khảo sát sự lưu hành của escherichia coli trên gà khỏe ở hộ chăn nuôi tại phường thới an đông– quận bình thủy – thành phố cần thơ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRỊNH HUỲNH NHẬT TOÀN

KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA
ESCHERICHIA COLI TRÊN GÀ KHỎE Ở HỘ
CHĂN NUÔI TẠI PHƢỜNG THỚI AN ĐÔNG–
QUẬN BÌNH THỦY – THÀNH PHỐ CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y

CẦN THƠ - 2013


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y

KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA
ESCHERICHIA COLI TRÊN GÀ KHỎE Ở HỘ
CHĂN NUÔI TẠI PHƢỜNG THỚI AN ĐÔNG–
QUẬN BÌNH THỦY – THÀNH PHỐ CẦN THƠ

Cán bộ hướng dẫn :
ThS. Bùi Thị Lê Minh

Sinh viên thực hiện :

Trịnh Huỳnh Nhật Toàn
MSSV : LT11670
Lớp : CN1167L1

Cần Thơ- 2013


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
Đề tài “Khảo sát sự lƣu hành của Escherichia coli trên gà khỏe ở hộ
chăn nuôi tại Phƣờng Thới An Đông – Quận Bình Thủy – Thành Phố Cần
Thơ”.
Do sinh viên Trịnh Huỳnh Nhật Toàn thực hiện tại Bộ môn Thú y, Khoa
Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ từ tháng 08 năm
2013 đến tháng 12 năm 2013.
Cần Thơ, ngày…tháng…. năm…

Cần Thơ, ngày….tháng….năm….

Duyệt Bộ Môn

Duyệt giáo viên hƣớng dẫn

Bùi Thị Lê Minh

Cần Thơ, ngày….tháng…..năm…..
Duyệt Khoa Nông Nghiệp& SHƢD

LỜI CẢM TẠ

Trong thời gian học tập và rèn luyện dƣới mái trƣờng Đại học Cần Thơ,
thầy cô đã dành bao tâm huyết để truyền đạt những kiến thức quý báu cho chúng
tôi vững bƣớc vào đời. Hôm nay ƣớc mơ của tôi đã thành sự thật, với sự phấn đấu
của bản thân tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Trong suốt quá trình học tập
cũng nhƣ thời gian thực hiện đề tài tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ của rất nhiều
ngƣời. Trong giây phút này đây tôi không biết nói gì hơn ngoài lời cảm ơn chân
thành đến những ngƣời đã quan tâm, lo lắng và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
Xin chân thành cảm ơn:
Cô Bùi Thị Lê Minh – ngƣời đã hết lòng chỉ bảo, động viên tôi hoàn thành
luận văn tốt nghiệp.
Thầy Trần Ngọc Bích đã luôn động viên và hết lòng chỉ bảo, dìu dắt tôi
trong suốt thời gian đại học.
Quý thầy cô Bộ môn Thú Y, Bộ môn Chăn Nuôi đã tận tình truyền đạt kiến
thức cũng nhƣ những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt những năm tháng
qua.
Cha mẹ tôi – ngƣời đã nuôi nấng, dạy dỗ và luôn đặt niềm tin, hy vọng vào
tôi để tôi có đƣợc ngày hôm nay.
Anh chị tôi – ngƣời luôn động viên, an ủi, luôn bên cạnh tôi những lúc khó
khăn nhất.
Các bạn trong và ngoài lớp đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn!


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu,

kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa từng đƣợc ai
công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trƣớc đây.

Tác giả luận văn

Trịnh Huỳnh Nhật Toàn


MỤC LỤC
Trang duyệt của Hội đồng Khoa ........................................................................i
Lời cảm tạ .........................................................................................................ii
Lời cam đoan ....................................................................................................iii
Mục lục .............................................................................................................iv
Danh mục chữ viết tắc .......................................................................................vi
Danh mục sơ đồ - hình ......................................................................................vii
Danh mục bảng - biểu đồ.................................................................................. viii
Tóm lƣợc ...........................................................................................................ix
CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................1
CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN .......................................................................2
2.1 Đại cƣơng về vi khuẩn Escherichia Coli ......................................................2
2.1.1 Đặc điểm hình thái....................................................................................4
2.1.2 Đặc tính nuôi cấy ......................................................................................4
2.1.3 Đặc tính sinh hóa ......................................................................................5
2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E.coli ..............................................6
2.1.5 Độc tố vi khuẩn ........................................................................................6
2.1.6 Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của vi khuẩn .....................................6
2.2 Kháng sinh ..................................................................................................7
2.3 Tình hình nhiễm E.coli trên gà.....................................................................8
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ................9
3.1 Nội dung nghiên cứu ...................................................................................9

3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu ...............................................................................9
3.2.1 Thời gian, địa điểm và đối tƣợng ..............................................................9
3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm .........................................................9
3.2.3 Hóa chất và môi trƣờng thí nghiệm ...........................................................9
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................10


3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu ...............................................................................10
3.3.2 Phƣơng pháp pha loãng mẫu .....................................................................10
3.3.3 Phƣơng pháp định lƣợng E.coli.................................................................11
3.3.4 Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ ...............................................................14
3.3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................15
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ..........................................................16
4.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli trên gà ..............................................................16
4.1.1 Tỉ lệ nhiễm E.coli trên gà thịt ...................................................................16
4.1.2 So sánh tỉ lệ nhiễm E.coli trên gà thịt và gà đẻ ..........................................16
4.2 Mật độ nhiễm E.coli trên gà thịt và gà đẻ .....................................................17
4.3 Kết quả làm kháng sinh đồ ..........................................................................17
4.4 Tính đa kháng của E.coli đối với các loại kháng sinh ...................................19
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................20
5.1 Kết luận .......................................................................................................20
5.2 Đề nghị ........................................................................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................21
PHỤ CHƢƠNG ................................................................................................ 23


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
E.coli: Escherichia coli
APEC: Avian pathogenic E.coli
ST: Heat stable

LT: Heat labile
TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam


DANH MỤC SƠ ĐỒ - HÌNH
Danh mục sơ đồ
Sơ đồ 1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu ................................................................ 10
Sơ đồ 2. Quy trình định lƣợng vi khuẩn E.coli (Theo TCVN5155-90) ...............13
Danh mục hình
Hình 1. Túi khí chứa nhiều dịch viêm ................................................................ 2
Hình 2. Màng fibrin phủ đầy quanh tim .............................................................3
Hình 3. Viêm màng bao tim và viêm màng bụng ...............................................3
Hình 4. Viêm rốn và lòng đỏ không tiêu ............................................................3
Hình 5. Vi khuẩn E.coli trên môi trƣờng MC.....................................................11
Hình 6. Kết quả sinh hóa của E.coli ...................................................................12
Hình 7. Kết quả làm kháng sinh đồ ....................................................................17


DANH MỤC BẢNG – BIỂU ĐỒ
Danh mục bảng
Bảng 1. Số lƣợng mẫu thu thập..........................................................................10
Bảng 2. Bảng tiêu chuẩn đƣờng kính vòng vô khuẩn của kháng sinh .................14
Bảng 3. Kết quả tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli trên gà thịt theo lứa tuổi ................16
Bảng 4. Kết quả tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli trên gà thịt và gà đẻ .......................16
Bảng 5. Kết quả mật độ nhiễm E.coli trên gà thịt và gà đẻ .................................17
Bảng 6. Kết quả kháng sinh đồ của các mẫu E.coli phân lập đƣợc .....................18
Bảng 7. Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các chủng E.coli phân lập ..............19
Danh mục biểu đồ
Biểu đồ 1. Kết quả kháng sinh đồ của các mẫu E.coli phân lập..........................19

TÓM LƢỢC
Đề tài “Khảo sát sự lưu hành của Escherichia coli trên gà khỏe ở hộ chăn
nuôi tại Phường Thới An Đông – Quận Bình Thủy – Thành Phố Cần Thơ” được
thực hiện từ tháng 08 đến tháng 12/2013 trên 56 mẫu phân gà ở trạng thái khỏe
mạnh, trong đó bao gồm 20 mẫu phân gà đẻ và 36 mẫu phân gà thịt ở các lứa
tuổi khác nhau. Sau khi lấy mẫu về chúng tôi tiến hành phân tích định lượng theo
TCVN 5155-90 và thử độ nhạy của một số loại kháng sinh đối với các mẫu phân
lập được. Kết quả phân tích định lượng thu được là tỷ lệ nhiễm E.coli trên phân
gà 78,57%. Mật độ nhiễm 7,2 x 106 - 9,6 x 106 tùy đối tượng. Kháng sinh đồ thu
được cho biết E.coli nhạy cảm với các kháng sinh Norfloxacin (72,72%),
Amoxicillin/ clavulanic acid (63,63%) và đề kháng mạnh với các kháng sinh
Amoxcillin (88,63%), Ampicilline (59,09). Xét về tính đề kháng kháng sinh thì
một số vi khuẩn có thể đề kháng cùng lúc từ 2 đến 8 loại kháng sinh khác nhau,
trong đó số vi khuẩn đề kháng cùng lúc 6 loại kháng sinh chiếm đa số các mẫu
phân lập được (31,82%) và số mẫu kháng lại 2 và 3 loại kháng sinh chiếm tỷ lệ
nhỏ nhất (2,27%).


CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Trần Cẩm Vân (2001), vi khuẩn E.coli thƣờng cƣ ngụ sẵn trong đƣờng
tiêu hóa của các loại gia cầm ở mọi lứa tuổi với tỷ lệ cao, ở trong ruột chúng sống
đối kháng với một số vi khuẩn khác nhƣ Salmonella và Shigella nhờ có khả năng
tạo ra một loại chất ức chế có tên là Colixin. Chúng có khả năng tổng hợp một số
vitamin thuộc nhóm B, E và K. Vì thế khi không gây bệnh chúng có lợi cho
đƣờng ruột nhờ hạn chế đƣợc một số vi khuẩn khác, giữ thế cân bằng sinh thái
trong ruột và sinh tổng hợp một số vitamin, tuy nhiên khi gặp điều kiện thuận lợi
vi khuẩn sẽ phát triển mạnh hơn và gây bệnh cho đàn gia cầm (trích dẫn bởi Phan
Chí Thiên, 2011). E.coli gây bệnh trên gia cầm với nhiều thể bệnh khác nhau,
ngoài các serotype chỉ gây bệnh trên gia cầm thì E.coli còn có chủng O157:H7 có

thể lây lan từ gia cầm qua con ngƣời (Nguyễn Đức Hiền, 2009). Vì vậy, việc hiểu
biết về tỉ lệ nhiễm và mật độ nhiễm của vi khuẩn E.coli trên đàn gia cầm khỏe để
có thể giúp chúng ta ngăn ngừa mầm bệnh E.coli gây bệnh cho đàn gia cầm.
Xuất phát từ tình hình thực tế trên đề tài “Khảo sát sự lƣu hành của
Escherichia coli trên gà khỏe ở hộ chăn nuôi tại Phƣờng Thới An Đông –
Quận Bình Thủy – Thành Phố Cần Thơ” đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu:
- Phân lập vi khuẩn E.coli trên phân gà bằng phƣơng pháp định lƣợng theo
TCVN 5155-90 để xác định tỉ lệ và mật độ nhiễm E.coli trên gà.
- Kiểm tra độ nhạy của kháng sinh đối với các chủng E.coli phân lập đƣợc.


CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 Đại cƣơng về vi khuẩn E.coli
E.coli đƣợc mô tả lần đầu tiên năm 1885 do bác sĩ ngƣời Đức tên Thoedore
Escherich, nó đƣợc xem là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở ngƣời và động vật.
Nguồn gốc tên gọi này do Escherich phát hiện từ trong tã lót của trẻ em đƣợc
công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune. Chỉ 4 năm sau vi khuẩn
này đƣợc giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân ngƣời có công
khám phá. Tuy nhiên nó đƣợc gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và
Bacterium coli vào một năm sau đó. Sau nhiều kiểu gọi đến năm 1991 vi khuẩn
đƣợc định danh thống nhất toàn cầu là Eschrichia coli ().
Vi khuẩn E.coli gây nhiễm khuẩn huyết đƣợc mô tả lần đầu vào năm 1907
trên gà, gây bệnh viêm ruột đƣợc mô tả và phân lập từ năm 1923. Giữa năm 1938
và 1956 E.coli đƣợc phân lập trong các bệnh có liên quan nhƣ viêm rốn, viêm tế
bào, hội chứng sƣng đầu, bệnh tiêu chảy, viêm âm đạo ở gia cầm mái, viêm màng
bụng, viêm vòi trứng, viêm túi khí, viêm khớp, áp xe bàn chân, viêm da và các
thể gây nhiễm trùng huyết (thể toàn thân, thể hô hấp, thể viêm ruột, thể gia cầm
mới nở và thể cấp tính ở gà đẻ trứng), ngoài ra còn có các di chứng ở các gia cầm
sau khi hồi phục do nhiễm trùng huyết nhƣ viêm màng não, viêm mắt, Hjarre
(bệnh u hạt coli ), viêm khớp và sƣng màng khớp (Nguyễn Đức Hiền, 2009).

Hình 1. Túi khí chứa nhiều dịch viêm
( />

Hình 2. Màng fibrin phủ đầy quanh tim.

Hình 3. Viêm màng bao tim và viêm màng bụng
( />
Hình 4. Viêm rốn và lòng đỏ không tiêu
( />

2.1.1 Đặc điểm hình thái
Theo Nguyễn Nhƣ Thanh (1997), E.coli là một loại trực khuẩn hình gậy
ngắn, kích thƣớc 2-3 μm x 0,6 μm. Trong cơ thể trực khuẩn có hình cầu đứng
riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi trong môi trƣờng nuôi cấy còn thấy
những trực khuẩn dài 4-8 μm, những loại này thƣờng gặp trong canh khuẩn già.
Phần lớn E.coli di động do có lông ở xung quanh thân nhƣng một số không thấy
di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, bắt màu Gram âm, có thể bắt màu toàn
thân hoặc sẫm ở hai đầu khoảng giữa nhạt hơn, có thể hình thành giáp mô khi gặp
môi trƣờng dinh dƣỡng tốt, nhƣng soi tƣơi có thể không thấy đƣợc. Nếu cố định
bằng axit osmic rồi quan sát dƣới kính hiển vi thấy tế bào E.coli có nhân, đó là
một khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng.
Theo Rea và Fleming (1994), trên thạch dinh dƣỡng chúng tạo ra khuẩn lạc
từ trơn láng (Smooth= S) đến sần sùi (Rough= R) hoặc dạng nhầy (Mucoid= M),
đƣờng kính từ 1,5-3 mm. Dạng S thì hơi lồi, ƣớt với bề mặt bóng láng, rìa khuẩn
lạc nguyên vẹn và tan dễ dàng trong nƣớc muối sinh lý. Dạng R thì khô và khó
tan trong nƣớc muối sinh lý. Dạng S có chuỗi polysaccharide là một phần của
chuỗi lipopolysaccharide ở màng ngoài vi khuẩn. Trong khi dạng R thì chuỗi
polysaccharide mất đi do đột biến cho nên chúng xuất hiện khuẩn lạc khô và nhăn
trên thạch (Trích dẫn của Phan Chí Thiên, 2011).

2.1.2 Đặc tính nuôi cấy
Theo Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv (1997), E.coli phát triển dễ dàng trên các
môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có
thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 5-40 oC, thích hợp là 37oC; pH 7,2- 7,4, phát tiển đƣợc
ở pH 5,5-8. Trên môi trƣờng nƣớc thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trƣờng rất đục,
có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi
trƣờng, môi trƣờng màu phân thối. Trên môi trƣờng Meller Kauffman và môi
trƣờng Malasit, E.coli không mọc. Trên môi trƣờng Endo, E.coli có khuẩn lạc
màu đỏ, có ánh kim hoặc không có ánh kim (Trích dẫn của Nguyễn Quốc Cƣờng,
2010).
Theo Lê Đình Phùng (1997), trên môi trƣờng DA (Desoxycholate Agar):
E.coli có khuẩn lạc màu đỏ, dẹt, tròn và khô đƣờng kính 0,5mm. Trên môi trƣờng
EMB (Eosin Methylen Blue Agar) khuẩn lạc tròn, bóng, màu tím đen, có ánh
kim. Trên môi trƣờng MC (MacConkey Agar) vi khuẩn E.coli hình thành khuẩn
lạc to, tròn đều, màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2-3mm.


Theo Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1977), trên môi trƣờng NA (Nutrient Agar) và
TSA (Tripticase Soy Agar) qua 18-24 giờ trong tủ ấm 37oC, hình thành khuẩn lạc
tròn ƣớt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đƣờng kính 2-3mm (Trích dẫn
của Phan Chí Thiên, 2011).
2.1.3 Đặc tính sinh hóa
Theo Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv (1997), vi khuẩn E.coli đƣợc định danh
bằng phản ứng sinh hóa qua các môi trƣờng Indol (Trypton Agar), MR (Methyl
Red), VP (Voges – Proskauer), KIA (Kligler Iron Agar), Simmons Citrate…
Indole: Triptophan là một axit amin có thể bị oxi hóa bởi sinh vật có hệ men
trytphanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc Indole. Nếu trong môi trƣờng có
triptophan, E.coli sẽ li giải Tritophan thành Indole. Để nhận biết Indole ngƣời ta
nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, hợp chất Indole với thuốc thử Kovacs có màu đỏ.
Methyl Red: thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác

biệt về khả năng tạo và duy trì các sản phẩm biến dƣỡng có tính axit bền trong
môi trƣờng trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị methyl red giúp phân biệt
nồng độ H+ hiện diện trong môi trƣờng sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ
thị này thay đổi khác nhau tùy vùng pH hay nồng độ ion H+: đỏ khi pH thấp hơn
4,4; màu cam khi pH 5,0- 5,8 và màu vàng khi pH trên 6,0. Nồng độ ion H+ phụ
thuộc vào tỉ lệ CO2 , H2 và con đƣờng chuyển hóa đƣờng của từng vi sinh vật.
Trong môi trƣờng glucose, E.coli tạo môi trƣờng có H+ cao (pH<4,5) cho thuốc
thử Methyl Red vào môi trƣờng có màu đỏ → MR +.
Theo Nguyễn Thanh Bảo và ctv (2004), đối với môi trƣờng Vogesprokauer(VP) tùy loại enzyme vi khuẩn có đƣợc mà quá trình lên men glucose sẽ
cho sản phẩm cuối cùng khác nhau. Một trong số đó là aceton sẽ tạo phức màu đỏ
với thuốc thử α- naphthol và KOH. E.coli có VP âm tính (không có màu đỏ).
Citrate: trong môi trƣờng Simmon citrate, nguồn cacbon duy nhất là citrate,
vi khuẩn sử dụng citrate sẽ kiềm hóa môi trƣờng làm đổi màu từ màu xanh lục
sang xanh lơ E.coli có phản ứng citrate âm tính.
E.coli lên men sinh hơi các loại đƣờng glucoz, mantoz, galactoz, levuloz,
lactoz, fructoz. Có thể có lên men hoặc không lên men các đƣờng nhƣ
Saccharose, Rafinose, Slixin, Esculin, Duxit, Glycerol. Nhƣng nó không thể lên
men các loại đƣờng nhƣ: Dextrin, Amidon, Glycoren, Inosit, Xenlobiose.


Tất cả E.coli đều lên men đƣờng lactoz nhanh và sinh hơi, đây là đặc điểm
quan trọng để phân biệt E.coli và Salmonella (Trích dẫn của Phan Chí Thiên,
2011).
2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E.coli
Theo Lƣu Hữu Mãnh (2009), E.coli có các loại kháng nguyên sau:
- Kháng nguyên O: kháng nguyên thân, ký hiệu bằng số học, thí dụ: O133;
Kháng nguyên H: kháng nguyên lông, ký hiệu bằng số, thí dụ: H2; Kháng nguyên
K: kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ bọc. Trong kháng nguyên K còn
các loại kháng nguyên L, A, B nên tạo thành nhiều type huyết thanh khác nhau.
Phần lớn E.coli có kháng nguyên K bao phủ kín kháng nguyên O nên khi còn

sống vi khuẩn không gây ngƣng kết với kháng nguyên O tƣơng ứng.
Ngoài ra theo Nguyễn Đức Hiền (2009) còn có kháng nguyên bám dính ký
hiệu là kháng nguyên F.
2.1.5 Độc tố vi khuẩn
Theo Nguyễn Đức Hiền (2009), độc tố là một thành phần cấu trúc của tế bào
vi khuẩn. Độc tố E.coli gây bệnh ở loài gia cầm thì ít độc hơn ở loài hữu nhủ. Sự
khác nhau có thể do sự sản sinh ít độc tố hơn ở gia cầm hoặc có thể do không tìm
ra do sử dụng test thử của chủng gây bệnh ở loài hữu nhủ. Độc tố đƣợc xác định
theo loài vi khuẩn gây bệnh.
- Enterotoxin: gồm 2 loại là chịu nhiệt (ST: heat stable) và không chịu nhiệt
(LT: heat labile). Là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy cấp tính.
- Verotoxin (gồm VT1, VT2 và VT2v): độc tố này tƣơng tự nhƣ Shiga-toxin
của vi khuẩn Shigella dysenteriae type 1 gây xuất huyết tiêu hóa, phổi, thận và
tác động đến hệ thần kinh.
- Necrotoxin: gồm CNF1 và CNF2 là độc tố gây hoại tử.
2.1.6 Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của vi khuẩn
E.coli không chịu đƣợc nhiệt độ cao, đun 55 oC chết trong 1 giờ; 60 oC chết
trong 30 phút, 100oC chết ngay. Ở môi trƣờng ngoài các chủng E.coli độc có thể
tồn tại đến 4 tháng. Các chất sát trùng thông thƣờng diệt đƣợc E.coli: acid phenic,
biclorua thủy ngân, formol, hydroperoxid 0,1% diệt vi khuẩn sau 5 phút (Lƣu
Hữu Mãnh, 2009).


Hầu hết các loài gia cầm bao gồm gà vịt, chim cút, đà điểu…..đều cảm
nhiễm tự nhiên với E.coli. Hầu hết các chủng E.coli phân lập từ gia cầm chỉ gây
bệnh cho gia cầm, ít nguy hại đến ngƣời và các động vật khác nhƣ: O1, O2, O35,
O78, O18, O81, O115, O116 và O132. Tuy nhiên loài gia cầm cũng mẫn cảm với
chủng E.coli O157:H7 là một chủng sinh độc tố Shiga gây hại cho ngƣời (Nguyễn
Đức Hiền, 2009).
Trong đƣờng tiêu hóa E.coli chiếm tỉ lệ cao nhất trong số vi khuẩn hiếu khí

(khoảng 80%). Tuy nhiên, E.coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó
đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đƣờng tiết niệu, viêm đƣờng
mật, đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E.coli có thể
gây nhiều bệnh khác nhƣ viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thƣơng. Theo báo cáo
của chƣơng trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh
thƣờng gặp (1988- 1994) thì E.coli đứng thứ hai (sau S. aureus) về tỉ lệ phân lập
đƣợc từ các loại bệnh phẩm ở nƣớc ta (Viện sốt rét ký sinh trùng – côn trùng Quy
Nhơn).
Theo Trần Cẩm Vân (2001), bình thƣờng E.coli sống trong ruột nhƣng
không gây bệnh. Khi cơ thể suy yếu một số chủng trở nên gây bệnh. E.coli không
chỉ gây bệnh đƣờng ruột nhƣ tiêu chảy, kiết lỵ mà còn có thể gây một số bệnh
khác nhƣ viêm phế quản, viêm màng phổi...
Theo Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1997), bệnh do trực khuẩn E.coli có thể xảy ra
nhƣ một bệnh truyền nhiễm kế phát trên cơ thể thiếu vitamin và mắc các bệnh do
virus và kí sinh trùng. E.coli thƣờng gây bệnh cho súc vật mới đẻ từ 2-3 ngày
hoặc 4-8 ngày, gây bệnh đƣờng ruột cho ngựa, bê, lợn con, cừu con, gia cầm con.
Ở gia cầm (gà, vịt, bồ câu) phân xanh lá cây rất hôi thối, có khi viêm kết mạc
mắt, viêm cuống phổi, viêm phổi, viêm niêm mạc mũi làm gia cầm thở khó
(Trích dẫn của Phan Chí Thiên, 2011).
Theo Lê Hồng Mận (1999), vi khuẩn E.coli gây bệnh trên gà là nhóm APEC
(Avian pathogenic E.coli) thuộc các serotype O1, O2, O78 gây bệnh ở đƣờng ruột
thƣờng là do kết hợp với yếu tố ngoại cảnh và nhân tố mở đƣờng (Trích dẫn của
Nguyễn Quốc Cƣờng, 2010).
2.2 Kháng sinh
Theo Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1977), chất kháng sinh là những chất hóa học do
sinh vật bài tiết ra hoặc do tổng hợp hóa học, có khả năng ức chế sự phát triển của


vi sinh vật hay tiêu diệt vi khuẩn hay vi sinh vật khác (Trích dẫn của Phan Chí
Thiên, 2011).

Các chủng vi khuẩn này có tính kháng kháng sinh cao và đề kháng đồng
thời từ 2 đến 14 loại kháng sinh khác nhau. Vi khuẩn E. coli có tỷ lệ kháng
Amoxicilline (90,5%), Ciprofloxacin (86,4%) và 85% các kháng sinh Ticarcillin,
Trimethoprime-sulfamethoxazol và Norfloxacine (Viện Pasteur TP. HCM).
Một nghiên cứu gần đây trên gà cho thấy kháng sinh mẫn cảm tốt với E. coli
là Ceftriaxone (97,73%), Cefotaxime (95,45%), Colistin (93,18%), Amoxicillin /
Clavulanic acid (81.82%) và Cephalexin (72,73%) (Lƣu Hữu Mãnh và Đỗ Võ
Anh Khoa, 2012).
2.3 Tình hình nhiễm E.coli trên gà
Theo Nguyễn Xuân Bình (1991- 1993), khảo sát về bệnh E.coli trên gà ở
Long An cho thấy 30- 40% bị nhiễm bệnh, chết là 5- 10% và và giảm đẻ 3050%.
Nguyễn Thị Ánh Tuyết (1995), bƣớc đầu phân lập vi khuẩn E.coli trên túi
khí và phân gà có triệu chứng hô hấp ở Thủ Đức và một số vùng lân cận cho thấy
tỉ lệ nhiễm trên phân gà là 67,80%.
Theo Maryvonne (1999), trong 1 gram phân của gia cầm bình thƣờng có
khoảng 104 - 107 vi khuẩn E.coli (Trích dẫn của Nguyễn Văn Hiệp, 2000).
Nguyễn Văn Bình (2004), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E.coli trên
phân và trứng gà ác ở một số trại giống thuộc Thành Phố Hồ Chí Minh với tỷ lệ
nhiễm trên phân là 75%.
Trƣơng Hà Thái (2009), nghiên cứu bệnh trực khuẩn E.coli ở một số giống
gà nuôi công nghiệp hƣớng thịt với kết quả ở gà Lƣơng Phƣợng nhiễm 9,26% và
Ross 308 là 12,36% (Trích dẫn của Trƣơng Phƣớc Đức, 2010).
Phần lớn gà bị bệnh tiêu chảy là do sự nhiễm E. coli (74-87%). Tỉ lệ nhiễm
E. coli cao nhất ở giai đoạn 0-2 tuần tuổi (87%), có khuynh hƣớng giảm từ 2-4
tuần tuổi (74%) và tăng trở lại ở 4-6 tuần tuổi (81%) (Lƣu Hữu Mãnh và Đỗ Võ
Anh Khoa, 2012).


CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Nội dung nghiên cứu

Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn E.coli trên phân gà bằng phƣơng pháp định
lƣợng theo TCVN 5155-90 để xác định tỉ lệ và mật độ nhiễm E.coli trên gà.
Kiểm tra độ nhạy của kháng sinh đối với các chủng E.coli phân lập đƣợc.
3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013.
Địa điểm thu mẫu: mẫu đƣợc lấy tại một số hộ nuôi gà thuộc địa bàn
Phƣờng Thới An Đông – Quận Bình Thủy - Thành Phố Cần Thơ.
Địa điểm phân tích mẫu: tại phòng vi trùng và miễn dịch của Bộ Môn Thú
Y, Khoa Nông Nghiệp & SHƢD, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Đối tƣợng nghiên cứu: phân gà thịt (ở 3 lứa tuổi: dƣới 1 tháng tuổi, 1-2
tháng tuổi, trên 2 tháng tuổi) và phân gà đẻ.
3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm
Ống đong các loại 50ml, 500ml,…máy autoclave, tủ sấy vô trùng, tủ ấm, tủ
sấy khô, bếp đun cách thủy, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que trang, đèn cồn,
pipet, micropipet các loại, bình tam giác, cốc thủy tinh, bình định mức, cân điện
tử, kéo, kẹp, tampon vô trùng, đũa thủy tinh, thƣớc đo vòng vô khuẩn, thùng trữ
lạnh, túi nylon, khẩu trang, găng tay và một số dụng cụ khác.
3.2.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm
Hóa chất sử dụng: cồn 70o, 90o, nƣớc cất, Natri clorua, thuốc thử VP1, VP2,
Methyl Red, Kovacs, Bacl2.2H2O 1,175%, H2SO4 1%...
Các môi trƣờng sử dụng: Mac Conkey Agar (MC), Nutrient Agar (NA),
Nutrient Broth (NB), Simmons Citrate Agar, Voges Proskauer (VP), Methyl Red
(MR), Trypton Water (Indol), Glycerol, MHA (Muller- Hilton)…
Các kháng sinh sử dụng: Kanamycin (Kn), Amoxicillin (Ax), Gentamicin
(Ge), Amoxicillin/ clavulanic acid (Ac), Norfloxacin (Nr), Tetracycline (Te),
Cefuroxime (Cu), Trimethoprime/ sulfamethoxazol (Bt), Doxycycline (Dx),
Cefaclor (Cr), Ampicillin (Am), Amikacin (Ak), Streptomycin (Sm).

3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu vật thí nghiệm là mẫu phân nguyên (phân gà vừa đi tiêu) của gà đẻ
khỏe mạnh, gà thịt khỏe mạnh ở 3 lứa tuổi (dƣới 1 tháng, 1-2 tháng và trên 2
tháng tuổi) ở một số hộ chăn nuôi tại Phƣờng Thới An Đông- Quận Bình ThủyTP Cần Thơ. Tổng số mẫu thu thập là 56 mẫu. Mẫu sau khi thu thập đƣợc cho
vào túi nylon vô trùng và trữ lạnh trong quá trình vận chuyển về phòng thí
nghiệm để phân tích.
Bảng 1. Số lƣợng mẫu thu thập
Đối tƣợng

Số mẫu (con)

Gà thịt dƣới 1 tháng tuổi

12

Gà thịt 1 – 2 tháng tuổi

12

Gà thịt trên 2 tháng tuổi

12

Gà đẻ

20

Tổng cộng

56

3.3.2 Phương pháp pha loãng mẫu
Mẫu sau khi đƣợc lấy về tiến hành nuôi cấy phân lập vi khuẩn E.coli ngay
trong ngày. Cân chính xác 1 gram mẫu để đồng nhất với 9ml nƣớc muối sinh lý
9‰ vô trùng ta sẽ có mẫu với độ pha loãng 10 -1. Tiếp tục tiến hành pha loãng đến
các nồng độ 10-5.
1g phân

1ml

1ml

1ml

1ml

9 ml

9 ml

9 ml

9 ml

9 ml

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Sơ đồ 1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu


3.3.3 Phương pháp định lượng E.coli
Nuôi cấy và phân lập E.coli bằng phƣơng pháp định lƣợng theo TCVN
5155-90. Sau khi pha loãng mẫu, chúng tôi chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp,
mỗi nồng độ chang lên 2 đĩa môi trƣờng MC. Khi chang xong đem ủ tủ ấm 37oC
trong 24 giờ. Trên môi trƣờng MC khuẩn lạc E.coli có màu hồng, phần tâm có
màu sậm hơn hoặc trắng hơn, đƣờng kính khoảng 1-2mm. Lấy 5 khuẩn lạc nghi
ngờ là E.coli cấy thuần trên môi trƣờng NA ủ ấm 37oC/24 giờ. Sau đó kiểm tra
đặc tính sinh hóa để khẳng định là E.coli bằng cách cấy lên các môi trƣờng
Trypton (Indol), MR-VP, Simmons Citrate ủ ấm 37oC/24 giờ.
Môi trƣờng Trypton dùng để kiểm tra tính sinh Indol của vi khuẩn. Nhỏ vài
giọt thuốc thử Kovacs lên bề mặt môi trƣờng rồi quan sát thấy: Phản ứng dƣơng
tính thì trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện một lớp màu đỏ. Phản ứng âm tính thì
bề mặt môi trƣờng không đổi màu.
Môi trƣờng MR nhỏ 1 giọt thuốc thử Methyl Red lên có kết quả nhƣ sau:
Phản ứng dƣơng tính thì môi trƣờng từ màu vàng chuyển sang màu đỏ. Phản ứng
âm tính thì môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu vàng.
Môi trƣờng VP lần lƣợt nhỏ vài giọt thuốc thử VP1 sau đó vài giọt thuốc
thử VP2 và có kết quả nhƣ sau: Phản ứng dƣơng tính thì trên bề mặt môi trƣờng
không màu sau khi nhỏ xuất hiện vòng đỏ. Phản ứng âm tính thì trên bề mặt môi
trƣờng vẫn giữ nguyên không màu.

Môi trƣờng thạch nghiêng Simmons Citrate Agar: Phản ứng dƣơng tính thì
môi trƣờng sẽ chuyển từ màu xanh lá sang xanh dƣơng. Phản ứng âm tính thì môi
trƣờng vẫn giữ nguyên màu xanh lá.

Hình 5. Vi khuẩn E.coli trên môi trƣờng MC


1

2

3

4

5

6

7

8

Hình 6. Kết quả sinh hóa của E.coli
Ống 1: môi trƣờng Indol dƣơng tính với E.coli
Ống 5: môi trƣờng Indol ban đầu
Ống 2: môi trƣờng MR dƣơng tính với vi khuẩn E.coli
Ống 6: môi trƣờng MR ban đầu
Ống 3: môi trƣờng VP âm tính với E.coli
Ống 7: môi trƣờng VP ban đầu

Ống 4: môi trƣờng Citrate âm tính với E.coli
Ống 8: môi trƣờng Citrate ban đầu
Số lƣợng E.coli trong 1 gram phân đƣợc tính dựa vào công thức sau:
∑C
N(CFU/ g) =

xR
V(n1+0.1n2)d

N: tổng số vi khuẩn E.coli
∑C: tổng số khuẩn lạc ở 2 nồng độ
V: thể tích mẫu cấy lên 1 đĩa (ml)
n1: số đĩa ở nồng độ thứ nhất
n2: số đĩa ở nồng độ thứ hai


d: nồng độ tƣơng ứng với độ pha loãng thứ nhất
R: số khuẩn lạc dƣơng tính so với tổng số khuẩn lạc làm sinh hóa

1 gram phân gà

Cho vào ống nghiệm chứa 9ml NaCl 9‰ và pha loãng

Mac Conkey (MC)
37oC, 24 giờ

Bắt 5 khuẩn lạc E.coli điển hình cấy thuần lên NA
37oC, 24 giờ

Cấy khuẩn lạc từ NA lên môi trƣờng sinh hóa

37oC, 24 giờ

Kiểm tra sinh hóa

Citrate (-)

MR (+)

VP (-)

Indol (+)

E.coli
Sơ đồ 2. Quy trình định lƣợng vi khuẩn E.coli
(Theo TCVN 5155-90)


3.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ
Bảng 2. Bảng tiêu chuẩn đƣờng kính vòng vô khuẩn của kháng sinh
(Theo CLSI, 2012)

Tên kháng sinh

Kí hiệu

Đƣờng kính vòng vô khuẩn(mm)

Hàm
lƣợng

Nhạy

Trung gian

Kháng

Tetracycline

Te

30 µg

≥15

12-14

≤11

Ampicicline

Am

10 µg

≥17

14-16

≤13

Amoxicillin

Ax

10 µg

≥17

14-16

≤13

Amoxicillin/
clavulanic acid

Ac

20/10 µg

≥18

14-17

≤13

Gentamycine

Ge

10 µg

≥15

13-14

≤12

Kanamycine

Kn

30 µg

≥18

14-17

≤13

Norfloxacin

Nr

10 µg

≥17

13-16

≤12

Trimethoprime/
sulfamethoxazol

Bt

≥16

11-15

≤10

Cefuroxime

Cu

30 µg

≥23

15-22

≤14

Doxycycline

Dx

30 µg

≥14

11-13

≤10

Amikacin

Ak

30 µg

≥17

15-16

≤14

Streptomycin

Sm

10 µg

≥15

12-14

≤11

Cefaclor

Cr

30 µg

≥18

15-17

≤14

1,25/
23,75 µg

Chuẩn bị canh khuẩn: chủng vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc chọn làm kháng
sinh đồ đƣợc tăng sinh trong NB khoảng 6 giờ. Canh khuẩn đƣợc so độ đục với
Mac Farland 0,5 tƣơng đƣơng có chứa vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml. Sau đó pha
canh khuẩn có nồng độ 106 CFU/ml.
Chuẩn bị môi trƣờng MHA, độ dày thạch khoảng 4mm. Các đĩa kháng sinh
bảo quản theo đúng yêu cầu của nhà sản xuất. Không dùng kháng sinh quá hạn,
kháng sinh ẩm ƣớt. Khi lấy từ tủ lạnh ra phải để ra ngoài 1-2 giờ để cho nhiệt độ
trong lọ bằng nhiệt độ phòng.
Phƣơng pháp tiến hành: dùng tăm bông vô trùng tẩm canh trùng ở 10 6
CFU/ml sau đó trải đều lên khắp mặt thạch MHA. Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng
để đặt từng khoanh đĩa kháng sinh lên đĩa thạch. Đặt các đĩa kháng sinh lên mặt
thạch sao cho 2 đĩa cách nhau 2,5cm – 3,5cm và cách mép hộp thạch 2cm- 2,5cm,