So sánh động thái tích lũy một số chất trong mầm đậu tương DT84 và đt26 sinh trưởng ở điều kiện nhiễm mặn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

TRẦN THỊ KIM THOA

SO SÁNH ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY MỘT SỐ
CHẤT TRONG MẦM GIỐNG ĐẬU TƢƠNG
DT84 VÀ ĐT26 SINH TRƢỞNG Ở
ĐIỀU KIỆN NHIỄM MẶN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên nghành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI - 2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

TRẦN THỊ KIM THOA

SO SÁNH ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY MỘT SỐ
CHẤT TRONG MẦM GIỐNG ĐẬU TƢƠNG
DT84 VÀ ĐT26 SINH TRƢỞNG Ở
ĐIỀU KIỆN NHIỄM MẶN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên nghành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ
của các thầy cô giáo.
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Văn Mã là
ngƣời thầy đã hƣớng dẫn tận tình, tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành
tốt khóa luận này.
Em xin gửi lời cám ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, những ngƣời đã truyền đạt cho em những
kiến thức và phƣơng pháp nghiên cứu quý báu trong suốt thời gian học tập tại
trƣờng.
Và cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè và
những ngƣời luôn quan tâm giúp đỡ trong suốt thời gian học tập và nghiên
cứu vừa qua.
Trong quá trình hoàn thành khóa luận, do lần đầu tiên làm nghiên cứu
khoa học và thời gian có hạn không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong
nhận đƣợc sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn sinh viên để khóa
luận đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội,tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Trần Thị Kim Thoa


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan khóa luận “So sánh động thái tích lũy một số chất

trong mầm giống đậu tương DT84 và ĐT26 sinh trưởng ở điều kiện nhiễm
mặn” đƣợc hoàn thành là kết quả nghiên cứu của riêng em, những số liệu
trong khóa luận là trung thực, không sao chép, không trùng lặp với kết quả
nghiên cứu của tác giả khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Trần Thị Kim Thoa


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Hàm lƣợng prolin trong mầm giống DT84
Bảng 2: Hàm lƣợng prolin trong mầm giống ĐT26
Bảng 3. Hàm lƣợng vitamin C trong mầm giống DT84
Bảng 4. Hàm lƣợng vitamin C trong mầm giống ĐT26
Bảng 5: Tỉ lệ nảy mầm của 2 giống đậu tƣơng DT84 và ĐT26
Bảng 6: Chiều dài mầm 2 giống đậu tƣơng DT84 và ĐT26


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Sơ đồ mô tả vai trò của prolin đối với tính chống chịu của cây
Hình 2 : Cơ chế và tác nhân điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật
Hình 3: Hàm lƣợng prolin M0.4 trong mầm giống đậu tƣơng DT84
Hình 4: Hàm lƣợng prolin M0.6 trong mầm giống đậu tƣơng DT84
Hình 5: Hàm lƣợng prolin M0.8 trong mầm giống đậu tƣơng DT84
Hình 6. Hàm lƣợng vitamin C M0.4 trong mầm giống ĐT26
Hình 7. Hàm lƣợng vitamin C M0.6 trong mầm giống ĐT26
Hình 8. Hàm lƣợng vitamin C M0.8 trong mầm giống ĐT26
Hình 9: Tỉ lệ nảy mầm giống đậu tƣơng DT84
Hình 10: Tỉ lệ nảy mầm giống đậu tƣơng ĐT26

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài ................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................... 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................... 3
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ....................................................... 3
5. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn ................................................................ 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Sự nảy mầm của hạt đậu tƣơng ........................................................ 4
1.2. Vai trò của prolin và vitamin C trong quá trình nảy mầm của hạt ...... 6
1.3. Ảnh hƣởng của nhiễm mặn đất trồng đến thực vật nói chung và cây đậu
đỗ nói riêng ........................................................................................... 9
1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của prolin và vitamin C ở đậu đỗ nói
chung và đậu tƣơng nói riêng trong điều kiện nhiễm mặn ...................... 11
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............... 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.................................................................... 14
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................... 14
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 19
3.1. So sánh động thái tích lũy prolin trong mầm hai giống đậu tƣơng DT84
và ĐT26 .............................................................................................. 19
3.2. So sánh động thái tích lũy vitamin C trong mầm hai giống đậu tƣơng
DT84 và ĐT26 .................................................................................... 25
3.3. Tỉ lệ nảy mầm và chiều dài mầm ở 2 giống đậu tƣơng DT84 và ĐT26
........................................................................................................... 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 35

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Đậu tƣơng hay đỗ tƣơng, đậu nành (tên khoa học là Glycine max) là loại
cây họ Đậu, là loài có giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế khá cao và giữ một vị
trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng hiện nay. Cây đậu tƣơng đƣợc trồng chủ
yếu lấy hạt để chế biến thức ăn cho ngƣời và gia súc. Sản phẩm từ cây đậu
tƣơng đƣợc sử dụng rất đa dạng nhƣ dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến
thành đậu phụ, ép thành đậu nành, nƣớc tƣơng, làm bánh kẹo, sữa đậu
nành,…
Hạt đậu tƣơng có thành phần dinh dƣỡng giàu protein (40%), lipit (1225%), gluxit (10-15%), có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, Na, S; các vitamin
A, B1, B2, E, D, F, các enzim, sáp, nhựa, xenlulozo,…[11], [12]. Đậu tƣơng
còn đƣợc xem nhƣ là một thứ dƣợc liệu có tác dụng ức chế phân hủy protein,
điều hòa ngũ tạng, phòng bệnh và chữa bệnh cho con ngƣời. Hạt đậu tƣơng là
một mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị.
Ngoài ra, đậu tƣơng còn có tác dụng cao trong cải tạo đất vì hệ rễ có nốt
sần chứa vi khuẩn cố định đạm. Hiện nay đậu tƣơng đƣợc gieo trồng ngày
càng rộng rãi ở nƣớc ta và trên thế giới.
Có rất nhiều yếu tố môi trƣờng bất lợi trong đó có nhiễm mặn là yếu tố
hạn chế năng suất của cây trồng nói chung và đậu tƣơng nói riêng. Việc đƣa
các giống đậu tƣơng vào gieo trồng ở các vùng sinh thái khác nhau nhất là
vùng đất ngập mặn gặp không ít trở ngại do đậu tƣơng là loại cây tƣơng đối
mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chống chịu hạn. Đặc
biệt đậu tƣơng rất mẫn cảm với nƣớc ở các giai đoạn: hạt nảy mầm, cây con,
ra hoa, quả non.
Khả năng chống chịu của cây trồng đối với điều kiện môi trƣờng khắc
nghiệt đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học trong và ngoài nƣớc quan tâm
1


nghiên cứu. Trên cơ sở tính mẫn cảm của các loại cây trồng khác nhau với

điều kiện ngoại cảnh, ở từng giai đoạn nhất định ngƣời ta đã tìm những giống
có khả năng chống chịu nhƣ chịu hạn, chịu mặn, chịu lạnh… trong đó khả
năng chống chịu ở giai đoạn nảy mầm đƣợc đặc biệt quan tâm vì sự phát triển
của cây ở giai đoạn này là nền móng cho sự phát triển ở những giai đoạn tiếp
theo.
Cho đến nay đã có nhiều công trình của các nhà khoa học trong nƣớc
nghiên cứu về các vấn đề chống chịu liên quan đến đậu tƣơng nhƣ: Nguyễn
Văn Mã, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Minh Ngọc, Trần Đình Long,
Trần Thị Phƣơng Liên [8], [10], [11]… Tuy nhiên, hƣớng nghiên cứu về khả
năng chịu mặn chƣa đƣợc thật rộng rãi và sâu sắc.
Nghiên cứu và đánh giá khả năng chịu mặn của đậu tƣơng trong điều
kiện mặn nhân tạo, là cơ sở bƣớc đầu cho tuyển chọn giống đậu tƣơng có thể
thích nghi với vùng đất nhiễm mặn.
Prolin và axit ascorbic (vitamin C) là các chất có khả năng bảo vệ tế bào
trong điều kiện sinh trƣởng ở môi trƣờng cực đoan.
Prolin là một axit amin có vai trò quan trọng trong việc chống stress
trong cơ thể thực vật. Prolin tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội
bào, tham gia bảo vệ màng, protein và axit nucleic…
Vitamin C là một chất chống oxi hóa tốt, nó tham gia vào nhiều hoạt
động sống của cơ thể, là một đồng yếu tố trong một số phản ứng enzim quan
trọng…
Những nghiên cứu về vai trò của các chất nêu trên còn chƣa nhiều, đặc
biệt là động thái tích lũy của chúng ở mầm hai giống đậu tƣơng DT84 và
ĐT26 có năng suất và phẩm chất tốt đã đƣợc gieo trồng rộng rãi ở Việt Nam
khi sinh trƣởng ở điều kiện stress muối còn chƣa đƣợc nghiên cứu.

2


Xuất phát từ vấn đề này chúng em nghiên cứu đề tài: “So sánh động

thái tích lũy một số chất trong mầm giống đậu tương DT84 và ĐT26 khi
sinh trưởng ở điều kiện nhiễm mặn”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh động thái tích lũy prolin và vitamin C trong mầm
đậu tƣơng khi sinh trƣởng ở điều kiện nhiễm mặn ở 2 giống đậu tƣơng DT84
và ĐT26.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xác định hàm lƣợng prolin và vitamin C trong quá trình hạt nảy mầm
ở điều kiện nhiễm mặn của hai giống đậu tƣơng DT84 và ĐT26.
- Xác định khả năng nảy mầm, chiều dài mầm của hai giống đậu tƣơng
DT84 và ĐT26.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng: mầm đậu tƣơng 2 giống DT84 và ĐT26.
- Phạm vi nghiên cứu: xác định sự tích lũy prolin và vitamin C trong giai
đoạn nảy mầm của 2 giống đậu tƣơng dƣới ảnh hƣởng của các nồng độ muối
từ 0.4% đến 0.8%.
5. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn
- Bổ sung nguồn tài liệu về động thái tích lũy các chất prolin và vitamin
C trong mầm đậu tƣơng ở điều kiện nhiễm mặn.
- Là căn cứ để chọn giống phù hợp điều kiện môi trƣờng nhiễm mặn.

3


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sự nảy mầm của hạt đậu tƣơng
Sự nảy mầm là giai đoạn quan trọng trong chu trình sinh trƣởng và phát
triển của thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng. Giai đoạn nảy mầm ảnh
hƣởng rất lớn tới sự phát triển của cây sau này.
Khả năng nảy mầm của hạt giống là một trong những chỉ tiêu quan trọng

để đánh giá tiêu chuẩn của một giống tốt. Đối với các loại cây trồng nói chung
và cây đậu tƣơng nói riêng, nảy mầm là giai đoạn khởi đầu của quá trình sinh
trƣởng, thời kì mọc mầm đƣợc tính từ khi gieo hạt đến khi xuất hiện mầm trên
mặt đất. Khi nảy mầm, trong hạt diễn ra hàng loạt các quá trình sinh lí, sinh
hóa một cách phức tạp.
Tỷ lệ mọc mầm cao hay thấp, thời gian mọc mầm nhanh hay chậm đều
có liên quan tới tốc độ sinh trƣởng của giống và sự đồng đều của các loại
giống trong quần thể. Do vậy, giống nào có tỷ lệ mọc mầm cao, thời gian mọc
mầm nhanh sẽ rất thuận lợi cho sinh trƣởng và phát triển của cây sau này.
Những giống có tỷ lệ mọc mầm thấp sẽ không đảm bảo cho mật độ, thời gian
mọc mầm kéo dài sẽ làm cho cây sinh trƣởng kém ngay từ đầu, từ đó ảnh
hƣởng nghiêm trọng đến năng suất. Tỷ lệ và khả năng mọc mầm không chỉ do
bản chất di truyền của giống mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm... Đối với
đậu tƣơng ở nhiệt độ 27 – 280C hạt đậu tƣơng nảy mầm thuận lợi hơn, tốc độ
nảy mầm cũng nhanh hơn. Hạt đƣợc gieo trong dung dịch muối có áp suất
thẩm thấu cao nên tế bào thực vật sẽ khó hút nƣớc hơn trong điều kiện bình
thƣờng, thậm chí nếu áp suất thẩm thấu quá cao nƣớc sẽ đi từ trong tế bào ra
ngoài môi trƣờng, kìm hãm sự nảy mầm của hạt. Theo nghiên cứu của
Fernando và cộng sự trên đối tƣợng thực vật Chenopodium quinoa willd cho

4


thấy tỉ lệ nảy mầm chỉ đạt 14% sau gieo hạt 14 giờ khi cho chúng nảy mầm
trong dung dịch NaCl.
Quá trình nảy mầm diễn ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa trong hạt với
tốc độ cao để chuẩn bị cho sự hình thành cây con mới. Đậu tƣơng thuộc cây
hai lá mầm nên sự nảy mầm của đậu tƣơng cũng gồm các pha nhƣ sự nảy
mầm của cây hai lá mầm. Pha trƣơng hạt: khi bắt đầu nảy mầm hạt hút nƣớc
rất mạnh làm trƣơng hạt. Pha hình thành và hoạt hóa mầm trong hạt: có một

lƣợng enzim nhất định nhƣng chủ yếu ở dạng liên kết. Khi hạt hút nƣớc enzim
mới đƣợc giải phóng ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh. Pha tích lũy
chất dinh dƣỡng ngay trong những phút ngâm nƣớc đầu tiên độ hấp thụ oxi
của hạt tăng lên do vậy lƣợng ATP tích lũy nhiều. Pha động viên các chất dự
trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc biệt cho cơ thể ở giai đoạn nảy mầm: các
chất dinh dƣỡng trong hạt thuộc ba nhóm chất hữu cơ là : gluxit, protein, lipit.
Trong quá trình này enzim a-amilaza tác động vào liên kết 1,4-glucozit phân
giải tinh bột trong các dextrin tham gia vào quá trình hô hấp ở giai đoạn
sacarozo tích lũy ở tế bào trụ phôi. Protein đƣợc giải phóng bởi enzim
proteaza thành các amit. Phần lớn các axit amin tạo thành đƣợc vận chuyển để
tổng hợp các phân tử protein đặc trƣng cho cơ thể.
Sự nảy mầm đƣợc bắt đầu bằng sự hấp thụ nƣớc nhờ cơ chế hút trƣơng của
hạt làm hạt trƣơng lên. Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ hạt bắt đầu tăng tính thủy
hóa của keo nguyên sinh chất, giảm tính ƣa mỡ và độ dính của keo dẫn đến sự
biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất của hạt liên quan đến
sự nảy mầm. Đặc trƣng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính enzim thủy phân phân
hủy polisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành các chất đơn giản
dẫn đến sự thay đổi hoạt động thẩm thấu. Các sản phẩm thủy phân này làm
nguyên liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ ở phôi hạt, vừa làm tăng
áp suất thẩm thấu trong hạt giúp cho quá trình hút nƣớc vào hạt nhanh chóng.

5


1.2. Vai trò của prolin và vitamin C trong quá trình nảy mầm của hạt
Tác hại lớn do đất mặn gây ra cho thực vật đó là hiện tƣợng hạn sinh lí.
Có khá nhiều nghiên cứu tập trung tìm hiểu cơ chế sinh hóa của tính chịu
thiếu nƣớc, trong đó không ít nghiên cứu đề cập đến vai trò của prolin,
viatmin C, axit abscisic (ABA)... Nhìn chung, khi tế bào bị mất nƣớc dần dần
các chất hòa tan sẽ đƣợc tích lũy nhằm chống lại việc giảm tiềm năng nƣớc và

tăng khả năng giữ nƣớc của nguyên sinh chất. Các chất hòa tan đƣợc hình
thành hầu hết có đặc tính không tích điện ở pH trung tính và có khả năng hòa
tan tốt trong nƣớc có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu đƣợc sinh ra ngay
trong quá trình trao đổi chất.
Prolin
Prolin hay pirolidin cacboxylic là một aminoaxit ƣa nƣớc có công thức
phân tử C5H9NO2. Trong phân tử prolin có chứa vòng pirolidin đƣợc tạo
thành do sự kết hợp của nhóm amin bậc 1 ở C α với cacbon ở mạch bên.
Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu trong cơ thể thực vật.
Chúng có khối lƣợng phân tử nhỏ, đƣợc tổng hợp từ glutamine bởi enzim cảm
ứng stress P5CS (pyrolin – 5 – cacboxylate - synthetase). Prolin là thành phần
chủ yếu trong nhóm các chất amoni bậc 4 và nhóm các hợp chất 3 dimethylsunfulfonio propionate (DMSP) là các nhóm có khả năng tạo áp suất
thẩm thấu cao [20]. Các hợp chất này có cùng tính chất không tích điện ở pH
trung tính và có khả năng tan tốt trong nƣớc, không độc khi tập trung với
nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc của các đại phân tử protein, giúp thành tế
bào chống lại ảnh hƣởng làm biến tính của sự tập trung muối cao và các chất
hòa tan khác có hại cho tế bào [20]. Sự tích lũy các chất đó có vai trò nòng cốt

6


trong việc duy trì sức trƣơng của tế bào và hấp thụ nƣớc ngƣợc gradient nồng
độ dƣới tác động của stress.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng prolin đóng vai trò là nhân tố chính bảo
vệ màng tế bào, chống lại tác động có hại của nồng độ muối cao, làm tăng thế
năng thẩm thấu của tế bào. Sự tập trung prolin để phản ứng lại stress muối
diễn ra chủ yếu trong chất nguyên sinh. Prolin cũng có thể có chức năng nhƣ
protein thẩm thấu ƣa nƣớc. Do đó, sự tích lũy prolin đƣợc coi là một phản ứng
thích nghi thông thƣờng của thực vật bậc cao trong điều kiện khô hạn.
Khi nghiên cứu chức năng của prolin, Nanjo và cộng sự đã phát hiện:

những cây bị đột biến về hình dạng (có sự bất thƣờng về biểu bì, tế bào mô
mềm và hệ mạch) có hàm lƣợng P5CS thấp, rất mẫn cảm với áp lực thẩm
thấu. Nhƣng những sự biến đổi kiểu hình đó có thể ức chế đƣợc bằng cách
tăng cƣờng hàm lƣợng prolin ngoại bào [6].
Theo Wyn Jones (1977) những chất đƣợc coi là tác nhân cạnh tranh
thẩm thấu, trong đó đáng kể nhất là prolin, đƣợc xem nhƣ đóng vai trò chủ
đạo trong việc thích ứng thẩm thấu tế bào chất thực vật, nhằm phản ứng lại áp
lực thẩm thấu. Khi bị tác động bởi áp lực thẩm thấu thì sự tích lũy prolin có
thể tăng từ 10 - 100 lần [21].
Sơ đồ dƣới đây mô tả khái quát vai trò của prolin đối với tính chống chịu của
cây [27].

7


NADPH/NADP
+

Cân bằng
oxi hóa

Bảo vệ thẩm thấu
Trao đổi chất
(ví dụ hidrat
cacbon, acid

Dịch mã

Proline

Protein giàu
prolin

Truyền tín hiệu

ROS

amin)
Tổn thƣơng
lipid

Các enzim
tham gia
quang hợp
CST,
CAT, APX

Bổ sung
nƣớc trở lại
PDH,
P5CDH

Các quá trình
phát triển (phôi,
ra hoa, phát triển
rễ)

Chức năng
của ti thể
(ROS, PCD)

PCDPCD)

Hình 1. Vai trò của prolin đối với tính chống chịu của cây
(Szabados và CS, 2010)
Vitamin C
Trọng lƣợng phân tử của vitamin C là 176,13g. Tên khoa học của
vitamin C là γ-lacton của 2,3-dehydro L-gulonic acid hay ascorbic
dehydroasorbic và dạng liên kết ascorbigen.
Vitamin C tồn tại trong tự nhiên dƣới ba dạng phổ biến là ascorbic
dehydroasorbic và dạng liên kết ascorbigen.
Vitamin C có nhiều trong rau quả tƣơi, tham gia nhiều quá tình quan
trọng của cơ thể sinh vật: duy trì cân bằng giữa các dạng ion Fe 2+/Fe3+,
Cu+/Cu2+, vận chuyển hidro trong quá trình oxi hóa khử ở thực vật và làm
tăng tính đề kháng của cơ thể đối với những điều kiện không thuận lợi của
môi trƣờng. Vitamin C cần thiết cho một loạt phản ứng chuyển hóa thiết yếu
8


của cơ thể thực vật. Trong các sinh vật sống, ascorbate là một chất chống oxi
hóa vì nó bảo vệ cơ thể chống lại stress oxi hóa và là một đồng yếu tố trong
một số phản ứng enzim quan trọng [28].
Các nhà khoa học nhận định rằng, vitamin C đƣợc sản xuất trong mỗi tế
bào thực vật khi các phân tử ascorbate tƣơng tác với một enzim quan trọng
qua đƣờng sinh hóa. Có hai con đƣờng chính để điều tiết sản xuất. Một con
đƣờng là chỉ thị ADN trở thành phƣơng tiện truyền tin cho phân tử RNA- một
phân tử sắp xếp tế bào theo chức năng. Con đƣờng thứ hai là dành cho RNA
chuyển đổi trực tiếp thành enzim sản xuất vitamin C [28]. Các nhà nghiên cứu
tại trƣờng Đại học Công nghệ Queensland nhận thấy thực vật sản xuất
vitamin C hoàn toàn sử dụng con đƣờng thứ hai theo một cách đặc biệt.

Các nhà khoa học khẳng định: thực vật sản xuất nhiều hơn hoặc ít hơn
vitamin C tùy thuộc vào yếu tố môi trƣờng. Trong điều kiện môi trƣờng khắc
nghiệt, có nhiều ánh sáng hoặc hạn hán, thực vật thƣờng sản xuất nhiều
vitamin C hơn để bảo vệ chúng khỏi tác hại oxi hóa.
Phát hiện này sẽ giúp các nhà khoa học hiểu cơ chế mà một số loài thực
vật nhƣ mận Kakadu có thể tổng hợp lƣợng vitamin C rất cao.Việc hiểu rõ cơ
chế này có thể hỗ trợ các chƣơng trình lai giống để phát triển các giống cây
khỏe mạnh hơn và cải thiện sức khỏe con ngƣời [28].
1.3. Ảnh hƣởng của nhiễm mặn đất trồng đến thực vật nói chung và cây
đậu đỗ nói riêng
Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng muối cao, đặc biệt là NaCl đều hạn
chế khả năng khuếch tán của nƣớc dẫn đến cây khó khăn trong việc lấy chất
dinh dƣỡng. Nếu cây sinh trƣởng trong môi trƣờng không chứa muối thì nƣớc
sẽ dễ dàng thấm qua màng bán thấm để đi vào tế bào nhờ hiện tƣợng thẩm

9


thấu. Đất bị nhiễm mặn sẽ gây nên tác hại đối với thực vật nói chung và đậu
đỗ nói riêng:
Tác hại thứ nhất là gây ra hiện tƣợng hạn sinh lý. Đất bị nhiễm mặn chứa
hàm lƣợng muối cao nên áp suất thẩm thấu lớn. Nếu áp suất thẩm thấu tế bào
không thắng nổi áp suất thẩm thấu môi trƣờng thì cây sẽ bị khô héo do nƣớc
từ trong tế bào bị rút ra ngoài. Thiếu nƣớc nhẹ thì làm giảm tốc độ sinh
trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo chất nguyên sinh
làm tăng quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nƣớc nguyên sinh chất bị đứt
vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thƣơng và có thể chết.
Tác hại thứ hai liên quan đến tính gây độc của các ion đối với thực vật.
Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng cao các ion đặc biệt là Na + và Cl-, ngoài ra
còn có các ion khác: SO 42-, HCO3-, Li+,... hàm lƣợng cao các ion này đều gây

hại cho sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật.
Về khả năng chịu mặn của thực vật, trƣớc hết nói đến cơ chế tích lũy và
duy trì nồng độ cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sức cạnh
tranh với nƣớc, với môi trƣờng nhiễm muối và chống lại hiện tƣợng hạn sinh
lý. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh một cách chắc chắn khả năng
điều chỉnh áp suất thẩm thấu của thực vật, thậm chí ngay khi rễ tiếp xúc với
môi trƣờng nhiễm mặn. Trong khi đó một số tác giả khác lại thấy rằng khi bị
nhiễm mặn thực vật thƣờng hạn chế khả năng thẩm thấu nƣớc của màng tế
bào khiến cho nƣớc không dễ dàng đi ra hoặc đi vào.
Những nghiên cứu về tác động của muối lên sinh trƣởng và phát triển
của một số cây trồng nhƣ lúa mạch, tế bào cam nuôi cấy... về trao đổi ion ở
lúa cho thấy cây trồng có khả năng thích ứng trong một giới hạn nhất định với
tác động của muối trong môi trƣờng đất, nƣớc. Tuy nhiên mức độ đó phụ
thuộc vào loại cây trồng nghiên cứu [2]. Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng
NaCl cao nên các loài thực vật sống thƣờng xuyên trên đất này phải có khả
năng thu nhận và tích tụ Na+, Cl- cao hơn nhiều so với thực vật không chịu
10


mặn [15]. Đây là cơ chế chính tạo nên tính chịu mặn trong thế giới thực vật
có khả năng sống trên đất mặn (Green way, 1968) [1], [2].
1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của prolin và vitamin C ở đậu đỗ nói
chung và đậu tƣơng nói riêng trong điều kiện nhiễm mặn
1.4.1. Trên thế giới
Trên thế giới với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, đã có
nhiều công trình nghiên cứu về tính chống chịu của thực vật nhƣ các nghiên
cứu của các tác giả: Bernet N.M, Naylor A.W (1996) [14], Goyal K, LJ
Walton (2005) [17], Ingram J, D. Bartel (1996) [18], Thomashow MI (1998)
[23], Xiao B, Y Huang, N Tang (2007) [25], Zhao và CS (2000) [26]... nghiên
cứu về tính chịu mặn, chịu lạnh, chịu hạn... ở lúa và thực vật nói chung.

Các nghiên cứu về prolin
Đã có nhiều công trình nghiên cứu ở nƣớc ngoài trên các đối tƣợng thực
vật và cây trồng khác nhau, nhằm tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyển hóa
prolin,... liên quan đến vai trò của prolin đối với tính chịu mặn của thực vật.
Trong dòng tế bào thuốc lá đƣợc nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428 nM
NaCl, prolin chiếm 80% axit amin tự do (Rhodes and handa, 1989) [24].
Ngƣời ta thừa nhận rằng có sự phân bố đồng đều prolin trong toàn bộ thể tích
nƣớc nội bào, kết quả đƣợc xác định axit amin tại thời điểm này vƣợt quá 129
nM. Sự tích lũy prolin nội bào ở các tế bào Distichlis spicata trong điều kiện
stress muối (xử lí ở nồng độ 200 nM NaCl) ƣớc tính trên 230 nM (Ketchum et
al, 1991) [19]. Cũng trên đối tƣợng cây thuốc lá, tác giả Kishor P.B.K và cộng
sự (1995) [20] nghiên cứu cây thuốc lá đƣợc chuyển gen (gen liên quan đến
sinh tổng hợp prolin – P5CS) trong điều kiện hạn muối. Kết quả cho thấy hàm
lƣợng prolin gấp khoảng 10 - 18 lần so với đối chứng. Thực vật đƣợc chuyển
gen (gen P5CS) cũng đƣợc nghiên cứu trên đối tƣợng là cây đậu tƣơng. Các

11


tác giả tiến hành so sánh dòng đậu tƣơng chuyển gen có khả năng chống chịu
tốt hơn.
Về đậu tƣơng cũng có nhiều tác giả nghiên cứu nhƣ: Whitsitt và cộng sự
(1977) đã cho thấy lƣợng nƣớc mất trên 60% thì đậu tƣơng không thể phục
hồi đƣợc. Femando E.P và cộng sự (2000) [16] nghiên cứu ảnh hƣởng của
muối đến hạt đậu tƣơng nảy mầm. Green way (1968) nghiên cứu cơ chế tạo
nên tính chịu mặn trong cây có khả năng sống trên đất mặn. Nghiên cứu về
sự thay đổi hàm lƣợng prolin và nồng độ axit abcisic của những cây đậu
tƣơng mẫn cảm và chống chịu điều kiện áp suất thẩm thấu của ZhengYi –
Zhi và Li Tian cũng kết luận rằng: phản ứng với áp lực khô hạn và nồng độ
muối, cây đậu tƣơng tích lũy hàm lƣợng prolin cao, đó đƣợc xem nhƣ một

phản ứng thích nghi.
Các nghiên cứu về vitamin C
Các nhà khoa học từ Đại học Exeter và trƣờng Đại học Shimane ở Nhật
Bản đã chứng minh lần đầu tiên rằng vitamin C là chất cần thiết cho sự phát
triển của thực vật. Giáo sƣ Nicholas Smirnoff của Đại học này cho biết:
"Vitamin C là chất chống oxy hóa phong phú nhất trong các cây” [29].
Hancock và Viola đề nghị một số phƣơng pháp để tăng lƣợng vitamin C
trong thực phẩm bao gồm cả kỹ thuật di truyền, nhân bản, và chăn nuôi. Xét
trên đối tƣợng rau diếp đƣợc 96% nƣớc trong cơ thể, các nhà khoa học tin
rằng sự cảm ứng đơn giản của vitamin C vào nguồn cung cấp nƣớc có thể
giúp cây phát triển nhanh hơn hoặc lớn hơn [19].
Theo các nghiên cứu đăng trên tạp chí The Plant Cell, các nhà khoa học
đã hiểu đƣợc cơ chế mà một số loài thực vật nhƣ mận Kakadu có thể tổng hợp
lƣợng vitamin C rất cao [28].
Phát hiện của giáo sƣ sinh hóa Daniel Gallie ở trƣờng Đại học California
về tầm quan trọng của vitamin C trong việc giúp thực vật tự bảo vệ chống lại
sự

tàn

phá

do

ôzôn

–

thành

phần

chủ

yếu

tạo

sƣơng.

Bằng cách điều khiển dehydro ascorbate reductase (DHAR), là một loại
12


enzim có trong tự nhiên tái tạo vitamin C nhằm tăng lƣợng vitamin này trong
lá cây, Gallie đã giảm đƣợc những ảnh hƣởng có hại của ôzôn đến thực vật,
nhƣ các chấm nâu ở lá, tình trạng còi cọc và năng suất thấp ở cây trồng.
1.3.2. Ở Việt Nam
Nghiên cứu tính chống chịu của cây trồng ở Việt Nam đƣợc trồng trên
diện rộng ở các đối tƣợng lúa, đậu tƣơng, lạc... trong đó đậu tƣơng là cây
trồng đƣợc chú trọng khá lớn về đặc điểm di truyền và khả năng chịu mặn,
chịu hạn. Tác giả Nguyễn Thị Kim Anh và CS (2003) [1] bằng việc xử lí lạnh,
mặn, hạn trên các giống lúa đã cho thấy có mối tƣơng quan thuận giữa tính
chống chịu của cây với hàm lƣợng prolin gia tăng của các giống lúa nghiên
cứu. Sự biến đổi hàm lƣợng prolin ở rễ và lá đậu xanh dƣới tác động của
stress muối NaCl đƣợc Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh Huyền [7] nghiên
cứu. Nguyễn Huy Hoàng và CS [8] đã nghiên cứu và đánh giá khả năng chịu
hạn của một số giống đậu tƣơng nhập nội ở miền Bắc Việt Nam và các tác giả
khác nhƣ Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã, Phan Hồng Quân, Trần
Thị Phƣơng Liên [3], [5], [11], [12]... Các kết quả nghiên cứu đã đƣợc ứng

dụng trong sản xuất và chọn tạo đƣợc nhiều giống đậu tƣơng mới có năng
suất cao, phẩm chất tốt phù hợp với điều kiện khí hậu và canh tác của Việt
Nam.

13


Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là giống đậu tƣơng DT84 và ĐT26.
DT84: Giống đƣợc tạo ra bằng cách xử lý đột biến dòng 33 - 3 (tổ hợp lai
DT80 ĐH4) bằng tia gama /18 Kr. Đƣợc công nhận giống năm 1995. Hạt to,
màu vàng sáng. Khối lƣợng 1000 hạt 150 - 160g. Năng suất trung bình 18 24 tạ/ha. Thời gian sinh trƣởng 85 - 95 ngày. Giống có khả năng chống chịu
khá.
ĐT26: Giống đƣợc tạo ra từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12 từ năm 2002.
Hạt vàng, rốn nâu đậm. Năng suất trung bình 20 - 28 tạ/ha. Giống đậu tƣơng
ĐT26 có thời gian sinh trƣởng trung bình từ 90 - 95 ngày. Giống có khả năng
chống chịu khá.
Hai giống DT84 và ĐT26 do Trung tâm giống Vũ Di - Vĩnh Tƣờng
cung cấp.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
* Thời gian nghiên cứu: từ 10/2014-5/2015
* Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
- Tiến hành thí nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và
Chuyển giao công nghệ - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
- Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
* Thiết bị và vật liệu:
- Dung dịch NaCl (đã test trƣớc khi làm TN để chọn 3 nồng độ đạt mức
nảy mầm trong khoảng 60 - 70% để làm thí nghiệm).
- Khay cho hạt nảy mầm, giấy thấm, nƣớc cất.

- Hạt giống (đậu tƣơng DT84, ĐT26) có khả năng nảy mầm cao.
* Cách tiến hành:

14


- Để xác định chỉ tiêu nghiên cứu, tiến hành thí nghiệm gieo hạt trong
dung dịch muối theo phƣơng pháp của Volcova có cải tiến [9].
- Chọn hạt giống đều, khỏe, có phôi sáng, không nấm mốc. Khử trùng
khay, bình, dụng cụ... bằng cồn. Giấy lọc đƣợc sấy 130 0C trong vòng 1 giờ,
hạt đƣợc khử trùng bằng dung dịch KMnO 4 5% trong 5 phút.
- Gieo trên khay có giấy thấm, chia thành 2 phần:
Phần 1: Lô đối chứng (ĐC) cho hạt nảy mầm trong nƣớc cất.
Phần 2: Lô thí nghiệm (TN) cho nảy mầm trong các dung dịch muối
NaCl với nồng độ 0.4%, 0.6%, 0.8% và đặt tên tƣơng ứng là các mẫu TN:
M0.4; M0.6; M0.8.
Hạt nảy mầm trong các dung dịch muối và nƣớc cất phải đƣợc thƣờng
xuyên bổ sung lƣợng nƣớc hoặc dung dịch muối với các nồng độ tƣơng ứng ở
các lô.
Ngày đầu GM là ngày 0, bắt đầu đo các chỉ tiêu từ ngày 1.
Xác định các chỉ tiêu sinh lý
*Xác định khả năng nảy mầm
Tỷ lệ nảy mầm đƣợc xác định theo phƣơng pháp Volcova (1984).
Đếm số hạt nảy mầm trong các mẫu từ khi hạt đầu tiên nảy mầm cho
tới khi không còn có thêm hạt nào nảy mầm mới. Tỷ lệ nảy mầm (N) trong
dung dịch muối NaCl đƣợc tính theo công thức:
N = a/b.100%
N: là khả năng nảy mầm của hạt

a: số hạt nảy mầm trong lô TN

b: Số hạt nảy mầm trong lô ĐC
* Xác định các chỉ tiêu sinh trƣởng của mầm

15


Tiến hành đo chiều dài mầm vào các ngày 2, 4, 6 sau khi hạt nảy mầm.
Chiều dài mầm (mm) sử dụng thƣớc chia đơn vị đến mm để đo.
Xác định hàm lượng prolin trong mô thực vật (theo Bates và CS) [9]
* Nguyên tắc thí nghiệm:
Dựa trên phản ứng giữa prolin và dung dịch ninhydrin trong axit tạo hợp
chất màu vàng, hấp thụ bƣớc sóng đặc trƣng 520nm. Công thức tính hàm
lƣợng prolin xác định trên cơ sở tham khảo Reigosa Roger M.J.
* Thiết bị, vật liệu:
- Axit sulphosalicylic 3% (w/v)
- Axit photphoric 6M
- Axit axetic
- Dung dịch ninhydrin trong axit (đƣợc chuẩn bị bằng cách ủ nóng 1,25g
axit ninhydrin sẽ giữ ổn định chỉ trong 24 giờ, tại 40C.
- Toluen
* Cách tiến hành:
Ở đây chúng em mô tả phƣơng pháp định lƣợng prolin tự do trong các
mô lá, bao gồm bốn bƣớc chính:
 Cân 0,5g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10ml dung dịch axit sulfosalicylic
3%, ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dịch lọc.
 Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml axit axetic và 2ml dung
dịch ninhydrin, ủ trong nƣớc nóng 1000C trong thời gian 1 giờ sau đó ủ nƣớc
đá 5 phút.
 Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch màu

hồng ở trên đem đo OD520nm bằng máy đo quang phổ.
 Hàm lƣợng prolin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn prolin và
tính toán theo công thức sau:

16


Prolin (µg/g) =

X .V (ml ).df
(g)

Trong đó:
X: giá trị OD520 của mẫu; V: thể tích dịch chiết (= số ml toluen); df: hệ
số pha loãng (trong trƣờng hợp này là 5); w: khối lƣợng mẫu.
Định lượng vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ iot [12]
* Hóa chất
- HCl 5%: 115,2 ml dung dịch HCl 37% (d=1,19) để pha 1 lít HCl 5%
(d=1.00).
- Dung dịch chuẩn độ iot 0,01N: hòa tan 13g iot tinh thể vào 20g KI
trong 50ml nƣớc, pha loãng với nƣớc đủ 1lít thì đƣợc dung dịch chuẩn độ
0,1N. Rồi lấy 10ml dung dịch chuẩn iot 0,1N pha với nƣớc cất đủ 100ml đƣợc
chuẩn 0,01N.
- Dung dịch tinh bột 1%: hòa 1g tinh bột trong 100ml nƣớc cất, gia nhiệt
ở 500C gần sôi.
*Cách tiến hành
- Cân mẫu (số gam mẫu tế bào) tƣơi, nghiền nhỏ trong cối sứ với 5ml
HCl 5%, cho vào ống đong (hoặc bình định mức), dẫn đến vạch 50ml bằng
nƣớc cất (để trong tối 10 phút).
- Khuấy đều, lọc dịch trong, lấy 20ml dịch nghiền cho vào bình nón dung

tích 100ml và thêm khoảng 300µl dung dịch tinh bột 1%, lắc nhẹ, chuẩn độ
bằng dung dịch iot cho đến màu xanh lam nhạt.
- Hàm lƣợng vitamin C đƣợc tính theo công thức sau:
X (mg/g) =

VxV1x0.00088x100
V2xw

Trong đó, V: số ml dung dịch iot 0,01N dùng chuẩn độ

17


V1: thể tích dịch mẫu TN (50ml)
V2: thể tích dịch mẫu lấy để xác định (20ml)
w: khối lƣợng mẫu (g)
0,00088: số gam vitamin C ứng với 1ml dd iot 0,01N.
Xử lí số liệu
Kết quả thí nghiệm đƣợc tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft
Excel 2007 theo các tham số: giá trị trung bình ( ), sai số trung bình (m), sai
số của hiệu các trung bình số học (md), độ chính xác của thí nghiệm (m%), độ
tin cậy của hai số trung bình (td) đƣợc tính theo các công thức sau :
=

m% =

md =

m=
td =

Trong đó: Xi: là giá trị đo đƣợc qua mỗi lần đo
N: là số lần nhắc lại

(Trong đó

: trung bình thí nghiệm,

mẫu đối chứng, m2: sai số mẫu thí nghiệm)

18

: trung bình đối chứng, m1: sai số