PHẢN ỨNG HUYẾT THANH ứng dụng miễn dịch chẩn đoán vi sinh và bệnh nhiễm

PHẢN ỨNG HUYẾT THANH
ứng dụng miễn dịch chẩn đoán vi sinh và
bệnh nhiễm

Võ Thị Chi Mai


Đáp ứng miễn dịch


Mục tiêu
• Trình bày các tính chất của phản ứng KN-KT.
• Nêu nguyên tắc, phương pháp, kết quả từng
loại phản ứng.
• Nhận định ý nghĩa kết quả phản ứng


Cơ quan miễn dịch





Chẩn đoán huyết thanh học

• Nhận biết kháng nguyên hoặc kháng thể
• Lượng giá kháng nguyên hoặc kháng thể


Loại kháng nguyên
– Kháng nguyên hòa tan = kết tủa

• Không kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp

– Kháng nguyên hữu hình = ngưng kết
• Kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp


Loại kháng thể
– Kháng thể đa dòng
• Hỗn hợp tế bào B
• Xác định nhiều epitope
• Có thể phản ứng chéo với KN khác

– Kháng thể đơn dòng
• Từ 1 clone tế bào B
• Đặc hiệu cho từng epitope
• Ít nhạy cảm hơn KT đa dòng


Phản ứng kết tủa
Kết tủa trên thạch (Ouchterlony)
• Ưu điểm
– Rẻ
– Đơn giản (“Có” / “Không”
– Không cần KN tinh chế

• Nhược điểm
–
–
–
–

Ít nhạy. Không định lượng
Tốn thời gian (24-48 giờ)
Cần nhiều huyết thanh (0,5 mL/test)
Có thể khó đọc kết quả


Kết tủa trên thạch

Control antibody

Test Antibody

Antigen


Kết tủa vòng Mancini
Khuếch tán vòng đơn
Pha KT trong thạch
Cho KN vào giếng
Kết tủa dạng vòng
Càng nhiều KN, vòng kết tủa càng lớn

Diameter (mm)

Thử nghiệm định lượng

Test

Standard Curve

mg antibody / mL


Phản ứng kết tủa
Đường cong kết tủa

Đường kết tủa xuất hiện khi tỉ lệ KN-KT tối ưu


Phản ứng ngưng kết
– Kháng nguyên hữu hình. Tạo mạng kết tụ với kháng thể
• Ưu điểm
– Đơn giản, rẻ
– KN hòa tan có thể gắn vào phân tử tải để thành hữu hình
• Nhược điểm
– Có thể phụ thuộc isotype

- IgM ngưng kết hiệu quả hơn IgG
• Sử dụng:
– Test sàng lọc
– Định nhóm máu


Ngưng kết trực tiếp


Ngưng kết gián tiếp

Tìm KN

Tìm KT


Đọc kết quả

1:5
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:640
1:1280
1:2560
1:5120
No serum

• Hiệu giá: Số nghịch đảo của nồng độ huyết thanh pha loãng cao nhất
cho phản ứng dương tính. Hiệu giá là 100, không phải là 1/100.
– Hiệu giá KT trong huyết thanh tùy thuộc loại test thực hiện
• Do độ nhạy các loại test khác nhau.
• Ví dụ: mẫu huyết thanh kháng Bartonella henselae có hiệu
giá ngưng kết 20; hiệu giá miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
128; hiệu giá western blot 400; hiệu giá ELISA 4.000.

Positive control
Patient 1
Patient 2

Patient 3
Negative Control

Dilution of serum


Phản ứng trung hòa
• Trung hòa:
• Nuôi cấy tế bào bị tổn thương do độc tố, vi khuẩn,
virus
• Cho tác nhân gây bệnh tiếp xúc KT trước khi cho
vào nuôi cấy tế bào
• Sự hủy hoại tế bào nuôi bị ức chế.
• Mục đích
– Định danh virus
– Định lượng kháng thể


Phản ứng trung hòa

Trung hòa độc tố

Ngăn ngưng kết hồng cầu: trung hòa virus


Phản ứng miễn dịch đánh dấu
• Chất đánh dấu được gắn vào 1 thành phần
– 3 loại chất đánh dấu
• Enzyme
• Thuốc nhuộm huỳnh quang

• Chất phóng xạ
• 1 thành phần phản ứng được gắn lên pha
rắn (solid phase) có thể rửa
– Thủy tinh, nhựa, màng, tế bào …
– Phiến kính, phiến nhựa, hạt, ...


Miễn dịch huỳnh quang (IFA)
UV light
shines on dye

Detection:

dye becomes excited -electron shift

light emitted from dye
at a different wavelength

Fluorecein Isothyocynate
emits green light

Rhodamine Isothyocynate
emits red light

positive cells

negative cells

• Ưu điểm
– Độ nhạy cao

– Có thể định lượng
– Kỹ thuật có thể phát triển
• Nhược điểm
– Thiết bị đắt
Ví dụ: microscope >$15,000;
fluorometers >$25,000;
flow cytometers >$100,000
• Mục đích
– Phát hiện mầm bệnh
– Định danh mầm bệnh
– Định lượng / loại tế bào


Thử nghiệm trực tiếp tìm KN
• Ví dụ: test tìm KN virus bệnh dại
– Dùng KT đánh dấu huỳnh quang
phát hiện KN trong mô ký chủ


Phản ứng gián tiếp tìm KT
• Ví dụ: test huỳnh quang gián tiếp
tìm KT chống Toxoplasma gondii
– Dùng kháng kháng thể đánh dấu


Miễn dịch phóng xạ (RIA)
• Ưu điểm:
- Rất nhạy
- Định lượng
• Nhược điểm:

- Thiết bị đắt
- Chất thải phóng xạ
• Mục đích:
- Thử nghiệm thuốc
- Định lượng hormone