Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới thành phần hóa học và tác dụng dược lý của vị thuốc hoàng liên

Bễ Y Tẫ

TRlTễNG DAI HOC Dĩ0C H NễI
m

N G U Y ấ N ANH LY

NGHIấN CtJU NH HUễNG CĩA NHIấT Dễ TễI
THNH PHAN HễA HOC
V TAC DUNG DlfOC

L CĩA VITHUOC HONG LIấN
(KHễA LUN TễT NGHIấP DLiỹc SẽKHO 1990 - 2003)

Nguối huomg dõn:

TS. PHNG HễA BẽNH
DS. NGUYấN THE MINH

Nai thirc hiờn:

Bụ mon Diùỗfc hoc co truyờn
Phong Vi sinh - Bụ mon Cụng
nghiờp duac
Phong nghiờn cuu trung tõm
Phong Duac l Viờn Duoc lieu

Thụi gian thuc hiờn: 3/2003 - 5/2003

LÙl CfiM ON!
Trong quâ trinh thuc hiên dê tài này, em dâ nhân duoc su nhiêt tînh
giüp do cüa câc thây cô giâo.
Dâc b iê t, nhô cô su hctng dân tân tînh, chu dâo cüa thây:
TS. Phùng Hôa Binh , em dâ hoàn thành dê tài này . Em xin bày
tô long kmh trong và biêt on sâu sàc tcti thây .
Em xin chân thành câm on câc thây cô giâo trong bô mon Duoc co
truyên, DS. Nguyén Thé Minh, thây: TS Cao Van Thu bô môn Công
nghiêp Duoc - phong Vi sinh, thây: TS . Dô Ngoc Thanh, TS . Nguyên
Dâng Hoà phông nghiên curu Trung tâm dâ tao diêu kiên giüp dô em hoàn
thành dê tài này.

Hà Nôi, thâng 5 nam 2003
Sinh viên

Nguyên Anh Ly.


MUC LUC
Trang
DAT VAN DE

1

PHAN 1: TONG QUAN

2

1.1- Dõc diờm thuc võt

2

1.2- Thnh phõn hoõ hoc

3

1.3- Tac dung

5

1.4- Cụng dung

7

V 1.5- Dinh lirỗmg

8

1.6- Che bien

9

1.6.1 - Mue dợch che bien thuoc co truyờn

9

1.6.2 - Cõc phifcfng phõp che bien thuoc co truyờn

9

1.6.3 - Cõc phuong phõp che bien Hong liờn

11

1.7- Nhõn xột chung
PHAN 2: THUC NGHIấM V KấT QU
2.1 - Nguyờn lieu, phuong tien v phuong phõp nghiờn cihi

11
12
12

2.1.1 - Doi ttfỗfng nghiờn cỹu

12

2.1.2 - Thiet bi, hoõ chat, sue võt thợ nghiờm

12

2.1.3 - Phvtcfng phõp nghiờn cỷu

12

2.2 - Kột quõ thuc nghiờm v nhõn xột

16

2.2.1 - Thộo doi õnh huụng cỹa nhiờt dụ dộn si/ doi mu cỹa

vi thuoc.
2.2.2 - Nghiờn cỹu su bien doi alcaloid ụ cõc MNC

16
16


2.2.3 - Nghiên cûu mot so tâc dung sinh hoc
2.3 - Bàn luân

31
36

2.3.1 - Phicong phâp dinh hcçfng alcaloid trong Hoàng lien

36

2.3.2 - Ânh huông nhiêt dô tâi thành phàn hoâ hoc

37

2.2.3 - Tâc dung sinh hoc

37

PHAN 3: KÉT LUÂN VÀ DE XUAT
3.1 - Ket luân

39
39

3.1.1 -Nhiêt dô ânh huông tâi màu sac vi thuô'c

39

3.1.2-Thành phàn hoâ hoc

39

3.1.3-Tâc

40

dung sinh hoc

3.2 - Mot vài ÿ kien de xuâ't

40


CAC KŸ HIÊU VIÉT TÂT.

Ber :

Berberin

DL :

Dirac lieu

g(mg)/KgT.T :

g(mg) duoc liêu/Kg thé trong suc vât thf nghiêm

HPLC :

Sâc kÿ long hiêu nâng cao

MeOH :

Methanol

MNC :

Mâu nghiên ciïu

Pal :

Palmatin

SKLM :

Sâc kÿ lorp mông

t°:

Nhiêt dô

t:

Thài gian

TT:

Thuoc thü


DT VAN DE
Vi thuục Hong liờn chõn g (Rhizoma Coptidis) l thõn rở cỹa nhiờu loi
Hong liờn thuục chi Coptis ho Hong liờn (Ranunculaceae). Thnh phõn hụa
hoc chinh cỹa vi thuục Hong liờn l alcaloid, trong dụ chỷ yộu l Ber v Pal.
Hong liờn cụ vi dng tmh hn, cụ tõc dung khõng khuan [3, 7, 12], chụng viờm
[22], lai mõt [1], ha huyột õp [3, 6].
Thộo y hoc co truyờn, truục khi sỹ dung, cõc vi thuục duỗfc chộ biộn nhm
tõng tõc dung diờu tri giõm tõc dung khụng mong muụn, tõng dụ an ton. Vi
thuục Hong liờn duỗfc chộ biộn theo nhiờu phuofng phõp khõc nhau, trong dụ cụ
phuong phõp sao. Phuong phõp sao thuc chat l su tõc dụng cỹa nhiờt dụ dộn vi
thuục. Cõc phuong phõp sao khõc nhau thi nhiờt dụ tõc dụng khõc nhau lm cho
thnh phõn hụa hoc sờ biộn doi khõc nhau dõn toi tõc dung sinh hoc khõc nhau.
Vi võy, chỹng tụi nghiờn cỹu dờ ti ny vụi mue dợch tợm hiởu su õnh huụng
cỹa nhiờt dụ (õ mỷc dụ nhiờt dụ khõc nhau trong khoõng thdi gian khõc nhau)
dộn Alcaloid cỹa vi thuục Hong liờn
Nụi dung nghiờn cỹu gụm:
+ Dinh tùnh Alcaloid bng phõn ỷng voi thuục thỹ chung.
+ Phõn tich su biộn doi Alcaloid bng SKLM
+ Dinh luong Berberin, Palmatin.
+ Thỹ mot sụ tõc dung sinh hoc: khõng khuan, an thõn.

1

PHAN 1: TÔNG QUAN
1.1- DÂC
DIÊM THÜC
VÂT:
•
•
•
C6 nhiêu loài Hoàng liên chân gà:
Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis teetoides C.Y. Cheng,
Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao. Ho Hoàng liên (Ranunculaceae).
Hoàng liên là cây thâo sô'ng nhiêu nâm cao chùng 1 5 - 3 5 cm, thân moc
thang phfa trên phân nhânh, co nhiêu rê nhô. La moc so le tir thân rê lên, cuong
la dài 6 - 12 cm. Phién la gôm 3 - 5 la chét, môi la chét lai chia thành nhiêu thùy
mép cô nhüng rang ara [3, 2, 6, 7, 9, 12].
Cây thuông ra hoa vào mùa xuân. Hoa co 5 la dài màu vàng lue, cânh hoa
hïnh müi mâc dài bàng 1/2 la dài, co nhiêu nhi dài bàng cânh hoa. Quâ dai co
cuong trong chtra 7 - 8 hat màu xâm.
Hoàng liên thucmg moc à vùng nui cao 1500 - 2500 m. Cây ua noi mât am
thâ'p nhiêt dô 20 - 25 °C, dât dê thâo nuôc [3, 7, 9]. Hoàng liên trong bàng hat,
thucmg trong vào mùa xuân [2, 7].
Thu hâi Hoàng liên vào cuôi mùa thu dàu mùa dông thâng 9 - 1 0 [3, 7, 12,
17, 24], néu là cây trong thï thu hâi sau 4 - 5 nâm. Hoàng liên moc hoang và
trong nhiêu à Trung Quôc (TûXuyên, Hô Bac). Ô Viêt Nam, Hoàng liên moc
hoang trên dây nui Hoàng liên Son (Sapa cô Coptis quinquesecta Wang, ô Quang
Ba- Hà Giang cô Coptis chinensis Franch) [3,2,12].
- Bô phân dùng:
Bô phân dùng cüa Hoàng liên là thân rê, dô là nhüng mâu cong queo dài tù
3 cm trô lên, rông 0,2 - 0,5 cm. Cô nhiêu dot khüc khuÿu, phân nhânh nhiêu
giông hînh chân gà nên côn goi là Hoàng liên chân gà. Mât ngoài thân rê màu

vàng nâu côn vêt tich cûa rê phu và cuô'ng lâ. The chat ctfng rân, bê ngang không
phâng, phàn gô màu vàng tuai, phân vô và ruôt màu vàng dô [3, 24], không mùi,
vi rat dâng, ton tai lâu trong miêng.

2


9

X

Anh 1.1 : Mâu Hoàng liên lây tai SaPa

Ghi chu: 1: Toàn cây

2: Hoa

3:Thân ré (MNC)

4: Thân rê

1.2- THÀNH PHAN HÔA HOC:

Thành phàn hoa hoc chmh cüa thân rê là Alcaloid (5 -8 %), trong do chü
yéu là Berberin, Palmatin, ngoài ra là

Worenin, Coptisin, Jatrorizin,

Magnoflorin, Columbamin [3,6, 9, 12].
Hàm lirong Alcaloid trong cây thay doi theo mùa và thcfi kÿ sinh truang cüa

cây. Hàm luong Ber trong thân rê cao nhât vào thâng 9 -1 0 , thâp nhât vào thofi kÿ
cây ra hoa. Trong la cüng cô Ber, à la già hàm luçmg Ber cao nhât vào thâng 7 10 khoâng 2,5 - 2,8 % [3, 20]. Ô hoa và hat cüng chüa 1 luong nhô Ber: hoa 0,56
%, hat 0,23 %.
Ngoài Alcaloid trong thân rê Hoàng liên côn cô tinh bot, acid hùu co nhu
acid ferulic [3].

3


Công thuc eau tao cüa mot so Alcaloid trong Hoàng liên:
Jatrorizin

=

- H
r 2= - c h 3

R {=

Berberin

Ri + ~ ■CH2-

Palmatin

R, +R2 = - CH 3

Coptisin

R - - H

Worenin

R = - CH3

CH 3O

CH - COOH

HO
HO

Acid ferulic
CH

3

O

M a g n o flo rin

Mot so tînh chât vât lÿ cüa câc Alcaloid tlO, 11, 15, 21, 26Î duoc ghi à
bàng 1.1
Bàng 1.1: Mot sô tmh chat vât lÿ cüa câc Alcaloid
Alcaloid

Nhiêt dô nông chây

Cire dai hâp thu
UV X max (nm)

Ber dang base

144 °C

354, 278, 218

Ber dang nitrat ( N+)

205 °C

350, 264, 228

Ber clorid
Pal dang nitrat ( N+)

427, 349, 266, 230
192 °C

Pal clorid

340, 270, 224
430,348,267,227

D- tetrahydro Pal

142 °C

L- tetrahydro Pal

147 °C

DL- tetrahydro Pal

148 °C

4

335, 287


1.3- TAC DUNG:
♦♦♦ Tâc dung khâng khudn:
Hoàng liên cô tâc dung khâng khuân manh dâc biêt là trên vi khuân Gram (-).
Trong dô cô nhiêu vi khuân duông ruôt. Nuôc sâc Hoàng liên cô tâc dung rïc ché
mot sô' vi khuân:

Shigellashiga, Shigella dysenteriae, Vitrio cholerae,

Streptococus virideus Bacilhis proteus, Bacillus typhi, Bacillus pyocyaneus,
Staphylococus aureus... [3,12].
Y

hoc cë truyên thucmg dùng Hoàng liên két hop vôi hoàng bâ, hoàng càm,

chi tü trong bài Hoàng liên giâi dôc thang dê giâi dôc li truc khuân, tiêu chây
cap, viêm màng nâo [4, 16].
Tâc dung khâng khuân cüa Hoàng liên theo co ché: Ber ûc ché sinh tong
hop ARN, ADN và protein cüa té bào vi khuân [ 20 ,22 ]. Ngoài ra Ber côn tàng
cucmg chiïc nàng thuc bào vi khuân cüa câc té bào miên dich bach câu [4].

Mot sô vi khuân Staphylococus aureus, Streptococus hemolyticus dê khâng
thuoc vôi Ber sulfat nhung vôi bài Hoàng liên giâi dôc thang lai khô sinh ra tînh
chat khâng thuôc [4, 20].
❖ Tâc dung chong viêm:
Do Ber cô tâc dung \xc ché giâi phông acid arachidonic tir màng té bào, giâm
luong prostaglandin (PGI2) trong huyét tUdng [22], ûc ché hïnh thành u hat trên
suc vât thuc nghiêm.
❖ Tâc dung trên tim:
Ber làm giâm su co that cüa tim, làm giâm nhip tim trên chuôt thuc nghiêm [22].
Fang cho ràng vôi liêu lmg/kg trên mèo thî nghiêm, Ber làm giâm co co tâm
thât. Ber cô tâc dung chông loan nhip tim, duoc xép vào nhôm thuôc dô'i khâng
canh tranh vôi hê a , , a 2 adrenergic [20].
*X* Tâc dung ha huyét âp :

5


Do lm dõn mach [3,6] thuụng dựng dộ phong ngựa xỹ vỷa dụng mach, do Ber
lm giõm luỗmg cholesterol trong huyột tuong [20].
Vụi dudng tiờu hoa:
Hong liờn vụi liờu nhụ kich thich giỷp su tiờu hoa tng co bụp da dy, ruụt,
chỷa viờm da dy [3,6,12].
Tõc dung khõng virỷt cỷm [4,6,20] :
Nuục sc Hong liờn vụi nụng dụ 50% nghiờn cỷu trờn phụi g cụ tõc dung ỷc
chờ su phõt triởn cua virỷt cỹm chung PR8, 56S8 P.M [20].
Ba Protoberberin alcaloid tự dich chiột Hong liờn cụ tõc dung ỷc chộ
monoamino oxydase (MAO), riờng Jatrorrhizin ỷc chờ' khụng canh tranh cõ
MAOA v MAOB (ụ ti lap thộ nõo chuụt cụng trõng) vụi giõ tri IC50 l 4pM v
62 (J.M. Cụn Ber chợ ỷc chộ canh tranh vụi MAOA vụi IC50 l 126 p,M trong khi
Pal vụi IC5() = 200jiM cỹng khụng ỷc chộ 2 enzim ny [23].

Nhỹng hop chat protoBer lm giõm hm luỗmg seretonin vụi IC50 cỹa
Ber l 3,0(xM cỹa Pal l 16,5pM. Cõc hop chat protoBer vụi liờu toi da 20(j,M
khụng dục hai vụi tộ bo P815 kột quõ l Ber v Pal ỷc chộ hoat tmh enzim
tryptophan hydroxylase do dụ lm giõm hm luong seretonin tộ bo P8i5 [13].
Ber ỷc chộ su kột tõp tiởu eau, lm giõm luong Thromboxan (TXB2),
do dụ cụ tõc dung chụng thiộu mõu nõo eue bụ [22].
> Dich chiột tự Hong liờn cụ tõc dung ỷc chộ su phõt triởn cỹa tộ bo
ung thu, Hong liờn dõ ỷc chộ su phõt triởn khụi u v su hinh thnh trong qun
thở dụng tộ bo ung thu da dy, ruụt kột, vỹ, phu thuục vo liờu v thụi gian
dựng. Su phõt triởn cỹa tộ bo bi ỷc chộ hon ton sau 3 ngy chiu tõc dung cỹa
thuục 10|ag/ml duoc thõo. Tõc dung ỷc chộ phõt triởn khụi u cỹa Hong liờn l
do giõn tiộp ỷc chộ hoat tmh cỹa CDC2 kinase. Tõc dung ny nụi bõt lờn nhu mụt
mue tiờu diờu tri ung thu bng hoa liờu phõp [18].
Thuc nghiờm tiờ'n hnh trờn tộ bo u thõn kinh dờm cỹa chuụt, Chen cho
rng Ber ỷc chộ sinh t6ng hop ARN, ADN v protein v lm giõm nng luong
lase dở tiờu diờt tộ bo u thõn kinh dờm [22].

6


Ber co tõc dung vụi dan bo (leihsmania), diờt k sinh trựng sot rột

[2 0 , 21]
Pal rùc chộ epinephrine, co tõc dung khõng khuan, hoat hoõ
acetylcholin esterase, hoat hoõ cõ enzim anticholin esterase [21]
Dục tmh cỹa Hong liờn :Ber co LD50 =25 mg/Kg T .T , LD50 cỹa
hong liờn sụng = 6,875 0,904 g/Kg T.T 0 ].

1.4- CễNG DUNG:

*Theo y hoc co truyờn, Hong liờn cụ tõc dung thanh nhiờt tõo thõp, thanh
nhiờt tõ hụa [2,4].
*Hong liờn cụ vi dng, tmh hn, quy vo nm kinh: tõm, t, vi, can, dai
trng [4, 5 ,7, 20]
* Cụng nõng chỹ tri:
Thanh nhiờt tõo thõ'p:diờu tri li, viờm ruụt. Hong liờn cụ tmh khõng
khuan manh phộ rụng nờn dựng dộ tri li amip, li truc khuan [3,4, 24].
Thanh tõm trựphiờn: dựng dở diờu tri chựùùg tõm hụa thinh gõy ra hụi
hụp mõt ngỹ, bon chụn, niờm mac luụi miờng phụng dụp [4,24].
- Thanh can sang mõt: tri chiùng can hụa gõy ra dau mõt dụ , sot cao
xuõt huyột hong dõn , diờn cuụng phõ phõch ( can hoõ vuang ) [2, 7 ].
Chi huyờt: dựng cho truụng hap huyột nhiờt dõn dộn chõy mõu cam,
non ra mõu [4, 6].
Gidi dục ha hụa: diờu tri ung nhot dục bờn trong, sot cao mờ sõng
phõt cuụng [4, 6].
Trong dõn gian thung dựng dich nuục sc Hong liờn dở tri chỷng dau mat
dụ, dựng ngoi dở tri nam ngoi da, eczema, viờm tai giỷa cụ mỹ [3,24] bụi
ngoi diờu tri trờ em tua luụi ,sung luụi ,viờm miờng , lụ mụi [7].
Can chu y; Hong liờn vi rat dng khụng nờn dựng liờu cao kộo di dở gõy
non, liờt thõn kinh vi giõc, ton thuang dich vi, õn khụng biột ngon [4].

7


1.5- DINH LĩONG ALCALOID:

De dinh luỗmg Alcaloid trong Hong liờn cụ nhiờu phuong phõp:
Dinh luong bng phiùỹng phõp cõn [3,5,11 ]
Nguyờn tõc: Chiột alcaloid trong duoc lieu bng cụn, kột tỹa Ber bng dung
dich Kl, thờm aceton, kiờm hoa bng amoniac de tao tỹa phỹc. Loc ly tỹa sy

khụ dem cõn.
lg tỹa tuong duong 898,2 mg Berberin.
lml dich loc tuong ỷng 0,0272 mg Berberin.
Duoc diởn Viờt Nam I quy djnh duoc lieu phõi cụ ft nhõt 4% Berberin.
Phtfcfng phõp acid base [3,11]
Nguyờn tac: Chiột alcaloid trong duoc lieu duụi dang base bng dung mụi
hỹu co ft phõn eue, acid hoa dich chiột chuyởn alcaloid sang dang muụi tan duoc
trong nuục. Gan lõy lụp nuục, kiờm hoa bng NaOH, lc vụi dung mụi hỹu co ft
phõn eue de chuyởn hột alcaloid base sang pha dung mụi. Thờm chmh xõc mot
luong acid HC1. Chuõn dụ HC1 du bng NaOH, chợ thi dụ Methyl, tự dụ trnh
luong alcaloid.
Phtfong phõp dựng sac k chờ'hoõ de tõch roi do quang [11,24]
Nguyờn tõc: dựng SKLM dở tõch riờng cõc alcaloid khụi hụn hop, cao ly
riờng cõc vột, phõn hõp phu bng dung mụi thich hop, do quang ụ buục sụng
thùch hop. Mõt dụ quang tợ le vụi nụng dụ dung dich alcaloid.
Phtfcfng phõp sõc k long hiờu nõng cao (HPLC) [15]
Nguyờn tac: Dich chiột alcaloid duoc tiờm vo cụt sõc k pha dụng
duoc bom liờn tue qua cụt tõch riờng cõc alcaloid khụi hụn hop. Mụi alcaloid
khi ra khụi cụt duoc detector UV nhõn biột, biộu hiờn ra bng 1 pic. Diờn tich
pic tuong ung vụi nụng dụ alcaloid trong dung dich tiờm vo cụt.

8


1.6. CHÉ BIEN:

1.6.1. Mue dîch che bién thuôc co truyên:
> Loai bô nhüng thành phân không can thiét làm vi thuôc tôt hon lên.
Giâm dôc tmh cüa vi thuôc vî du Ban ha ngâm trong nirôc vôi giâm hét vi ngüa,
ché phu tu thành bach phu diêm phu dë giâm dôc tmh cüa aconitin [4, 12 , 14]

> Giâm tâc dung không mong muôn, thay doi tâc dung cüa thuôc, vî
du: Hà thü ô ché vôi dàu den dë giâm anthranoid, giâm tâc dung nhuân tay [4,

12].
> Giüp bâo quân thuôc tôt hon: làm on dinh duoc lieu trânh nam môc,
vî du Hoè hoa trong diêu kiên am, men rutinase phân huÿ rutin thành queexetin
làm hoè bi xâm di [4, 12].
> Làm thay doi tmh vi quy kinh cüa thuôc tù dô làm thay doi tâc
dung cüa thuôc, vî du: Sinh dia vi dang tmh hàn, tâc dung thanh nhiêt luong
huyét, sau khi ché vôi sa nhân, gùng, ruou duôi tâc dung cüa nhiêt trü thành thuc
dia vi ngot tînh ôn cô tâc dung bo huyét ; hoàng kÿ trîch mât tàng quy kinh tÿ ,
tâng tâc dung bo khî [4, 7, 12].
> Làm tâng tâc dung cüa thuôc do làm giâm dô bên co hoc, tâng khâ
nâng giâi phông hoat chat, làm mât mot sô thành phân không can thiét, sinh ra
mot sô thành phân moi cô tâc dung diêu tri bênh. Vî du thâo quyét minh vi sao
cô tâc dung nhuàn tây , sao vàng cô tâc dung nhuân ha, ha âp, sao chây cô tâc
dung an thân [4]
1.6.2. Câc phuong phâp ché bién thuoc co truyên:
Cô ba phuong phâp co bân ché bién thuôc co truyên: hoâ ché, thuÿ ché, thuÿ
hoâ hop ché [4, 12].
♦> Hoâ che: là phuong phâp ché bién chî dùng lüa, nhàm mue dîch:
- Giâm dôc tînh, giâm tâc dung quâ manh cüa vi thuôc.
- On dinh hoat chât trong vi thuôc.
- Giâm dô bên co hoc cüa vi thuôc.
Câc phuong phâp hoâ ché duoc ghi à bâng 1.2

9


Bàng 1.2: câc phuong phâp hoâ ché.

Câc phirang phâp hoâ
che
Sao qua

Sao truc
tiép
(không
cô phu
liêu)

Sao vàng
Sao vàng
chây canh
Sao vàng ha
thô

Nhiêt dô
(°C) '

Màu sac vi
thuôc

50-80

Màu cüa duac
lieu sông
Màu vàng

140-180

Màu vàng, canh
màu den chây

Giâm bot mùi vi khô chiu

100 -140

Vàng

Cân bàng âm dueng cho vi thuoc

180 - 240

Sao chây

180-240

Sao câch cât

200 - 250

Sao

Sao câch
câm
Sao câch
hoat thach
hoac van
câp

Làm khô và thofm thuoc trânh moi
mot, on dinh hoat chat.

100 -140

Sao den
(hâc sao)

Sao
giân
tiép
(cô phu
liêu)

Mue dich

Mat ngoài màu
den, bên trong
màu vàng
Mât ngoài màu
den, bên trong
màu nâu den

Dân thuoc vào kinh tÿ

Tàng tâc dung tiêu thuc giâm tmh
mânh liêt cüa vi thuôc
Tàng tâc dung câm mâu

Truyên nhiêt dô dông dèu vào vi

thuôc.
Tàng tâc dung kiên tÿ, giâm tmh khô
tâo cüa vi thuôc
Trânh két dmh thuôc

200

Nung

Hàng
nghin

Ché sirang

Hàng
nghln

Vô ca hoâ, phâ vô câu truc cüa thuôc
Tinh ché thuôc cô nguôn khoâng vât,
à nhiêt dô cao câc hoat chat thàng hoa
tâch ra khôi tap
Giâm bôi chat dàu trong vi thuôc,
giâm tmh kich ufng cüa vi thuôc
Làm chin, giâm tmh mânh liêt cüa vi
thuôc
Làm thay doi tmh chat vi thuôc loai
trîr nuôc trong câu truc phân tu tàng
khâ nàng hüt nuôc làm sàn se

Lùi

Nirâng
Hoâ phi

Mot so công trinh nghiên cuu vê ânh huông cüa nhiêt dô tôi thành phàn
hoâ hoc cüa duoc liêu cho thày : ô mue t° < 80° C ( tuong duong phuong phâp sao
qua cüa YHCT ) thành phàn hoâ hoc cüa vi thuôc ft thay dôi : diosgenin trong
thân rê mot sô loài thuôc chi Dioscorea L . ft thay doi à mire t° 50-60°C[ 10]. Ô
mûc t° cao (180 -200° C) tuong duong sao chây cüa YHCT thành phàn hoâ hoc
thay doi rat lôn .

10


Tu theo mue dich sir dung m ta lua chon phuong phõp chộ biộn khõc
nhau.
1.6.3. Cõc phuong phõp chộ biộn Hong liờn:
Hong liờn dộ sụng dựng dộ tõ tõm hoõ, tri chỹng phõt ban diờn
cuụng phiờn khõt.
Hong liờn trich ruỗru sao qua tõc dung tõp trung nỹa nguụi phia
trờn, tri viờm mõt, lụ miờng luụi [20 , 24]
Hong liờn trich nuục gựng tõng tõc dung trung tiờu dựng trong
truụng hop dy bung, buụn non, non do cõm mao phong nhiờt [20 , 24]
Hong liờn trich nuục ngụ thự du cụ tõc dung thanh can, diờu ho
truụng vi, chụng non, o chua [24]
Hong liờn tõm giõm tri can hu hoõ [1]
Hong liờn sao vụi hong thộ cụ tõc dung tiờu thuc chỷa bờnh cam ụ
trờ con.
Hong liờn trich mõt lỗm tri can dụm thuc hoõ.
Mot sụ cụng trợnh dõ nghiờn cỹu vờ chộ biộn Hong liờn cho thõy: Hong
liờn trich gựng cụ tõc dung loi mõt, ha sot tụt hon Hong liờn sụng. Hong liờn

chộ giõm cụ tõc dung loi mõt tụt hon cõ Hong liờn trich gựng [1]
1.7 NHN XẫT CHUNG:
Viờc chộ biộn lm õnh huụng rõ't nhiờu tụi tfnh chat cỷa vi thuoc, qua
chộ biộn tõc dung cỹa vi thuoc cỹng thay doi. Do dụ cõn nm chc duoc quy
luõt cỹa chộ biộn dộ tao ra nhỹng tõc dung diờu tri bờnh theo y muụn chỹ
quan. De tõng giõ tri su dung cỹa vi thuoc cõn lua chon nhỹng phuong phõp
chộ biộn phự hop.

11


PHAN 2: THĩC NGHIấM V KấT QU
2.1- NGUYấN LIấU PHI/NG TIấN, PHI/ONG PHP NGHIấN CĩU:
2.1.1 Doi ttrong nghiờn cuti:
Chỹng tụi tien hnh nghiờn cỹu trờn thõn rờ cõy Hong liờn (Rhizoma
Coptidis) thuục chi Coptis ho Ranunculaceae. Mõu lõy tai Sapa thõng 9/2002.
2.1.2 Thiột b i, hoõ chat ,suc võt thợ nghiờm .
- Tỹ sõy: Memmert, SHELLAB
-

May xõc dinh dụ õm Prộcisa HA60 (Thuy Sù)

-

Cõn phõn tợch

- Bụ Shoxhlet 150 ml
- May sõc k long (HPLC) Thermo Finnigan.
- Dung eu thỹy tinh.
- Chat chuõn: Ber clorid, Pal sulfat do Viờn Duỗfc lieu cap

Rotundin do khoa Duoc Hoc viờn Quõn y cap
- Bõn mụng Silicagel GF254Merck.
Hụa chat dat tiờu chuõn phõn tich (P.A): Methanol, Buthanol, acid
clorydric, acid acetic dc, Natrilauryl sulfat, Kalidihydrophosphat
- Chỹng vi khuan do phụng vi sinh, Bụ mon cụng nghiờp duỗfc cap.
2.1.3 Phirong phõp nghiờn cuti:
2.1.3.1 Chờ bien:
- Sõy cõc mõu Hong liờn cõc mỹc nhiờt dụ khõc nhau (tự 100 C dộn 220
C ) trong khoõng thefi gian 10, 20, 30.
- Nhõn xột cõm quan trờn co sụ mu cỹa cõc mõu nghiờn cỹu.
- So bụ dõnh giõ mõu cụ nhiờt dụ v thụi gian cho sõn phõm tuong duong
sao vng, sao chõy.

2.1.3.2 - Nghiờn cỹu su: bien doi thnh phõn hụa hoc
* Chiờ't xuõ't: chiột bng acid loõng trong MeOH [15]

12


* Nguyên tâc: trong môi truông acid alcaloid trong duoc liêu chuyën sang
dang muôi dê tan trong MeOH. Dùng MeOH de chiét alcaloid.
* Dinh tinh câc mâu nghiên cüu:
- Dinh tinh bàng phân ûng vôi TT chung Alcaloid: Mayer, Dragendorff,
Bouchardat.
- Dinh tinh bàng SKLM: so sânh thành phân Alcaloid cüa câc mâu sây vôi
nhau, vôi mâu sông, vôi chat chuân Ber, Pal, Rotundin. Dânh giâ so bô su bien
doi thành phàn hoa hoc.
* Dinh luong Alcaloid:
Dinh luong Ber và Pal bàng HPLC dâ duoc TS. Pham Thanh Kÿ, Trinh Vàn Lâu
nghiên ctru [15].

* Nguyên tac:
Dich chiét duoc liêu duoc tiêm vào côt sàc kÿ và duoc pha dông chay qua
côt tâch thành câc Alcaloid riêng biêt. Môi Alcaloid ra khôi côt duoc detector
UV nhàn biét, biëu hiên ra bàng môt pic. Diên tich pic tî le thuân vôi nông dô
dung dich Alcaloid.
* Tmh két quâ theo công thuc (1)
X%

cc.sTvc y

= --------—7----- r—.100
mO.Sc VT.rn.(\-a)

(1)

X: hàm luong hoat chat (%)
Cc: nông dô hoat chat dich chuân tiêm sàc kÿ (mg/ml) (Berberin , Palmatin)
Vc: thë tfch tiêm mâu chuân (|j,l)
VT: thë tich tiêm mâu thü (|j.l)
V : thë tich dich chiét thu duoc (ml)
Sc: diên tich pic chat chuân
Sj'. diên tfch pic chat thü
m: khôi luong duoc liêu chiét (g)
a: hàm âm cüa duoc lieu (%)
So sânh diên tich pic cüa Ber, Pal trong mâu thü vôi diên tich Ber, Pal trong
mâu chuân tù dô suy ra hàm luong Ber, Pal trong duoc liêu theo công thüc (1).

13

2.3.2.4 - Thütâc dung sinh hoc:
* Nguyên tac chon mâu:Trên co sa phân tich dinh tînh, dinh luong , chüng
tôi chon mâu dé thü tâc dung sinh hoc : mâu sông, mâu cô su thay dôî nhiêu vê
thành phân hoâ hoc , hàm luong Ber , Pal.
* Tâc dung khâng khudn: dùng phuong phâp khuyêch tan trên môi truông
thach [19].
Nguyên tac:
Dua trên su khuyêch tân cüa dich thü vào môi truông thach, üc ché su phât
triên cüa vi khuân chï thi, tao ra câc vông vô khuân cô duông kmh tî le vôi hoat
lue khâng khuân cüa thuoc.
Chî tiêu theo dôi: so sânh duông kînh vèng vô khuân cüa MNC vôi khâng
sinh dôi chüng và cüa câc MNC vôi nhau.
* Tâc dung an thân: Thü tâc dung hiêp dông vôi thuôc ngü barbituric [25]
(Viên Duoc lieu dâ chînh lÿ ) .
Nguyên tac: Chuôt duoc uông thuôc (cao long câc MNC) sau môt thôi
gian, gây ngü bàng thiopentan. Tâc dung tàng cuông thôi gian ngü cüa chuôt
duoc dânh giâ bàng su kéo dài thôi gian ngü ô lô dùng thuôc so vôi lô chüng ( chî
dùng thiopentan ).
Chî tiêu theo dôi: thôi gian ngü cüa chuôt ô tu thé nàm ngüa, dén khi chuôt
lât mînh trô dây trên bon chân. So sânh thôi gian ngü cüa câc lô dùng thuôc vôi
lô chüng và câc lô dùng thuôc vôi nhau.
Két qua: duoc xü lÿ theo phuong phâp thông kê âp dung cho sinh, y hoc [8]
ô nguông 5%.
■ Xü lÿ sai s6 thô : loai sai sô nghi ngô (b) ra khôi mâu
n -

Tînh :

1

X =

14


t = L ? L ztL

(2)

J n -1
So sânh t vôi ta n tra trong bàng
+ Néu t > ta n : so b là sai so thô , loai bô
+ Nëu t < ta n : so b không phâi sai s6 thô , giù la i.
■ Thôi gian ngü cüa chuôt duoc tmh theo công thuc:
y/n
Trong dô:
X : khoâng tin cây
X : trung bînh công thôi gian ngü cüa lô thü.
S: dô lêch chuân:
S

=
n(n-1)

t0: thay doi tuÿ theo bâc tu do cüa mâu phu thuôc vào xâc suât p cüa
phép tînh. à dây ta xü lÿ két quâ vôi p = 0,95 (95%)
■ Dë kiëm tra hai mâu thü cô thuc su khâc nhau cô ÿ nghîa thông kê
không, phâi dùng chi tiêu kiëm dinh Test t, tînh theo công thuc:
_

|AT,

-X ,

s Jy1n] +

-

n2

Trong dô:
X{

là trung bînh cüa mâu 1 cô n, con chuôt

X 2 là trung bînh cüa mâu 2 cô n2 con chuôt
S2C là phuong sai chung cüa hai mâu
s,

=

«, +n2-2

15


x^: thofi gian ngü cüa chuôt à mâu 1
x2i: thôi gian ngü cüa chuôt à mâu 2
Giâ tri t0 duorc tra trong bâng Student vôi bac tu do chung cüa hai mâu là:
itj + n2 - 2.

> Néu:
t > t0 thi hai mâu khâc nhau cô ÿ nghîa thông kê à nguông 5%.
t < t0thî hai mâu khâc nhau không cô ÿ nghîa thông kê à nguông 5%.
2.2 . K ÉT QUA THlTC NGHIÊM VÀ NHÂN XÉT.
2.2.1.Theo dôi ânh huông cüa nhiêt dô den sir doi màu cüa vi thuôc.
Thân rë Hoàng liên duoc tâch nhô, bô rê con, rüa sach phüi khô thâi phiên
chéo dây 2 - 4 mm, tan thành bôt thô.
Sây bôt thô duoc liêu ô câc müc t° khâc nhau trong khoâng thôi gian khâc
nhau (10 20 30 ’). Su dôi màu cüa vi thuôc duoc ghi à bâng 2.3.
Bàng 2.3: Su chuyén màu cüa vi thuoc Hoàng liên khi sây â nhiêt dô khâc nhau.
t sây
t°
(°C)

Màu cüa câc MNC
10

100
110
130
140
150
160
180
200
220
Nhân xét:

20
Vàng

Vàng
Vàng
Vàng dâm
Vàng nâu
Vàng nâu
Nâu den
Den

30
Vàng
Vàng
Vàng
Vàng dâm
Vàng nâu
Nâu
Den
Den

Vàng
Vàng
Vàng
Vàng
Vàng dâm
Nâu
Nâu dâm
Den
Den

> Câc mâu 100°C/30’, 110°C /10’, 20’, 30’, 130° / 10’, 20’, 30’,
140°C / 10 ; 20 ; màu câc mâu tuong duong nhau dêu cô màu vàng giông duoc

liêu sông.
> Câc mâu 140°C / 30 ; 150° / 10’, 20, 30 : câc mâu cô màu vàn
dâm, tuong duong vôi sao vàng.
> Câc mâu 200°C / 10’, 20, 30 ; 220°C / 10’, 20, 30 cô màu den
tuong duong sao chây.

16


2.2.2. Nghiờn cỷu sir bien doi alcaloid cõc MNC
2.2.2.I. Chiột xuõt alcaloid
Dựng phuong phõp chiột bng acid loõng trong MeOH [13]
So dụ chiột alcaloid duoc mụ tõ hợnh 2.1
Hinh 2.1: Sa dụ chiột xuõt alcaloid trong cõc MNC

Cõn chmh xõc 1 luong MNC theo bng 2.7. Chiột bng shoxhlet vụi dung
mụi MeOH: HCl ( 100 : 1), chiột tụi khi dich chiột khụng cụn tua vụi thuục thỹ
Mayer, Dragendorff. Cõt thu hụi MeOH trờn nụi cõch thu. Cõn alcaloid duoc
chiột bng nuục nụng 3 lõn, mụi lõn vụi 20 ml. Loc. Cụ cõch thu dich loc tụi
can. Cõn duoc ho vo MeOH, chuyởn vo binh dinh miic 50 ml, thờm MeOH tụi
vach. Duoc dich alcaloid (A).
2.2.2.2. Dinh tợnh alcaloid
*t* Dinh tinh bng thuoc thỹ chung:
Chiột xuõt alcaloid cỹa cõc MNC theo mue 2.2.2.1.
Dich (A) duoc dinh tmh bng cõc TT: Mayer, Dragendorff, Bouchardat.
Lõy 1 ml dich (A) cho lõn luot vo cõc ụng nghiờm, nhụ vo mụi ụng nghiờm 1
- 2 giot TT.
TT Mayer: phõn rùng duong tmh (+) khi xuõt hiờn tỹa trang.
TT Dragendorff: phõn ỷng duong tmh (+) khi xuõt hiờn tỹa vng cam.
TT Bouchardat: phõn ỷng duong tợnh (+) khi xuõt hiờn tỹa nõu.

Kờù qua : tõt cõ cõc MNC dờu cho phõn ỹng duong tợnh vụi TT chung alcaloid.


♦♦♦ Dinh tînh alcaloid bàng SKLM:
So sânh mâu sô'ng vôi câc MNC (ô t° và thdi gian khâc nhau) cô chat
chuân Ber, Pal, Rotundin.
■ Dich châm sâc kÿ:
* MNC: Lây 1 ml dich (A) ô mue 2.2.2.1, cô can kiêm hoâ bàng amoniac
10%, chiét alcaloid base bàng cloroform, gan lây lôp cloroform, bôc hoi
cloroform duoc cân. Hoâ tan cân trong 1 ml MeOH duoc dich châm MNC.
* Alcaloid chuân: Ber clorid, Pal sulfat, rotundin; kiêm hôa bàng amoniac
10%, chiët alcaloid base bàng cloroform, bôc hoi cloroform dén cân. Hoà tan can
trong 1 ml MeOH duoc dich châm chât chuân.
■ Chât hâp phu: silicagen GF254 (hâng Merck) kfch thuôc 10 cm x 10
cm, hoat hoâ ô 110°C trong 30 phüt
■ Hê dung môi khai triën:
n Butanol: acid acetic bàng: nuôc [ 7 : 1 : 2 ]
■
Hiên màu: *Soi duôi ânh sang tir ngoai X = 366 nm
*TT Dragendorff
Két quâ phân tfch duoc ghi ô bàng 2.4 ,2.5, ânh 2 . 2, 23
Anh 2.2: Két quâ phân tich alcaloid trong câc MNC bàng SKLM
( hiên màu bàng TT Dragendorff)

lU .V IIW '
\

■M
' -m

B

P

R

S

z

150° 160° 160° 160° 180° 180° 180° 200° 200° 200° 220° 220° 220°
30'

10’ 20’

30’ 10’

20’

18

30’

10’ 20’

30’ 10’ 20’

30’

*1

Anh 2.3: Két qua phân tich alcaloid trong câc MNC bàng SKLM
( hiên màu bàng ânh sâng tü ngoai  = 366 nm )

x
3

2

1

B

o

100
30'

o

O

110 110
10’ 20’

O

110
30'

O

130
10'

O

130
20'

O

130
30’

B

P

R

140° 140° 140° 150° 150° 150° 160° 160° 160°
10’ 20' 30’ 10’ 20' 30' 10' 20' 30'

BP

R

R : Rotundin chuân

Ghi chu : B : Ber chuân

S : MNC sông

P : Pal chuân

19

180° 180° 180° 200° 200° 200° 220° 220° 220°
10’ 20'
30’ 10' 20' 30' 10' 20’ 30’


Bàng 2.4 : Két qua phân tich alcaloid bàng SKLM
(hiên màu diroi dèn tur ngoai A = 366 nm)
Rf câc vet

Chat chuan
B

1

0,42

2

0,52

3

0,61

X

0,68

P

+

Sông

R

++

+

100°C

110°C

130°C

140°C

150°C

160°C

30'

10'

20’

30’

10'

20’

30’

10'

20’

30’

10'

20’

30’

10'

20’

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

180°C
30’

10'

20’

200°C
30’

220“C

10'

20’

30’

10'

20’

30’

+

+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

+

++

+++

++

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

++

++

+++

+++

+

Bàng 2.5: Két quâ phân tich alcaloid bàng SKLM
( hiên màu bàng TT dragendorff )
Rf

Chat chuan
B

1

0,42

2

0,52

3

0,61

X

0,68

4

0,70

P

Sông

R

+
+

100W
C

110°C

130°C

140°C

150°C

160"C

30’

10'

20’

30’

10’

20’

30’

10'

20’

30’

10'

20’

30’

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

180°C

* Ghi chu:
B: Ber berin

+ : vêt nhô

P: Palmatin

++: vêt vira

R: Rotundin

+++: vêt to

Chat moi sinh ra dàt tên là X

20

220#C

20’

30’

10’

20’

30’

10'

20’

30’

10

20’

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+++

++

++

++

++

++
+

200°C

10'

30’

++

++

+

+

+

+

+

+

++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++