Góp phần nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ khả kiến
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.75 MB, 42 trang )
B ộ YTÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI
PHẠM QUỲNH GIANG
GÓP PHẦN NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG
TOBRAMYCIN NGUYÊN LIỆU BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐO QUANG PHỔ HẤP THỤ KHẢ KIẾN.
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHÓA 2002-2007)
Người hướng dẫn:
PGS - TS TRẦN ĐỨC HẬU
Nơi thực hiện:
BỘ MÔN HÓA DƯỢC.
Thời gian thực hiện: 10/2006-5/2007
\x (\l •/V
HÀ NỘI, THÁNG 5 - 2007
'ì
/
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS-TS TRÀN ĐỬC
HẬU, người thầy trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kinh
nghiệm quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên ở
bộ môn Hóa Dược đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong thời gian tôi
làm thực nghiệm tại bộ môn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thế giảng viên, cán bộ
Trường Đại Học Dược Hà Nội vì sự dìu dắt, dạy bảo trong suốt năm năm tôi
học tập tại đây.
Cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết 011 tới gia đình và bạn bè
đã động viên, quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn
thành khóa luận.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Phạm Quỳnh Giang
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐÊ
1
PHẦN I : TỐNG QUAN
3
1.1. Vài nét về Tobramycin
3
1.2. Một số phương pháp được áp dụng để định lượng
Tobramycỉn
5
1.2.1 .Phương pháp trong dược điển
5
1.2.2. Phương pháp ngoài dược điển
8
1.3. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis
11
1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp định lượng
bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis
11
1.3.2. Các kỹ thuật định ỉượng bằng phương pháp
quang phổ ƯV- Vis
13
1.3.3. ư u nhược điểm của phương pháp định lượng
bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis
PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1.
Nội dung, đổi tượng, phương pháp nghiên cứu
19
20
20
2.1.1. Nội dung nghiên cứu
20
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
20
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
20
2.2. Kết quả nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát các điều kiện định lượng
21
21
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian phản ứng
đến độ hấp thụ của dung dịch ở các nhiệt độ khác nhau
25
2.2.3. Theo dõi độ ổn định của dung dịch sản phẩm
28
2.2.4. Xây dựng phương pháp và ứng dụng
28
2.2.5. Đánh giá phương pháp
30
2.3. Bàn luận
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT
35
36
3.1 Kết luận
36
3.2. Đề xuất
36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
U V -V is
: Ultraviolet - Visible
USP
: United States Pharmacopoeia - Dược điển Mỹ
BP
: British Pharmacopoeia - Dược điển Anh
JP
: The Japanese Pharmacopoeia - Dược điển Nhật
HPLC
: High - períormance liquid chromatography - sắc ký
lỏng hiệu năng cao
EP
: European Pharmacopoeia - Dược điển châu Âu
ĐẶT VẤN ĐÈ
Tobramycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid thu được từ
môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarỉus. Thuốc có tác dụng diệt khuẩn,
có phổ tác dụng tương tự như Gentamycin nhưng hoạt tính mạnh hơn đối với
phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginosa, thường được chỉ định trong
các b.ệnh nhiễm khuẩn nặng. Cơ chế tác dụng chính xác của thuốc chưa biết
đầy đủ, có lẽ là do sự ức chế tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhạy cảm bằng
cách gắn không thuận nghịch với các tiểu đơn vị 30S của Ribosom.
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều dạng bào chế của Tobramycin
như: Thuốc nhỏ mắt, mỡ tra mắt, thuốc tiêm, bột vô khuẩn pha tiêm...với
nhiều biệt dược khác nhau. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu
làm thuốc cũng như thành phẩm là nhiệm vụ rất quan trọng.
Cũng như các kháng sinh khác trong nhóm aminoglycosid, Tobramycin
không có hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả kiến, vì vậy phương pháp định
lượng phổ biến vẫn là phương pháp vi sinh vật. Phương pháp này mất nhiều
thời gian và có độ chính xác không cao. Dược điển Mỹ USP 28 đã áp dụng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector ƯV-Vis, tạo dẫn chất
trước cột để định lượng Tobramycin, nhưng qui trình tạo dẫn xuất này rất
phức tạp. Gần đây trong EP 2003 hay BP 2005, phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao với detector ampe kế đã được đưa vào sử dụng để thay thế phương
pháp vi sinh vật. Phương pháp này tiến hành nhanh, kết quả tin cậy, song hầu
1
hết các cơ sở kiểm nghiệm trong nước hiện nay không đáp ứng được các điều
kiện định lượng.
Đe mở rộng thêm các phương pháp định lượng Tobramycin, góp phần
làm eơ sở cho công tác kiểm nghiệm thuốc bằng một phương pháp kiểm
nghiệm đơn giản và có độ chính xác cao thay thế phương pháp vi sinh vật
chúng tôi đã tiến hành : “Nghiên cửu định lượng Tobramycin nguyên liệu
bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ khả kiến” với những mục tiêu
sau:
> Khảo sát các điều kiện định lượng và xây dựng phương pháp định
lượng Tobramycìn nguyên liệu.
> Đánh giá phương pháp vừa xây dựng theo các chỉ tiêu: tỉnh đúng,
tỉnh chính xác, tính tuyến tỉnh và tính đặc hiệu của phương pháp.
2
PHÀN I : TÔNG QUAN
1.1. VÀI NÉT VÈ TOBRAMYCIN :
Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid thu được từ môi
trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarỉus hoặc bằng các phương pháp
khác..[l],[12],[2 1 ]
Tên khoa học: 4-0-(3-Amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-2-deoxy6-0-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine.
[1],[12],[21]
Công thức phân tử
: C 18H 37N 5O9
Phân tử lượng
: 467,5
Công thức cấu tạo
:
Tỉnh chất'. Bột trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nước, rất khó tan
trong ethanol 96%, thực tế không tan trong cloroíòrm và ether. [a]D20từ +138
đến +148 (dung dịch 4% trong nước). [1],[6][,12].
Dược lý và cơ chế tác dụng: [1],[7].
3
Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng với
nhiều vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số vi khuẩn Gram dương hiếu khí.
Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số vi khuẩn yếm
khí. Tobramycin rất giống Gentamycin về tính chất vi sinh học và độc tính,
tuy nhiên đặc điểm quan trọng nhất của Tobramycin là có hoạt tính đối với
phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginosa.
Mặc dù cơ chế tác dụng chính xác chưa biết đầy đủ, nhưng có lẽ
Tobramycin ức chế sự tổng họp protein ở các vi khuẩn nhạy cảm bằng cách
gắn không thuận nghịch với các tiểu đơn vị 30S của Ribosom.
C hỉđịnhịl]
Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng,
đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn
huyết do vi khuẩn Gram âm. Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng,
Tobramycin được dùng phối hợp với 1 kháng sinh nhóm beta-lactam.
Trong các bệnh nhiễm khuẩn toàn thân do Pseudomonas spp. gây ra,
Tobramycin có thể dùng phối hợp với 1 kháng sinh nhóm beta-lactam chống
Pseudomonas. Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc
alpha- Streptococcus gây ra có thể dùng Tobramycin phối họp với ampicilin
hoặc benzyl penicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ.
Dạng thuốc và hàm ỉượng:[7]
Thuốc không hấp thu qua đường uống, thường được dùng dưới các
dạng:
Lọ 5ml 0,3% để nhỏ mắt. Tuýp 3,5g mỡ tra mắt 0,3%. Thuốc tiêm: Lọ
20mg/2ml; 60mg/6ml; 80mg/8ml; 80mg/2ml; l,2g/30ml.
Lọ l,2g bột Tobramycin sulphat vô khuẩn để pha tiêm.
4
1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP
•
Được
ÁP DỤNG ĐẺ ĐỊNH LƯỢNG
•
•
•
TOBRAMY CIN:
1.2.1. Phương pháp trong dược điển:
1.2.1.2. Phương pháp vỉ sính vị?/: [13],[20]
Xác định hoạt lực kháng sinh của Tobramycin bằng phương pháp vi
sinh vật theo BP 2000 hay JP14.
a. Chủng vỉ khuấn: Bacillus subtilis ATCC 6633.
b. Môi trường nuôi cấy: Môi trường đặc
c. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng Tobramycin chuẩn,
tương đương khoảng 25 mg (hiỷu lực), hòa tan trong dung dịch đệm phosphat
0,lmol/L, pH 8 thành chính xác 25ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc.
Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 5° c đến 15° c và sử dụng trong vòng
30 ngày. Lấy chình xác một lượng dung dịch chuẩn thích hợp thêm dung dịch
đệm phosphat 0,lmol/L, pH 8 để tạo thành dung dịch mà mỗi ml chứa 8|ig và
2(j,g (theo hiệu lực). Đó chính là những dung dịch chuẩn nồng độ cao và dung
dịch chuẩn nồng độ thấp.
d. Dung dịch thử:
Cân chính xác một lượng Tobramycin, tương đương khoảng 25 mg
(hiệu lực), hòa tan trong dung dịch đệm phosphat 0,lmol/L, pH 8 thành chính
xác 25ml. Lấy c^ình xác một lượng dung dịch thử thích hợp thêm dung dịch
đệm phosphat 0,lmol/L, pH 8 để tạo thành dung dịch mà mỗi ml chứa 8p,g và
2|ig (theo hiệu lực). Đó chính là những dung dịch thử nồng độ cao và dung
dịch thử nồng độ thấp.
1.2.1.2. Phương pháp H PLC 1: [12]
*
Điểu kiện sãc ký:
- Cột styren-divinylbenzen copolymer (4,6 X 250mm, 8|im).
- Nhiệt độ cột:
55°c.
5
•
- Pha động : Hỗn hợp pha trong nước đã loại cacbon dioxyd chứa 5,2g natri
sulfat khan; l,5g natri octansulíònat; 3ml tetrahydroíuran và 50ml dung dịch
kali dihydrophosphat 0,2M đủ 1 lít, đã được chỉnh pH về 3,0 bằng acid
phosphoric loãng.
- Tốc độ dòng: lml/phút.
- Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong nước
đã loại cacbon dioxyd. Tốc độ 0,3ml/phút.
- Detector: Detector amper kế hoặc các thiết bị tương tự. Nhiệt độ detector đặt
ở 35°c.
- Thể tích tiêm: 20 ịj1.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,lmg/ml trong nước.
*
Tiến hành:
Lần lượt tiêm các dung dịch chuẩn và thử. Dựa vào đáp ứng của píc
Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn,
tính lượng Tobramycin có trong chế phẩm.
1.2.1.3. Phương pháp HPLC 2\ [21]
*
Điều kiện sắc ký:
- Cột RP 18 (3,9 mm X 30 cm).
- Pha động : Hòa tan 2,0g tris(hydroxymethyl)aminomethan trong khoảng
800ml nước. Thêm vào dung dịch này 20ml dung dịch acid sulfuric IN, sau
đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000ml, lắc đều. Để nguội rồi lọc qua màng
lọc 0,2|im. Có thể điều chỉnh nếu cần.
- Thuốc thử 2,4-dinitroflourobenzen: Dung dịch 2,4-dinitroflourobenzen 1%
trong ethanol 96%. Dung dịch này nếu bảo quản lạnh có thể sử dụng được
trong vòng 5 ngày sau khi pha.
-
Thuốc
thử
tris(hydroxymethyl)aminomethan:
Pha
dung
dịch
gốc
tris(hydroxymethyl)aminomethan 1,5% trong nước. Chuyển 40ml dung dịch
6
thuốc thử gốc này vào bình định mức 200 ml. Bổ sung dimethyl sulfoxid đến
vạch bằng cách thêm từ từ dimethyl sulíòxid, vừa thêm vừa lắc đều. Dung
dịch thuốc thử này được dùng trong vòng 4 giờ sau khi pha. Nếu bảo quản
lạnh dưới 10° c , dung dịch này có thể được dùng trong vòng 8 giờ sau khi
pha. (Với dung dịch thuốc thử gốc 1,5%, nếu bảo quản lạnh có thể sử dụng
được trong vòng 1 tháng sau khi pha).
- Tốc độ dòng: l,2ml/phút.
- Detector ƯV: 365nm.
- Thể tích tiêm: 20 ịil/phút.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,22 mg/ml trong dung dịch acid
sulfuric 0,004 N.
*Tiểnhành:
-
Các dung dịch chuẩn và thử phải được tạo dẫn xuất với các thuốc thử
2,4-dinitroflourobenzen và tris(hydroxymethyl)aminomethan trước khi tiêm
sắc ký: Hút chính xác 4,0 ml dung dịch chuẩn, dung dịch thử và nước cất vào
các bình định mức 50 ml riêng biệt. Thêm vào mỗi bình 10 ml dung dịch
thuốc thử 2,4 - dinitroflourobenzen và 10 ml dung dịch thuốc thử
tris(hydroxymethyl)aminomethan, lắc đều, đậy nút. Đặt các bình vào trong
cách thủy ở nhiệt độ 60°c ± 2 °c trong 50 phút ± 5 phút. Sau thời gian trên,
lấy các bình ra, để yên 10 phút. Thêm acetonitril vào các bình đến dưới vạch
định mức khoảng 2 ml, để nguội xuống nhiệt độ phòng, sau đó pha loãng tiếp
bằng acetonitril đến vạch, lắc đều: Thu được các dung dịch chuẩn, dung dịch
thử đã tạo dẫn xuất và mẫu trắng. Chú ý phải tiến hành tạo dẫn chất trong
cùng một thời gian và cùng điều kiện đối với tất cả các dung dịch thử nghiệm.
-
Lần lượt tiêm mẫu trắng, các dung dịch chuẩn và thử đã tạo dẫn xuất.
Dựa vào đáp ứng của píc dẫn xuất Tobramycin trong các dung dịch chuẩn,
7
thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng Tobramycin có trong chế
phẩm.
1.2.2. Phương pháp ngoài dược điển:
I.2.2.I.
Định lượng Tobramycin bằng phương pháp vì sình vật theo
tiêu chuẩn cơ sở của một sỗ chế phẩm sản xuất trong nước: [8 ], [9]
a. Chủng vi khuẩn'. Bacillus pumilus NCTC 8241.
b. Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ±0,1:
Dikali hydrophosphat
16,75 g.
Kali dihydrophosphat
0,532g.
Môi trường định lượng:
Cao men bia
3,0 g
Pepton
6,0 g
Casein pancreatic
4,0 g
Glucose
1,0 g
Cao thịt
1,5 g
Thạch
15,0 g
100 ml
Nước cất
8,2 ± 0,2
pH sau khi tiệt trùng
d. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử:
+ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25,0 mg Tobramycin chuấn,
hòa tan trong dung dịch đệm pH 8,0 để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ
chính xác khoảng 1000 IƯ/ml. Dung dịch gốc được bảo quản ở nhiệt độ dưới
25°c.
Từ dung dịch chuẩn gốc này tiếp tục pha loãng với dung dịch đệm
phosphat pH 8,0 để được các dung dịch chuẩn thí nghiệm có nồng độ
Tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml, 20 IU/ml và 40 IU/ml.
8
+ Dung dịch thử (chế phẩm): Hút chính xác 5,0 ml chế phẩm (tương
ứng với khoảng 3mg Tobramycin), thêm lOml dung dịch đệm phosphat pH
8,0, được dung dịch thử gốc có nồng độ khoảng 1000 IƯ/ml. Tiếp tục pha
loãng với dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để được các dung dịch thử có nồng
độ Tobramycin khoảng 10 IU/ml, 20 IƯ/ml và 40 IU/ml.
+ Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp xác định hoạt
lực kháng sinh - Dược điển Việt Nam III.
L2.2.2. Phương pháp quang phổ tử ngoại 1 [19]
Một phương pháp quang phổ rất nhạy và chính xác để định lượng cả
dạng nguyên liệu và dạng thuốc tiêm. Phương pháp này dựa trên cơ sở tạo ra
sản
phẩm
màu
xanh
với
3-methyl-2-benzothiazolinone
hydrazone
hydrochloride và sắt (III) chloride. Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645nm.
Định luật Lambert - Beer được áp dụng trong khoảng nồng độ từ 50 - 500
miu/ml.
1.2.2.3. Phương pháp HPLC 3: [14]
*
Điều kiện sắc kỷ:
- Cột Purospher® STAR RP-18e (4 X 55mm, 3ịj,m, Merck).
- Pha động: Acetonitril - nước (50 : 50).
- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút.
- Dung dịch tạo dẫn xuất: Dung dịch 1-naphtyl isothiocyanat (NITC) trong
pyridin.
- Detector uv : 230 nm.
- Thể tích tiêm: 10 [xl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 5|xg/ml trong nước.
*
Tiến hành:
Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được tạo dẫn xuất với dung dịch
thuốc thử 1-naphtyl isothiocyanat trong pyridin ở 70°c. Lần lượt tiêm các
9
dung dịch chuẩn và thử đã được tạo dẫn xuất. Dựa vào đáp ứng của pic dẫn
xuất Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch
chuẩn, tính lượng Tobramycin có trong chế phẩm.
1.2.2.4. Phương pháp HPLC 4: [17]
*
Điều kiện sắc ký:
- Cột Xterra®RP-18 (2,1
X
250 mm, 5 |j.m).
- Nhiệt độ cột: 30°c.
- Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxid 28 - 30% vào 1 lít
nước Milli-Q®. Sử dụng dung dịch natrỉ hydroxid 2,5 N để chỉnh pH của pha
động A đến 11,0.
- Pha động B: Acetonitril.
- Tiếu hành sắc ký theo chương trình gradient dung môi như sau:
Thời gian (phút)
Pha động A (%)
Pha động B (%)
0
100
0
10
0
100
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.
- Detector khối phổ.
- Thể tích tiêm: 4|il.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 0,35 mg/ml trong nước muối
0,9%.
*
Tiến hành:
Lần lượt tiêm các dung dịch chuẩn và thử. Dựa vào đáp ứng của pic
Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn,
tính lượng Tobramycin có trong chế phẩm.
10
Ngoài các phương pháp nêu trên, người ta cũng đã nghiên cứu phương
pháp định lượng Tobramycin bằng sắc ký lỏng trao đổi anion với detector
amper kế và định lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid bằng sắc ký
lỏng detector huỳnh quang tạo dẫn xuất sau cột.
Các phương pháp định lượng Tobramycin nêu trên thường mất nhiều
thời gian (phương pháp vi sinh vật) hoặc tiến hành rất phức tạp và đòi hỏi
phải có trang thiết bị đặc biệt (các phương pháp HPLC).
Dựa vào cấu trúc của Tobramycin có chứa các đường khử, chúng tôi
nghiên cứu định lượng Tobramycin bằng phương pháp đo phổ hấp thụ vùng
khả kiến.
1.3. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS
1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp định lượng bằng quang phổ
hấp thụ ƯV-Vis. [2],[3],[4],[5],[11],[16],[18]
1.3.1.1. Định luật Lambert-Beer
Chiếu một chùm tia sáng đon sắc có bước sóng X và cường độ I0 qua
dung dịch đồng nhất có nồng độ c, bề dày lớp dung dịch là 1. Khi đi qua dung
dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì
đi qua dung dịch.
Mối quan hệ giữa I và I0 được thể hiện bằng định luật Lambert - Beer.
I = I0 X 1 0'eCI
Với 8 là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc
vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng
chiếu vào dung dịch.
1.3.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert - Beer
+ Chùm tia sáng phải đơn sắc
+ Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp).
11
+ Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang).
+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền dưới tác dụng của ánh
sáng (ƯV-Vis).
1.3.1.3. Sự sai lệch đối với định luật Lambert-Beer
•
0-
•
•
•
+ Sai lệch do máy: (do bộ phận đơn sắc, bộ phận khuếch đại kém) như
do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém.
+ Sai lệch do hóa học:
• Do sự phân ly (ion hóa): thường gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử
chất tan bị phân li, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân li không
như nhau.
• Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác
dạng đơn phân tử.
+ Do phản ứng các chất lạ:
• Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện
tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ
thiếu chất cần định lượng.
• Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết quả
định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng “tạo màu” (tạo khả năng hấp
thụ ánh sáng), phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia
phản ứng.
1.3.1.4. Một số đại lượng thông dụng
+ Đ ộ truyền qua (T-Transm ittance):
Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong
suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa:
_
ĩt
___
-ị ^ q
~ T o~
12
- gC I
Thường T tính ra phần trăm (%). Một chất có T = 1 (hay 100%), nghĩa
là hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong
suốt.
+ Đ ộ hấp thụ (A -A bsorbance):
Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa:
A = l g i = s .c .l
Đối với một chất xác định (có 8 xác định), thường đo trên một loại cốc
đo (có bề dày thông thường là 1 = lcm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với
nồng độ dung dịch:
A = K . c (K = 8.1)
+ Hệ số hấp thụ phần trăm ( EỊ“' ):
Theo công thức A = s.c.l, nếu 1 = lcm,
c=
1% thì:
A = e = EỊ“ '
Vậy E Ị™'chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1% , dùng cốc
đo có bề dày lcm. Với một chất tan xác định, tại một X xác định, EỊồ™là một
hằng số.
+ Hệ số hấp thụ phân tử (skl):
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol, là độ hấp thụ của
dung dịch có nồng độ 1M/1, dùng cốc đo có bề dày lcm.
Cũng như EỊ™, với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác
định (X, dung môi, nhiệt độ,...), Sụ, là một hằng số.
Giữa EỊ™ và
E ìcm
có môi liên hệ: 8^ = —^~ X M
Ở đây M là phân tử gam của chất tan.
1.3.2.
Các kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-
Vis. [2],[3]
13
1.3.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp:
Đo
độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ c
của dung dịch dựa vào
giá trị EỊ™ biết trước (tra cứu).
Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sóng (X)
và mật độ quang A bằng cách :
• Dùng đèn thủy ngân, đèn D 2 (cho một vạch sáng có bước sóng xác
định).
• Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.
• Dùng kính lọc Holmium (có các giá trị Xmax xác định cho trong tài
liệu) để kiểm tra lại máy.
• Dùng dung dịch K2C r0 4 , K 2Cr20 7 tinh khiết quang phổ pha thành
dung dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị Àroax và tìm Amax.
1.3.2.2. Phương pháp so sánh
Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử có nồng độ c x (chưa biết) và
của dung dịch chuẩn có nồng độ Ac (đã biết).
I I I
r
la có:
j*l V
_
C . ' V 1—1
_
^'Í V
t ^
_ = — —>•(Jx— — x(jc
Ac
Cc
Ac
Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc
không được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần
nhau, kết quả càng chính xác.
1.3.2.3. Phương pháp thêm chuẩn so sảnh
Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch cần tìm nồng độ
cx. Thêm một lượng
chất tan a (đã biết) vào dung dịch, đo độ hấp thụ A ’x của dung dịch tạo thành.
Cx
Ta có:
Co + C x - G
14
Vậy nên:
Cx = C0
A x
X
A
X
-
-
Ax
1.3.2.4. Phương pháp đường chuẩn
Pha một dãy dung dịch chuẩn, đo A của chúng ở bước sóng đã chọn,
lập đồ thị của A theo c. Đo Ax của dung dịch trên và xác định c x dựa vào
đường chuẩn. (Hình 1.1)
Trong trường hợp dung dịch không tuân theo định luật Lambert-Beer
(đường chuẩn không thẳng) cần pha nhiều dung dịch chuẩn hơn với nồng độ
gần nhau hơn (khác nhau không quá 10%).
6
c
Hình 1.1. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ
giữa nồng độ và độ hấp thụ quang
theo phương pháp đường chuẩn
Khi xây dựng đường chuẩn, người ta thường sử dụng đường chuẩn
tuyến tính (thẳng) hoặc tìm một đoạn tuyến tính trên đường chuẩn để sử dụng
trong định lượng nếu đường chuẩn cong (phi tuyến, không thẳng).
Đường chuẩn được lập dựa vào các điểm thực nghiệm, bằng phương
pháp bình phương tối thiểu; tìm phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số
15
tương quan r. Trong định lượng, nếu khảo sát được một đoạn đường chuẩn có
hệ số tương quan r > 0,9995 là tốt.
1.3.2.5. Phương pháp thêm đường chuẩn
Đo mật độ quang của dung dịch cần định lượng, rồi thêm vào những
lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn vào dung dịch cần định lượng,
đo mật độ quang của các dung dịch đó. Vẽ đường chuẩn (đồ thị của độ hấp
thụ A theo lượng chất thêm vào). Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành
(nồng độ) cho ta nồng độ của chất cần định lượng. (Hình 1.2)
A
Hình 1.2. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa
nồng độ chuẩn thêm vào với độ hấp thụ
quang theo phương pháp thêm đường chuẩn
1.3.2.6. Phươngphảp chuẩn độ đo quang
+ Nguyên tắc: Phát hiện điểm tương đương bằng phương pháp đo
quang.
16
(chất cần định lượng)
(thuốc thử)
(sản phẩm)
Trong 3 chất trên, ít nhất phải có một chất hấp thụ ánh sáng ở bước
sóng khảo sát.
Tại điểm tương đương, xuất hiện điểm gãy của đồ thị biểu diễn sự biến
thiên của độ hấp thụ A của dung dịch. Trên đồ thị, trục tung chỉ độ hấp thụ A
của dung dịch, trục hoành chỉ lượng thuốc thử cho vào dung dịch cần định
lượng. (Hình 1.3).
A
-----------------* c
Thể tích thuốc thử
Điểm kết thúc
Hình 1.3. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa thể tích thuốc thử và độ
hấp thụ quang theo phương pháp chuẩn độ đo quang.
Điều quan trọng của phương pháp này là tìm được bước sóng thích hợp
để xác định điểm tương đương.
+ Ưu điểm: phương pháp này có ưu điểm nổi bật là vẫn định lượng
được trong một số trường hợp mà các phương pháp khác không áp dụng
được:
• Dung dịch có màu không quá đậm.
• Dung dịch không quá đục.
• Dung dịch không tìm được chỉ thị màu.
• Dung dịch không định lượng được bằng phương pháp chuẩn độ đo
thế.
1.3.2.7. Phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ
Dựa trên tính chất cộng tính của độ hấp thụ ánh sáng ta có:
At = Aj + A2 +...
Với hỗn hợp có hai chất 1 và 2: At = Ai + A2
Lựa chọn các bước sóng Ằ,1 và x2, đo độ hấp thụ A /,, Ati của hỗn hợp ở
hai bước sóng Ằ,1 và %2 đóTại X.ị: A^, = E) 1. Ci + E 2.1-C2
Tại %2- A-tĩ = Ei 2' Ci + E2.2-C2
Các hệ số là các hằng số đã biết, hoặc đã xác định được bằng thực
nghiệm. Giảihệ hai phương trình hai ẩn số trên, ta tính được Ci, c 2.
Với hỗn họp gồm có 3 chất: đo độ hấp thụ của hỗn hợp tại 3 bước sóng
khác nhau, rồi giải hệ 3 phương trình 3 ẩn. Có thể đo mật độ quang (độ hấp
thụ) tại nhiều bước sóng hơn số chất cần định lượng (ví dụ đo tại 4-5 bước
sóng khi định lượng hỗn họp gồm 2-3 chất) rồi tính kết quả.
Chú ý: Trong hỗn hợp 2 chất, tại bước sóng nào đó mà có một chất
không hấp thụ ánh sáng hoặc hấp thụ không đáng kể thì ta có thể pha loãng
dung dịch rồi đo A như khi đo một chất.
Ví dụ: hỗn hợp Pethidin và Chlorocresol có:
Pethidin: E 2 57 = 7,3
E 2 79 - 0
C hlorocresol: E 2 57 = 20 E 2 79 = 105
Với E257, E279 lần lượt là độ hấp thụ của Pethidin và Chlorocresol ở
bước sóng 257nm và 279nm.
Như vậy nếu ta đo A ở 279nm, xác định được hàm lượng chlorocresol,
đo ở 257nm, tính hiệu, được hàm lượng Pethidin.
18
1.3.3.
ư u nhược điểm của phương pháp định lượng bằng quang
phổ hấp thụ UV-Vis
1.3.3.1. ưu điểm:
+ Độ chính xác của phương pháp khá cao.
+ Sai số tương đối của phương pháp nhỏ, thường vào khoảng 0,5-1%.
+ Độ nhạy của phương pháp giúp ta có thể phân tích được các dung
dịch loãng cỡ 10'4
rất thích hợp cho các phép phân tích vết (phân tích
độc chất).
+ Thời gian phân tích nhanh chóng, chỉ cần 5- 10 phút có thể cho biết
ngay kết quả.
+ Kỹ thuật thao tác đon giản, máy móc ngày càng hoàn thiện, gọn nhẹ,
trình độ tự động hóa, tin học hóa cao.
+ Với một số trường hợp hỗn họp 2 thành phần có khả năng hấp thụ
ánh sáng tử ngoại, có cực đại hấp thụ khác nhau và thành phần này không hấp
thụ quang ở bước sóng hấp thụ cực đại của thành phần kia, ta có thể dùng
phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis để định lượng đồng thời hai thành
phần mà không cần chiết tách.
13.3.2. Nhược điểm\
Với trường hợp hỗn họp nhiều thành phần không thể định lượng đồng
thởi, cần quá trình chiết tách phức tạp mới đo quang từng thành phần riêng rẽ,
quá trình này tốn kém dung môi, hóa chất, dễ xảy ra sai số, dung môi ít nhiều
độc hại và yêu cầu người tiến hành có tay nghề ổn định.
19
PHẢN 2: T H ự C NGHIỆM VÀ KÉT QUÃ
2.1. NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1.1. Nội dung nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu, khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp
định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ khả
kiến trên máy quang phổ thông thường.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
2.1.2.1. Dụng cụ:
- Cân phân tích hiện số Mettler AB 204 (Toledo - Thụy Sĩ) độ chính xác
0,1 mg.
- Máy đo quang phổ UV/VIS Lambda EZ 210 (Perkin Elmer- Đức).
- Bình định mức lOml, 20ml, lOOml.
- Pipet chính xác các loại, ống đong.
- Nồi đun cách thủy.
- Cốc có m ỏ, ống nghiệm .
2.1.2.2. Hóa chất:
- Tobramycin dạng nguyên liệu do bộ môn Hóa Dược cung cấp.
- Dung dịch NaOH 0,1 N; 0,01 N.
- Thuốc tím (KM n04) dạng bột nguyên liệu.
- Nước cất 2 lần.
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
*
Khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định lượng
Tobramycin.
20
