Phân tích đa dạng di truyền nguồn gen ba kích tím (morinda officinalis how) quảng ninh bằng chỉ thị ISSR

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
=====***=====

CHU THỊ THU HÀ

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
NGUỒN GEN BA KÍCH TÍM (MORINDA
OFFICINALIS HOW) QUẢNG NINH
BẰNG CHỈ THỊ ISSR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. LÂM ĐẠI NHÂN

HÀ NỘI - 2015
i


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ sinh học, được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các
Thầy Cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Viện, cùng với sự cố gắng
và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh –KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
trường đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành tới TS. Lâm Đại
Nhân đã trực tiếp hướng dẫn tôi, luôn chỉ bảo tận tình trong quá trình thực
hiện khóa luận tốt nghiệp.

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn TS. Phạm Bích Ngọc, TS.
Nguyễn Thị Thuý Hường và Th.S Hoàng Đăng Hiếu cùng các cán bộ phòng
Công nghệ Tế bào Thực Vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình
hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi có thể hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người
luôn bên cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Chu Thị Thu Hà

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận này hoàn toàn được thực hiện bằng sự
nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của TS. Lâm Đại Nhân và cán bộ
phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Các hình ảnh,
số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, đã thu được trong quá trình
nghiên cứu của mình và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Chu Thị Thu Hà

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Kí hiệu và địa điểm thu thập mẫu Ba kích ..................................... 19
Bảng 2.2: Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu ............... 20
Bảng 2.3: Các thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu..................................... 21
ảng 2.4: Hóa chất pha đệm rửa ..................................................................... 21
ảng 2.5: Hóa chất pha đệm chiết .................................................................. 22
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR-ISSR ................................................... 25
Bảng 3.1: Bảng giá trị độ tinh sạch và nồng độ DNA của các mẫu Ba kích .. 28
Bảng 3.2: Sản phẩm đa hình ISSR của mồi ISSR 56 nhận được sau khi chạy
PCR với DNA tổng số của các mẫu Ba kích .................................................. 33
ảng 3.3: Giá trị PIC và t lệ băng đa hình của 39 mẫu a k ch với 6 mồi ISSR. ... 35
Bảng 3.4: Hệ số tương đồng 39 mẫu Ba kích nghiên cứu .............................. 38

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How) [1]...................................... 4
Hình 1.2: Công thức của một số hợp chất có trong rễ Ba kích ......................... 5
Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR-ISSR ......................................... 26
Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số 18 mẫu Ba kích ..................................... 29
Hình 3.2 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR50 ........... 31
Hình 3.3 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR56 ........... 32
Hình 3.4: Sơ đồ hình cây biểu diễn mối liên kết di truyền giữa các mẫu Ba
kích dựa vào chỉ thị ISSR................................................................................ 37

v


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA

Deoxyribonucleic acid

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
ISSR

Inter Simple Sequence Repeat

SSR

Simple Sequence Repeat

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

PCR

Polymerase chain reaction

EtBr

Ethidium Bromide

Cs

Cộng sự

Bp

Base pair

CTAB Cetyltrimethyl amoniumbromide
EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate
dNTP

Deoxynucleosid triphosphat

TAE

Tris Acetate EDTA

vi


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục đ ch, yêu cầu ......................................................................................... 2

2.1. Mục đ ch ..................................................................................................... 2
2.2. Yêu cầu....................................................................................................... 2
3. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 2
3.1. Ý nghĩa lý luận ........................................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 2
NỘI DUNG....................................................................................................... 3
Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Ba kích (Morinda offcinalis How) ..................... 3
1.1.1. Phân loại .................................................................................................. 3
1.1.2. Mô tả ....................................................................................................... 3
1.1.3. Phân bố, sinh thái .................................................................................... 4
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Ba kích (Morinda offcinalis How) ............ 4
1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Ba kích (Morinda offcinalis How) ............... 5
1.1.6. Giá trị kinh tế của cây Ba kích (Morinda offcinalis How) ..................... 6
1.2. Một số chỉ thị phân tử thường dùng trong phân t ch đa dạng di truyền. .............. 7
1.2.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ................ 8
1.2.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 9
1.2.3. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) .............................................. 10
1.2.4. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ............... 11
1.2.5. Chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) ...................................... 12
1.3. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trên thế giới và
trong nước ....................................................................................................... 13
vii


1.3.1. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trên thế giới
......................................................................................................................... 13
1.3.2. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trong nước.. 14
1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Ba kích (Morinda offcinalis How) tại Việt
Nam ................................................................................................................. 16

Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 19
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 19
2.2.Vật liệu ...................................................................................................... 19
2.2.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 19
2.2.2. Trình tự các mồi ISSR........................................................................... 20
2.2.3. Hóa chất và thiết bị ............................................................................... 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 21
2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 21
2.3.2. Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế .............................. 23
2.3.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ........................................ 24
2.3.4. Phương pháp PCR-ISSR ....................................................................... 25
2.3.5. Phương pháp phân t ch số liệu .............................................................. 26
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 28
3.1. Kết quả tách chiết DNA ........................................................................... 28
3.2. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền Ba kích tím Quảng Ninh ........... 29
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 40
4.1. Kết luận .................................................................................................... 40
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41

viii


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây Ba kích (Morinda officinalis How) thuộc họ Cà phê (Rubiaseae) là
loại thảo dược quý, nơi phân bố của

a k ch chủ yếu mọc hoang ở những

vùng đồi, núi thấp tỉnh trung du và miền núi ph a bắc Việt Nam như: Quảng
Ninh, Lạng Sơn, ắc Giang, Cao ằng, Hà Giang, Tuyên Quang… Ngoài ra
còn có rải rác ở các nước khác như: Trung Quốc, Lào, Triều Tiên.
Ba k ch là một loài thảo được quý, theo nhiều nghiên cứu cho thấy củ
của cây a k ch được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu có tác dụng bổ
thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng, sức dẻo dai,
khử phong thấp [20]. Dịch chiết từ củ a k ch có tác dụng giảm huyết áp, tác
dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ tr não giúp ăn và ngủ ngon [38].
Do có giá trị y học cao, đặc biệt là khả năng bổ thận tráng dương tăng
cường sinh l ở nam giới nên cây

a k ch rất được ưa chuộng và có giá trị

kinh tế cao, giá bán rễ cây a k ch dao động từ 200.000 đến 600.000/1kg. Do
nhu cầu sử dụng rễ

a k ch ngày càng tăng dẫn đến khai thác quá mức bên

cạnh đó các dự án cải tạo đất trồng rừng đã làm cho a k ch không còn điều
kiện tự nhiên th ch hợp để phát triển. Ch nh vì vậy a k ch rơi vào tình trạng
gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần phải được bảo vệ
(Nghi định số 48/2002/NĐ-CP).
Ở Việt Nam, tỉnh Quảng Ninh có số lượng a k ch lớn nhất. Nhưng chỉ
còn rất t thuộc các huyện vùng sâu, vùng xa, vùng hải đảo, nơi ở sâu trong
rừng, nơi mà con người vẫn chưa tìm kiếm đến. Đây là loại a k ch cực tốt có
giá trị dược liệu cao, nhưng số lượng rất hạn chế.
Để góp phần đẩy mạnh việc sử dụng có hiệu quả nguồn dược liệu trong
nước và khai thác vốn quý của y học dân tộc. Với mục đ ch góp phần bảo tồn
nguồn gen của cây Ba kích và hỗ trợ cho công tác chọn tạo giống Ba kích
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền nguồn

1


gen Ba kích tím (Morinda officinalis How) Quảng Ninh bằng chỉ thị
ISSR”.
2. Mục đích, yêu cầu
2.1. Mục đích
Phân t ch đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích tím Quảng Ninh.
2.2. Yêu cầu
Thu thập và tách chiết được DNA của các mẫu Ba kích.
Thực hiện các phản ứng PCR-ISSR và điện di sản phẩm PCR-ISSR
trên gel agarose.
Xử lý số liệu thống kê và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích
tím tại Quảng Ninh bằng phần mềm NTSYSpc 2.1.
3.Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa lý luận
Nhằm góp phần đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen và bổ sung thêm
các nghiên cứu về cây Ba kích ở Việt Nam.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen của quần thể Ba kích từ đó ứng
dụng vào công tác chọn tạo giống.
Từ kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong công tác chọn lọc những
nguồn giống cây trồng khác nhau nhân rộng vào sản xuất, nhằm bảo tồn và
phát triển các nguồn gen quý.

2


NỘI DUNG
Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Ba kích(Morinda offcinalis How)
1.1.1. Phân loại
Bộ: Gentianales (Long đởm)
Họ: Rubiaseae (Cà phê)
Chi: Mirinada (Nhàu)
Loài: Morinda officinalis How
1.1.2. Mô tả
Cây Ba kích là cây thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Ngọn có
cạnh, màu tím, có lông, khi già thì nhẵn.
Lá mọc đối, hình mác hoặc hình bầu dục, thuôn nhọn, cứng, dài 6-14
cm, rộng 2,5-6 cm, cuống ngắn, lúc non màu xanh lục, khi già màu trắng mốc,
phiến lá cứng có lông tập trung ở mép và ở gân, khi già ít lông hơn. Lá kèm
mỏng ôm sát thân.
Hoa nhỏ, lúc non có màu trắng, sau hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu
cành, dài 0,3-0,5 cm, đài hoa hình chén hoặc hình ống gồm những lá đài nhỏ
phát triển không đều. Tràng hoa dính liền ở ph a dưới thành ống ngắn.Mùa ra
hoa vào tháng 5-6.
Quả hình cầu, khi ch n màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Mùa tạo quả
vào tháng 7-10.
Rễ cong queo, nhiều đoạn thắt nghẹt như ruột già, dài 15-20 cm có khi
hơn, to 1-2 cm chia ra nhiều đoạn chỗ phình to, chỗ teo lại rất đều đặn. Vỏ
ngoài màu nâu nhạt hoặc hồng nhạt, có vân dọc. Bên trong là thịt màu hồng
hoặc tím, vị hơi ngọt.

3


Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How)[1]
1.1.3. Phân bố, sinh thái
Cây a k ch thường mọc hoang ở vùng rừng thứ sinh, trung du và miền

núi các tỉnh ph a ắc, dưới tán một số kiểu rừng nhiệt đới ẩm lá rộng thường
xanh, nay trở nên thứ sinh gồm cây bụi và dây leo chằng chịt hoặc ở bờ
nương rẫy. Độ cao phân bố khoảng 100 m so với mặt biển. Càng lên cao cây
càng thưa dần, đến độ cao khoảng 1000 m thì hầu như hiếm gặp. Cây mọc
nhiều nhất ở các tỉnh Quảng Ninh, Phú Thọ, Hoà ình, Hà Giang, Lạng Sơn.
Ngoài ra nó còn có ở 1 số nước như Trung Quốc, Lào, Triều Tiên…
a k ch sinh trưởng và phát triển tốt ở những vùng có đặc trưng kh hậu
nhiệt đới ẩm, độ ẩm trung bình năm trên 80% và tổng lượng mưa cả năm đạt
1100 - 2000 mm.

a k ch sống th ch hợp trên các loại đất ẩm mát và thoát

nước tốt, thành phần cơ giới trung bình (cát pha đến thịt), tầng đất dày trên
1m, nhiều mùn, tơi xốp.
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Ba kích (Morinda offcinalis How)
Củ Ba kích có chứa các thành phần hoạt chất ch nh như: Gentianine,
Carpaine,

Choline,

Trigonelline,

Diogenin,

Yamogenin,

Gitogenin,

Tigogenin, Vitexin, Orientin, Quercetin, Luteolin, Vitamin B1,Morindin,
Vitamin C. Trong rễ Ba kích còn chứa Antraglycozid, đường, nhựa, Acid

hữu cơ, Phytosterol và t tinh dầu, Morindin. Rễ tươi có sinh tố C [1].

4


Ngoài ra trong Ba kích còn có Rubiadin, Rubiadin-1-Methylether,
Palmitic acid, Nanodecane [8]. Trong rễ củ

a k ch có thành phần của 24-

Ethylcholesterol. Các thành phần hóa học các hợp chất tự nhiên đã được xác
định ở rễ a k ch gồm: flavonoid, tannin, alkloid, glicoside và polyphenol [6].

Hình 1.2: Công thức của một số hợp chất có trong rễ Ba kích
1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Ba kích (Morinda offcinalis How)
Theo y học hiện đại thì Ba kích có tác dụng: Tăng sức đề kháng của cơ
thể đối với các yếu tố độc hại, chống viêm, điều hòa hệ thống nội tiết. Các thí
nghiệm trên chuột lớn và chuột nhắt cho thấy Ba kích không có tác dụng kiểu
Androgen nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của Androgen hoặc
tăng cường quá trình chế tiết hormon Androgen. Đối với nam giới có hoạt
động sinh lý yếu Ba kích có tác dụng làm tăng khả năng giao hợp (đặc biệt
đối với những trường hợp giao hợp yếu, ít). Ba kích còn có tác dụng tăng
cường sức dẻo dai, mặc dù nó không làm tăng nhu cầu sinh lý, không thấy có
tác dụng kiểu Androgen. Tuy không làm thay đổi tinh dịch đồ nhưng trên thực
tế có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh lý cũng như điều trị vô sinh
cho nam giới có biểu hiện vô sinh tương đối và suy nhược cơ thể. Đối với các
trường hợp tinh dịch ít, tinh trùng chết nhiều, không có tinh trùng, không xuất
tinh khi giao hợp thì sử dụng Ba kích chưa thấy có kết quả [2]. Đối với người
5

già hoặc những bệnh nhân không biểu hiện mệt mỏi, ăn kém, ngủ ít, gầy yếu
mà không thấy có những yếu tố bệnh lý gây nên và một số trường hợp có đau
mỏi các khớp, Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện qua những cảm
giác chủ quan như giảm mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon và những dấu hiệu khách
quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. Đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp thì
sau khi dùng Ba kích dài ngày cho thấy có hiệu quả [2]. Nước sắc Ba kích có
tác dụng tương tự như ACTH (adrenocorticotropic hormone). Rễ Ba kích
chiết xuất bằng rượu có tác dụng giảm áp huyết, có tác dụng nhanh đối với
các tuyến cơ năng, tăng cường não.
Ngoài ra Ba kích không có tính độc, LD50 của Ba kích được xác định
trên chuột nhắt trắng bằng đường miệng là 193g/kg (Trung dược dược lý, Độc
lý dữ lâm sàng) [6].
Theo y học cổ truyền, cây Ba kích có tác dụng bổ thận tráng dương,
mạng gân cốt, khử phong thấp. Từ xưa nhân dân ta đã biết sử dụng rễ Ba kích
trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa bệnh, Ba kích là vị thuốc bổ trí não và
tinh khí, dùng trong các bệnh liệt dương, sớm xuất tinh, di mộng tinh, phụ nữ
kinh nguyệt không đều, phong thấp, huyết áp cao [1], [7]. Ở những nơi có cây
a k ch người dân thường đào củ về nấu với thịt gà, ăn để bồi bổ sức khỏe.
1.1.6. Giá trị kinh tế của cây Ba kích(Morinda offcinalis How)
Ba kích là loại dược liệu có giá trị kinh tế cao. Trên thị trường hiện nay
giá của

a k ch tươi là 200.000 nghìn/kg, giá Ba kích khô là 600.000

nghìn/kg. Chính vì vậy nhiều tỉnh ở nước ta đã triển khai trồng Ba kích nhằm
bảo tồn và phát triển cây a k ch, tăng nguồn thu nhập cho con người, tránh
tình trạng người dân phải mua Ba kích từ Trung Quốc mà Ba kích Trung
Quốc thường đã bị người dân Trung luộc lấy hết dược liệu, chỉ còn bã đem
phơi khô và bán cho người Việt Nam.

6


1.2. Một số chỉ thị phân tử thƣờng dùng trong phân tích đa dạng di truyền.
Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác
định loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên
nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống
nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có
thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với
thực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái
lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực
quan nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều tính trạng được
thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn
khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên
ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân
gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
hiện đại.
Để đánh giá bản chất di truyền của các cá thể dựa vào hệ gen của
chúng, các chỉ thị DNA đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu
của sinh học phân tử như: Xây dựng thư viện bộ gen, xác định phát sinh
chủng loại, đánh giá đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng... Chỉ thị
DNA là một đoạn DNA dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hay hai giống
khác nhau. Chỉ thị DNA phong phú, đa dạng, ổn định cao, có thể nghiên cứu
ở bất kỳ giai đoạn phát triển nào của cá thể. Chỉ thị DNA cung cấp một công
cụ mạnh mẽ để đánh giá di truyền và mức độ sinh sản của cây trồng, đặc biệt
là xác định các loài và giống cây trồng [40], đánh giá phát sinh loài [34], giúp
hỗ trợ đánh dấu các gen quy định các đặc tính nông học quan trọng [25], xây
dựng bản đồ liên kết và bản đồ xác định vị trí của các vùng của bộ gen có
chứa các gen liên quan đến xác định một đặc điểm định lượng (bản đồ QTL Quantitative Traits Loci) [13].

7


Ở thực vật, có nhiều loại chỉ thị phân tử đã được ứng dụng trong các
nghiên cứu. Các chỉ thị DNA phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở
thực

vật

là:

RFLP

(Restriction

Fragment

Length

Polymorphism),

Microsatellite (hay SSR-Simple Sequence Repeat ), RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism) và ISSR (Inter - Simple Sequence Repeat) (Semagn và cs,
2006). Trong đó chia thành hai nhóm ch nh là: Chỉ thị dựa trên các trình tự
nhận biết của enzyme giới hạn (RFLP), các chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản
DNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) như: AFLP, RAPD,
SSR, ISSR. Mỗi chỉ thị đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định,
không có loại chỉ thị nào đáp ứng được tất cả các chỉ tiêu nhưng có thể bổ

sung cho nhau để hoàn thiện kết quả nghiên cứu.
1.2.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật RFLP là một kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu vật liệu di
truyền.Nguyên lý của kỹ thuật này là dùng các enzyme hạn chế cắt các mẫu
DNA cần phân tích tại những trình tự nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng ngàn đoạn
DNA có độ dài xác định khác nhau. Số lượng của những đoạn này tuỳ thuộc vào
số điểm nhận biết của enzyme cắt hạn chế có trong DNA bộ gen [39].
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội và được thừa nhận là chỉ thị di truyền
mạnh nhất, hiệu quả trong nghiên cứu biến dị di truyền, phân tích liên kết, chọn
giống, lập bản đồ, đa dạng di truyền... [16]. Các kết quả có độ chính xác cao nên
có thể tiến hành lặp lại ở các phòng thí nghiệm khác nhau.
Kỹ thuật này không đòi hỏi việc đọc trình tự song chỉ thị này cũng có
mặt hạn chế do phải tuyển chọn một quần thể lớn các mẫu dò và đòi hỏi phải
chuẩn hoá một thư viện các đoạn DNA được phân lập vào một số vector, vì
vậy kỹ thuật này cần có sự đầu tư đáng kể về trang thiết bị kỹ thuật phòng thí
nghiệm, giá thành cao, khi thực hiện đòi hỏi sự thành thạo về kỹ thuật.

8


Sự ứng dụng của chỉ thị RFLP còn gặp một trở ngại nữa đó là một chỉ
thị cho một đa hình, đây là vấn đề nghiêm trọng đặc biệt trong các phép lai
giữa các dòng có quan hệ gần.
1.2.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Cho đến nay đã có nhiều chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử được sử
dụng để xác định sự đa dạng di truyền thực vật. Trong số đó, kỹ thuật RAPD
đã được sử dụng để phân t ch đa dạng di truyền của số lượng lớn các giống
cây trồng [15], [23], [11]. Kỹ thuật này đã được ứng dụng rất thành công
trong những nghiên cứu về sự khác biệt di truyền trong các quần thể thực vật
[21], [36], [28]. Kỹ thuật RAPD đã cung cấp những tiếp cận hữu hiệu cho

việc đánh giá sự sai khác di truyền, đặc biệt trong những loài t được biết về
đặc tính di truyền.
Chỉ thị RAPD dựa trên cơ sở phản ứng PCR do sự nhân bội những
đoạn DNA trong hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random
primer) dài khoảng 10 nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C).
Khi sử dụng một mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên có k ch thước ngắn khoảng 10
nucleotit để thực hiện phản ứng PCR cho một DNA bất kỳ, mồi sẽ bắt cặp
ngẫu nhiên và quá trình nhân bản sẽ xảy ra (ở một đoạn nào đó) khi hai mồi
bắt cặp đúng chiều (vào đầu 3’ của mỗi sợi) và khoảng cách giữa hai mồi
không quá 1-3 kb. Đồng thời trong quá trình nhân bản sẽ xảy ra ở nhiều vị tr
và cho các đoạn DNA có k ch thước khác nhau. Kết quả chạy điện di cho các
băng vạch khác nhau và qua đó sẽ đánh giá được sự khác biệt về DNA giữa
các mẫu nghiên cứu. Đồng thời cho thấy sự đồng dạng (số băng trùng nhau)
của DNA giữa các cá thể đem phân t ch.
Ưu điểm của kỹ thuật RAPD là thực hiện nhanh dễ làm, ít tốn kém nên
được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện t nh đa dạng của sinh vật. Những
thay đổi trong gen, đột biến nhiễm sắc thể... đều làm thay đổi k ch thước của

9


đoạn nhân bản. Kỹ thuật này phù hợp với phân t ch đa dạng di truyền, lập bản
đồ gen.
Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của kỹ thuật RAPD là xác
định nguồn gốc di truyền, mối quan hệ họ hàng của động vật, thực vật và vi
sinh vật nên kỹ thuật này còn được gọi là phương pháp phân loại học phân tử.
Tuy nhiên, kỹ thuật này còn có những hạn chế như: Số băng thu được sau khi
sử dụng các mồi ngẫu nhiên còn rất lớn và không chắc chắn khi có băng AND
giống nhau thể hiện cùng k ch thước trên bản gel có thực sự là ở cùng một vị
trí trên hệ genom hay không [4].

1.2.3. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats)
Kĩ thuật còn được gọi là kĩ thuật microsatellies ( vi vệ tinh). Kỹ thuật
này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR[19].
Trong cấu trúc của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự
nucleotide lặp lại , chúng đặc trưng cho loài. SSR gồm 2-5 nucleotide lặp lại
nhiều lần. Ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n. SSR nằm rải rác trong hệ gen của
thực vật bậc cao. Đoạn mồi được thiết kế trên vùng bảo thủ ở hai đầu của
đoạn SSR. Số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được nhân có
độ dài ngắn khác nhau. Các trình tự lặp lại thường có vùng dị nhiễm sắc trên
mỗi nhiễm sắc thể. Chúng có vai trò điều hòa hoạt động của các gen, góp
phần làm tăng t nh ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có
thể mang thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính của động vật
và thực vật. Do sự khác nhau về số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp
lại mà số đơn vị lặp lại xuất hiện sự đa hình về độ dài của SSR được nhân
bản. Mức độ đa hình được xác định sau khi điện di trên gel agarose và gel
polyacrylamide. SSR được phân tích trên nhờ PCR nên chỉ đòi hỏi một lượng
mẫu DNA rất nhỏ. SSR là một công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và
chọn giống cây trồng vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện ra tính
đa hình rất cao. Trong thực tế chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số
10


tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh dại, xác định giới tính, phân tích
quan hệ di truyền, lập bản đồ gen… Song nhược điểm của chỉ thị này làcần
nhiều thao tác khi tiến hành,thiết kế mồi cho phản ứng nhân các đoạn SSR
phức tạp, thực hiện chỉ thị SSR tương đối tốn kém.
1.2.4. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên tắc là sử dụng kỹ thuật PCR để nhân
bản các đoạn DNA đã bị cắt bởi enzym cắt giới hạn. Khâu then chốt của kỹ
thuật này là việc thiết kế các mồi đặc trưng. Để thiết kế được các mồi đặc

trưng, trước hết phải cắt các mẫu DNA cần nghiên cứu bằng enzyme cắt giới
hạn. Người ta thường dùng đồng thời 2 enzym giới hạn để cắt DNA. Sau khi
xử lý với các enzym giới hạn, DNA bị cắt thành nhiều đoạn có k ch thước
khác nhau nhưng trình tự các nucleotit ở hai đầu đoạn cắt giống nhau và đã
được xác định. Dựa vào trình tự đã biết ở hai đầu cắt, có thể thiết kế các đoạn
Oligonucleotit ngắn (gọi là các adaptor) và gắn chúng vào hai đầu cắt. Dựa
vào trình tự adaptor có thể thiết kế mồi PCR gồm hai phần: Phần có trình tự
bổ sung với adaptor và phần có một đến ba nucleotide tùy ý. Với mồi thiết kế
như vậy chỉ có các đoạn DNA có trình tự 2 đầu bắt cặp bổ sung với trình tự
mồi mới được nhân bản.
 Các bước tiến hành kỹ thuật AFLP
ước 1: Tách chiết, tinh sạch DNA.
ước 2: Cắt các phân tử DNA bằng các enzyme giới hạn. Có thể dùng
2 enzym giới hạn để xử lý.
ước 3: Nối các đoạn DNA đã cắt với các adaptor.
ước 4: Nhân bản có chọn lọc các đoạn được nối ở trên bằng kỹ thuật PCR.
ước 5: Phân tích kết quả sản phẩm PCR bằng điện di và xử lý kết quả
bằng các phần mềm thông dụng để đánh giá sự khác biệt di
truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu.

11


 Những ưu, nhược điểm của kỹ thuật AFLP:
 Ưu điểm:
Kỹ thuật AFLP có thể phân tích với bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến
phức tạp. Phân tích sự đa dạng di truyền, đánh dấu các gen và ứng dụng để
lập bản đồ gen.
Kỹ thuật AFLP ít phức tạp hơn RFLP và phát hiện được một số lượng
lớn DNA đa hình trong thời gian ngắn và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong

nghiên cứu di truyền.
 Nhược điểm:
Đối với các hệ genom lớn, phức tạp thì số phân đoạn DNA là quá lớn,
khó phân tích, do vậy cần phải tìm biện pháp hạn chế số phân đoạn sao cho đủ
để phân tích.
Kỹ thuật thực hiện qua nhiều bước, phức tạp, đòi hỏi phải có kỹ thuật
phòng thí nghiệm cao, chi phi tốn kém.
1.2.5. Chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật sử dụng mồi có trình tự là các đoạn lặp lại,
tạo ra chỉ thị đa locus.
Kỹ thuật ISSR sử dụng phương pháp ch nh là PCR, bao gồm sự khuếch
đại của các đoạn DNA nằm giữa hai trình tự lặp lại liền kề nhau. Sản phẩm
PCR có thể được phân tách trên gel polyacrylamide hoặc gel agarose và sau
đó sẽ được chụp ảnh phóng xạ. Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh
rằng phương pháp ISSR cho mức độ đa hình cao hơn so với phương pháp
RFLP hoặc RAPD.
Kỹ thuật này đã được sử dụng rộng rãi trong đánh giá sự đa dạng quần
thể như: dó bầu [5], thầu dầu [35], Rauvolfia serpentina L [22], A. sinensis
(Lour.) Gilg và các giống sầu riêng [33], Diarsia brunnea [18]. Ngoài ra
phương pháp này đã được sử dụng thành công để mô tả dạng tứ bội hình
thành từ lai tế bào soma của bưởi [29] và quýt[32] và nhận biết cây tam bội
12


trong việc chọn tạo các giống quýt tam bội không hạt[12]. Bên cạnh đó ISSR
còn được dùng để xây dựng bản đồ liên kết của nhóm cây ăn quả có múi[27].
 Các bước tiến hành kỹ thuật ISSR
ước 1: Tách chiết DNA.
DNA được tách chiết phải có chất lượng tốt (tương đối sạch và không
bị gãy nhiều).

ước 2: Tiến hành phản ứng PCR.
Tiến hành phản ứng PCR với các đoạn có trình tự bổ sung với các đoạn
DNA ở giữa 2 trình tự lặp lại liền kề nhau.
ước 3: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, sau đó nhuộm gel
bằng Ethidium bromide.
ước 4: Chụp ảnh phổ điện di và phân tích số liệu.


Những ưu điểm của kỹ thuật

Chỉ thị ISSR không cần biết trước thông tin về trình tự nhân để thiết kế mồi.
Phương pháp ISSR chỉ cần một lượng nhỏ DNA để tiến hành [17], [35].
Kĩ thuật PCR-ISSR đơn giản và nhanh chóng, dễ thực hiện.
Chỉ thị ISSR có sự đa hình cao và được sử dụng để nghiên cứu đa dạng
di truyền, đa dạng loài, lập bản đồ gen và nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật.
1.3. Tình hình nghiên cứu Ba kích(Morinda offcinalis How) trên thế giới
và trong nƣớc
1.3.1. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trên thế giới
Trên thế giới cây Ba kích có phạm vi phân bố hẹp nên có ít công trình
nghiên cứu về loài cây này, chỉ có một số công trình nghiên cứu điển hình ở
Australia, New Guinea và Trung Quốc.
Ở Trung Quốc, a k ch cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về
thành phần hóa học và tác dụng dược lý, theo nghiên cứu Ba kích có tác dụng
tăng cường năng lực nam giới, chữa bệnh liệt dương, vô sinh và chữa trị thấp
khớp, điều hòa kinh nguyệt ở nữ giới. Tác dụng hạ đường huyết của cây Ba
13


k ch cũng được Soon và cs nghiên cứu trên mô hình chuột gây đái tháo đường
typel bằng steptozotocin và tác giả kết luận rằng rễ Ba kích có tác dụng hạ đường

huyết đối với chuột cống gây đái tháo đường typel bằng steptozotocin [31].
Cùng với đó, đặc điểm hình thái và di truyền của loài cây này cũng
được các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu. Sự đa dạng đi truyền Ba kích
được Ding và cs nghiên cứu, để phân tích sự đa dạng di truyền Ba kích tác giả
đã sử dụng chỉ thị RAPD, trong cả quá trình nghiên cứu tác giả sử dụng 40
mồi RAPD thì 14 mồi cho sản phẩm đa hình, qua phân t ch kết quả tác giả
đưa ra kết luận có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích ở mức độ phân tử [14].
Ngoài ra còn những công trình nghiên cứu nuôi cấy mô và nhân nhanh
cây

a k ch như công trình nghiên cứu của Wei và cs(2006) và công trình

nghiên cứu của Ning-Zhen Huang và cs (2007) [20],[38].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How)trong nước
Ở Việt Nam cây Ba kích còn có tên gọi khác là Ba kích thiên, Chẩu
phóng xì (tên gọi của dân tộc tày), Chày kiềng đòi (Dao) … và có tên khoa
học là Morinda officinalis How, 1858. Trong dân gian còn gọi là cây ruột gà.
Hiện nay cây a k ch đã bị khai thác nhiều và liên tục trong nhiều năm
nên phạm vi phân bố tự nhiên bị thu hẹp dần và bị suy gảm cả về chất lượng
cũng như số lượng. Loài cây này đang đối diện với nguy cơ tuyệt chủng, nên
đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) và Danh lục Đỏ cây thuốc Việt
Nam (1996, 2001 và 2006) nhằm khuyến cáo và bảo vệ. Cho đến nay có rất
nhiều nghiên cứu về Ba kích tuy nhiên vẫn chưa có công trình nào về nghiên
cứu bảo tồn nguồn gen cũng như t nh đa dạng sinh học ở loài cây này.
Năm 1972, để bảo tồn, khôi phục và phát triển, cây

a k ch bắt đầu

được gây trồng trên địa bàn Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm lâm sinh
Cầu Hai nay là Trung tâm Khoa học Lâm nghiệp vùng Trung tâm ắc ộ và

một số địa phương khác. Viện Khoa học lâm nghiệp Việt nam cũng đã có
những đề tài nghiên cứu thăm dò về gây trồng, bảo quản hạt và dược t nh của
14


cây a k ch như: Nghiên cứu gây trồng a k ch bằng hom dâm dưới tán rừng
và ngoài đất trống có dàn che của Nguyễn Đình Cầm (1972 - 1977) tại Trung
tâm Nghiên cứu Thực nghiệm lâm sinh Cầu Hai. Nghiên cứu thăm dò về bảo
quản hạt

a k ch và phương thức gieo ươm của Lê Đình Khả (1977). Tìm

hiểu về tác dụng của dịch chiết củ

a k ch của Thái Nguyễn Minh Tâm

(1975-1977)[42].
Ngoài ra còn có các nghiên cứu của Viện dược liệu và các trung tâm
nghiên cứu khác như:
+ Nghiên cứu tác dụng hướng sinh dục nam của Ba kích của Trần Mỹ
Tiên và cs(2012). Tác giả đã sử dụng cao chiết cồn 45% của rễ Ba kích và
tiến hành thí nghiệm trên chuột nhắt trắng bình thường và bị năng sinh dục.
Kết quả cho thấy trên cơ địa động vật, giảm năng sinh dục cao

a k ch đều

thể hiện tác dụng làm tăng nồng độ testosteron huyết, tăng trọng lượng của cơ
quan sinh dục đực và cơ hậu môn, tăng nồng độ toàn phần protein trong huyết
tương và không làm tăng thể trọng trong cơ thể. Tác dụng này cũng thể hiện
rõ trên động vật bình thường ở liều cao. Qua đó kết luận Ba kích thể hiện tác

dụng kiểu andorogen trên chuột đực bình thường và chuột đực giảm năng sinh
dục ở 2 liều thử nghiệm 50 mg/kg và 100 mg/kg. Ở 2 liều này trọng lượng
tinh hoàn không đổi sau thời gian thử nghiệm [9].
+ Nghiên cứu nhân giống in vitro cây a k ch của Võ Châu Tuấn và cs
(2010). Ở nghiên cứu này tác giả đã tái sinh chồi in vitro trên môi trường cơ
bản MS bổ sung 0,25 mg/L kinetin. Đoạn thân (khoảng 1 cm) của cây Ba
kích in vitro được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung các chất kích
sinh trưởng khác nhau cho cảm ứng nhân nhanh chồi. Số chồi in vitro đạt lớn
nhất trên môi trường cơ bản MS bổ sung 3,5 mg/L BA + 0,2 mg/L IBA (với
15,00 chồi/mẫu cấy). Chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung IBA hoặc
NAA, hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2 - 0,25 mg/L

15


IBA. Cây in vitro đưa ra nhà lưới, 97,9% cây sống và thích nghi với điều
kiện tự nhiên [10].
+ Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống và trồng vườn giống

a k chtrong

mô hình vườn gia đình, vườn trang trại (Công trình nghiên cứu khoa học tạo
nguồn nguyên liệu làm thuốc (1998 - 2008)) [42].
+ Nghiên cứu nhân giống a k ch in vitro giai đoạn vườn ươm (Công trình
nghiên cứu khoa học tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc (1998 - 2008)) [42].
1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Ba kích(Morinda offcinalis How) tại
Việt Nam
Ba kích là loài thảo dược quý và có giá trị kinh tế cao nhưng hiện nay Ba
k ch trong nước ta đang rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng, do vậy người
dân phải mua Ba kích của Trung Quốc. Để giải quyết thực trạng trên chính

quyền nhà nước đã có những ch nh sách để bảo vệ rừng, ngăn chặn nạn khai thác
rừng bừa bãi. Các dự án bảo tồn và phát triển cây Ba kích nhằm đem lại một
nguồn dược liệu chữa bệnh và tăng nguồn thu nhập cho con người.
Đã có nhiều công trình nghiên cứu đưa

a kích từ hoang dại thuần

hoá trở thành cây trồng trọt và Ba k ch được trồng ở các mô hình khác
nhau như trồng

a k ch dưới tán rừng thứ sinh, trồng xen với các cây

nông nghiệp như ngô, sắn trên các nương rẫy hoặc vườn hộ gia đình. Một
số dẫn liệu về nghiên cứu trồng Ba kích nhằm sản xuất dược liệu qua các
công trình nghiên cứu như:
Nghiên cứu trồng

a k ch dưới tán rừng thứ sinh ở Hoành Bồ (Quảng

Ninh) có độ che phủ khác nhau, không thấy chênh lệch về năng suất củ, nhưng
kém xa so với trồng a k ch ngoài đất trống không có tán che. Và sau 7 năm
trồng Ba kích, khối lượng củ mỗi bụi chỉ đạt 47 - 55 gam (tươi) tương ứng với
khối lượng thân. Nếu trồng a k ch có phân bón vô cơ và phân bón hữu cơ thì
sau 6 năm khối lượng củ cho mỗi bụi chỉ đạt dưới 100 gam. Như vậy, trồng Ba
16


k ch dưới tán rừng thứ sinh tuy có củ nhưng năng suất củ kém hơn nhiều so với
trồng ngoài đất được cải tạo trắng.
Nghiên cứu trồng thử nghiệm Ba kíchtrên đất đồi trống tại xã Chân

Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ. Cây con có k ch thước cao trung bình 9 cm,
đường kính gốc 0,3 cm. Sau 18 tháng trồng cây ở độ chiếu sáng 100%, đường
kính gốc 0,8 cm, cây đã ra củ và có đường kính cổ rễ 0,5-1,5 cm. Nhưng do là
cây dài ngày nên dự án không đủ kinh ph để tiếp tục theo dõi. Qua đó có thể
thấy ở điều kiện khí hậu Bắc Bộ, cũng có thể trồng Ba kích không cần tán che
vẫn có thể tạo được dược liệu. Khi trồng Ba kích xen với cây chè cho thấy Ba kích
sinh trưởng phát triển rất kém, có lẽ do đất trồng chè nhiều năm đã nghèo kiệt.
Năm 1993, khi trồng Ba kích xen ngô (khi ngô đã cao 30-40 cm, Ba kích giống đã
1 năm tuổi) nhưng a k ch cũng bị chết nhiều không thể phát triển được.
Trồng Ba kích của nông dân: Qua điều tra, khảo sát tại gia đình à Lê
Thị Phú, xã Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ, cho thấy gia đình

à Phú

(1989) đã đưa a k ch từ hoang dại vào trồng dưới vườn tán vườn mít, cây có
giá leo, khoảng cách trồng giữa các cây là 3-4 m. Khi cây 5 - 6 năm tuổi, đã
thu hoạch được từ 6 - 8 kg dược liệu tươi trên một bụi, tương đương 1,5 - 1,7
kg dược liệu khô. Thành công này vượt xa so với công bố của Trung Quốc.
Trồng Ba kích ở Thanh Hoá: Tại Thanh Hóa đã trồng thăm dò a k ch
dưới tán cây vườn tạp tại Xã Thành Tiến – Huyện Thạch Thành có tọa độ vĩ
độ bắc 105,7o, kinh độ đông 20o ( Lần đầu tiên trong Tỉnh trồng Ba kích). Kết
quả, khi cây 3 - 4 năm tuổi, cho năng suất mỗi bụi 150 – 200 gam dược liệu
(khô).Đáng chú ý là những cây được trồng sâu thấy không có củ, rễ. Ba kích
chỉ ăn nông trên mặt đất. Ở những khu đất thấp, khi mưa lớn gây ngập úng
cục bộ, rễ rất nhanh bị hỏng. Nếu trồng Ba kích sâu (cổ rễ a k ch dưới mặt
đất trồng 10 cm) thì rễ không to phình ra được, do vậy năng suất dược liệu rất
thấp. Từ năm 2003 - 2005, nghiên cứu trồng

a k ch dưới tán vải thiều 25

năm tuổi tại xã Thành Vân, huyện Thạch Thành, tỉnh Thanh Hoá với độ che
17