


Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè, gia đình đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi nghiên
cứu và hoàn thành khoá luận này.
Xin chân thành cảm ơn ỉ

LỜI CẢM ƠN

Hà Nội, ngày.........thảng...........năm 2015

Sinh viên

Hoàng Thị Thắm
Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Dưới sự hướng dẫn
của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phương Phú Công.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, em xin phép các
tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Neu sai em xin chịu hoàn toàn trách
nhiệm.
Xin chân thành cảm ơn ỉ
Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên

Hoàng Thị Thắm


MỤC LỤC

CÁC CHŨ VIẾT TẮT

BC

Bacterial cellulose

Cs

Cộng sự

G

Gam

N

Niutơn

PC

Plant cellulose

s

Diện tích bề mặt lên men tạo màng BC(cm 2 )

V

Thể tích dịch lên men tạo màng (cm 3 )

s/v

Tỷ lệ diện tích bề mặt lên men trên thế tích dịch lên men
tạo màng (cm" 1 )
DANH MỤC BẢNG BIÊU, HÌNH ẢNH

HÌNH
Hình 1.3. Con đường chuyến hoá cacbon trong vi khuấn Gluconacetobacter Hình
3.1. Ket quả nhuộm Gram của vi khuẩn Gluconacetobacter Hình 3.2. Chủng vi
khuấn Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng
Hình 3.3. Chủng vi khuấn Gluconacetobacter trên môi trường thạch đĩa Hình 3.4.
Hoạt tính catalaza
Hình 3.5. Thế hiện mối quan hệ giữa thời gian với khối lượng màng
Hình 3.6. Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với độ bền kéo màng

Hình 3.7. Màng BC ngày thứ 4
Hình 3.8. Màng tươi sau 5 ngày nuôi cấy
Hình 3.9. Hình ảnh màng BC khô
Hình 3.10. Mối quan hệ giữa nhiệt độ với khối lượng màng
Hình 3.11. Mối quan hệ với độ kéo màng
Hình 3.13. Mối quan hệ giữa s/v với khối lượng màng
Hình 3.14. Mối quan hệ giữa s/v với độ bền kéo màng


Hình 3.15. Hình ảnh ảnh hưởng của tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng BC


Các đặc điểm phân biệt Gluconobacter và Acetobacter (So sánh với

Pseudomonas)
BẢNG
Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Tính quy đối s/v
Bảngthí nghiệm nghiên cứu Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC
1.1. từ chủng Gluconacetobacter Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo

màng BC từ chủng Gluconacetobacter Tính quy đổi s/v thí nghiệm nghiên cứu
Bảng
Khảo sát tỷ lệ s/v với thời gian xuất hiện màng Khảo sát tỷ lệ s/v đến khả năng
1.2.
tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter Ảnh hưởng của tỷ lệ s/v đến độ
Bảng 2.
dai của màng
ỉ. Bảng
3.1.

Bảng
3.2.

Bảng
3.3.


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cùng với sự phát triến của khoa học thì công nghệ sinh học (CNSH) đã
trở thành một ngành kinh tế chủ đạo của nhiều quốc gia. Là một bộ phận của
ngành công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang phát triến mạnh mẽ với
những thành tựu to lởn trong lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y học.... Khó
có thế tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học mà không liên quan tới vi
sinh vật.
Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme p - 1,4- glucopyranose mạch
thẳng chuỗi polyme p - 1,4- glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo
thành sợi nhỏ (subfiril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo thành
sợi lớn hơn- sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau thành bó và cuối cùng
thành dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đấy ra ngoài sẽ liên kết với
những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc Vandecvan tạo thành
dạng sệt hay một lớp màng mỏng. Kích thước của màng tăng lên khi quần thể vi
khuẩn sinh trưởng [24].
Màng BC có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ chúng
không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ khác mà
được cấu tạo từ các sợi song song thành mạng lưới cellulose. Do đó BC có độ
bền cơ học cao hơn hắn cellulsose của thực vật [24] .
Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mói có tiềm năng
được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực
phẩm,công nghệ giấy,công nghệ sản xuất pin,đặc biệt trong lĩnh vực y học như:

mặt nạ tẩy trang, điều trị bỏng ... từ các chế phẩm sinh học như: màng ối, màng
da ếch. Màng BC chứng minh có hiệu lực tốt [9].


Do sự đa dạng về mặt ứng dụng như trên, tôi quyết định chọn hướng đề
tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men trên thê tích đến khả
năng tạo màng BC cho vỉ khuân Gluconacetobacter ”
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định được ảnh hưởng của tỷ lệ diện tích bề mặt dịch lên men trên thể
tích đến khả năng tạo màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter.
3. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Gluconactobacter phân lập từ nguồn nguyên liệu bia Hà
Nội, tại phòng Vi sinh- trường ĐHSP Hà Nội 2
4. Nội dung nghiên cứu của đề tài
4.1. Nghiên cứu khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuấn

Gluconacetobacter
4.1.1.

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả

năng tạo màng BC của chủng vi khuấn Gluconacetobacter
4.1.2.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ s/v

đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
4.2.

Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng của

vi khuẩn Gluconacetobacter
5. Ý nghĩa khoa học của đề tài
5.1. Ỷ nghĩa khoa học
Nghiên cứu được tỷ lệ s/v phù hợp nhất đối với quá trình lên men tạo
màng BC từ chủng Gỉuconacetobacter
5.2. Ỷ nghĩa thực tiễn


Rút ngắn thời gian lên men tạo màng BC cho chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter nhằm tạo màng BC được tốt nhất, có triến vọng ứng dụng
vào một số lĩnh vực trong cuộc sống, đặc biệt là lĩnh vực y học.
6. Điểm mới

Tìm ra tỷ lệ s/v = 0,8 thích hợp cho khả năng lên men
tạo màng, rút ngắn thời gian lên men tạo màng BC từ
chủng vi khuấn Gluconacetobacter, đáp ứng nhu cầu thực tiễn.
NỘI DUNG

1.1.

CHƯƠNG 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu tổng quan về đối tượng

1.1.1.

Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Đã từ lâu vi khuẩn acetic nói chung và đặc biệt là Gluconacetơbacter

nói riêng đã và đang thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên
thế giới. Ngay từ thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân loại chúng,
cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn có nhiều ý kiến khác nhau về vấn
đề này.
Một số đặc điếm sinh lý, sinh hóa là cơ sỏ’ phân loại của nhóm vi
khuẩn Acetobacter xylinum
Quan điểm 1: Dựa vào khả năng oxy hóa acid acetic, Beijerinck phân
chia các loài trong Gluconacetobacter thành 2 nhóm:
* Nhóm 1: Có khả năng oxy hoả acid acetỉc thành co2 và H2O + Sử dụng muối

amonium (NH4+) làm nguồn nitơ duy nhất (Sinh trưởng trên môi trường Hoyer)
+ Không sử dụng muối amonium (NH 4 + ) làm nguồn nitơ duy nhất chia
ra làm: trên bề mặt môi trường tạo thành màng nhầy chứa cellulose như

Gluconacetobacter và trên bề mặt môi trường không tạo thành màng nhầy có
chứa cellulosenhư:

Acetobacter

rancens, Acetobacter


pasteurianus, Acetobacter kneỉiỉgỉanus.
Nhóm 2: Không có khả năng oxy hoả acid acetỉc.
+ Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu với đen nhạt

(Acetobacter melanogenus); sắc tố hồng (Acetobacter resens)
+ Không tạo thành sắc tố: Nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 3035°C (Acetobacter suboxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng

18-21 °c {Acetobacter oxydans).
Theo quan điểm này, Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân
biệt với các loài khác trong chi bao gồm: + Có khả năng oxy hóa acid acetic
thành CƠ 2và H 2O + Không sử dụng muối amonium làm nguồn nitơ duy nhất +
Trên bề mặt môi trường tạo lớp màng nhầy chứa cellulose.

Quan điểm 2: Theo Bergey (1984 và 1992), Gluconacetobacter
được xếp vào chi Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Họ vi khuấn
này gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter . Đặc điểm phân biệt giữa
2 chi cụ thể là:
Bảng 1.1. Các đặc điểm phân biệt Gluconobacter và Acetobacter


(So sánh Gluconobacter , Acetobactervởi Pseudomonas )
Chi
Gluconobacte
Acetobacter
r
1. Vị trì tiên mao

Pseudomona
s

+

Chu mao hoặc Chu mao ở cực
không có

2. Phát triển ở pH= 4,5

3. Oxi hóa aceton ở pH= 4,5

+

+

-

+

+

-

4. Oxi hóa acid acetic

-

+

+

5. Oxi hóa lactate

-

+

+

+/-

+/-

6. Glucose -> gluconate

+

7. Sử dụng tinh bột, lactose

-

-

+/-

8. Sử dụng gelatin

-

-

+/-

-

-

+/-

9. Sắc tố huỳnh quang

Quan điểm 3: Theo Boesch và cs (1998) [13], Yamada và cs
( 2000), và hiện nay vẫn có những quan điểm khác nhau về phân loại họ

Acetobacteraceactrong đó Gluconacetobacter xylinus (A. xylinum) và xếp
vào chi Gluconacetobacter với cơ sở của sự phân chia này là việc phân
tích trình tự chuỗi 16S rDNA. Quan điếm này hiện nay có tính chính xác
cao do cơ sở là dựa vào cấu trúc phân tử nên được nhiều người công nhận
[32].


Đánh giá: Mặc dù xếp chủng vi khuấn Gluconacetobacter vào
những chi, những họ, những lớp phân loại khác nhau nhưng tất cả các
quan điểm trên đều thống nhất với nhau về một số đặc điểm sinh lý, sinh
hóa của Gluconacetobacter như: khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid
acetic, khả năng oxy hóa tiếp tục acid acetic thành CƠ 2 và H 2O; khả năng
hình thành acid 5-ketogluconic từ D-glucose... Đặc biệt là khả năng tống
hợp

cellulose

khả

năng

này

hầu

như

chỉ

có

ỏ’

các

chủng

Gluconacetobacter.
Đặc điếm hình thái, tế bào học

1.1.2.

Gluconacetobacter là loại trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong
kích thước khoảng 2 |im đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không có
bào

tử,

xếp

thành

từng

chuỗi,

không

có

khả

năng

di

động.

Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuấn Gram âm, hiếu khí, hiếu dị
dưỡng, tế bào của chúng tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả
hay trong đất [ 1].
Khuấn lạc Gluconacetobacter có kích thước nhỏ(đường kính khuẩn lạc
đạt 1 - 2mm),tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng,phần giữa khuẩn lạc lồi lên và
sẫm màu hơn các phần xung quanh,rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng Vi khuẩn Gluconacetobacter có bao
nhầy cấu tạo bởi cellulose. Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy là
polysaccarit (chủ yếu là glucose). Ngoài ra, còn có các polypeptit, protein.
Bao nhầy còn có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám
vào giá thể” [ 1].
Một

số tác

giả

cho

rang,

cellulose

tống

hợp

từ

vi

khuấn

Gluconacetobacter có vai trò dự trữ và có thể sử dụng khi môi trường nghèo


kiệt chất dinh dưỡng, nó sẽ phân huỷ nhờ enzyme của vi khuẩn là
endoglucanase và exoglucanase (Zippora G.E và cs, 1996). Nhờ đặc tính nhớt
và ưa nước của màng BC giúp cho vi khuấn Gluconacetobacter chống lại được
những thay đổi bất lợi.
1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Gluconacetobacter
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25-35°C. pH [4- 6].
Vì Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ
sung thêm axit acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuấn lạ.
Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của Gluconacetobacter bao
gồm: oxy hoá ethanol thành axit acetic, CƠ 2, H 2O; phản ứng catalse dương
tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, chuyến hoá glucose thành

axit, chuyến hoá glycerol thành dihydroxyaceton, không sinh sắc tố nâu, tổng
hợp cellulose [ 2].
1.2.

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo màng BC
Đe đảm bảo cho hoạt đông sống bình thường của vi khuẩn, môi trường

thức ăn ngoài rượu, nước còn phải bố xung thêm muối khoáng,


nguồn cacbon, nguồn nito dễ hấp thụ như : (NH 4) 2S 04, MgSƠ 4. 7H 20, KH 2P0 4...[4]

Đe phục vụ cho nghiên cứu thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quvết
định sử dụng hàm lượng glucose 20g/l cho các nghiên cứu
trên chủng Gluconacetobacter.
1.2.1.

Nhu càu nguồn cacbon
Theo kết quả nghiên cứu của thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng

A.xylium HN 5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành màng của
Gluconacetobacter [11].
Cacbon có trong tế bào chất,thành tế bào,trong tất cả các phân tử enzim,
axit nucleic và các sản phấm trao đối chất. Chính vì vậy,những hợp chất hữu cơ
có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật. Ảnh hưởng
của nguồn cacbon dến năng suất màng BC được thế hiện ở bảng 1. 2.
Bảng 1.2. Ảnh hưởng cũa nguồn cacbon đến năng suất sản xuất
màng BC

Nguồn cacbon

Năng suất tông Nguồn

Monosaccharide hợp cellulose

cacbon Năng suất tổng

Disaccharide

hợp cellulose

D-Glucose

100

Lactose

D-Fructose

92

Maltose

16

D-Galactose

15

Sucrose

7

D-Xylose

11

Cellobiose

33

D-Arabinos

14

D-Sorbose

11

7-11

1.2.2. Nhu cầu nguồn Nitơ
Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần Nito trong quá trình
sống để xây dựng tế bào. Vì vậy nếu nguồn Nito trong môi trường quá ít sẽ ảnh
hưởng tới hoạt động sống của tế bào. Vì vậy ảnh hưởng tới quá trình tạo màng
BC. Ở nồng độ 2,0g cho hiệu suất màng BC cao nhất. Khi nuôi cấy vi khuẩn


Gluconacetobacter người ta

thường

sử

dụng

nguồn

nito

vô

cơ

là

(NH 4) 2S 04,NH 4N 03, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men [1 ].
1.2.3.

Nhu cầu của nguồn MgSOặ
MgS0 4 ỏ' nồng độ 2g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS.TS Đinh Thị

Kim Nhung :“Mg là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những enzim
này xúc tác cho phản ứng chuyến hóa chất trong quá trình hình thành màng BC”
[11].
1.2.4.

Nhu cầu của Photpho
Photpho ngoài vai trò tham gia cấu trúc của tế bào, nó còn có vai trò hết

sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở chủng vi khuẩn Gluconacetobacter. Đe
đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta sử dụng các loại phospho vô cơ
như: KH2PO4, K 2HPO 4, KNO 3... Việc bổ sung phosphat (nhất là phosphat kali)
vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường.
Đối với vi khuấn Gluconacetơbacter, nguyên liệu chủ yếu hiện nay được sử
dụng là nước dừa già, dịch hoa quả, rỉ đường..., khi nuôi cấy không cần phải bổ
xung các nguyên tố vi lượng nữa [ 1], [16].
1.2.5.
1.2.5.1.

Điều kiện nuôi cấy
ĐộpH
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trường có pH

thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bố sung thêm axit acetic nhằm axit hoá
môi trường. Đồng thời axit acetic còn có tác dụng sát khuấn,giúp ngăn chặn sự
phát triến của các vi sinh vật có hại [31]. ỉ.2.5.2. Nhiệt độ
Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuấn Gluconacetobacter vào
khoảng 25-30°C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình
chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [29], [30].
1.2.5.3.

Độ thông khí


Vi khuấn Gluconacetobacter là vi khuấn hiếu khí bắt buộc. Do đó, điều
kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong thực tế độ
thông khí quyết định đến năng suất tống hợp BC.
1.2.5.4.

Thời gian nuôi cay
Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện một

lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36-48 giờ, hình
thành một lớp trong và ngày càng dày.
Theo Thesis Holemes (2004), hàm lượng glucose trong môi trường giảm
nhất sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi khuẩn bắt
đầu sử dụng axit gluconic và 5-keto axit gluconic trong quá trình trao đổi chất.
Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt trạng thái tốt nhất.
1.2.5.5.

Anh hưởng giữa bề mặt và thế tích dịch nuôi cay (tỷ lệ S/V)
Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự khả năng hình thành

màng tốt nhất ở tỷ lệ thể tích s/v= 0,8 với chiều cao môi trường dụng cụ lên men
h= l,25cm [10].
1.3.
1.3.1.

Bacterial cellulose (BC)
Cấu trúc
BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC-plant

cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme Ị3 -1,4- glucopynanose. Có
thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính
lại khác xa nhau.
Chuỗi polyme (3 - 1,4- glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo
thành sợi nhỏ ( subfibril) có kích thước l,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn
hơn - sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah,1998), những sợi này kết hợp với
nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanakaet.al 2000). Dải ribbon

có chiều dài trong khoảng từ l-9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này
sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc lực Van
Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi
trường nuôi cấy [31].


1.3.2.

Một số tính chất của màng BC
Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuấn

Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là
hemicillulose. Hemicillulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng
tan trong dung dịch kiềm tính [16], [17].
Một số tính chất của màng BC:

Độ tinh sạch : màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các
cellulose khác, có thế phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.

Độ bền cơ học : màng BC có độ tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng
thấp, ổn định về kích thước.

Tính hút nước : màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có
tính xốp, độ ẩm cao.
1.3.3.

Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter
Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) các enzim tham gia vào quá trình sinh

tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm:

1PKF: Fructose-1 -photphate kinase PGM:

dehydrogenase

Phosphoglucomutase UGP:

PGI: Phosphoglucoisomerase

UDP-glucose

pyrophotphorylase Fru-6-P: Fructose-6-

PTS:

phosphate Glc-l-P: Glucose-1 -phosphate

phosphotransferrase

UDPGlc: Uridine diphosphoglucose GK:

Fru-bi-P:

glucokinase

phosphate

FBP:

Fructose-1,6-biphosphate

phosphatase
G6PDH:

Hệ

thong
Fructose-1,6-bi-

Glc-6-P: Glucose-6-phơsphate. PGA:
Phosphogluconic acid acid CS: Cellulose

Glucose-6-phosphate

synthase FK: fructokinase


Hình 1.3. Con đường chuyển hoá cacbon trong vi khuẩn
Gluconacetobacter Quá trình sinh tống hợp BC là một tiến trình bao gồm
nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ
thống chứa nhiều loại enzym, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà.
Theo
tác giả Alina Krystynowicz và cộng sự cho rằng có 4 enzym tham
CELLULOSE
gia xúc tác tổng hợp cellulose ở chủng vi khuẩn Gluconacetobacter:
es
UDPGlc(GK), Phosphoglucomutase
Glucose
Glucokinase
(PGM), Glucose - 1- phosphate
uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP),Cellulose synthase

(CS). Trong đó UGP là enzym có vai trò quan trọng nhất [31].
1.4.
1.4.1.

ứng dụng của màng BC
ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực
Màng BC có nhiều lợi điếm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết


tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu,
khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề
dày của vi sợi dưới lOOnm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh học,
tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các ứng dụng
đa dạng trong nhiều lĩnh vực
1.4.1.1.

Thực phâm
Sản pham cellulose được sử dụng trong nước ép trái cây và những thức

uống khác, trong mứt kẹo, trong kem, yaourt, salad, thức ăn tráng miệng có tác
dụng như chất làm đặc, vật liệu on định dịch huyền phù, vật liệu làm vỏ bọc
thực phẩm. Các sản phẩm ứng dụng cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực thực
phấm: Món tráng miệng (thạch dừa, kem ít calori, thức ăn nhanh, kẹo), chất nhũ
hóa trong nước ép trái cây và những thức uống khác, màng bao thực phẩm...
1.4.1.2.

Yhọc
Màng trị bỏng: màng cellulose vi khuẩn Gluconacetơbacter tẩm dầu mù u

có tác dụng tương tự màng sinh học trị bỏng

Màng băng vết thương, điều trị tổn thương da, trong ghép mô, cơ quan nội
tạng.
Tác nhân vận chuyến thuốc (qua đường miệng và da): dựa vào đặc tính
trương nở của bột BC người ta ứng dụng làm tác nhân vận chuyển thuốc, làm tá
dược tự rã, dùng huyền phù BC để ổn định các tá dược dạng nước, làm cho
chúng không bị tách pha khi bảo quản lâu ngày.
Da nhân tạo: Ớ Brazil, màng BC ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị
trường như một loại da nhân tạo dùng để đắp vết thương.
1.4.1.3.

Mỹ phâm
BC vừa có khả năng giữ ẩm cao mà không bám lại lên làn da sau khi rửa

và cũng không gây các tác dụng phụ như các chất giữ ẩm khác,


do đó được ứng dụng: Kem dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chất
tăng độ dày và bền cho nước làm bóng móng tay.
1.4.2. ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày.
Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại
di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh.
Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận
khoảng hơn 400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi.
Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng...
Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc
biệt quan trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng
làm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuấn, tạo điều kiện tốt cho
quá trình tái tạo phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ
có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩn

tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch
trong cơ thế (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại
tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biếu mô hóa hình
thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật.
1.5.

Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới.

1.5.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter và những ứng
dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown,
1999 [16] dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước,
dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown,
Jonas và Farad, dùng màng như là một chất đế biến


đối độ nhớt, đế làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh
học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown đã dùng BC làm vải
đặc biệt, Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự
(2006) Sirlene M.Costa, dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ
chất đế cố định protein hay cho sắc kí. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo
các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan hoặc
cellulose và polyvinyl, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay thế
da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu điều trị các bệnh tim
mạch.
Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong
phẫu thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ dưỡng
da cho phụ nữ, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạo
màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ gia, làm cơ
chất để cố định protein hay cho sắc kí ....

Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng
của nguồn cacbon đến khả năng hình thành cellulose. Nghiên cứu chế tạo màng
từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản
xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn.
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997),
Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs,
(2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết
quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm màng
BC từ Acetobacter xylinum dùng trị
bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC
làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [24].


1.5.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam những nghiên cứu về Gỉuconacetobacter và màng BC là
khá mới mẻ. Hầu như có rất ít các nghiên cứu, công bố liên quan đến

Gluconacetobacter,Acetobacter, sự hình thành BC và ứng dụng màng BC còn
rất khiêm tốn. Năm 1997 có công trình của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị
Mùi nghiên cứu môi trường nước giá đỗ thay thế nước dừa trong sản xuất
thạch dừa từ vi khuấn Acetobacter xylinum. Năm 1995- 2000 các công trình
nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter và khả năng lên men sinh acid acetic của
nhóm tác giả Lê Văn Nhương, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung,
Nguyễn Văn Cách. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình sinh
acid acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC gần đây nhất là
nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ đế cố định tế bào vi
khuẩn [ 8], [9]. Năm 2000 nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị
Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về
ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn

Acetobacter xylinum ứng dụng vào làm thạch dừa. Năm2003 có nghiên cứu
của nhóm tác giả Nguyễn Thuý Hường và Phạm Thành Hổ về chọn lọc dòng

Acetobacter xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất
cellulose vi khuẩn. Năm 2006 nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn
Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự về màng BC từ Acetobacter xylinum
tẩm dầu mù u dùng trong điều trị bỏng [5], [9]. Năm 2008, có nghiên cứu của
Đinh Thị Kim Nhung đã chọn được 1 chủng vi khuẩn Acetobacter xylỉnum

NHỊ [4], khảo sát khả năng tạo tạo màng của chủng này. Ngoài nguồn nguyên
liệu nước hoa quả dùng cho lên men


giấm, còn có thế sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu khác như các loại bia, rượu
nhạt, các nguyên liệu có chứa đường, tinh bột, acid hữu cơ, giàu vitamin... từ
các vùng miền khác nhau ở Việt Nam [5].
Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày
càng được nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các nghiên cứu, công bố
liên quan đến chủng A. xylỉnum sự hình thành màng BC và các hướng ứng dụng
màng BC. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh - Ký
Sinh, Trường đại học
Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng
phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và
trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm
thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên
nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da, chính vì vậy
dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo
điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm
thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu [5].

Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận
màng BC từ vi khuấn A. xylinum, ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng. Công
tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc
dùng một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng
chitossan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng
[12]. Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC với các hoạt
chất tái sinh mô và các chất sát khuấn đều có nguồn gốc thiên nhiên. Vì thế, nó
không chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực tiếp, không gây dị ứng,
không có yếu tố lây lan mầm bệnh, không giải phóng chất lạ vào vết thương.
Màng có khả năng diệt 100% vi khuẩn thường gây ra các nhiễm trùng vết


thương hở da như vết bong... Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và không cần
sử dụng bất cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thời làm lành
vết thương [9].

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.

Vật liệu

2.1.

/. Nguồn giống
Nhận vi khuấn Gluconacetobacter thuần chủng từ phòng thí nghiệm vi
sinh học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2.

2.1.2.

Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1.

Hoả chất
Nguồn cacbon: glucose (CèH^Oó), acid acetic.
Nguồn nitơ: cao thịt, cao nấm men, pepton, (NH 4) 2SƠ 4
Nguồn muối khoáng: NaCl, MgSƠ 4. 7H 20, KH 2PO 4
Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol...
Phenol lỏng 5%, H 2S0 4đặc.
Nước dừa già
Dung dịch Becberin clorid 0,1% (Thành phẩm được cung cấp từ Viện

bỏng quốc gia).
2.1.2.2.

Thiết bị

* Tại phòng Công nghệ sinh - Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và phòng thí nghiệm Vi sinh, tổ Thực Vật- Vi sinh, khoa Sinh- KTNN,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)
Nồi hấp Tommy (Nhật)
Box vô trùng (Haraeus)


Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)
Máy li tâm Sorvall (Mỹ)
Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5|il - lOml

Máy so màu uv - vis (Nhật)
Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ)
Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)
Máy cất nước 2 lần (Hamilton - Anh)
Kính hiến vi quang học Carl Zeiss (Đức)
Bộ điện di - AE - 4650 (Nhật)
Máy PCR (Applied biosystems, Mỹ)
Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác,
que trang, lamen, đèn cồn...và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.
2.1.3.

Môi trường

2.1.3.1.

Môi trường giữ giống (MT1)
: 20(g)
(NH 4 ) 2 S04 Glucose
: 3(g) Thạch
agar: 20(g) KH 2PO 4: 2(g)
Peptone: 5(g)
Nước máy: 1000 ml

MgS0 .7H 20: 2(g)
2. ỉ.3.2. Môi trường nhân giông (MT2) 4Glucose
: 20(g)

Axit acetic : 2%
MgS0 4.7H 20: 2(g)
Nước dừa :1000ml

2.1.3.3.

Môi trường lên men(MT3)

(NH 4) 2S0 4 : 3(g)
PH : 5,0-6,0
KH 2PO 4: 2(g)
Acid acetic :

Glucose : 20(g)

(NH 4) 2S0 4 : 3(g)

KH 2PO 4 : 2(g) pH :

MgS0 4.7H 2 0 : 2(g)

5,0-6,0 Nước gạo :

Axit acetic : 2%

1000 ml