Giáo trình thực tập sinh học đại cương

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
KHOA DƢỢC

GIÁO TRÌNH THỰC TẬP

SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG
(Lƣu hành nội bộ)

Năm 2014


NỘI QUY PHÒNG THỰC TẬP
1. Sinh viên phải thực hiện đầy đủ các bài thực tập theo chƣơng trình của môn học.
Sinh viên vắng 1 buổi thực tập sẽ không đƣợc thi hết môn.
2. Sinh viên phải đến phòng thực tập đúng giờ qui định. Trong giờ thực hành,
sinh viên muốn ra ngoài phòng thực tập phải xin phép giảng viên.
Giờ thực tập:

- Sáng:

7h30-11h15

- Chiều: 12h50-16h35
- Tối:

17h00-20h45

3. Sinh viên muốn nghỉ thực tập thì phải làm đơn xin phép nghỉ và ghi rõ ngày đi
thực tập bù nộp cho giảng viên phụ trách buổi thực tập (thực tập bù ngay
trong tuần). Khi đi thực tập bù, sinh viên phải trình đơn có chữ ký xác nhận cho
giảng viên. Thực tập bù đúng bài qui định.

4. Sinh viên phải đọc bài thực tập trƣớc khi đến phòng thực tập.
5. Trong giờ thực tập, sinh viên phải đội mũ, mặc áo blouse (có gài nút), đeo
bảng tên và tắt chuông điện thoại. Không tự ý sử dụng máy móc khi chƣa có
sự cho phép của giảng viên.
6. Sau mỗi buổi thực tập, sinh viên phải sắp xếp dụng cụ đúng vị trí, vệ sinh sạch sẽ
phòng thực tập. Tắt tất cả các thiết bị điện trƣớc khi ra về.
7. Sinh viên làm hƣ hỏng, bể vỡ dụng cụ phải đền trƣớc khi môn học kết thúc
thì mới đƣợc dự thi hết môn.
8. Sinh viên phải thực hiện đúng quy định phòng cháy, chữa cháy.

ii


MỤC LỤC
PHẦN A. SINH HỌC TẾ BÀO ..................................................................................1
Bài 1. KÍNH HIỂN VI - QUAN SÁT TẾ BÀO NHÂN SƠ VÀ TẾ BÀO NHÂN
CHUẨN.......................................................................................................................2
1. Kính hiển vi quang học ........................................................................................2
2. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản hiển vi ...............................................................5
3. Thực hành: Quan sát tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn .....................................6
Bài 2. MỘT SỐ BÀO QUAN, CHẤT DỰ TRỮ VÀ CHẤT CẶN BÃ CỦA TẾ
BÀO THỰC VẬT .......................................................................................................7
1. Các bào quan ........................................................................................................7
2. Chất dự trữ ............................................................................................................8
3. Chất cặn bã ...........................................................................................................9
Bài 3. TÍNH THẤM QUA MÀNG TẾ BÀO – NGUYÊN PHÂN ...........................10
1. Màng tế bào ........................................................................................................10
2. Nguyên phân.......................................................................................................11
PHẦN B. SINH HỌC PHÂN TỬ .............................................................................12
Bài 1. KỸ THUẬT CƠ BẢN ....................................................................................13

1. Một số dụng cụ cơ bản .......................................................................................13
2. Cách cân pha hóa chất cần thiết .........................................................................15
Bài 2. AN TOÀN THÍ NGHIỆM – CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG ......17
1. An toàn phòng thí nghiệm cơ bản ......................................................................17
2. Xử lý chất thải ....................................................................................................18
3. Phƣơng pháp khử trùng ......................................................................................18
Bài 3. CHIẾT TÁCH PLASMID PBLUESCRIPT TỪ E.COLI BẰNG PHƢƠNG
PHÁP MẪU NHỎ (MINIPREP) ..............................................................................22
1. Nguyên tắc ..........................................................................................................22
2. Nguyên vật liệu ..................................................................................................22
3. Thực hành ...........................................................................................................22
Bài 4. CHIẾT TÁCH ADN BỘ GEN TỪ TẾ BÀO MÁ Ở NGƢỜI........................24
1. Vật liệu – hóa chất ..............................................................................................24
2. Nguyên tắc ..........................................................................................................24
3. Phƣơng pháp tiến hành .......................................................................................25
Bài 5. CHIẾT TÁCH ADN TỪ MÔ THỰC VẬT ...................................................26
1. Phƣơng pháp MITSUI ........................................................................................26
2. Phƣơng pháp CTAB ...........................................................................................27
Bài 6. KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠN ADN ..............................................................29
1. Vật liệu – hóa chất ..............................................................................................29
2. Các enzyme cắt giới hạn.....................................................................................29
3. Phƣơng pháp tiến hành .......................................................................................30
Bài 7. PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE ....................................31
1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................31
2. Tiến hành ............................................................................................................31
iii


Bài 8. PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG ĐO MẬT ĐỘ QUANG .....33
1. Nguyên tắc ..........................................................................................................33

2. Nguyên vật liệu ..................................................................................................33
3. Tiến hành ............................................................................................................33
Bài 9. PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN - PCR .....................................................34
1. Nguyên tắc chung ...............................................................................................34
2. Thực hành ...........................................................................................................34
PHA CHẾ MỘT SỐ HÓA CHẤT DÙNG TRONG THỰC HÀNH ........................36

iv


PHẦN A
SINH HỌC TẾ BÀO
Biên soạn: PGS.TS. Trƣơng Thị Đẹp

1


Bài 1
KÍNH HIỂN VI - QUAN SÁT TẾ BÀO NHÂN SƠ VÀ
TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Nêu được các thành phần cấu tạo của kính hiển vi quang học và sử dụng
được kính hiển vi để quan sát tế bào.
2. Thực hiện được các tiêu bản hiển vi để quan sát bằng kính hiển vi quang học.
3. Quan sát và vẽ được hình dạng và cấu tạo của tế bào nhân sơ và nhân chuẩn.
1. Kính hiển vi quang học

Thân kính

Chân kính

Hình 1. Kính hiển vi 2 thị kính hiệu OLYMPUS

2


1.1. Cấu tạo của kính hiển vi
Các bộ phận cơ bản của một kính hiển vi quang học (Hình 1) nhƣ sau:
a. Chân kính: Để giữ thăng bằng cho kính, có các hình dạng khác nhau.
b. Thân kính: Từ dƣới lên trên gồm các bộ phận sau:
- Bộ phận lấy ánh sáng: là đèn chiếu sáng hoặc gương phản chiếu đƣợc gắn
trên chân kính. Gƣơng phản chiếu có hình tròn, gồm một mặt phẳng và một mặt
lõm, có thể xoay theo nhiều hƣớng khác nhau; trong thực hành tại Bộ môn, sinh
viên chỉ sử dụng mặt lõm của gƣơng để hội tụ ánh sáng từ nguồn sáng là đèn néon
hay ánh sáng mặt trời.
- Bàn kính (bàn mang lam kính): Để đặt tiêu bản, có hình tròn hay hình
vuông, ở giữa có một lỗ thủng để cho ánh sáng đi từ dƣới lên. Trên bàn kính có kẹp
dùng để cố định lam kính. Lam kính có thể di chuyển theo chiều ngang và chiều dọc
nhờ các ốc di chuyển gắn trên bàn kính. Bàn kính có thể đƣợc cố định hay di chuyển
lên xuống bằng ốc sơ cấp.
- Ốc di chuyển vật kính: gồm ốc điều chỉnh lớn (ốc sơ cấp) và ốc điều chỉnh
nhỏ (ốc vi cấp). Ốc sơ cấp giúp nâng lên hoặc hạ xuống bàn kính hoặc vật kính; khi
điều chỉnh bằng ốc sơ cấp khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản quan sát thì thay
đổi mắt thƣờng có thể nhìn thấy đƣợc. Ốc vi cấp dùng điều chỉnh hình ảnh rõ nét
hơn.
- Tụ quang: có hình trụ, nằm ngay bên dƣới bàn kính; đây là một hệ thống
thấu kính dùng để hội tụ ánh sáng từ gƣơng phản chiếu để tạo thành chùm tia sáng
mạnh hơn, có thể di chuyển nhờ một ốc gắn trên thân kính. Phía dƣới hệ thống sáng
có một cần gạt để mở hay đóng cửa sổ chắn sáng giúp ta điều chỉnh nguồn ánh sáng
vào nhiều hay ít.

- Cần kính: là chỗ cầm kính hiển vi khi di chuyển kính, ở đầu mang thị kính,
ở giữa có gắn một bàn xoay trên đó có gắn các vật kính có độ phóng đại khác nhau.
- Vật kính: là bộ phận quan trọng và phức tạp nhất của kính hiển vi, bên
ngoài vỏ có ghi: loại vật kính, độ phóng đại, độ mở,…
Ví dụ: Vật kính có ghi 40X/0.65 và 160/0.17 thì có nghĩa là: vật kính có độ phóng
đại là 40 lần, độ mở của tụ quang là 0,65, chiều dài ống kính phù hợp là 160 mm,
chiều dày của phiến kính trung bình là 0,17 mm ( 0,02 mm).
Các kính hiển vi sử dụng tại Bộ môn thƣờng có 4 loại vật kính có độ phóng
đại là 4, 10, 40 và 100 lần (4X, 10X, 40X, 100X). Các vật kính trên có thể:
+ Di chuyển xoay tròn nhờ một bàn xoay, trong bàn xoay có một cái khớp.
Khi muốn quan sát ở vật kính nào thì xoay vật kính đó vào đúng khớp.
+ Di chuyển lên - xuống nhờ ốc sơ cấp.
- Thị kính: gồm 2 thấu kính có mặt lõm hƣớng xuống phía dƣới, trên mặt có
ghi những độ phóng đại khác nhau thƣờng là 10 lần (10X). Kính hiển vi có loại có
1 thị kính, có loại có 2 thị kính.

3


Các bộ phận: chân kính, bàn kính, kẹp, ốc di chuyển vật kính là phần cơ học
của kính hiển vi. Các bộ phận: tụ quang, vật kính, thị kính, đèn chiếu sáng, gƣơng
phản chiếu là phần quang học.
1.2. Cách sử dụng kính hiển vi
Mỗi buổi thực hành, trƣớc khi sử dụng kính hiển vi, sinh viên phải kiểm tra các
bộ phận của kính, nếu thấy thiếu bộ phận hay bộ phận nào đó bị thay đổi thì báo cáo
ngay cho giáo viên hƣớng dẫn. Trƣớc khi cắm điện cần phải kiểm tra công tắc ở
vị trí 0 và nút chỉnh cƣờng độ sáng ở vị trí nhỏ nhất.
a. Điều chỉnh ánh sáng cho quang trƣờng
- Đối với kính hiển vi có 2 thị kính và có đèn gắn trên chân kính
Làm tuần tự các bƣớc sau đây:

+ Cắm điện.
+ Bật công tắc đèn từ vị trí 0 sang I.
+ Vặn nút chỉnh cƣờng độ sáng tăng dần.
+ Mở cửa sổ chắn sáng tối đa.
+ Nâng tụ quang lên cho đến khi mặt kính tròn trên đầu tụ quang cách bàn
mang vật khoảng 5 mm.
+ Xoay vật kính nhỏ (10X) vào vị trí quan sát (vào khớp).
- Đối với kính hiển vi có 1 thị kính và có gƣơng phản chiếu
+ Xoay mặt lõm của gƣơng phản chiếu vào nguồn sáng (có thể là ánh sáng mặt
trời hay ánh sáng điện).
+ Mở cửa sổ chắn sáng tối đa.
+ Nâng tụ quang lên cho đến khi mặt kính tròn trên đầu tụ quang cách bàn
mang vật khoảng 5 mm.
+ Xoay vật kính nhỏ (10X) vào vị trí quan sát (vào khớp).
+ Nhìn vào thị kính, tay điều chỉnh gƣơng phản chiếu hƣớng về nguồn sáng cho
đến khi quang trƣờng sáng tối đa.
b. Quan sát mẫu vật
- Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp chặt lại. Điều chỉnh sao cho mẫu vật quan sát
nằm đúng ở giữa lỗ trống của bàn kính và ngay bên dƣới đầu vật kính 10X.
- Dùng ốc sơ cấp chỉnh cho bàn kính lên cao tối đa (hoặc hạ từ từ vật kính
xuống cho đến khi đầu vật kính cách phiến kính mỏng khoảng 5 mm).
- Nhìn vào thị kính, tay vặn ốc sơ cấp để hạ từ từ bàn kính xuống (hoặc nâng từ
từ vật kính lên) cho đến khi nhìn thấy mẫu vật cần quan sát trong quang trƣờng.
- Dùng ốc di chuyển tiêu bản để quan sát sơ bộ toàn bộ mẫu vật.
- Khi muốn chuyển sang quan sát ở vật kính lớn: ta giữ nguyên trạng thái của
kính hiển vi, dùng tay xoay nhẹ nhàng đĩa mang vật kính để đƣa vật kính cần quan
sát (ví dụ vật kính 40X) vào khớp, sau đó vặn ốc vi cấp để thấy rõ nét mẫu vật.

4

1.3. Những điều chú ý khi sử dụng kính hiển vi
- Khi di chuyển kính phải dùng cả hai tay để cầm kính, một tay cầm trên cần kính,
một tay đỡ dƣới chân kính và luôn luôn để kính đứng thẳng.
- Trong khi sử dụng kính hiển vi:
+ Không để dung dịch quan sát dính vào đầu vật kính hay nhỏ xuống dƣới tụ quang.
+ Vặn các ốc nhẹ nhàng. Đặc biệt đối với ốc vi cấp, khi vặn theo một chiều mà
thấy cứng thì lập tức phải vặn ngƣợc trở lại, không bao giờ cố vặn tới (sẽ gãy
ốc vi cấp).
+ Nếu ngƣng quan sát một thời gian thì phải giảm nguồn sáng (không cần tắt đèn).
- Sau khi sử dụng kính hiển vi:
+ Giảm tối đa ánh sáng của đèn chiếu sáng.
+ Tắt đèn.
+ Lau cẩn thận phần cơ học bằng vải mềm khô và sạch.
+ Lau cẩn thận phần quang học bằng giấy lau kính của Bộ môn. Tuyệt đối
không đƣợc dùng khăn lau hay sờ tay vào các phần quang học.
- Cất kính hiển vi vào tủ:
+ Xoay vật kính nhỏ nhất vào khớp.
+ Rút dây điện khỏi ổ cắm và quấn tròn quanh cần kính.
+ Cất kính vào tủ theo đúng vị trí của kính.
2. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản hiển vi
2.1. Phƣơng pháp thực hiện
Làm tuần tự các bƣớc sau:
- Cho 1 giọt dung dịch quan sát (nƣớc cất, glycerin, KI, Soudan III…) vào giữa
phiến kính dày (phiến kính mang vật, lame).
- Đặt mẫu vật cần quan sát vào giữa giọt dung dịch.
- Đậy nhẹ nhàng phiến kính mỏng (phiến kính đậy vật, lamelle) lên mẫu vật sao
cho không có bọt khí trong dung dịch.
Lưu ý:
- Nếu dung dịch cho vào không đủ (không bao phủ hết mẫu vật), khi đó phải

cho thêm dung dịch vào bằng cách dùng ống nhỏ giọt cho từ từ dung dịch vào một
cạnh của phiến kính mỏng, dung dịch sẽ tự lan vào giữa 2 phiến kính.
- Nếu dung dịch cho vào quá dƣ, trào ra ngoài phiến kính mỏng thì phải dùng
giấy thấm lau hết phần dung dịch thừa bên ngoài phiến kính mỏng.
2.2. Cách thay dung dịch quan sát
Khi cần quan sát một mẫu vật ở nhiều dung dịch khác nhau, có thể thay dung
dịch bằng cách: dùng giấy thấm đặt ở một cạnh của phiến kính mỏng để rút dung
dịch đang sử dụng, nhỏ 1-2 giọt dung dịch cần thay vào cạnh đối diện của phiến
kính mỏng.
5


3. Thực hành: Quan sát tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn
- Vật liệu: Bèo hoa dâu - Vi khuẩn lam, tế bào biểu mô miệng, củ Hành tây.
- Hóa chất, dụng cụ:
+ Dung dịch iod, nƣớc cất.
+ Dao lam, bông gòn y tế.
3.1. Tế bào nhân sơ
Vi khuẩn lam có cấu tạo là tế bào nhân sơ, có khả năng tự dƣỡng nhờ quang
hợp, sống cộng sinh trong bèo hoa dâu.
Các bƣớc thực hiện:
- Đặt ngƣợc một khuôn bèo hoa dâu lên phiến kính dày có sẵn một giọt nƣớc,
dùng kim mũi mác làm nát cánh bèo, đậy phiến kính mỏng.
- Quan sát: Hình dạng và cách sắp xếp các tế bào của vi khuẩn lam trên kính
hiển vi ở vật kính 10X và 40X.
3.2. Tế bào nhân chuẩn
3.2.1. Tế bào biểu bì Hành tây
Các bƣớc thực hiện:
- Dùng dao lam rạch mặt trong vảy Hành tây một hình vuông cạnh 2 mm. Bóc
lớp biểu bì (lớp ngoài cùng) của hình vuông vừa rạch. Úp mặt vừa bóc lên phiến

kính dày có sẵn 1 giọt dung dịch iod. Đậy phiến kính mỏng lên mẫu vật.
- Quan sát: Hình dạng và các thành phần của tế bào biểu bì trên kính hiển vi ở
vật kính 10X và 40X.
3.2.2. Tế bào biểu mô miệng
Các bƣớc thực hiện:
- Dùng bông vô trùng quệt vào vòm họng, sau đó phết lên phiến kính dày trong
1 giọt nƣớc và đậy phiến kính mỏng lên mẫu vật.
- Quan sát: Hình dạng tế bào và các thành phần của tế bào biểu mô miệng trên
kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X.
BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào vi khuẩn lam.
2. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào biểu bì vảy Hành tây.
3. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào biểu mô miệng.

6


Bài 2
MỘT SỐ BÀO QUAN, CHẤT DỰ TRỮ VÀ CHẤT CẶN
BÃ CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Quan sát và vẽ đúng một số bào quan của tế bào thực vật.
2. Quan sát và vẽ đúng các dạng chất dự trữ và chất cặn bã ở tế bào thực vật.
Vật liệu: Quả Ớt chín, lá Lẻ bạn, lá Rong đuôi chồn, tinh bột Khoai tây, củ Thƣợc
dƣợc, hạt Thầu dầu, cuống lá Trầu bà, thân Rau sam, phiến lá Đa búp đỏ.
Hóa chất, dụng cụ:
- Dung dịch iod, nƣớc cất, dung dịch Soudan III, ethanol 900, ether.
- Dao lam, giấy thấm
1. Các bào quan
1.1. Sắc lạp ở quả Ớt chín

Các bƣớc thực hiện:
- Dùng dao lam cắt ngang thịt quả Ớt chín thành lát mỏng. Đặt lát cắt lên phiến
kính dày đã có một giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng.
- Quan sát: Hình dạng, màu sắc và cách sắp xếp của sắc lạp trong tế bào trên
kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X
1.2. Vô sắc lạp ở tế bào biểu bì lá Lẻ bạn
Các bƣớc thực hiện:
- Dùng dao lam tách một mảnh biểu bì dƣới (mặt có màu tím) của lá Lẻ bạn.
Úp mặt biểu bì vừa bóc lên phiến kính dày trong 1 giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng.
- Quan sát: Hình dạng, màu sắc và vị trí của vô sắc lạp trong tế bào trên kính
hiển vi ở vật kính 10X và 40X.
1.3. Lục lạp và sự chuyển động của tế bào chất ở lá Rong đuôi chồn
Tế bào sống thì chất tế bào luôn chuyển động tạo thành dòng nội chất.
Tuy nhiên, ta không thể quan sát trực tiếp sự chuyển động này vì chất tế bào
trong suốt. Chất tế bào di chuyển sẽ lôi kéo các hạt lục lạp di chuyển theo. Nhờ đó
chúng ta có thể quan sát gián tiếp sự chuyển động của chất tế bào nhờ vào sự
di chuyển của các hạt lục lạp.
Các bƣớc thực hiện:
- Chọn một lá rong đuôi chồn tƣơi xanh, đặt lên phiến kính dày trong một giọt
nƣớc, đậy phiến kính mỏng.
- Quan sát: Hình dạng, màu sắc và sự di chuyển của lục lạp trong tế bào trên
kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X.
7


Chú ý: Tìm những tế bào ở vùng gần gân lá của lá rong sẽ dễ tìm thấy sự chuyển
động của chất tế bào hơn.
2. Chất dự trữ
2.1. Glucid
- Tinh bột: là loại chất dự trữ phổ biến nhất trong tế bào thực vật (trong củ, thân,

rễ, hạt…). Mỗi loại cây có dạng tinh bột riêng, đặc sắc cho loại cây đó.
Các bƣớc thực hiện:
+ Dùng đầu kim lấy một ít tinh bột Khoai tây đặt lên phiến kính dày trong một
giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng..
+ Quan sát hạt tinh bột trong nƣớc ở vật kính 10X, 40X.
+ Thay nƣớc thƣờng bằng 1-2 giọt nƣớc iod. Ghi nhận màu sắc của hạt tinh bột.
- Inulin: là một đồng phân của tinh bột, tan trong nƣớc nhƣng kết tinh trong cồn
cao độ thành những tinh thể hình cầu.
Các bƣớc thực hiện:
+ Dùng dao lam cắt ngang một lát mỏng củ Thƣợc dƣợc, đặt lát cắt lên phiến
kính dày trong một giọt ethanol 900, đậy phiến kính mỏng.
+ Quan sát tinh thể inulin ở vật kính 10X, 40X.
2.2. Protid
Hạt A-lơ-rôn là dạng chất dự trữ protid của thực vật thƣờng gặp trong hạt, đƣợc
hình thành từ sự mất nƣớc cùa không bào trong quá trình hạt chín. Hạt a-lơ-rôn
không màu, chiết quang, có hình cầu hay hình bầu dục gồm một cầu thể và một á
tinh thể.
Các bƣớc thực hiện:
- Bóc vỏ hạt Thầu dầu, dùng dao lam cắt ngang phôi nhũ hạt thành lát mỏng,
đặt lên phiến kính dày. Cho vài giọt ether lên lát cắt, để khô, sau đó cho một giọt
nƣớc iod vào lát cắt, đậy phiến kính mỏng.
- Quan sát hạt a-lơ-rôn ở 40X.
2.3. Lipid
Giọt dầu mỡ là dạng chất dự trữ lipid ở thực vật, không màu hay màu vàng, rất
chiết quang, không tan trong nƣớc, cho màu đỏ cam với Soudan III.
Các bƣớc thực hiện:
- Dùng dao lam cắt ngang phôi nhũ hạt Thầu dầu thành lát mỏng, đặt lên phiến
kính dày và nhỏ vào một giọt Soudan III, đậy phiến kính mỏng.
- Quan sát giọt dầu mỡ ở vật kính 10X, 40X.

8


3. Chất cặn bã
Các bƣớc thực hiện:
- Cắt ngang các mẫu: Cuống lá Trầu bà, thân Rau sam, phiến lá Lẻ bạn, phiến lá
Đa búp đỏ thành lát mỏng, đặt lên phiến kính dày đã có 1 giọt nƣớc, đậy phiến kính
mỏng.
- Quan sát các vi phẫu ở vật kính 10X, 40X.
3.1. Tinh thể calci oxalat
- Hình kim (cuống lá Trầu bà): các tinh thể có thể nằm riêng lẻ hay xếp thành bó.
- Hình cầu gai (thân Rau sam): các tinh thể có hình cầu gai.
- Hình khối (phiến lá Lẻ bạn): tinh thể có hình khối lăng trụ rải rác trong tế bào.
3.2. Tinh thể calci carbonat (bào thạch, nang thạch) trong phiến lá Đa búp đỏ
Tinh thể có dạng một khối xù xì nhƣ quả Mít, treo bởi một cuống bằng
cellulose có tẩm silic vào vách tế bào hạ bì chứa nó (thạch bào).
BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Hình vẽ tế bào mô mềm của thịt quả Ớt chín có sắc lạp.
2. Hình vẽ tế bào biểu bì lá Lẻ bạn có vô sắc lạp.
3. Hình vẽ tế bào lá Rong đuôi chồn có lục lạp và đánh dấu dòng chuyển động của
tế bào chất.
4. Hình vẽ tinh bột, tế bào có các dạng chất dự trữ và chất cặn bã. Các hình vẽ đều
có chú thích đầy đủ.

9


Bài 3
TÍNH THẤM QUA MÀNG TẾ BÀO – NGUYÊN PHÂN
MỤC TIÊU HỌC TẬP

1. Giải thích được các hiện tượng xảy ra khi để tế bào thực vật trong dung dịch
ưu trương hay nhược trương.
2. Thực hiện được thí nghiệm chứng minh chức năng của màng sinh chất và
giải thích được kết quả của thí nghiệm.
3. Quan sát và vẽ đúng các kỳ của phân bào nguyên nhiễm.
Vật liệu: Lá Lẻ bạn, củ Dền đỏ, rễ Hành tím.
Hóa chất, dụng cụ:
- Dung dịch NaCl 3%, nƣớc cất, nƣớc 30oC, 50oC, 70oC, 80oC, 100oC và
ethanol 300, phẩm nhuộm orcein, dung dịch HCl 1N.
- Dao, dao lam, cốc nhỏ, becher 500 ml, kẹp gắp.
1. Màng tế bào
1.1. Hiện tƣợng thẩm thấu
Đối với tế bào sống, màng tế bào sẽ kiểm soát sự di chuyển của nƣớc và các
chất tan. Sự khuếch tán nƣớc qua màng sinh chất của tế bào thực vật đƣợc gọi là sự
thẩm thấu. Trong dung dịch không cân bằng áp suất thẩm thấu, nƣớc sẽ di chuyển
qua màng sinh chất từ nơi có áp suất thẩm thấu thấp (môi trƣờng nhƣợc trƣơng) đến
nơi có áp suất thẩm thấu cao hơn (môi trƣờng ƣu trƣơng) cho đến khi áp suất thẩm
thấu cân bằng giữa bên trong và bên ngoài tế bào.
Tế bào biểu bì lá Lẻ bạn có chứa anthocyan nên có màu tím. Ở điều kiện sống
bình thƣờng, màng sinh chất áp sát vách tế bào nên màu tím nhuộm đầy tế bào.
Các bƣớc thực hiện:
- Bóc biểu bì dƣới của lá Lẻ bạn (mặt có màu tím). Quan sát tế bào biểu bì trong
một giọt nƣớc ở vật kính 10X. Thay nƣớc bằng dung dịch NaCl 3%. Quan sát dƣới
kính hiển vi hiện tƣợng gì sẽ xảy ra trên các tế bào biểu bì?
- Thay nƣớc muối bằng nƣớc thƣờng, lặp lại 2 lần. Quan sát dƣới kính hiển vi
hiện tƣợng gì sẽ xảy ra trên các tế bào biểu bì?
Chú ý: Không nên kéo dài thời gian quan sát trong dung dịch NaCl 3% quá 5 phút,
vì tế bào có thể bị chết, khi đó không thể thực hiện đƣợc giai đoạn tiếp.
1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và dung môi hữu cơ lên tính thấm của màng sinh chất
Màng sinh chất là màng lipo-protein, các phức hợp này có thể bị tổn thƣơng do

nhiệt độ hay hóa chất, làm phá vỡ cấu trúc chuyên biệt và làm cho màng mất khả
năng kiểm soát hoạt động sinh lý bình thƣờng. Khi màng sinh chất bị tổn thƣơng,
10


nó không còn khả năng giữ các chất tan trong tế bào và do đó các chất này khuếch
tán ra ngoài tế bào theo nguyên lý cân bằng áp suất thẩm thấu.
Các bƣớc thực hiện:
- Cắt củ Dền đỏ thành 6 miếng đều nhau, có kích thƣớc 1 x 5 x 2 cm, rửa dƣới
dòng nƣớc chảy cho đến khi nƣớc rửa không còn màu tím. Ngâm các miếng củ Dền
trong nƣớc sạch.
- Lấy 6 cốc nhỏ, mỗi cốc đựng 30 ml nƣớc thƣờng, đánh số thứ tự từ 1 đến 6.
- Chuẩn bị nƣớc có nhiệt độ thay đổi: 30oC (nhiệt độ phòng thí nghiệm), 50oC,
70oC, 80oC, 100oC và ethanol 30o.
- Cho 1 miếng Dền vào cốc đựng nƣớc 30oC trong thời gian 2 phút. Sau đó,
chuyển miếng Dền vào cốc số 1 và để yên trong 30 phút.
- Cho 1 miếng Dền khác vào cốc đựng nƣớc 50oC trong thời gian 2 phút. Sau
đó, chuyển miếng Dền vào cốc số 2 và để yên trong 30 phút.
- Tiếp tục thực hiện nhƣ trên đối với 3 miếng Dền khác ở các nhiệt độ xử lý là
o
70 C, 80oC và 100oC. Sau 2 phút xử lý, chuyển các miếng Dền vào các cốc tƣơng
ứng là cốc 3, cốc 4, cốc 5 và để yên 30 phút.
- Cho miếng Dền còn lại vào cốc đựng ethanol 30o trong thời gian 2 phút. Sau
đó, chuyển miếng Dền vào cốc số 6 và để yên trong 30 phút.
- Sau 30 phút, gắp các miếng Dền ra khỏi cốc, ghi nhận màu sắc của dung dịch
trong 6 cốc.
2. Nguyên phân
Các bƣớc thực hiện:
- Trồng củ Hành ta trong dung dịch Knop ½ 24 giờ. Khi rễ có chiều dài
0,5-1 cm thì cắt chóp rễ một đoạn dài khoảng 2 mm, nhuộm với 0,5 ml orcein và 1

giọt dung dịch HCl 1N trong 2 giờ. Vớt chóp rễ đặt trên phiến kính dày trong một
giọt glycerin, đậy phiến kính mỏng rồi đè bẹp mẫu vật bằng đầu que diêm.
- Quan sát ở vật kính 10X và 40X các tế bào mô phân sinh rễ Hành ta ở các giai
đoạn: Gian kỳ (interphase), kỳ đầu (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ sau
(anaphase) và kỳ cuối (telophase).
BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Hình vẽ hiện tƣợng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh.
2. Đánh giá kết quả của thí nghiệm trên các miếng Dền đỏ bằng các dấu + để chỉ
mức độ màu của dung dịch. Giải thích kết quả.
3. Hình vẽ các kỳ của phân bào nguyên nhiễm và gian kỳ ở tế bào mô phân sinh rễ
Hành ta. Các hình vẽ phải có chú thích đầy đủ.

11


PHẦN B
SINH HỌC PHÂN TỬ
Biên soạn: TS. Lê Nguyễn Uyên Chi

12


Bài 1
KỸ THUẬT CƠ BẢN
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Biết cách sử dụng một số dụng cụ cơ bản
2. Nắm vững một số kỹ thuật cơ bản trong thực hành
1. Một số dụng cụ cơ bản
1.1. Micropipet
Pipet tự động có thể điều chỉnh đƣợc thể tích cần lấy. Micropipet có nhiều kích

cỡ: 0,1→1µl, 1→ 10 µl, 1→ 20 µl, 10→ 100 µl, 10→ 200 µl, 100→ 1000 µl …, và
kèm theo tip tƣơng ứng: 0,1→ 10 µl (trắng), 10→ 200 µl (vàng), 100→ 1000 µl
(xanh). Khi sử dụng chọn cỡ pipet và tip phù hợp với thể tích cần lấy để tránh sai số.
Cấu tạo micropipet thay đổi tùy theo kiểu thiết kế nhƣng nhìn từ bên ngoài đều
gồm; cần bơm, bộ phận điều chỉnh thể tích, số chỉ thể tích đƣợc chọn, bộ phận đẩy
tip (có thể tháo rời), đầu hút (nơi gắn tip).
Sử dụng: cầm chắc pipet trong lòng bàn tay sao cho ngàm tựa tì lên đốt đầu tiên
của ngón trỏ, dùng ngón cái để bấm cần bơm
Núm chỉnh thể tích
và núm đẩy tip. Có 2 cách sử dụng cụ thể:
Cần bơm
Hút một lần: điều chỉnh thể tích cần lấy,
Ngàm tựa
lấy tip, bấm cần bơm (một nấc) rồi giữ luôn,
Núm chỉnh thể tích
nhúng đầu tip vào dung dịch cần lấy, thả cần
Núm đẩy tip
bơm từ từ để lấy thể tích, đặt đầu tip vào nơi
Số chỉ
cần cho vào, bấm cần bơm để đẩy thể tích cần
lấy ra. Nếu cần thiết thì bấm tiếp nấc thứ hai để
tống hết phần chất lỏng còn dính ở đầu tip.
Hút nhiều lần cùng một thể tích: điều
Ống (cần) đẩy tip
chỉnh thể tích cần lấy, lấy tip, bấm cần bơm 2
nấc rồi giữ luôn, nhúng đầu tip vào dung dịch
Đầu hút
cần lấy, thả cần bơm từ từ cả 2 nấc để lấy thể
Tip
tích, đặt đầu tip vào nơi cần cho vào, bấm cần

bơm 1 nấc để đẩy thể tích cần lấy ra rồi giữ
luôn (khi đó trong đầu tip vẫn còn một thể tích
Hình 2. Cấu tạo micropipet
thừa), nhúng đầu tip vào dung dịch cần lấy, thả
cần bơm từ từ 1 nấc để lấy thể tích,...
Lƣu ý: Không dùng đầu hút để hút mà phải dùng đầu tip, tip phải đƣợc gắn chặt vào
đầu hút nếu không sẽ mắc sai số.

13


1.2. Eppendorf
Ống đựng nhỏ bằng nhựa có nắp bật hay nắp vặn dung tích 1,5 hay 0,5 ml.
Khi sử dụng cầm eppendorf trong lòng bàn tay, dùng ngón cái để bật và đóng nắp;
nếu eppendorf có nắp vặn dùng ngón cái và ngón trỏ để vặn nắp.

Hình 3. Eppendorf
1.3. Máy lắc rung (Vortex)
Máy cấu tạo cơ bản gồm 1 rotor có tâm sai với bán kính tâm sai nhỏ, đƣợc
sử dụng để lắc trộn các dung dịch hay để phân tán các cắn trong tube.
Máy thƣờng có 2 chế độ vận hành:
- Liên tục: rotor quay liên tục
- Kích hoạt: khi ta đặt tube vào rotor rồi nhấn xuống
rotor mới quay.
Khi sử dụng các tube phải đƣợc đậy nắp kỹ để tránh
dung dịch bắn ra ngoài và điều chỉnh tốc độ để có
lực rung phù hợp với yêu cầu.
Hình 4. Máy vortex
1.4. Máy ly tâm nhỏ (Microcentrifuge)
Dùng để lắng các cặn lơ lửng nhƣ tế bào hay tủa. Các rotor của máy thuộc loại rotor

góc và có thể thay đổi tùy theo kích thƣớc ống sử dụng. Máy ly tâm có 2 chế độ sử dụng:
- Pulse (spin): Nhấn và giữ luôn nút pulse, khi muốn dừng lại thả tay ra,
áp dụng để dồn các thành phần đang dính trên thành ống xuống.
- Ly tâm: để lắng cặn. Chọn tốc độ và thời gian thích hợp rồi nhấn nút
ly tâm. Lƣu ý: một số tube, eppendorf có thành mỏng (tube PCR) không chịu đƣợc
tốc độ ly tâm cao nên có thể bị thủng. Sau khi ly tâm tủa sẽ lắng ở đáy ống phía
đối diện với trục, do đó nên đặt ống vào rotor sao cho quai nắp hƣớng ra ngoài
(xem hình minh họa), khi đó ta có thể dễ dàng hút phần dịch nổi mà không
ảnh hƣởng đến cặn.
Lực ly tâm của máy tỷ lệ với tốc độ và độ dài của bán kính rotor.

14


Hình 5. Máy ly tâm
1.5. Máy luân nhiệt
Máy tạo ra các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
theo chƣơng trình định trƣớc, dùng để thực hiện
phản ứng PCR hay các phản ứng có nhiệt độ thay đổi
theo chu kỳ.
1.6. Máy điện di
Là thiết bị dùng để tách và phân tích các hỗn hợp
chất có điện tích bằng dòng điện.

Hình 6. Máy luân nhiệt

2. Cách cân pha hóa chất cần thiết
Các hóa chất sử dụng thƣờng đƣợc pha thành dung dịch mẹ và tồn trữ, khi dùng
mới pha loãng thành nồng độ mong muốn.
2.1. Công thức cân - pha

- Cân chính xác khoảng:
Thể tích dung môi cần lấy (ml) =

Hay Thể tích dung môi cần lấy (ml) =
- Cân chính xác và pha trong thể tích cố định:
Lƣợng cần cân (mg) = thể tích dung môi (ml) x nồng độ muốn pha (mg/ml)
- Cân và pha theo nồng độ mol:
Cần phân biệt mol là đơn vị chỉ hàm lƣợng: cho biết số phân tử gam (MW) chất
cần có; và M là nồng độ phân tử gam: cho biết có bao nhiêu mol chất trong 1 lít
dung dịch. Khi cân pha các chất theo nồng độ mol, ta có thể tham khảo giá trị
phân tử gam đƣợc ghi trên nhãn của hóa chất tinh khiết. Ví dụ: dung dịch KCl 5 M
nghĩa là trong 1 lít dung dịch có 5 mol KCl, và trong 100 ml dung dịch trên thì
hàm lƣợng KCl là 0,5 mol.

15


Lƣợng cần cân (g) = thể tích dung dịch (l) x nồng độ muốn pha (M) x MW (g)
Hay:
Lƣợng cần cân (mg) = thể tích dung dịch (l) x nồng độ muốn pha (mM) x MW (g)
Ví dụ: pha 200 ml dung dịch NaOH 1,5 M:
Số gam NaOH nguyên chất cần cân = 0,2 x 1,5 x 40 = 12 g
Ví dụ: pha 250 ml dung dịch NaOH 150 mM:
Số gam NaOH nguyên chất cần cân = 0,2 x 150 x 40 = 1500 mg = 1,5 g
2.2. Công thức điều chỉnh nồng độ pha loãng
Thể tích dung dịch mẹ cần lấy (ml) =

x số ml muốn pha

Hay:

Thể tích dung dịch mẹ cần lấy (ml) =

x

Sau đó thêm dung môi vừa đủ thể tích cần pha
Ví dụ: pha 100 ml TAE 0,5x từ TAE 10X
Số ml TAE 10X cần lấy = (0,5/10) x 100 = 5 ml
Ví dụ: pha 150 ml dung dịch EtBr 0,5 µg / ml từ dung dịch mẹ 0,5 mg/ml để nhuộm gel:
Số ml dung dịch mẹ cần lấy = (0,5/500) x 150 = 0,15 ml = 150 µL
Ví dụ: pha 250 ml Tris-Cl 50 mM từ Tris-Cl 2M.
Số ml Tris-Cl 2M cần lấy = (50/2) x 0,25 = 6,25 ml.

16


Bài 2
AN TOÀN THÍ NGHIỆM – CÁC PHƢƠNG PHÁP
THANH TRÙNG
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Hiểu biết về các quy tắc đảm bảo an toàn trong phòng thí nghiệm và khi làm việc
2. Nắm vững và vận dụng các phương pháp khử trùng khi làm thí nghiệm sinh học
1. An toàn phòng thí nghiệm cơ bản
1.1. Bảo hộ cá nhân
- Phải mặc áo choàng, áo khoác hoặc đồng phục phòng thí nghiệm (PTN) trong
suốt thời gian làm việc trong PTN.
- Phải đeo găng tay trong tất cả các quá trình tiếp xúc trực tiếp hoặc tình cờ với
các chất có khả năng gây nhiễm trùng, gây bệnh, các hóa chất độc hại. Sau khi
sử dụng, tháo bỏ găng tay đúng cách và phải rửa tay.
- Ngƣời làm việc trong PTN phải rửa tay sau khi thao tác với các vật liệu có
khả năng gây nhiễm trùng, gây bệnh, các hóa chất độc hại và trƣớc khi ra khỏi

khu vực làm việc của PTN.
- Luôn đeo kính bảo hộ, mặt nạ hoặc các thiết bị bảo hộ khác để không bị các
dung dịch nhiễm trùng bắn vào mắt và mặt cũng nhƣ tránh đƣợc các vật có sức ép
lớn và tia cực tím nhân tạo.
- Cấm ăn uống, hút thuốc trong khu vực làm việc của PTN.
1.2. Khu vực làm việc
- PTN phải ngăn nắp, sạch sẽ và chỉ để những gì cần thiết cho công việc.
- Vào cuối buổi thực hành, mặt bàn ghế phải đƣợc làm sạch và khử nhiễm
sau khi làm đổ các vật liệu nguy hiểm.
- Tất cả các vật liệu, vật phẩm và môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật phải đƣợc
khử trùng trƣớc khi thải bỏ.
1.3. Ngƣời làm việc
Nhằm rèn luyện kỹ năng PTN và nâng cao tính chủ động trong nghiên cứu,
sinh viên khi làm thực tập cần lƣu ý một số điểm sau:
- Chủ động trong công việc: xem và sắp xếp các thí nghiệm hợp lý để rút ngắn
thời gian và tăng hiệu quả công việc.
- Nghiêm túc và cẩn thận khi làm thí nghiệm.
- Trật tự trong PTN: tuân thủ các quy định làm việc, quy định về an toàn tại
PTN. Giữ vệ sinh PTN.
- Bảo quản các dụng cụ, thiết bị của phòng: sinh viên cần giữ gìn các dụng cụ
đƣợc nhận và sử dụng cẩn thận các thiết bị của phòng. Những hƣ hỏng mất mát phải
chịu bồi thƣờng tƣơng xứng.
17


- Khi ra về: phải kiểm tra tắt điện, nƣớc, máy móc không sử dụng.
2. Xử lý chất thải
2.1. Chất thải là tất cả các vật liệu cần thải bỏ
Trong PTN, việc khử trùng chất thải và thải bỏ chúng sau này có liên quan
chặt chẽ với nhau. Trong khi sử dụng hằng ngày, chỉ một số ít vật liệu nhiễm trùng

thật sự cần thải bỏ hoặc tiêu hủy. Hầu hết các vật liệu thủy tinh, dụng cụ và áo quần
bảo hộ sẽ đƣợc sử dụng lại hoặc tái sinh. Nguyên tắc hàng đầu là tất cả các vật liệu
nhiễm trùng phải đƣợc khử trùng, thanh trùng hoặc thiêu hủy trong PTN.
2.2. Khử nhiễm
Hấp tiệt trùng là phƣơng pháp đƣợc ƣu tiên cho tất cả các quá trình khử nhiễm.
Các vật liệu để khử nhiễm hoặc thải bỏ cần đƣợc đặt trong hộp nhƣ túi nhựa
tổng hợp đƣợc mã hóa màu theo nội dung công việc là thanh trùng hay thiêu hủy.
3. Phƣơng pháp khử trùng
3.1. Định nghĩa
Một vật phẩm đƣợc xem là vô trùng khi không còn mang một mầm sinh vật nào nữa.
Thông thƣờng sự khử trùng đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp vật lý hay hóa học.
3.2. Khử trùng bằng phƣơng pháp vật lý
Có thể dùng: nhiệt, lọc, bức xạ, âm ba và siêu âm.
A. Khử trùng bằng nhiệt
Đối với tác nhân nhiệt, các tế bào dinh dƣỡng của vi sinh vật có thể bị giết dễ dàng.
1) Nhiệt khô (lò Pasteur hay tủ sấy)
Khử trùng bằng nhiệt khô là do sự làm khô vi trùng và oxy hóa các cấu tử của chúng.
Nhiệt khô dùng để khử trùng các dụng cụ bằng kim loại hay thủy tinh: ống
nghiệm, hộp lồng, ống hút, các bột khô.
Sự diệt trùng bằng nhiệt khô đƣợc thực hiện trong tủ sấy, đó là một phòng kín bằng
kim loại, đƣợc đốt nóng bằng chất khí hay điện trở. Nhiệt độ trong lò có thể lên đến
180oC và khí nóng phải đƣợc quạt đều trong lò để tránh sự sai biệt về nhiệt độ.
a) Khi dùng tủ sấy:
- Các dụng cụ phải đƣợc làm khô và gói giấy để đảm bảo tính vô trùng
sau khi sấy.
- Khi cho dụng cụ vào lò sấy xong, đậy nắp lại.
- Điều chỉnh nhiệt độ lên từ từ 175-180oC trong 30 phút (hoặc 160oC trong
2 giờ).
- Tắt lò, để nguội dƣới 80oC mới đƣợc mở cửa tủ ra. Nếu không, có thể làm
nứt vỡ các dụng cụ, làm ảnh hƣởng đến tính vô trùng của dụng cụ.

- Lấy dụng cụ ra khỏi lò sấy: phần giấy bao hoặc bông đậy phải có màu hơi vàng.

18


- Vì nhiệt độ cao, phƣơng pháp này chỉ áp dụng cho các vật phẩm chịu
đƣợc nhiệt độ trên 180oC.
b) Hơ trên lửa: que cấy vi sinh, kéo, kẹp,v.v… có thể diệt trùng bằng kiểu này.
Nên nhúng dụng cụ vào alcool rồi đốt làm nhiều lần.
2) Nhiệt ẩm
Ƣu điểm: làm nóng nhanh, hơi nóng thấm sâu vào trong vật phẩm và cho
hơi ẩm nhiều. Do đó vi sinh vật bị giết chết vì protein đông kết lại.
a) Hấp Pasteur
Áp dụng phƣơng pháp này phải chọn nhiệt độ diệt trùng thích hợp và
thời gian cần thiết (bảng)
Vi sinh vật

Nấm men
Nấm mốc
Vi sinh vật
không có bào tử
Vi sinh vật có
bào tử
Siêu vi trùng

Nhiệt độ diệt trùng
Tế bào dinh dƣỡng
Bào tử
o
o

Nhiệt độ ( C)
Thời gian (phút)
Nhiệt độ ( C)
Thời gian (phút)
50 – 70
5 – 10
70 – 80
5 – 10
60
5 – 10
70
5 – 10
60 – 70
5 – 10
60 – 70

5 – 10

60 – 70

5 – 10

120

12

b) Nƣớc sôi
Diệt tế bào dinh dƣỡng, bào tử và nấm vẫn còn. Thời gian là 5 phút.
c) Chƣng cách thủy nhiều lần
Đối với những môi trƣờng chứa serum hay chất dễ hƣ ở nhiệt độ cao, phải

áp dụng phƣơng pháp đun cách thủy với nhiệt độ 70 – 80oC, mỗi lần đun 1 giờ và
liên tiếp trong 3 ngày liền.
d) Hơi nƣớc lƣu thông
Dùng cho dung dịch hóa học không chịu đƣợc nhiệt độ trên 100oC. Có thể
dùng autoclave nhƣng luôn mở khóa thoát hơi để nhiệt độ không quá 100oC.
Đun 30 phút - 1 giờ.
Cũng nhƣ phƣơng pháp chƣng cách thủy nhiều lần nhƣng vật phẩm
diệt trùng bằng hơi nƣớc lƣu thông phải đƣợc kiểm soát sự vô trùng bằng cách để ở
37oC trong 24 giờ.
e) Hơi nƣớc bão hòa ở áp suất cao (autoclave)
Nguyên tắc: Làm gia tăng nhiệt các vật bằng hơi nƣớc bão hòa dƣới một
áp suất lớn hơn áp suất bình thƣờng của khí quyển. Khi áp suất hơi nƣớc tăng lên
thì nhiệt độ cũng tăng theo.

19


Nhiệt độ hơi nƣớc bão hòa ở các áp suất khác nhau:
Nhiệt độ (oC)
100
112
121
128
134

Áp suất (atm)
0
0,5
1
1,5

2

Thời gian khử trùng phụ thuộc thể tích vật muốn khử trùng và dụng cụ để
chứa đựng vật đó. Thông thƣờng sử dụng 121oC trong 20 phút.
Với phƣơng pháp autoclave có thể tiêu diệt cả tế bào dinh dƣỡng lẫn bào tử của
vi sinh vật.
Sơ đồ nồi hấp áp lực autoclave:
Cách sử dụng autoclave:
- Cho nƣớc cất một lần vào lò đến mức quy định.
- Xếp dụng cụ, vật liệu cần khử trùng vào nồi trong các giá đựng.
Không nên xếp các dụng cụ sát nhau quá để hơi nƣớc thông qua dễ dàng.
- Đậy nắp nồi hấp thật kín.
- Mở van thoát khí.
- Đun nồi cần phải loại hết không khí có sẵn trong nồi hấp ra, bởi vì ở cùng
một áp suất thì nhiệt độ của hơi nƣớc đơn thuần sẽ cao hơn nhiệt độ của
hỗn hợp giữa hơi nƣớc và không khí. Do đó tác dụng khử trùng của
hơi nƣớc đơn thuần lên các vi sinh vật sẽ mạch hơn rất nhiều.
- Khi hơi nƣớc thoát ra thành luồng liên tục (không khí trong nồi hấp đã bị
loại hết), đóng van xả hơi lại. Tiếp tục đun cho áp suất tăng dần. Khi đạt
đến áp suất yêu cầu, ta giữ áp suất ở mức đó trong thời gian cần thiết.
Các nồi hấp hiện đại có chế độ điều chỉnh tự động. Khi áp suất đạt 1 atm,
nhiệt độ nồi hấp khoảng 120 – 121oC.
- Khi hết thời gian khử trùng, autoclave báo hiệu và tự động giảm dần
nhiệt độ. Đợi cho áp suất trong nồi hấp cân bằng với áp suất khí quyển
(kim áp kế về 0), nhiệt độ nồi hấp giảm xuống dƣới 80oC, mở van xả hơi.
Mở nắp nồi hấp. Tắt điện.
B. Khử trùng bằng sự lọc
Dùng cho vật phẩm lỏng, có độ nhầy yếu, không chịu đƣợc nhiệt độ cao
trên 60o. Cho vật phẩm đi qua một màng lọc xốp mà những lỗ có đƣờng kính
nhỏ hơn đƣờng kính của vi sinh vật nhỏ nhất. Sinh vật sẽ bị giữ lại trên màng lọc,

còn dung dịch đi qua sẽ vô trùng.
Màng xốp có thể bằng sứ, amiante, cellulose, hỗn hợp cellulose và muối ester
của cellulose. Mỗi lọc có một dung tích nhất định, có nghĩa là sự lọc phải dùng
áp suất tƣơng ứng.

20


C. Khử trùng bằng bức xạ
- Tia tử ngoại: thƣờng dùng nhất là tia UV, sử dụng để khử trùng phòng
thí nghiệm, phòng vô trùng, bệnh viện. Tia UV chỉ diệt trùng bề mặt, không
thấm sâu vào bên trong phẩm vật.
- Tia âm cực: khử trùng các dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Tia âm cực
có thể diệt trùng các vật đã cho vào bao gói kín.
D. Âm ba và sóng siêu âm
Với cƣờng độ lớn và thời gian vừa đủ sẽ làm vỡ màng tế bào và nội chất vi sinh
vật sẽ chảy ra. Dùng âm ba và siêu âm với mục đích lấy các chất trong tế bào
(phá vỡ tế bào) hơn là diệt trùng.
3.3. Khử trùng bằng phƣơng pháp hóa học
Mục tiêu dùng chất hóa học để ngăn ngừa nhiễm trùng. Sự phân loại và sử dụng các
chất sát trùng dựa vào các điểm sau:
- Tính chất của vật cần sát trùng.
- Loại vi sinh vật cần khử
- Cần ấn định rõ các điều kiện tổng quát nhƣ nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ.
Các loại chất sát trùng: phenol, rƣợu, iode, chlor và hợp chất có chlor, thuốc tẩy,
v.v…

21