Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của hydroxyure

BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ố*,£Q°>^

TRẨN THỊ THU THẢO

NGHIÊN CỨU XÂY DựNG TIÊU CHUẨN
CHẤT LƯỢNG CỦA HYDROXYURE

(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DUỌC SỸ KHÓA 21KG-'
f A ĩ ' } c'
[

ỳ
v

m

%
ỉ ỹ

Người hướng dẫn:

TIẾN SỸ NGUYỄN THỊ KlỄỦ ANH

Nơi thực hiện:

PHÒNG THÍ NGHIỆM TRUNG TÂM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Thòi gian thực hiện:

Từ 3/2007 - 5/2007

HÀ NỘI, 6 -2 0 0 7


LỜI CẢM ƠN
& n \ x i 1^ c l\ấ n t K ò n k c ả m ơn c á c i k ầ y c ô g i á o ~Crưởv\g đ ạ i K ọ c D u ợ c
•H à nộị cfã l ạ n líiak d ạ y d ồ e m f^on 0 s u ô t 5 n a m Uọc. Đ ạ c b iẹ t gUÌ lời t^aia
c a m ơkA tói TTiêtt s ỹ /VlguyốKx TTkị K j ể u A n K lagUỜi đ ă f^ ụ c l i ế p kucíng
d a n 7 c k í b<ảo Ỷận +ĨkK v à 0 itXỊO cfỡ e m k o à n i K ò n k U k ố a

lu ạ n n à y .

(Sin XỈI^ c a m đh +k<ầy: Ĩ ^ a S / T ^ S 7\]guyểrv Q u a n g B ạ f đ ă c u n g c ấ p
m a u rvgKiếrv cứ u v à t ạ o đ i ề u kiẹia tkuạrv lợi c \\o e m K o à n tKiẹ^ đ ề là i.

^K\n c ị\ầ n í h à ^ k c a m ơv\ B a n g i ấ m k ìẹ u nV\ă Ỷ m ờ n g / c a m ơh c ấ c t k ổ ỵ c ồ
PkỜ K 0
~C^Uc?n0

Iagkỉẹm Ir n n g f a m 7 B ọ mồK
đ ạ \

\\Ọ ( Z

D u ợ c 'H à laọi

đ ã

6

tíck/ B ộ m ổh [\< c\ K^u
lạ o đ iề u kiẹK tổ f

n \\ắ ị

v à gìup đơ em

ị^ o n g

s u ổ t qiAấ fr ín k +kục W\Ạn đ ề tài CŨK0 nku +kc?i giaia e m k p c t ạ p +ạì t^uờng.

C u ổ i CÙK0

c a m ơn g i a ctmk/ b ạ n b è đ ã đ c m g vìerv, g ì u p đ õ tồi t^oiag

s u ô i tkờì gỉcm q u a .

Trần Thị Thu Thảo
A3K57 Trường Đại học
Dươc Hà nôi.


CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

A

: Diện tích pic (Area)

-MeCN

: Acetonitril

BP

: Dược điển Anh (British Pharmacopeia)

c

: Nồng độ (Concentration)

CP

: Dược điển Trung Quốc (Pharmacopoeia of the people republic
of China).

EP

: EP ( European Pharmacopeia)

IR

: Phổ hấp thụ hồng ngoại (Inírared)

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

M

: Khối lượng phân tử

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

s

: Độ lệch chuẩn (Standard deviation).

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation).

TB

: Giá trị trung bình.

THF

: Tetra hydro furan

USP

: Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia).


MỤC LỤC
ĐẬT VẤN Đ Ể ..........................................................................................................1
PHẦN 1: TỔNG QUAN.......................................................................................3
1.1 Vài nét về Hydroxyure............................................................................ 3
1.2 Một sô tiêu chuẩn chất lượng của Hydroxyure được qui định trong
một sô dược điển..............................................................................................5
1.3 Một sô phương pháp phân tích sử dụng trong khóa luận..................7
1.3.1 Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR).................................................................7
1.3.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao....................................................................9

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ...........................................18
2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm....................................18
2.1.1 Nguyên vật liệu................................................................................... 18
2.1.2 Đối tượng nghiên cứu......................................................................... 18
2.1.3 Nội dung..............................................................................................19
2.1.4 Phương pháp nghiên cứ u....................................................................19
2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét.........................................................22
2.2.1 Tính chất............................................................................................ 22
2.2.2 Độ chảy.............................................................................................. 22
2.2.3 Định tính............................................................................................ 22
2.2.4 Mất khối lượng do làm khô...............................................................25
2.2.5 Tro sulfat............................................................................................ 26
2.2.6 Kim loại nặng....................................................................................26
2.2.7 Tạp chất liên quan............................................................................. 27
2.2.8 Định lượng.........................................................................................28
2.3 Bàn luận.................................................................................................... 40

PHẦN 3: KẾT LUẬN .......................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 43


ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngày nay ung thư là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới. Trước đây,
khi chưa phát minh ra thuốc kháng sinh thì con người mắc và chết chủ yếu
do các bệnh nhiễm trùng. Nhưng ngày nay thì số người mắc và chết do bệnh
ung thư trên toàn thế giới hàng năm tăng lên chỉ sau bệnh lý tim mạch.
ở nước ta hiện nay, bệnh ung thư có xu hướng gia tăng cùng với sự
gia tăng của nền công nghiệp và ô nhiễm môi trường. Theo kết quả ghi
nhận về ung thư, mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 100.000 người mới
mắc bệnh ung thư và tỷ lệ tử vong lên tới 50% [6]. Do đó, bệnh ung thư
đối với sức khỏe là vấn đề ngày càng được xã hội quan tâm, nhu cầu về
thuốc chống ung thư ngày càng lớn.
Ớ nước ta các sản phẩm thuốc chống ung thư, đặc biệt là nguyên liệu
chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài, giá cả rất cao. Do đó, các chế
phẩm này chỉ đáp ứng được nhu cầu của một bộ phận nhỏ người bệnh có
điều kiện kinh tế, đủ khả năng chi trả.
Với mục tiêu góp phần tạo ra các chế phẩm chất lượng tốt đồng thời có
giá cả phù hợp với điều kiện kinh tế của người dân, việc nghiên cứu tổng
hợp để sản xuất nguyên liệu làm thuốc trong nước thay thế các nguyên liệu
nhập khẩu đặc biệt được chú trọng. Đóng góp vào vấn đề này, Bộ môn Hóa
hữu cơ_Trường đại học Dược Hà nội đã tổng hợp thành công một trong
các nguyên liệu thuốc chống ung thư đó là Hydroxyure. Để nguyên liệu
này được đưa vào sản xuất nhằm tạo ra các dạng bào chế thích hợp, có hiệu
quả điều trị và an toàn thì chất lượng nguyên liệu phải là vấn đề được quan
tâm hàng đầu. Muốn đánh giá chất lượng nguyên liệu cần phải có các tiêu
chuẩn chất lượng đi kèm với các phương pháp thử phù hợp. Trong khi đó,
1

Dược điển Việt nam chưa có chuyên luận riêng về hydroxyure, vì vậy
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất
lượng của hydroxyure” với mục tiêu:
+ Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu Hydroxyure.
+ Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm phù hợp để đánh giá chất
lượng Hydroxyure.

2


Phần 1- TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về hydroxyure.
• Công thức phân tử: CH4N20 2

M= 76,05

0
..
• Công thức câu tạo:
• Tên khoa học:

11
/O H
H2N '' ~"n h
N- Hydroxyurea

• Tổng hợp: có hai phương pháp tổng hợp Hydroxyure
1. Phản ứng của Kali cyanat với Hydroxylamin hydrochlorid trong môi

trường nước [16] [13]
h

KCN

+

H2N —OH.HC1

2o

— :í— ►

H2N —c —N H —OH
o

2.

Phản ứng của Methyl carbamat với Hydroxylamin hydrochlorid trong

môi trường nước [18].
H 2N — c — O C H 3

+

H 2N —OH.HC 1

----------►

0

H 2N —C —N H —O H

0

• Tính chất của hydroxyure: [16] [18]
Lý tính: bột trắng hoặc gần như trắng, kết tinh, hút ẩm, dễ tan trong nước và
ethanol nóng, ít tan trong ethanol ở nhiệt độ phòng.
Hóa tính:
s Dễ bị thủy phân tạo NH3 và C 02.

3


H 2N — C O N H — O H

+

H 20

—- — ►

N H 3t

+

C0 2t

s Phản ứng với FeCl3 tạo màu xanh tím.
6 HONH

CONH2

6 H O -N = C -N H 2
1
ỎH
-

[(H O -N = C —NH2)6Fe]'3+ 6H + + 3C Ĩ
0'

• Cơ chê tác dụng: [5] tác dụng lên sự tổng hợp AND, ít nhất là ức chế một
phần các men chuyển dạng các Ribonucleotid thành deoxyribonucleotid.
• Chỉ định: [5]
s

Ung thư đầu mặt cổ.

s

Bạch cầu kinh dòng hạt, các bạch cầu cấp với số lượng tế bào non
cao.

s

Tăng tiểu cầu.

s

Tăng hồng cầu.

• Tác dụng phụ: [5]
'S ức chế tủy xương.
S Buồn nôn và nôn.
s Da và niêm mạc: ít khi gây viêm miệng, phồng rát, làm nặng thêm các
viêm niêm mạc do tia phóng xạ.
s Giảm chức năng gan, thận tạm thời hoặc bí tiểu thường gặp.
'S Rối loạn thần kinh trung ương: ít gặp.
•S Tăng thể tích hồng cầu: hay gặp.
s Có thể gây bệnh bạch cầu.
4


• Dạng bào chế: [2] [8]
- Hydrea: viên nang 500 mg (Đức), hộp

1 lọxioo viên.

- Hydrin: viên nang 500 mg (Korea United Pharm).
• Định tính:
s

Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại: phổ hấp thụ IR của thử phải
phù hợp với phổ IR của chuẩn đối chiếu [10] [11] [17] [19].

^

Phương pháp hoá học [17].

Thuốc thử:

1.

Acid sulíuric: xuất hiện bọt khí

2.

Natri hydroxyd: xuất hiện mùi amoniac đặc trưng.

3.

Phức đồng tartrat kiềm: xuất hiện kết tủa đỏ đồng oxyd.

4.

Dung dịch sắt clorid: xuất hiện màu tím xanh.

s

Phương pháp sắc ký lớp mỏng: [10] [11] vết của chất thử phải cùng
vị trí với vết của chất chuẩn đối chiếu.

• Định lượng:

v

v' Sắc ký lỏng [10] [19] [11].
s Chuẩn độ đo thế [17].

1.2 Một sô tiêu chuẩn chất lượng của Hydroxyure
1.2.1 Tính chất: bột kết tinh, màu trắng hoặc gần trắng, hút ẩm

Tan tốt trong nước, thực tế không tan trong alcolhol [10] [17].
1.2.2 Điểm chảy: 138 -145°c [17].
1.2.3 Độ trong: dung dịch 0,5 g trong 10 ml nước phải trong suốt [17].
1.2.4 Định tính:
1. Phổ hấp thụ hồng ngoại: phổ của hydroxyure thử phải phù hợp với phổ
của hydroxyure chuẩn đối chiếu [10] [17] [11] [19].

5


2. Sắc ký lớp mỏng: tiến hành cùng điều kiện với phép thử giới hạn tạp
chất liên quan. Vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử phải tương đương
về vị trí và kích thước so với vết thu được trên sắc đồ dung dịch đối chiếu
[10] [11].
3. Phương pháp hoá học: [17] dương tính với thuốc thử.
1.2.5 Mất khối lượng do làm khô:
Không quá 0,5% [10] [11].
1,0% [17] [19].
1.2.6 Urea:
Không quá 0,5% [10] [11] [17] [19].
1.2.7 Tạp liên quan
Phương pháp sắc ký lỏng.

Giới hạn:
- Từng tạp: không quá 0,1% [10] [11].
không quá 0,5% [17] [17].
- Tổng các tạp: không quá 0,2% [10] [11].
- Giới hạn có thể bỏ qua: 0,02% [10] [11].

1.2.8 Tạp dung môi dễ bay hơi:

Lượng tạp dung môi hữu cơ dễ bay hơi có mặt trong mẫu thử không được
vượt quá giới hạn sau đây: [19]
Tạp

Giới hạn (ụgl g)

Chloroíorm

60

1,4-dioxan

380

Methylchlorid

600

Trichloroethylen

80

6


1.2.9 Dung môi tồn dư: [19].
1.2.10 Chlorid:
Không quá: 50 ppm [10] [11]
Không quá: 0,05% [17].
1.2.11 Kim loại nặng:

Không quá 0,003% [19].
0,002% [17].
0,005% [10] [11].
1.2.12 Tro sulfat:
Không quá: 0,1% [10] [11] [17].
0,5% [19].
1.2.13 Định lượng: theo phương pháp sắc ký lỏng.
Tính theo chế phẩm đã làm khô, hàm lượng CH4N20 2 :
Không được dưới 97,0% và quá 103,0% [19], phương pháp HPLC.
Không được dưới 97,5% và quá 102% [10] [11], phương pháp HPLC..
Không được dưới 98,5% [17], phương pháp chuẩn độ đo thế.

1.3. Một sô phương pháp phân tích sử dụng trong khóa luận.
1.3.1. Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) [3] [9]
1.3.1.1. Vài nét về p hổ hấp thụ hồng ngoại
Bức xạ hồng ngoại bắt đầu từ vùng nhìn thấy đến vùng vi sóng, được kéo
dài từ 0,5 -1000 |0,m. Tuy nhiên người ta quan tâm và sử dụng nhiều bức xạ
thuộc vùng 1 -25 |um.
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ làm thay đổi trạng thái năng
lượng của e mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động nên phổ IR còn được
gọi là phổ dao động.
Trong phân tử, khi nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ E và thay đổi trạng
thái dao dộng thì tạo nên một dải hấp thụ (đỉnh hấp thụ) trên phổ IR.

7


Dựa vào sự tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ, người ta có
thể thông qua sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó.
Có nhiều nhóm chức có dải hấp thụ đặc trưng, đây là cơ sở cho việc phân

tích cấu trúc bằng phổ IR
Trong vùng từ 1000 - 600 cm'1, có nhiều đỉnh hấp thụ nhưng khó gắn cụ
thể cho một nhóm chức nào đó, tuy nhiên sự có mặt của tập thể các nhóm
chức giúp chúng ta định tính, nhận diện một chất.
1.3.1.2. ứng dụng p hổ hồng ngoại
• Phổ hồng ngoại cho thông tin về nhóm chức (dựa vào các đỉnh hấp
thụ tương ứng với dao động của nhóm chức đó), góp phần vào việc
nghiên cứu cấu trúc phân tử.
• Phương pháp quang phổ IR được dùng chủ yếu trong việc định tính
các chất hữu cơ. Việc định tính dựa vào sự phù hợp giữa phổ chất thử với
chất chuẩn tiến hành đồng thời hoặc phổ chuẩn cho sẩn trong sách tra
cứu hoặc thư viện phổ lưu trong máy tính.
1.3.1.3. Một sô chú ý khi ghi và xử lý phổ hồng ngoại
Không có qui tắc nghiêm ngặt nào trong biện luận phổ IR, tuy nhiên có
một số yêu cầu đề ra trước khi biện luận như sau:
- Phổ phải có độ phân giải và cường độ thích hợp
- Chất đo phải tinh khiết
- Thiết bị phải được chuẩn hoá đúng số sóng ( tần số, bước sóng) thường
với bản film polystyren chuẩn (có thể kết hợp kiểm tra độ phân giải)
- Chuẩn bị mẫu đo phải thực hiện đúng kỹ thuật, nếu dùng đến dung môi
thì cần phải ghi rõ tên dung môi, nồng độ và bề dày cốc đo
- Cần chú ý các đỉnh yếu (như là các đỉnh của alkyl và nitril) nếu cần
thiết phải ghi lại phổ với nồng độ cao hơn.
8


1.3. 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). [9] [12] [15]
1.3.2.1. Vài nét vê sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
a. Đỉnh nghĩa: HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di
chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan

đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối
của các chất này với pha tĩnh và pha động.
Khác với sắc ký lỏng cổ điển, người ta thường dùng các cột thuỷ tinh đường
kính 1-5 cm, dài 50- 500 cm, hạt chất nhồi đường kính lớn, thời gian phân
tích kéo dài, không dùng bơm được vì hiệu lực tách sẽ giảm. HPLC với cỡ hạt
nhồi nhỏ đòi hỏi dùng bơm để nén dung môi qua cột, có nhiều ưu điểm nổi
bật.
b. Các thôns sô đăc trưng cho sắc ký:
+ Thời gian lưu
tR: là thời gian cần thiết (phút, giây) để một chất tan dịch chuyển từ lúc
nó được nạp vào đầu cột sắc ký đến thời điểm được phát hiện ở nồng độ cực
đaị.
Việc so sánh thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn làm
trong cùng điều kiện sẽ giúp chúng ta định tính được chất đó.
+ Hiệu lực của cột sắc kỷ
Được biểu thị bằng số đĩa lý thuyết N
Bằng thực nghiệm ta có:
2
N -16
w
Trong đó

hoặc:

ÍV= 5,54 Ír
-wu2.

W: chiều rộng đáy pic.
W l/2: chiều rộng pic đo ở nữa chiều cao của đỉnh.

9


Yêu cầu cụ thể về số đĩa lý thuyết sẽ được qui định trong từng phép
phân tích. Thông thường một cột sắc ký dùng phân tích thường có N> 1000
đĩa lý thuyết.

+ Hệ sô bất đôi xứng
* Sắc ký tuyến tính
Sự tạo thành pic sắc ký đối xứng như đường cong phân bố Gauss chỉ diễn
ra trong sắc ký tuyến tính, ở đây, hệ số phân bố K giữ giá trị không đổi trên
một khoảng nồng độ của chất phân tích. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của
nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh thay đổi tuyến tính với nồng độ trong
pha động.
*

Tính bất đối xứng của pic

Do các hiệu ứng của sự khuếch tán xoáy, dọc, chuyển khối nên lượng
chất tan phân bố trong pha động và pha tĩnh khác nhau dẫn tới có sự không
cân xứng của pic sắc ký.
+ Hiệu ứng của khuếch tán xoáy: do dòng chảy không đều của pha động
qua pha tĩnh, các phân tử chất tan đi theo dòng chảy của pha động với tốc độ
khác nhau. Điều này làm pic giãn rộng ra do di chuyển theo nhiều đường
khác nhau.
+ Hiệu ứng của khuếch tán dọc: do sự khuếch tán của chất tan theo
chiều ngược và xuôi theo dòng chảy của pha động.
+ Quá trình chuyển khối: sự không đồng đều của tốc độ di chuyển chất
tan trong lòng pha động, vùng tiếp giáp hai pha và trong lòng pha tĩnh.
Để đánh giá tính bất đối xứng, người ta dùng hệ số bất đối Ap

a

Trong đó: a, b là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước và phía sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic.

10


+ Hệ số dung lượng k ’
k ’ mô tả tốc độ di chuyển của một chất
Theo thực nghiệm:

k' = -t !L- =
K
K

=> k ’ phụ thuộc bản chất hai pha, chất phân tích, nhiệt độ và đặc điểm cột
( V Sp/Vmp).

Thường người ta chọn điều kiện sắc ký để k ’ dao động từ 1- 5.

+ Độ phân giải
Là đại lượng đo mức độ tách hai chất liền kề trên một cột sắc ký.
R =ầ ằzIiL
w
” 1 ^+w.
rr\

hoặc
'

Rs = u 11(12 ~ )
'v w.1/2(2) +w.
~ rr1/2(1)

Trong đó

t2, tị! thời gian lưu của hai pic liền kề nhau (t2>t|).
W2, w ,: độ rộng các pic tương ứng đo ở các đáy pic
W 1/2(2), W 1/2(1): độ rộng pic tương ứng đo ở nửa chiều cao các
pic

Để tách riêng hai chất, yêu cầu Rs tối thiểu phải đạt 1,5 (khi hai pic có độ
lớn cùng cỡ).

11


1.3.2.2. Sắc ký phân bố pha liên kết
Sắc ký phân bố là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, tuỳ
thuộc vào pha tĩnh chia làm 2 dạng:
Sắc ký lỏng- lỏng: pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt mang chất
mang rắn, đó là chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến
sự phân bố giữa 2 pha lỏng
Sắc ký pha liên kết: chất phân tích có liên kết với pha tĩnh, được gọi là
pha liên kết. Hiện nay với ưu điểm của nó, sắc ký pha liên kết chiếm ưu thế.
a. Pha tĩnh
Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxyd (silica). Nhóm OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo dẫn chất siloxan

CH3

— OH

+

C1

1

—

Si— R

►

*
CH3
1
1
wvw*Si— o — Si— R

-HC1

CH3

1
*

ĩ

ch3

R có thể là mạch thẳng có 18 hoặc 8 c, hoặc các nhóm chức hữu cơ khác như:
amin mạch thẳng, nitril, hydrocarbon thơm.
Dựa vào gốc R người ta chia làm 2 nhóm:
Pha tĩnh không phân cực: octadecyl -CH2- (CH2)16-CH3
Octyl

-CH2- (CH2)8-CH3

phenyl

-CH2- (CH2)2-C6H5

Pha tĩnh phân cực: cyano, amino, diol.
Sắc ký pha thuận, sắc ký pha đảo: hai dạng sắc ký này khác nhau phụ
thuộc vào độ phân cực tương đối của pha động và pha tĩnh.
Sắc ký pha thuận: nếu R là nhóm khá phân cực như amin, cyano... dung
môi ít phân cực như hexan.
12


sắc ký pha đảo: nếu R là một nhóm ít phân cực như C8, Ci8 hay
phenylpropyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril.
Hiện nay sắc ký pha đảo được dùng rất rộng rãi vì nó cho kết quả tách tốt
với rất nhiều đối tượng tách.
b. Dung môi sử dụng trong sắc ký pha đảo.
Ba dung môi thường dùng trong sắc ký pha đảo là acetonitril (MeCN),
methanol (MeOH) và tetrahydroíuran (THF).
Pha động thường là hỗn hợp 1-2 dung môi trên với nước hoặc dung dịch

đệm nhằm đảm bảo quá trình tách mẫu phân tích cụ thể.
Hỗn hợp thường dùng nhất là MeCN với nước, MeCN có ưu điểm là độ
nhớt thấp nên có thể sắc ký ở áp suất thấp. Mặt khác có thể đo độ hấp thụ u v
ở 190 nm.
Methanol được lựa chọn thứ 2 vì độ nhớt cao hơn và giới hạn đo ở vùng là
205 nm.
THF ít dùng hơn vì ổn định kém hơn (dễ bị oxyhoá), cân bằng với pha
tĩnh chậm hơn.
Bảng 1.1: Giới hạn dưới đo ƯV của một sô dung môi thường dùng
trong sắc ký
Thứ tự

Tên dung môi

Giới hạn dưới đo
ƯV (nm)

1

n- hexan

190

2

Methylen chlorid

233

3

n- propanol

240

4

Tetrahydroíuran

212

5

Chloroíorm

245

6

Ethanol

210

7

Acetonitril

190

8

Methanol

205

9

Nước

190

13


Các yêu cầu của pha động:
• Không làm già hoá cột tách và các đặc tính của nó.
• Phù hợp với detector.
• Hoà tan mẫu cần tách.
• Độ nhớt thấp.
• Cho phép thu hồi lại mẫu nếu cần thiết.
• Tinh khiết, không độc.
• Dễ tìm, giá cả vừa phải
Sắc ký phân bố được ứng dụng để phân tích nhiều đối tượng, được trình
bày ở bảng 1.2
Bảng 1.2: Một sô ứng dụng của sắc ký phân bô
Lĩnh vực

Đôi tượng phân tích

Dược

Kháng sinh, các chất giảm đau, an thần, steroid

Hoá sinh

Aminoacid, protein, lipid, carbonhydrat

Thực phẩm

Chất làm ngọt, chất phụ gia, các chất chống oxyhoá,
aílatoxin

Hoá công nghiệp

Hợp chất thơm, chất màu, hoạt động bề mặt

Môi trường

Các chất trừ sâu diệt cỏ, dẫn chất phenol, PCB, PAH

Hoá pháp lý

Các chất độc, thuốc ngủ, rượu trong máu

Y học lâm sàng

Acid mật, các chất chuyển hoá của thuốc, thuốc trong
dịch sinh học

1.3.2.3. Các phương pháp định lượng thường dùng trong HPLC [3] [9]

Các phương pháp định lượng dùng trong HPLC:
• Phương pháp chuẩn ngoại
• Phương pháp chuẩn nội

14


• Phương pháp thêm chuẩn
• Phương pháp qui về 100% diện tích pic
Trong đó, các phương pháp được sử dụng trong đề tài là phương pháp
chuẩn ngoại, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp qui về 100% diện
tích pic.
a. Phương pháp chuẩn ngoại
So sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích hoặc chiều cao pic
trong mẫu thử chưa biết với một dung dịch chuẩn của chấtđó là một phương
pháp phổ biến trong sắc ký. Phương pháp này yêu cầu tiêm các thể tích xác
định vào hệ thống sắc ký. Các chất được tiêm vào dưới dạng dung dịch chuẩn
có nồng độ xấp xỉ nồng độ chất phân tích. Phương pháp này có thể tiến hành ở
các nồng độ khác nhau (chuẩn hoá một điểm, hai điểm, nhiều điểm). Trong
phương pháp chuẩn hoá một điểm, nồng độ của mẫu thử được tính như sau:
c
c ,= s ,—

se

Trong đó:

c ,: nồng độ mẫu thử
Cc: nồng độ chất chuẩn
St : diện tích (chiều cao) pic của mẫu thử

Sc: diện tích (chiều cao) pic của mẫu chuẩn

Với phương pháp chuẩn hóa 2 điểm hay nhiều điểm, phương trình đường
chuẩn phải được xác định đầu tiên. Thường được mô tả bằng đường chuẩn thu
được từ các điểm đo, cùng phương pháp phân tích hồi qui tuyến tính.
S0+mCc
Trong đó:
S0: là giao điểm của đường chuẩn với trục tung
m : độ dốc của đường chuẩn
Trong trường hợp này, nồng độ của mẫu thử được tính theo công thức sau:

15


m
Độ lớn của pic mẫu thử Sa nên giữa độ lớn của pic chuẩn thấp nhất và cao
nhất bởi vì đường chuẩn được xác định trong vùng nồng độ đã nghiên cứu này.
b.Phương pháp thêm chuẩn
Phương pháp thêm chất chuẩn được sử dụng trong HPLC chủ yếu khi có
vấn đề ảnh hưởng của chất phụ. Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác
định chất chuẩn. Các pic thu được của cả 2 dung dịch mẫu thử và mẫu thử
thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện sắc ký. Phương pháp
thêm chất chuẩn có thể được thực hiện một, hai hay nhiều mức nồng độ.
Trong trường hợp đơn giản nhất với một mức nồng độ thêm chất chuẩn, nồng
độ chưa biết của mẫu Ct được tính bằng sự chênh lệch nồng độ Ac (lượng chất
chuẩn thêm vào) và độ tăng của độ lớn Pic As theo công thức:
c ' = s ' £ầs
Ưu điểm của phương pháp thêm chuẩn:
- Độ chính xác cao, loại trừ được các yếu tố ảnh hưởng khác
- Sự thay đổi về nhiệt độ, áp suất đã được mô tả bù trừ trong đồ thị chuẩn

và không ảnh hưởng đến kết quả đo đạc, không bị ảnh hưởng của quá trình xử
lý mẫu.
Nhược điểm: đòi hỏi nhiều thời gian phân tích vì phải chuẩn hoá đối với từng
mẫu mà không chuẩn hoá định kỳ như dùng phương pháp chuẩn ngoại.
c.

Phương pháp qui về 100% diện tích píc.

Kỹ thuật này đơn giản, nhưng trong HPLC thì việc ứng dụng bị hạn chế,
thường hay được sử dụng trong sắc ký khí. Nó đòi hỏi mọi cấu tử trong hỗn
hợp chất cần phân tích đều được rửa giải và được phát hiện.

16


%x =---- ^ ------100
Ax +Ay + A :

Trong đó

%X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, z
Ax, Ay, Az : diện tích pic của cấu tử X, Y, z

Trong HPLC, công thức này chỉ đúng khi sự đáp ứng của detector trên
các cấu tử X, Y, z là như nhau. Nếu không như nhau, mỗi cấu tử cần có hệ số
điều chỉnh f(x), f(y), f(z).
Hệ sô hiệu chỉnh f(i) = nồng độ/diện tích Aj
Nồng độ của một thành phần j = diện tích pic Aj X fj
Lúc đó hàm lượng phần trăm của chất X trong mẫu nhiều thành phần sẽ
trở thành % x = ---------- 4 / 0 0 ---------- 100

A J ( x ) + Ayf ( y ) + Azf ( z )

Trong đó

Ac, Ax:

diện tích pic của chuẩn và cấu tử X

fi:

hệ số hiệu chỉnh


PHẦN 2- THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM.
2.1.1 Nguyên vật liệu
2.1.1.1 Dung môi, hoá chất
Dung môi, hoá chất

Nguồn gốc

Methanol

Merck- Đức

Pyridin

PA- Đức

Ethylacetat

Merck- Đức

Acid sulíuric 99,9%

Suprap- Mỹ

Acid hydrochlorid đặc

Suprap- Mỹ

Dimethylaminobenzaldehyd

PA- Đức

Kali bromid

PA- Đức

2.1.1.2 Thiết bị
• Cân phân tích Metller (Thụy sỹ)
• Hệ thống HPLC Thermo Finnigan (Mỹ)
• Máy quang phổ hồng ngoại Perkin- Elmer (Mỹ)
• Hệ thống chấm sắc ký Camag (Thụy sỹ)
• Lò nung
• Máy đo độ chảy: Gallenkamp (Anh)
• Bình định mức, pipet, chén sứ, và dụng cụ thuỷ tinh đạt tiêu chuẩn
dùng cho phòng thí nghiệm phân tích.
2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu thử: nguyên liệu Hydroxyure được tổng hợp tại bộ môn Hoá hữu
cơ, Trường đại học Dược Hà nội.
- Chất đối chiếu: Hydroxyure 98,0% (Aldrich- Mỹ).
18


2.1.3 Nội dung
Xây dựng các chỉ tiêu chất lượng cho nguyên liệu Hydroxyure.
^ Xây dựng phương pháp thử để đánh giá các chỉ tiêu chất lượng đưa ra.
r ’ ứng dụng các phương pháp đã xây dựng để kiểm tra, đánh giá chất
lượng của nguyên liệu Hydroxyure thử nhằm hoàn thiện qui trình tổng hợp.
2.1.4 Phương pháp nghiên cứu
1. Tính chất: tiến hành bằng cảm quan.
2. Độ chảy: tiến hành xác định trên máy đo độ chảy, Dược điển Việt
Nam III, phụ lục 5.19.
3. Định tính:
* Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại theo chỉ dẫn của Dược điển Việt
Nam III, phụ lục 3.2.
Nguyên tắc đánh giá: dựa vào sự phù hợp của phổ hấp thụ IR của chất
thử với chất chuẩn đối chiếu.
* Phương pháp SKLM với điều kiện sắc ký như sau:
- Bản mỏng: silicagel
- Pha động: pyridin-nước-ethylacetat (2:2:10)
- Thể tích chấm sắc ký: 5 |J,1
- Dung dịch phát hiện: dung dịch dimethyl aminobenzaldehyd 10 g/1
trong dung dịch acid HC1 IM.
Đánh giá: vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử phải tương ứng về vị trí
và màu sắc với vết thu được trên sắc đồ dung dịch chuẩn đối chiếu.
4. Mất khôi lượng do làm khô: tiến hành theo chỉ dẫn trong Dược điển
Việt Nam III, phụ lục 5.16: phương pháp sấy chân không ở 60°c , tiến hành

trên 2,00 g mẫu thử.

19


>

Nguyên tắc: trên cơ sở cân một lượng chính xác nguyên liệu làm khô

ở điều kiện qui định sao cho chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp
không vượt quá 0,5 mg. Tính % mất khối lượng do làm khô.
5 Tro sulýat: tiến hành theo chỉ dẫn trong Dược điển Việt Nam III, phụ
lục 7.7, phương pháp I.
Nguyên tắc: nung một lượng chính xác nguyên liệu đã làm ẩm với acid
sulfuric đến khối lượng không đổi ở điều kiện qui định (chênh lệch giữa 2 lần
cân kế tiếp không vượt quá 0,5 mg). Tính % cắn thu được.
6 Kim loại nặng: tiến hành theo chỉ dẫn trong Dược điển Việt Nam III,
phương pháp I.
'r

Nguyên tắc: so sánh màu của 2 ống thử và chuẩn được tiến hành

đồng thời theo chỉ dẫn thử giới hạn kim loại nặng. Qua đó xác định được giới
hạn kim loại nặng có đạt hay không đạt.
7 Tạp chất liên quan: sử dụng phương pháp HPLC theo chỉ dẫn Dược
điển Việt Nam III, phụ lục 4.3 (qui về 100% diện tích pic).
Nguyên tắc đánh giá: dựa vào % diện tích píc của từng tạp thành phần so
với tổng diện tích pic thu được, đối chiếu với yêu cầu của từng tạp tương ứng.
8 Định lượng-, sử dụng phương pháp HPLC
> Lựa chọn điều kiện sắc ký

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Qua khảo sát thực tế và tài liệu lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp: bước
sóng, pha động, cột, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu
> Thẩm định phương pháp phân tích. [1] [3] [7]
Phép phân tích được đánh giá dựa theo các tiêu chí sau:
s Độ phù hợp của hệ thống
Xác định độ phù hợp của hệ thống sắc ký bằng cách tiêm lặp lại 6 lần
dung dịch chuẩn Hydroxyure có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi
lại diện tích pic đáp ứng qua các lần tiêm. Yêu cầu chênh lệch đáp ứng phân

20


tích (diện tích pic, thời gian lưu) giữa các lần tiêm của cùng một dung dịch,
biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD% không lớn hơn 2%.

RSD% = -Ẹ^m
X

s

Với

Độ tuyến tính

Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, thường chọn khoảng
nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu diện tích pic với nồng độ
chất cần phân tích. Chúng ta cần xác lập mối tương quan giữa diện tích pic với
nồng độ. Triển khai sắc ký 5 nồng độ của chất phân tích. Mối tương quan giữa
diện tích pic với nồng độ chất cần phân tích được biểu diễn bằng phương trình

hồi qui và hệ số tương quan hồi qui.
Yêu cầu đường hồi qui thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ
số tương quan hồi qui xấp xỉ 1

•S Độ lặp lại của phương pháp
Tiến hành phân tích ở một mức nồng độ nằm trong khoảng nồng độ tuyến
tính. Tiến hành 5 mẫu thử độc lập, đánh giá độ lặp lại của diện tích pic thu
được thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD%.
Yêu cầu chênh lệch kết quả giữa các mẫu thử, biểu thị bằng độ lệch
chuẩn tương đối không được lớn hơn 3%.

s Độ đúng của phương pháp.

;

■

Xác định bằng phương pháp thêm chuẩn
Nguyên tắc: thêm từng lượng chính xác hydroxyure chuẩn đã biết trước vào
mẫu hydroxyure thử. Tìm lại lượng chất chuẩn đã thêm vào thông qua tương
quan giữa nồng độ chất chuẩn thêm vào với chênh lệch của diện tích pic đáp
ứng thu được ở dung dịch thử so với dung dịch hỗn hợp ( thử+chuẩn).
21