Nghiên cứu định lượng acid shikimic trong đại hồi bằng HPLC

BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

HÀ THỊ MAI TRANG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID SHIKIMIC
TRONG ĐẠI HỒI BẰNG HPLC
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược s ĩ KHOÁ 2002-2007)

Người hướng dẫn:

TS. Nguyễn Đình Luyện

Nơi thực hiện:

Bộ môn Công Nghiệp Dược,
trường Đại học Dược Hà Nội

Thời gian thực hiện: 3 - 5/2007

HÀ NỘI, THÁNG 5, 2007


£Ờã®cÀMƠQl

^ĩvưâe tiề n lở i rỉtìễt h àụ tú lòềtíị Uíiih ti'íịiiịf ÚỈL h ièí đ u ềứiẨ ẳiíe ĩtên :

®s, ^ìỉiịuụỉtr (Dìtih JIuịậỉ*l
Qtụưèl (tã tản tình hưổitíị dẫn OỈL ạiứfL ĩtẵ tỏi tvGnụ. âiiiít ÍỊUÚ trình (kíiừ hiẽễt
u t iú ú í tí í/ít ttùíẬ .
&ỒÌ dùếL chân thàễih tủíH 0*1

£7/tc£.

QtạuụẪễi (ĩỳàii /
7ôăiLf anh (J)haii &ỉêii £7fatinh

eùểtụ eá e t k ẵ ụ eê tu i cáết h ê k ụ t h u ủ t OẨẻit h ê ễMÔii Q m iụ , Qflụhi$jfL nOưọe ĩt ũ ễ ih ìê t tìếih
ụ ì ú p ít ổ tu i ta ú m ú i đ iề u Uiêễt t h i iã n l ú i eht) t ê ỉ h ú à ễ i t liù ỉt h U h ú /i Luâễt n a ụ .

Q ỉài <*>ìễt eủ tn ổ n e á e th ầ ụ ừê ụ ỉâ ú tvúễtụ ỈVUỔÌUẬ itũ e h i d ẫ n ờ/tí) t à i ivtìễtíị 3ít (ít

th ú i ụlíiễt hjạa fậ p tạ i tvƯỔễiíỊ^.
ũ í i ế i e ầ t u ị t ò i tXÙn eitỉễt ú’ễt h a u hè O íi ạ iu đ ìn h đ ã q u a n t ã tu ỉtộ n í} o Jê iif ( ỊỈú p ĩtở
t ồ i tv ũ n ạ ẫ uôt t k đ i ụ ia t t q u a .

'Tỗă Qlội, ttíịùí^ 8 ikátUẶ 5 ễtủễn 2 0 0 7
Ẵitth oiên
'7ÔĨL £7/f/

&VIUIII


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN Đ Ể ......................................................................................... 1
PHẦN I: TỔNG QUAN......................................................................... 3
1.1. Đại h ồ i............................................................................................. 3
1.1.1. Nguồn gốc, phân b ố ................................................................... 3
1.1.2. Thành pỉĩần hoá h ọ c...................................................................3
1.1.3. Công dụng, tác dụng.................................................................. 4

1.2. Vài nét về acid shikỉmỉc...................................................................5
1.2.1. Nguồn g ốc...................................................................................5
1.2.2. Tính chất.....................................................................................5
1.2.3. Công dụng...................................................................................5
1.3. Một số phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại h ồ i................8
1.3.1. Chiết bằng thiết bị chiết Sohxlet với dung môi cồn 9 6 °............... 8
1.3.2. Chiết bằng phương pháp ngâm nóng ở 60 ‘U với dung.................8
môi nước
1.3.3. Chiết bằng cách hồi lưu trong cồn 9 5 °........................................8
1.3.4. Chiết bằng siêu â m ......................................................................9
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)........................... 9
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp......................................................9
1.4.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC..................................... 10
1.4.3. Một số thôngsố đặc trưng của HPLC.......................................... 12
1.4.4. Các phương pháp định lượngbằng HPLC....................................15


PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q UẢ.............................................19
2.1. Nguyên vật ỉiệu và phương pháp thực nghiệm................................. 19
2.1.1. Nguyên vật liệu và hoá chất......................................................... 19
2.1.2. Máy móc,thiết b ị ........................................................................... 19
2.1.3. Phương pháp thực nghiệm............................................................ 20
2.1.4. Phương pháp xử lý kết quả phân tích............................................ 21
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận x é t..................................................... 22
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng acid shikimic bằng................. 22
HPLC
2.2.2. Khảo sát phương pháp và thời gian để chiết ìdệt acid...................29
shikimic trong đại hồi
2.2.3. Áp dụng phương pháp để định lượng dịch chiết đại h ồ i................ 32
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT.................................................... 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỂ
Đại hồi từ lâu đã được biết đến và sử dụng để điều trị bệnh trong cả đông y
và tây y. Hồi còn là một thành phần của ngũ vị hương - một loại gia vị truyền
thống trong văn hoá ẩm thực Trung Hoa, Việt Nam và một số nước Đông Nam Á
như Indonesia, Malaysia. Hồi thường chỉ trồng để lấy tinh dầu với giá tiị kinh tế
không cao. Vài năm trở lại đây, cây hồi được biết đến với một vai trò hoàn toàn
khác sau khi hãng dược phẩm Hoffmann La Roche của Thuỵ Sỹ mua bản quyền
sản xuất và cung ứng thuốc Tamiílu của tập đoàn Gilead, Caliomia (Mỹ). Hiện
nay, TamiAu là thuốc duy nhất có tác dụng điều trị và ngăn chặn bệnh cúm gia
cầm do virus H5N1 và hoạt chất chính của thuốc là Oseltamivir được tổng hợp từ
acid shikimic trong cây hồi. Ngoài đại hồi, acid shikimic còn có trong một số cây
khác như: cây bạch quả (Gingko bilobà), quả sau sau (chi Liquidambar), bạch
đàn (chi Eucalyptus)... Acid shikimic cũng có thể được sinh tổng hợp nhờ E.coli
hay tổng hợp hoá học với các nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền hơn. Tuy nhiên,
những phương pháp này hiện chưa được đưa vào sản xuất công nghiệp, do đó hồi
vẫn là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất Tamiílu, cung cấp cho Roche 2/3
lượng acid shikimic mỗi năm.
Ở Việt Nam, đã có một vài cơ sở chiết xuất và tinh chế được acid shikimic
trong đại hồi như phòng Tổng hợp hoá dược của bộ môn Công nghiệp Dược,
trường Đại học Dược Hà Nội, viện Dược liệu, viện Hoá học (Viện Khoa Học và
Công Nghệ Việt Nam). TS. Nguyễn Quyết Chiến của viện Hoá học và các cộng
sự cũng đã tổng hợp thành công Oseltamivir phosphate vào tháng 3/2006, mở ra
khả năng tự sản xuất Tamiílu trong nước. Mặt khác nguồn hồi nguyên liệu của
Việt Nam lại rất dồi dào, hoàn toàn có thể đáp ứng nhu cầu cho sản xuất thuốc

1

phòng chống cúm gia cầm trong nước và có thể xuất khẩu. Tuy nhiên, hiện vẫn
chưa có tài liệu nào công bố chính thức hàm lượng acid shikimic trong đại hồi,
chỉ ước chừng từ 5-7% dựa theo các kết quả chiết xuất đã được công bố. Do đó
chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu định lượng acid shỉkỉmic trong đại hồi bằng HPLC”
Với mục tiêu:

- Xây dựng phương pháp định lượng acid shỉkỉnức bằng HPLC.
- ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng acỉd shikimic trong
đại hồi Việt Nam bằng HPLC.

2


PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1.

Đại hồi - nguồn gốc, thành phần hoá học, tác dụng, công dụng:

1.1.1. Nguồn gốc, phân bố:
Đại hồi còn gọi là bát giác hồi hương hay đại hồi hương là quả chín phơi
khô của cây hồi (Ilỉicium verum Hook.f., Illiciaceae).
Đại hồi chỉ mọc ở bốn tỉnh của Trung Quốc là Quảng Đông, Quảng Tây,
Phúc Kiến, Vân Nam và hai tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn của Việt Nam. Các tỉnh
như Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Thái Nguyên có trồng nhưng sản lượng
không đáng kể. Hồi thu hái vào 2 vụ tháng 7-8 (hồi mùa) và 11-12 (hồi chiêm).
Hồi mùa có hàm lượng và chất lượng tinh dầu tốt hơn hồi chiêm. Ngoài hai vụ
chính, còn có một vụ quả lép rụng sớm vào tháng 3. Trên thị trường người ta chia
hồi thành ba loại:

Loại 1: có 8 cánh to đều nhau, màu nâu đỏ (hồi đại hồng).
Loại 2: có 1-2 cánh bị lép, màu nâu đen.
Loại 3: có 3 cánh trở lên bị lép, màu nâu đen.
Hồi xô gồm lẫn lộn cả ba loại trên [3,7,9].
1.1.2. Thành phần hoá học:
Trong quả hồi, ngoài các chất như chất nhầy, đường, chủ yếu chứa tinh dầu
từ 3-3,5% (tươi) hoặc 8-9% hay hơn (khô) và acid shikimic. Tinh dầu hổi có mùi
đặc biệt, vị ngọt, kết tinh khi để lạnh với thành phần chính là trans-anethol (8590%), còn lại là terpen, a-pinen, A3-caren, dipenten, limonen, saírol, terpineola

3


v.v... Lá hồi cũng chứa tinh dầu với thành phần gần tương tự, hàm lượng từ 0,561,73% (80-90% trans-anethol) [3,4,7].
33

CH3
Anethol
1.1.3. Công dụng, tác dụng [3,4,7]:
Hồi là một vị thuốc được dùng trong cả đông y và tây y. Tây y dùng hồi
làm thuốc trung tiện, giúp tiêu hoá, lợi sữa. Nó có tác dụng trên hệ thống thần
kinh và cơ (dịu đau, giảm co bóp) được dùng trong đau dạ dày, đau ruột và co
thắt dạ dày-raột. Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học đang nghiên cứu về
tác dụng chống ung thư của đại hồi sau khi có một vài trường hợp điều trị thành
công ung thư phổi [23].
Theo Đông y, hồi có vị cay, tính ôn, quy kinh can, tỳ, thận, vị. Có tác dụng
ôn trung khứ hàn, kiện tỳ, khai vị, dùng chữa nôn mửa, đau bụng, bụng đầy
chướng, giải độc của thịt cá. Mỗi ngày dùng 4-8g dưới dạng thuốc sắc. Những
người âm hư hoả vượng không được dùng.
Hồi ngâm rượu dùng ngoài để xoa bóp chữa đau nhức, tê thấp. Ngoài ra,
hồi còn được dùng làm gia vị, chế húng lìu, nấu thịt bò và các thịt khác.

Tinh dầu hồi có tác dụng tương tự quả. Tinh dầu là hương liệu dùng trong
thực phẩm và chế rượu mùi. Anethol dùng để tổng hợp hormon.

4


Cần đặc biệt lưu ý phân biệt đại hồi với cây hồi Nhật Bản Illicium
anisatum Lour. và cây hồi núi Illicium grỉjfưhiỉ vì chúng trông tương tự như đại
hồi nhưng quả của chúng có độc tính cao [3,9].
1.2.

Vài nét về acid Shikimic:

1.2.1. Nguồn gốc:
Acid shikimic là một acid alcol mạch vòng, thường được biết đến nhiều
hơn ở dạng anion shikimat, lần đầu tiên được J.F. Eykman chiết xuất từ Illicium
religlosium, một giống hồi Nhật Bản, vào năm 1885. Tên gọi của nó xuất phát từ
từ Shikimi-no-ki trong tiếng Nhật, có nghĩa là cây hồi [9,20].
1.2.1. Tính chất [18]:
Acid Shikimic có tên khoa học: acỉd (3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxy-lcyclohexen-1 -carboxylic (QHịoOs), trọng lượng phân tử 174,15. Nó có công thức
cấu tạo như sau:
COOH

OH
Acid shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước (18%),
tan trong methanol, ethanol tuyệt đối (2,25%), không tan trong ethylacetat,
aceton, chloroíorm, benzen, ether dầu hoả.
Nhiệt độ nóng chảy của acid này là 183-184,5°c.
Năng suất quay cực [a]18= -183,8° (C=4,03/ H20).

5


Dung dịch acid shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở 213nm.
1.2.2. Công dụng:
Acid shikimic có trong nhiều loại cây và cũng là một chất hoá-sinh học
trung gian quan trọng trong thực vật và vi sinh vật. Nó là nguyên liệu cần thiết
cho quá trình sinh tổng hợp acid amin thơm như phenylalanin, tyrosin và
tryptophan, hay các chất có nhân thơm trong cây (ílavonoid, coumarin), indol và
các dẫn chất, một số alkaloid, tannin, lignin, acid p-aminobenzoic thông qua con
đường shikimat. Con đường này cùng với con đường quinic là hai cách chính
tổng hợp các hợp chất thơm trong cây. Con đường shikimat đi từ glucose để tạo
ra các hợp chất thơm đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu kĩ và có thể tóm
lược theo sơ đồ sau [13,16]:
D-glucose — »Erythrose-4-phosphate -» 3-desoxy-arabino heptulosonate-7phosphate —>• 3-dehydroquinate <-» 3-dehydroshikimate <-» shikimate —»• shikimate-3phosphate —» 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate —>chorismate Jr_^. Tyrosin
[ryptophan
'Phenylalanin
'Acid p-amino benzoic
Tuy nhiên, các động vật lại không thể sử dụng con đường sinh hóa này để
tổng hợp những acid amin này từ các tiền chất carbonhydrate.
Acid shikimic có tác dụng giảm đau, chống viêm, kháng viras, chống kết
tập tiểu cầu và huyết khối bằng cách tác động lên sự chuyển hoá acid arachidonic
[24].
Gần đây, nó còn được sử dụng là nguyên liệu để tổng hợp Oseltamivir, một
chất ức chế neuraminidase - enzym chính quyết định quá trình giải phóng và lây
lan virus từ các tế bào bị nhiễm. Oseltamivir có tác dụng điều trị và phòng bệnh

6

do virus Influenza typ A và typ B, đặc biệt với chủng H5N1. Hiện tại đây là chất
duy nhất có tác dụng với bệnh cúm gia cầm, nên acid shikimic đang được giới
chuyên môn cũng như cộng đồng hết sức quan tâm chú ý [9].
Ngoài ra, cũng cần lưu ý đến độc tính của acid shikimic. LD5 của acid này
trên chuột là lOOOmg/kg. Đã có một vài báo cáo về khả năng gây ung thư và đột
biến của acid shikimic, nhưng vấn đề này vẫn còn nhiều ý kiến trái ngược nhau
[21,14,18].
Acid shikimic còn có thể được chiết từ hạt của quả sau sau (chi
Liquidambar, Altỉngỉaceae) ở Bắc Mỹ với hàm lượng khoảng 1,5%, nhưng vẫn
kém hơn nhiều so với hàm lượng trong đại hồi. Một số loài thực vật khác có chứa
acid shikimic bao gồm nho, táo, bạch quả (Ginkgo bỉỉoba), liễu (Salix nigra,
Salỉcaceae), một số cây thuộc chi Eucalyptus (E. sieberiana F. Muell, E. citriodora),
đinh hương {Syzygium aromaticum, Myrtaceae), quả cây lý gai (Gooseberry), cây việt
quất châu Mỹ và châu âu (Vaccinium macrocarpon, V. oxycoccos, V. myrtiUus) v.v
[15,22].
Mặc dù acid shikimic có mặt trong phần lớn các sinh vật tự dưỡng như
Escherìchia coli, Penicillỉn griseoýulvum..., nhưng nó chỉ là chất tổng hợp sinh
học trung gian với hàm lượng rất thấp. Gần đây, phương pháp tổng hợp sinh học
nhờ E.coli cũng đã được hoàn thiện hơn, có thể có đủ lượng acid shikimic cho sử
dụng thương mại [16].
Đặc biệt, đã có những công bố đáng chú ý về các phương pháp mới sản
xuất Tamiflu không dùng nguyên liệu acid shikimic hoặc acid quinic. Elias J.
Corey (Đại học Harvard) cùng các cộng sự Ying-Yeung, Sungwoo Hong đã tổng
hợp Tamiílu qua phản ứng Diels-Alder đi từ các hoá chất có sẩn trong công nghiệp
là 1,3-butadien và 2,2,2-trifluoroethyl acrilat với xúc tác oxazaborolidinum ở nhiệt
độ thường [8,11]. Trong khi đó, Masakatsu Shibasaki (Đại học Tokyo) và các

7

cộng sự lại xuất phát từ nguyên liệu 1,4-cyclohexandien. Giai đoạn chính của
tổng hợp này dùng tác nhân trimethyl silyl azide với xúc tác chiral Ytrium [8].
Các nghiên cứu về acid shikimic vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm đảm
bảo có đủ acid shikimic để sản xuất Oseltamivir, đáp ứng nhu cầu thuốc phòng
chống cúm gia cầm trong trường hợp có đại dịch xảy ra.
1.3.

Một số phương pháp chiết xuất acid shỉkimic từ đại hồi:
Muốn định lượng được hàm lượng các hoạt chất trong dược liệu nói chung

và định lượng acid shikimic trong đại hồi nói riêng, vấn đề đầu tiên cần quan tâm
là chọn được phương pháp chiết thích hợp. Phương pháp chiết được lựa chọn
phảo đảm bảo chiết kiệt được hoạt chất cần định lượng và dịch chiết thu được
phải đủ sạch để kết quả được chính xác.
Theo các tài liệu chúng tôi đã tham khảo, có các phương pháp sau để chiết
acid shikimic trong đại hồi:
1.3.1. Chiết bằng thiết bị chiết Soxhlet với dung môi cồn 96 °:
Dược liệu được nghiền nhỏ, gói trong túi giấy lọc và tiến hành chiết với
dung môi cồn 96%. Sau khi chiết kiệt, dịch chiết được lọc và cất quay đến dạng
siro rồi thêm nước, đun nóng đến 80°c để tách riêng tinh dầu. Dịch gạn để lạnh,
lọc bỏ kết tủa và đem định lượng [5,19].
1.3.2. Chiết bằng phương pháp ngâm nóng ở 60 X! với dung môi nước:
Nguyên liệu được cho vào cốc có mỏ, thêm nước đến ngập dược liệu và
cách thuỷ ở 60°c trong bể điều nhiệt. Duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình chiết.
Dịch chiết thu được xử lý như trên [5].

8


1.3.3. Chiết bằng cách hồi lưu trong cồn 95 °:

Cho dược liệu và dung môi chiết vào bình thuỷ tinh cổ mài thích hợp, đun
hồi lưu trong thời gian 3 giờ. Lọc bỏ bã dược liệu. Dịch chiết được xử lý như trên
[5].
1.3.4. Chiết bằng siêu âm:
Cân dược liệu cho vào cốc có mỏ, đổ cồn 96° cho ngập dược liệu và siêu
âm. Tiến hành chiết bằng siêu âm nhiều lần rồi gộp chung dịch chiết và xử lý như
khi chiết bằng Soxhlet [2,6].
1.4.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [1,2,6,17]:
Từ khi ra đời vào cuối những năm 60 phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao đã phát triển nhanh chóng thành một trong những phương pháp phân tích
hiện đại, quan trọng và rất phổ biến hiện nay. Phương pháp này đã thể hiện rõ
tính ưu việt trong nghiên cứu, đặc biệt trong lĩnh vực sinh dược học.
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High períormance liquid chromatography HPLC) là một kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân bố khác nhau của các
chất vào hai pha không trộn lẫn với nhau nhưng luôn tiếp xúc vói nhau. Trong đó,
pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưói áp lực cao nhờ một
bơm cao áp.
Dung dịch chất cần phân tích được đưa vào hệ thống qua van tiêm mẫu và
được pha động kéo tới cột nhờ áp lực của bơm. Tại cột xảy ra quá trình phân bố
và tách các chất. Những chất có ái lực thấp với pha tĩnh được rửa giải ra trước và

9


ngược lại. Khi ra khỏi cột, các chất được detetor phát hiện và ghi lại dưới dạng
peak.
1.4.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC:

❖ Hệ thống bơm
Bơm được xem là một trong những thành phần quan trọng nhất của hệ
thống sắc ký. Bơm đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ hằng định. Bơm
phải đạt được các yêu cầu sau: tạo được áp suất cao (3000-6000 p.s.i hay 250500 at), với lưu lượng 0,l-10ml/phút, không bị ăn mòn bởi nhiều loại dung môi.
Hệ bơm hiện đại hiện nay được điều khiển bằng máy tính có thể lập
chương trình để thay đổi tỉ lệ của các thành phần pha động theo yêu cầu (sắc ký
gradient).
❖ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi:
Bình chứa thường bằng thuỷ tinh, đôi khi bằng thép không rỉ. Dung môi
cần được lọc qua màng lọc 0,45 I^m và đuổi khí hoà tan trước khi sắc ký. Khí hoà
tan có thể làm biến dạng peak và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền, làm xuất
hiện các peak lạ.
Phương pháp rửa giải thường (isocractic) chỉ cần một bình dung môi.
Phương pháp rửa giải gradient cần dùng nhiều bình chứa các dung môi khác nhau.
Hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp các loại dung môi trên được trộn với tỷ lệ biến
đổi theo chương trình đã định.
❖ Hệ tiêm mẫu
Có thể dùng bơm tiêm để tiêm mẫu vào đầu cột. Phương pháp phổ biến là
dùng van tiêm mẫu có vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích xác định và
chính xác. Có thể thay đổi vòng chứa mẫu với các dung tích khác nhau.
Một số máy HPLC có hệ tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều khiển thể
tích mẫu, số lần tiêm và chu kỳ rửa vòng chứa mẫu.

10


❖ Cột sắc ký, pha tĩnh, pha động
Cột
Đây có thể coi là bộ phận quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Tại cột sẽ
xảy ra quá trình tách các chất. Cột ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tách các chất.

Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất
cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột tách có nhiều
kích cỡ, thường có chiều dài 10-30cm, đường kính trong 4-10mm, hạt nhồi cỡ 510|am. Vói chất nhồi cỡ 3-5ịj.iĩi có thể dùng các cột ngắn (3-10cm) và nhỏ (đường
kính trong l-4,6mm). Loại cột này có hiệu lực rất cao.
Pha tĩnh
Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký.
- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ (silicagel, nhôm oxyd, polymer xốp) thì
các chất được tách theo cơ chế hấp phụ nên được gọi là sắc ký hấp phụ.
- Khi sử dụng pha tĩnh là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ hoặc
nó được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ, thì các chất được phân tách theo
cơ chế phân bố, ta có sắc ký phân bố.
- Nếu pha tĩnh là nhựa trao đổi ion thì gọi là sắc ký trao đổi ion.
Sắc ký trao đổi ion thường sử dụng các loại cột C18 và LC18 với pha tĩnh
là Octadecyl. Một số cột loại này có trên thị trường hiện nay là Supelco C18,
Supercosil LC18, Nucleosil LC18, Lichrosorb RP18...

Octadecyl (C18)
- Nếu pha tĩnh là các gel ta có sắc ký loại cỡ (hay còn gọi là sắc ký rây
phân tử).
Pha động

11


Ái lực của một chất đối với pha tĩnh hay nói cách khác, thời gian lưu của
nó ở trên cột được điều khiển bằng cách thay đổi độ phân cực của pha động. Pha
động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp. Người ta có thể thay đổi độ phân cực
của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ các thành phần dung môi trong hỗn hợp.
Tuỳ thuộc vào pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố thành
hai loại:

Sắc kỷ pha thuận (normal phase): Pha tĩnh: phân cực
Pha động: ít phân cực.
Sắc ký pha đảo (reverse phase):

Pha tĩnh: ít phân cực
Pha động: phân cực.

Trong lĩnh vực dược, phương pháp HPLC với kỹ thuật sắc ký phân bố pha
đảo được sử dụng nhiều nhất.
❖ Detetor
Là bộ phận phát hiện các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột và các tín
hiệu này được ghi trên sắc đồ. Có các loại detetor sau:
- Detetor UV-VIS: có thể làm việc ở bước sóng tuỳ chọn, hiện nay được
dùng rất phổ biến. Detetor hiện đại thuộc loại này là detetor mảng diod (diode
array detetor). Detetor này luôn luôn có tỷ lệ tín hiệu nhiễu thấp hơn so với
detetor UV-VIS bình thường.
- Detetor huỳnh quang và detetor điện hoá: có độ nhạy và độ chọn lọc
cao, chủ yếu dùng trong phân tích vết và phân tích y sinh học.
- Detetor đo chỉ số khúc xạ (RI): là detetor vạn năng nhưng kém nhạy.
- Detetor phổ phát xạ nguyên tử.
1.4.3. Một số thông số đặc trưng của HPLC:

12


Các chất khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành
đường cong rửa giải hay còn gọi là sắc ký đổ, nó thường có dạng như sau:
signal

Hình 1: sắc ký đồ của hổn hợp hai thành phẩn

♦♦♦ Thòi gian lưu tR(Retention time):
Là thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu vào hệ thống
sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của peak. Thời gian lưu là một hằng số đối với một
chất nhất định. So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn trong cùng điều
kiện sắc ký ta có thể định tính được chất đó.
❖ Thời gian chết t0:
Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống tách.
❖ Thời gian lưu thực:

13


Là hiệu số giữa thời gian lưu và thòi gian chết
t R~ tR-to
❖ Thừa số dung lượng K’ (Capacity íactor):
Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển của một chất.
ỊA f_

t'u R

_

~ to ‘

tL R - 1L 0
t0

Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và khả năng tách kém. K’ lớn thì peak bị
doãng, độ nhạy kém. Trong thực tế, K’ nằm trong khoảng từ 2-5 là tốt nhất.
❖ Thừa số chọn lọc a (Selective factor):

Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất.

Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1.
Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau khi chúng có giá trị K’ khác nhau. Tức
là a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, giá tiị tối ưu từ 1,5 - 2.
❖ Độ phân giải Rs (Resolution):
Là đại lượng đặc trưng cho mức độ tách của hai chất ra khỏi nhau trên
cùng một điều kiện sắc ký.

R

20.1 - t M) l,18(t„-tM)
s W „ + W m W„,ll+ WtJ0)

WB1, WB2: độ rộng peak ở đáy của lần lượt hai chất.
W05(1), Wo5(2): độ rộng peak đo ở 1/2 chiều cao của lần lượt hai chất.
Để tách riêng hai chất, Rs phải đạt tới 1,5. RS>1,5 là không cần thiết vì sẽ
kéo dài thời gian phân tích.
❖ Số đĩa lý thuyết N:

14


Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu lực cột sắc ký.
N = 16

WD

= 5,54

w,

0,5

Nếu gọi L là chiều dài cột sắc ký, chiều cao của đĩa lý thuyết còn được tính
theo công thức:
H = ềN
Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột. Khi phân tích yêu cầu N > 3000.
❖ Hệ số bất đối AF (Asymmetry íactor):
AC_ b
AF = —
a
b: chiều rộng phía sau của peak.
a: chiều rộng phía trước của peak.
Chiều rộng của peak được đo ở 1/10 chiều cao của peak.
Hệ số này dùng để đánh giá tính bất đối của peak. AF càng gần 1 thì peak
càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả diện tích peak càng chính xác.
Yêu cầu AF = 0,9-1,1.
1.4.4. Các phương pháp định lượng bằng HPLC:
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:
Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó.
Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:
❖ Phương pháp chuẩn ngoại (Extemal Standard).
Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh diện tích peak mẫu thử vói mẫu
chuẩn được sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ mẫu thử được tính toán so vói
mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.

15

CT=

cT

Trong đó: Cc, Cpi nồng độ mẫu chuẩn và mẫu thử.
sc, Spi diện tích peak mẫu chuẩn và mẫu thử.
* Phương pháp chuẩn nội (Intemal Standard).
Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai
có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi
tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai được gọi là chất chuẩn nội. Phương pháp
này giúp cực tiểu hoá các sai số có thể nảy sinh trong quá trình xử lý mẫu (chiết
xuất, tinh chế), do máy móc và kỹ thuật tiến hành.
Độ nhạy của chất chuẩn nội và chất cần phân tích là khác nhau, vì thế cần
xác định yếu tố hiệu chỉnh Fx.

Trong đó c x, Cis: nồng độ dung dịch chuẩn và dung dịch chuẩn nội.
Sỵ, Sis: diện tích peak chuẩn và chuẩn nội.
Nếu Fx là hằng số trong vùng nồng độ nghiên cứu, nồng độ của chất thử
được tính như sau:
Q—

s,

x c isx Fx

is
Phương pháp thêm chuẩn (Standard addition).
Được sử dụng trong HPLC chủ yếu khi có ảnh hưởng của chất phụ hay quá
trình xử lý mẫu phức tạp.
Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng chính xác các chất chuẩn tương

ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký

16


trong cùng điều kiện với mẫu chuẩn. Khi đó nồng độ mẫu thử là:
CT=

AC
------AS

Trong đó: c r: nồng độ mẫu thử
Sr: diện tích peak mẫu thử
ÀC: lượng chất chuẩn tìiêm vào
AS: diện tích peak tăng thêm
*♦* Phương pháp chuẩn hoá diện tích peak (Area normalization).
Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được
tính bằng tỉ lệ phần trăm diện tích peak của nó so với tổng diện tích của tất cả các
peak thành phầa
Phương pháp đòi hỏi các thành phần đều được rửa giải và có đáp ứng như
nhau với detetor. Tuy nhiên, trong sắc ký lỏng để đạt được điều này là rất khó. Vì
vậy, người ta khắc phục bằng cách xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần.
Để xây dựng hệ số đáp ứng ta chọn một thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng
bằng 1. Các thành phần khác có hệ số đáp ứng tính theo công thức sau:

sc, sx là diện tích peak của thành phần chọn làm chuẩn gốc và thành phần
cần tính hệ số đáp ứng.
Cc, c x lần lượt là nồng độ của hai chất.
fc là hệ số hiệu chỉnh của chuẩn.
Khi đó hàm lượng của thành phần X tính theo công thức:

%x=-

SV.F
V.100
X' X
SX-FX+SV'FV+SZFZ +

s~X,.F
~X.100
i s ,F.

i=l

Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng tạp chất trong thuốc.

18


PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1.

Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm:

2.1.1. Nguyên vật liệu và hoá chất:
- Nguyên liệu:
Trên thị trường thường chỉ có lẫn lộn các loại hồi từ các nguồn cung khác
nhau nên rất khó để xác định nguồn gốc của một loài nhất định. Để lấy tinh dầu
người ta thường chọn loại có cánh to dầy, mùi thơm và ít hạt. Nhưng acid

shikimic lại có nhiều hơn trong hạt, do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 3
mẫu hồi được phân loại dựa theo hình dáng quả để so sánh hàm lượng acid trong
các loại khác nhau. Đó là:
• Mẫu 1: hồi có 7-8 đại đều nhau, mỗi đại mang một hạt.
• Mẫu 2: có 1-3 đại bị lép, màu đen. Mỗi đại có một hạt.
• Mẫu 3: có nhiều hơn 3 đại bị lép, màu đen.
Các mẫu đều được sấy khô, xay nhỏ, chiết, xử lý và tiến hành sắc ký trong
cùng điều kiện.
- Hoá chất:
• Acid shikimic chuẩn (Merck).
• Cồn 96°.
• Acid sulíuric PA .
• Nước cất hai lần.
2.1.2. Máy móc, thiết bị:
- Máy HPLC Shimadzu SPD-M10 Avp với detetor u v (Nhật).
- Thiết bị chiết Soxhlet.

19


- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức).
- Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ).
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S vói độ chính xác ±lmg (Thuỵ Sỹ).
- Máy đo pH Cyber Scan 500 (Singapore).
- Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S (Đức).
- Bếp điện.
- Màng lọc 0,45 |nm.
- Dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức, bình cầu, bình gạn, pipet, ống đong, pipet,
cốc có mỏ, ống nghiệm...
2.1.3. Phương pháp thực nghiệm:

*** Xây dựng phương pháp định lượng acid shikimic trong quả hồi:
- Hiện chưa có tài liệu nào công bố phương pháp định lượng acid shikimic
trong đại hồi, do đó chúng tôi căn cứ vào phương pháp định lượng acid shikimic
trong rượu vang bằng HPLC của Federico Castellucci - Hiệp hội nho và rượu
vang quốc tế (International Organization of Vine and Wine - OIV) để làm cơ sở
xây dựng phương pháp định lượng.
- Tiến hành chạy sắc ký theo phương pháp đã xây dựng. Đánh giá phương
pháp về:
Khoảng tuyến tính của nồng độ acid shikimic vói diện tích peak trên sắc ký đồ.
Độ chính xác (Độ lặp lại).
Độ đúng.
♦♦♦ Chiết xuất acid shikimic trong quả hồi:
Acid shikimic tan trong nước tốt hơn trong cồn, nhưng khi chiết với dung
môi là nước thì việc xử lý và tinh chế gặp nhiều khó khăn hơn khi dùng dung môi

20


cồn. Mặt khác khi chiết bằng cồn còn có thể thu được tinh dầu hồi. Do vậy,
chúng tôi chọn phương pháp chiết bằng siêu âm và bằng thiết bị Soxhlet để khảo sát.
- Phương pháp chiết bằng siêu âm.
Lấy chính xác một lượng dược liệu đã xay nhỏ vào cốc có mỏ, thêm cồn
96° cho ngập dược liệu. Đem lắc siêu âm trong 40 phút. Gạn lấy dịch chiết, bã
được chiết tiếp 4 lần như trên. Các dịch chiết gộp chung và được xử lý để đinh lượng.
- Chiết bằng bộ chiết Soxhlet.
Cân chính xác một lượng dược liệu, gói trong túi giấy lọc, cho vào thiết bị
và chiết với dung môi cồn 96° trong 13 giờ (đến khi dịch chiết hết màu). Dịch
chiết thu được đem xử lý và chạy sắc ký.
♦> Định lượng dịch chiết đại hồi:
Dịch chiết đại hồi được xử lý và chạy sắc ký theo các điều kiện đã chọn, từ

đó xác định hàm lượng acid shikimic.
2.1.4. Phương pháp xử lý kết quả phân tích:
- Giá trị trung bình:
1

—

"

X=-Ẻ x f
n i=i

- Độ lệch chuẩn:

- Độ lệch chuẩn tương đối:
RSD% = S x l0 0
X

Sai số chuẩn:
sX

s

21