Nghiên cứu tách phân đoạn protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (spongia sp ) theo phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TRẦN CAO PHƯƠNG VŨ

NGHIÊN CỨU TÁCH PHÂN ĐOẠN PROTEIN CĨ
HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TỪ DỊCH CHIẾT
HẢI MIÊN (SPONGIA SP.) THEO PHƯƠNG PHÁP
KẾT TỦA BẰNG AMMONIUM SULFATE

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Chế biến thủy sản

NHA TRANG – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TRẦN CAO PHƯƠNG VŨ

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH CHIẾT VÀ KHẢO
SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA
DỊCH CHIẾT TỪ CÂY SẢ CHANH
(CYMBOPOGON CITRATUS STAPF)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Chế biến thủy sản

Giáo viên hướng dẫn:
TS. HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO

NHA TRANG – 2015


i

Lời cảm ơn
Để hoàn thành đợt thực tập tốt nghiệp này ngoài nỗ lực không ngừng của bản
thân em còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía gia đình, thầy cô, bạn bè. Trước
hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa
Công Nghệ thực Phẩm, Phòng Đào tạo niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại
trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được giành cho Thầy Huỳnh Nguyễn Duy Bảo
đã tận tình hướng dẫn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt
nghiệp này.
Xin cám ơn Thầy Vũ Ngọc Bội - Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn
Công nghệ Chế biến thủy sản, Ban giám đốc và các anh chị quản lí phòng thí
nghiệm Công nghệ Sinh học, phòng thí nghiệm Công nghệ Chế biến thuộc Trung
tâm thí nghiệm thực hành trường Đại học Nha Trang và các anh chị học viên cao
học đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động
viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua.
Nha Trang, ngày 28/06/2015
Sinh viên thực hiện
Trần Cao Phương Vũ

ii

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................................. i
MỤC LỤC.................................................................................................................. ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii
Lời mở đầu ..................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................3
1.1. Giới thiệu về hải miên..................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm sinh học và tập tính sống của hải miên.............................3
1.1.2. Phân loại, môi trường sống ...............................................................9
1.1.3. Cấu tạo cơ thể..................................................................................11
1.1.4. Đặc điểm của các nhóm hoạt chất sinh học chống oxy hóa có trong hải
miên.........................................................................................................................15
1.1.5. Tình hình nghiên cứu về hải miên trên thế giới và Việt Nam.........17
1.2. Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và khả năng chống oxy hóa của protein21
1.2.1. Quá trình oxy hóa............................................................................21
1.2.1.1.Gốc tự do...............................................................................................21
1.2.1.2. Nguồn gốc hình thành các gốc tự do .......................................22
1.2.2. Chất chống oxy hóa.........................................................................22
1.2.2.1 Khái niệm chất chống oxy hóa .................................................22
1.2.2.2. Cơ chế chống oxy hóa .............................................................22
1.2.3. Khả năng chống oxy hóa của protein..............................................23
1.3. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa và phân đoạn protein ....25
1.3.1. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa............................25
1.3.2. Các phương pháp tinh sạch protein.................................................27
1.3.2.1. Phương pháp kết tủa protein bằng muối..................................27

1.3.2.2. Phương pháp kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ ..............29


iii

1.3.2.3. Phương pháp kết tủa protein ở điểm đẳng điện.......................29
1.3.2.4. Phương pháp kết tủa protein bằng các non–ionic polymer .....29
1.3.2.5. Phương pháp kết tủa protein bằng ion kim loại ......................30
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................31
2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất .......................................................................31
2.1.1. Nguyên liệu .....................................................................................31
2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................31
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................31
2.2.1. Bố trí thí nghiệm .............................................................................31
2.2.1.1 Quy trình tách chiết phân đoạn protein lần 1 dịch chiết từ hải miên.33
2.2.1.2. Quy trình tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1........35
2.2.1.3. Quy trình tinh chế protein từ các phân đoạn protein...............36
2.2.2. Các phương pháp phân tích.............................................................39
2.2.2.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH..........39
2.2.2.2. Phương pháp phân tích tổng năng lượng khử .........................39
2.2.2.3. Phương pháp Lowry ................................................................40
2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm..................................40
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................41
3.1. Hoạt tính chống oxy hóa, mối tương quan giữa protein và hoạt tính chống
oxy hóa của các phân đoạn lần 1 từ dịch chiết hải miên...................................41
3.2. Hoạt tính chống oxy hóa, mối tương quan giữa protein và hoạt tính chống
oxy hóa của các phân đoạn lần 2 từ dịch chiết hải miên...................................46
3.3. Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế đến hoạt tính sinh học của các phân
đoạn protein từ dịch chiết hải miên...................................................................55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................59

1. Kết luận .........................................................................................................59
2. Kiến nghị. ......................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................60
PHỤ LỤC..................................................................................................................62


iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine.
AS: Ammonium sulfate.
AA: Ammonium acetate.
UV – Vis (Ultraviolet – Visite): Tử ngoại – khả kiến.


v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hải miên ......................................................................................................3
Hình 1.2. Hải miên nước ngọt Spongilla lacustris ......................................................4
Hình 1.3. Loại tế bào chính của Porifera [13]...........................................................11
Hình 1.4. Giải phẩu cấu tạo cơ thể hải miên .............................................................14
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Purpurone ...............................................................19
Hình 1.6. Các dẫn xuất của Subergorgic axit............................................................19
Hình 1.7. Độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối. .............................28
Hình 2.1. Loài hải miên Spongia sp. lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc ......................31
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát..............................................................32
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein lần 1 từ dịch chiết hải miên ......33
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1. ............35
Hình 2.5. Quy trình tinh chế protein từ các phân đoạn. ............................................38

Hình 3.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn lần 1 từ nồng độ AS
bão hòa 20% đến 80% và dịch chiết hải miên thô ban đầu. Số liệu trên đồ thị là giá
trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ................................................................................41
Hình 3.2. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của các phân đoạn protein dịch chiết hải
miên lần 1. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký
tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..........................43
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện hàm lượng protein của các phân đoạn. Số liệu trên đồ thị là
giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). .........................................................................44
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa protein và khả năng khử gốc tự do
của các phân đoạn protein từ phân đoạn lần 1. .........................................................45
Hình 3.5. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa tổng năng lực khử của các phân đoạn
lần 1 với protein có trong các phân đoạn đó. ............................................................46


vi

Hình 3.6. Đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn protein
lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự
khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..............................48
Hình 3.7. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của các phân đoạn lần 2 từ các phân
đoạn lần 1. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký
tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..........................50
Hình 3.8. Đồ thị so sánh khả hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn tốt nhất
trong phân đoạn lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ±
SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). .....51
Hình 3.9. Hàm lượng protein trong phân đoạn protein lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá
trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ................................................................................53

Hình 3.10.Đồ thị thể hiện mối tương quan giữ khả năng khử gốc tụ do
DPPH với hàm lượng protein

................................................................................54

Hình 3.11. Đồ thị thể hiên mối tương quan giữa protein và tổng năng lực khử của
các phân đoạn protein lần 2.......................................................................................54
Hình 3.12. Đồ thị tổng năng lực khử của các phân đoạn sau khi tinh chế. Số liệu trên
đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ............................................................55
Hình 3.13. Đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn protein.

Số

liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau
thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ..............................................56
Hình 3.14. Đồ thị thể hiện hàm lượng protein của các phân đoạn sau khi tinh chế. Số
liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau
thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ...............................................57


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. So sánh giữa các lớp hải miên. .................................................................10
Bảng 1.2. Sự khác nhau giữa các lớp hải miên sống trong các phạm vi khác
nhau của môi trường sống .........................................................................................11
Bảng 2.1. Nồng độ AS bão hòa ở 40C và 100C.........................................................34

1

Lời mở đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay khi cuộc sống ngày càng phát triển, khi cái ăn cái mặt không còn là vấn
đề lớn thì người ta bắt đầu quan tâm hơn tới sức khỏe của mình, họ luôn đòi hỏi những sản
phẩm có chất lượng ngày càng tốt hơn, chính điều này cùng với sự phát triển của các thiết
bị khoa học hiên đại đã thúc đẩy các nhà khoa học trên thế giới không ngừng tìm tòi,
nguyên cứu, để tìm ra các chất mới từ các loài sinh vật mới có các tác dụng đặt biệt có khả
năng phòng ngừa, đều trị và nâng cao sức khỏe cho con người.
Đến nay, con người đã nhận biết và gọi tên được hơn 1.400.000 loài sinh vật
trên thế giới. Nhưng trong những khu rừng nhiệt đới hay trong lòng đại dương bao
la vẫn còn nhiều loài sinh vật mà con người chưa từng biết về chúng. Theo ước tính
của các nhà khoa học, trên trái đất có khoảng 10 triệu loài sinh vật. Cũng có con số
thống kê lên đến 30.000.000 loài. Từ đó có thể thấy rằng, hiểu biết của loài người
chúng ta về thế giới sinh vật phong phú này còn rất khiêm tốn.
Việt Nam với diện tích đất liền hơn 330 ngàn km2 và diện tích phần nước gấp
hơn 4 lần diện tích đất liền bao gồm các sông, hồ, biển và đại dương cùng với việc
là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới nên có nhiều điều kiện cho các sinh vật phát triển
và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau,
đặc biệt là các sinh vật biển, có nhiều loài sinh vật có giá trị cao mang lại nhiều lợi
ích về khoa học, y tế, kinh tế chưa được quan tâm nguyên cứu vì vậy vấn đề cấp
thiết đặc ra là phải phát huy được những giá trị mà sinh vật đó mang lại bằng những
phương pháp nguyên cứu đúng đắng, thích hợp, có hệ thống.
Hải miên là một động vật biển còn rất xa lạ với người Việt Nam, với số
lượng nhiều, đa dạng về chủng loài. Ở Việt Nam có rất nhiều điều kiện thuận lợi
cho các loài hải miên cùng với các động vật ký sinh sinh sống và phát triển. Tuy
nhiên các nghiên cứu về hoạt chất sinh học từ hải miên vẫn còn khá mới mẻ, những
nghiên cứu, đánh giá cũng như ứng dụng các hoạt tính sinh học của hải miên ở Việt

Nam vẫn còn rất khiêm tốt, chưa khai thác được nguồn tài nguyên biển vô cùng quý


2

giá này, mặt dù giá trị mà nó mang lại là rất lớn, đặc biệt là giá trị vệ mặt y tế, dược
phẩm. Vì vậy em xin chọn đề tài "Nghiên cứu tách phân đoạn protein có hoạt
tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) theo phương pháp kết
tủa bằng ammonium sulfate" từ đó làm cơ sở cho các nguyên cứu tách chiết, tinh
chế các chất chống oxy hóa từ Hải Miên sau này.
2. Mục tiêu của đề tài
Tách phân đoạn protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên
(Spongia sp.) theo phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate (AS).
3. Ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học của đề tài.
- Ý nghĩa khoa học:
Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống từ việc tìm chọn các thông số
cho việc kết tủa phân đoạn protein có hoạt tính sinh học từ hải miên, vì vậy là
nguồn bổ sung các tư liệu có tính khoa học về các protein có hoạt tính sinh, hóa của
hải miên. Các kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong
phú cho các nhà nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ hải miên nói riêng và
các loài động vật khác nói chung, đồng thời khuyến khích các công trình nguyên
cứu, tìm tòi các loại sinh vật chưa được biết đến dưới đại dương nhằm bổ sung 1
lượng kiến thức khoa học lớn cho nhân loại và nâng cao được giá trị của các loài
sinh vật đó, cũng như lợi ích mà đại dương đem lại cho chúng ta.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm sử
dụng các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ hải miên trong y, dược học và đời
sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của hải miên. Thành công của đề tài mở
ra một hướng mới trong việc sản xuất các loại sản phẩm chức năng và các loại thuốc dùng
trong y học nhằm nâng cao sức khỏe con người, thúc đẩy nền kinh tế nước nhà.

4. Nội dung.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn protein kết tủa từ
dịch chiết hải miên (Spongia sp.) bằng ammonium sulfate có nồng độ khác nhau.
-

Thử nghiệm tinh chế protein từ các phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về hải miên

`Hình 1.1. Hải miên
Hải miên là loài động vật không xương sống có cấu tạo rất đơn giản sống
vĩnh viễn gắn liền với một vị trí trong nước. Có từ 5.000 đến 10.000 loài đã được
biết. Hầu hết hải miên sống ở nước mặn, chỉ có khoảng 150 loài sống ở nước ngọt.
Hải miên là một sinh vật cổ đại đã sống trong các vùng biển trên thế giới hơn 600
triệu năm.
Cơ thể của động vật hoang dã này có hàng ngàn lỗ nhỏ để cho nước chảy qua
liên tục và nhờ đó nó được nuôi dưỡng và lấy oxytừ dòng nước chảy qua cơ thể
chính vì thế hải miên còn được gọi là động vật thân lỗ.
1.1.1. Đặc điểm sinh học và tập tính sống của hải miên
- Đặc điểm sinh học:
Hải miên là động vật đa bào, dị dưỡng, thiếu các vách tế bào và sản xuất các
tế bào tinh trùng. Không giống như các loài động vật khác, chúng thiếu mô và bộ
phận cơ thể, và không có đối xứng cơ thể. Các hình dạng cơ thể sẽ thích nghi cho
hiệu quả tối đa lượng nước chảy qua khoang trung tâm, nơi đó có các cơ quan thu

4

nhận các chât dinh dưỡng thông qua một lỗ gọi là osculum. Nhiều loài hải miên có
bộ xương bên trong và/hoặc có gai của canxi cacbonat hoặc silicon dioxide. Tất hải
miên là động vật không xương sống. Có một số sống ở nước ngọt, nhưng đại đa số
sống ở biển có nhiều loài khác nhau, từ các khu thủy triều đến độ sâu vượt quá
8.800 m.
Có khoảng 5.000 - 10.000 loài hải miên đã được biết đến, chúng ăn vi khuẩn và
thức ăn khác trong nước. Một vài loài hải miên sống trong môi trường nghèo chất
dinh dưỡng đã trở thành động vật ăn thịt mà chủ yếu là ăn các động vật nhỏ, động
vật giáp xác [4].
Cơ thể hải miên có hai lớp bên ngoài ngăn cách bởi một lớp gel (không có tế
bào) gọi là mesohyl (còn gọi là mesenchyme). Trong lớp gel hoặc là spicules (kim hỗ
trợ tạo từ canxi cacbonat) hoặc sợi spongin (một loại xương linh hoạt có cấu tạo từ
protein). Hải miên không có mô tạng, các loại hải miên khác nhau tạo thành hình
dạng khác nhau, bao gồm cả ống, quạt, ly, nón, đụn, thùng và lớp vỏ có kích thước từ
vài mm cho tới 2 mét.
Giống như các động vật ngành Thích ty bào như sứa và sứa phiến lược và
không giống như tất cả các động vật đa bào khác đã biết, cơ quan hải miên bao gồm
một phi sinh khối thạch giống như kẹp giữa hai lớp chính của các tế bào.
- Sinh sản:
+ Sinh sản vô tính:

Hình 1.2. Hải miên nước ngọt Spongilla lacustris


5

Hải miên có ba phương pháp sinh sản vô tính: phân mảnh; nảy chồi; và bằng
cách sản xuất gemmules. Những mảnh vỡ của hải miên có thể được tách ra bởi các

dòng chảy hoặc sóng. Chúng sử dụng các tính di động của pinacocytes, choanocytes
và tái định hình của mesohyl lại gắn mình vào một bề mặt phù hợp và sau đó xây
dựng lại bản thân như hải miên nhỏ nhưng diễn ra theo một quá trình trong một vài
ngày. Một mảnh hải miên chỉ có thể tái sinh nếu nó chứa cả collencytes để sản xuất
mesohyl và archeocytes để sản xuất tất cả các loại tế bào khác [18]. Một số rất ít
loài sinh sản bằng cách nảy chồi [9].
Gemmules là "kén sống còn" mà một vài loài hải miên và nhiều loài hải miên
nước ngọt sản xuất hàng ngàn khi chết và một số trong đó, chủ yếu là các loài hải
miên nước ngọt, thường xuyên sản xuất vào mùa thu. Spongocytes làm gemmules
bằng cách gói vỏ spongin, thường được gia cố bằng gai, cụm vòng của archeocytes
có đầy đủ các chất dinh dưỡng [9]. Gemmules nước ngọt cũng có thể bao gồm
phytosynthesizing vật cộng sinh [18]. Các gemmules sau đó trở thành không hoạt
động, và trong trạng thái này có thể tồn tại ở các điều kiện lạnh, khô, thiếu oxyvà
các biến thể cực đoan ở độ mặn [9]. Gemmules thường không hồi sinh cho đến khi
nhiệt độ giảm xuống, giữ lạnh cho một vài tháng và sau đó đạt đến một mức bình
thường [10]. Khi một hạt nảy gemmule, các archeocytes quanh bên ngoài của cụm
biến thành pinacocytes, các cụm tế bào từ từ nổi lên và hầu hết các archeocytes còn
lại biến thành các loại tế bào khác cần thiết để làm cho một miếng hải miên hoạt
động. Gemmules từ cùng một loài nhưng các cá nhân khác nhau có thể tham gia lực
lượng để tạo thành một miếng hải miên [9].
+ Sinh sản hữu tính:
Hầu hết hải miên là loài lưỡng tính (có chức năng như cả hai giới cùng một
lúc), mặc dù hải miên không có tuyến sinh dục (cơ quan sinh sản). Tinh trùng được
sản xuất bởi choanocytes hoặc toàn bộ buồng choanocyte đó chìm vào mesohyl và
tạo thành tinh nang trong khi trứng được hình thành bởi sự biến đổi của archeocytes,
hoặc của choanocytes ở một số loài. Mỗi quả trứng thường có được một lòng đỏ
bằng cách tiêu thụ các tế bào cung cấp dinh dưỡng. Trong thời gian đẻ trứng, tinh


6

trùng vỡ ra khỏi nang và bị trục xuất qua các osculum. Tinh trùng được dòng nước
mang đi, khi gặp các hải miên cùng loài, thay vì bị tiêu hóa, chúng được ameboid
hình thức qua mesohyl với trứng.
Một vài loài đẻ trứng đã được thụ tinh vào trong nước, nhưng hầu hết giữ lại
những quả trứng cho đến khi chúng nở. Có bốn loại ấu trùng, nhưng tất cả là bóng
của các tế bào với một lớp bên ngoài của các tế bào có roi hoặc lông mao cho phép
ấu trùng di chuyển. Sau khi bơi trong một vài ngày ấu trùng thu thập dữ liệu cho
đến khi chúng tìm thấy một nơi thích hợp để sinh sống. Hầu hết các tế bào biến đổi
thành archeocytes và sau đó thành các loại phù hợp với vị trí đã chọn sau đó phát
triển đầy đủ như một miếng hải miên trưởng thành nhưng với kích thước thu nhỏ [9].
- Phòng thủ:
Hầu hết các loài hải hiên sống trong trạn nhiệt đới đã phát triển các phương
tiện để tạo ra một loạt các hợp chất hóa học để tự vệ hoặc để ngăn chặn các sinh vật
khác phát triển trên cơ thể của mình. Các Nudibranch màu sắc rực rỡ là một ví dụ rõ
ràng về một nhóm động vật mà không chỉ sản xuất các hợp chất phòng thủ độc hại
mà nó muốn cảnh báo bởi màu sắc rực rỡ. Trong khi nhiều hải miên không phô
trương độc tính của nó qua những màu sắc rực rỡ mà nó có thể sản xuất ra một số
các hợp chất phức tạp nhất được tìm thấy ở bất cứ đâu trên rạn san hô trên thế giới.
Từ nhiều năm nay, khoa học đã thu thập và phân tích một hợp chất trên nhiều miếng
hải miên để sử dụng trong các lĩnh vực y tế để chống lại căn bệnh ung thư của con
người và cho họ sử dụng như một chất kháng khuẩn. Nhiều người nghĩ rằng trong
số các hợp chất này có thể được hải miên sử dụng như một hình thức chiến tranh
hóa học (allelopathic) chống đóng cặn hoặc ngăn cản các sinh vật xâm lấn bao gồm
các hải miên khác. Hải miên không có hệ thống miễn dịch phức tạp như của hầu hết
các loài động vật khác. Tuy nhiên nó từ chối ghép từ các loài khác, nhưng chấp
nhận chúng từ các thành viên khác của cùng một loài. Trong một vài loài hải miên,
các tế bào màu xám giữ vai trò chủ đạo trong việc từ chối các loài khác. Khi chiếm
được, nó sản xuất ra một chất hóa học làm dừng chuyển động của các tế bào khác
trong khu vực bị ảnh hưởng, do đó ngăn ngừa sự xâm nhập từ việc sử dụng hệ

7

thống giao thông nội bộ của miếng hải miên. Nếu sự xâm nhập vẫn tồn tại, các tế
bào màu xám tập trung trong khu vực và giải phóng độc tố giết chết tất cả các tế
bào trong khu vực. Hệ thống "miễn dịch" có thể ở trong trạng thái kích hoạt này cho
đến ba tuần [10].
- Tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa và bài tiết:
Hải miên không có khác biệt về hệ thống tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa và bài
tiết thay vào đó hệ thống dòng chảy hỗ trợ tất cả các chức năng này. Nó lọc các hạt
thức ăn ra khỏi nước khi cho dòng nước chảy qua. Các hạt lớn hơn 50 micromet
không thể vào, Ostia và pinacocytes tiêu thụ chúng bằng các thực bào (engulfing và
tiêu hóa nội bộ). Các hạt từ 0,5 micromet đến 50 micromet đang bị mắc kẹt trong
Ostia, những hạt này được xử lý bởi pinacocytes hoặc bởi archaeocytes. Vi khuẩn
có kích thước hạt, dưới 0,5 micromet, đi qua Ostia và sau đó được giữ lại bởi
choanocytes [9], choanocytes giữ lại 80% nguồn cung cấp chất dinh dưỡng của một
miếng hải miên [18]. Tại đây các chaeocytes có nhiệm vụ đóng gói, vận chuyển chất
dinh dưỡng trong các túi từ tế bào trực tiếp tiêu hóa thức ăn cho những cơ quan khác.
Tế bào hải miên hấp thụ oxykhuếch tán từ nước vào tế bào khi nước chảy
qua thân, đồng thời carbon dioxide và các sản phẩm chất thải hòa tan khác như
amoniac cũng lan tỏa. Archeocytes loại bỏ các hạt có kích thước lớn đang đe dọa sẽ
chặn các Ostia, vận chuyển chúng qua mesohyl và thường thải chúng lại vào trong
nước, mặc dù một số loài kết hợp chúng vào xương của chúng [9].
Một vài loài sống trong vùng biển nơi các loại thức ăn dạng hạt rất nghèo chỉ
có các loại động vật giáp xác và động vật nhỏ khác. Vì vậy, đến nay chỉ có 137 loài
đã được phát hiện [4]. Hầu hết thuộc về loài Cladorhizidae, nhưng một vài thành
viên của loài Guitarridae và Esperiopsidae cũng là loài ăn thịt [15]. Trong hầu hết
các trường hợp ít được biết về cách thức thực sự của hải miên khi bắt mồi, mặc dù
một số loài được cho là sử dụng một trong hai cách dính hoặc tạt gai [15][16]. Hầu

hết hải miên ăn thịt sống ở vùng nước sâu, lên đến 8840 m [7] và sự phát triển của
kỹ thuật thăm dò đại dương sâu dẫn đến việc phát hiện ra nhiều thông tin hơn. Tuy
nhiên một trong những loài đã được phát hiện trong một hang động ở độ sâu 17-23


8

m (56-75 ft) ở Địa Trung Hải, thì việc ăn các động vật giáp xác và động vật nhỏ
thường xuyên hơn viêc ăn bằng cách lọc. Các loại hải miên ăn thịt động vật giáp
xác ,trong các hang đông, bằng cách chụp lấy chúng sau đó quấn lấy và tiêu hóa
chúng bằng cách bao bọc chúng trong một vài ngày, và sau đó quay trở lại hình
dạng bình thường của nó; không có bằng chứng cho thấy chúng sử dụng nọc độc [18].
Các loài hải miên ăn thịt được biết hầu hết đã hoàn toàn mất hệ thống dòng
chảy và choanocytes. Tuy nhiên các chi Chondrocladia sử dụng một hệ thống dòng
chảy đã đươc tiến hóa để làm tăng khả năng săn bắt con mồi [15][8].
- Vòng đời:
Hải miên trong vùng ôn đới sinh sống trong ít nhất một vài năm, nhưng một
số loài sống ở vùng nhiệt đới và cũng có thể ở những đại dương sâu có thể sống 200
năm hoặc hơn. Một số bị vôi hóa demosponges chỉ tăng 0,2 mm (0,0079 in) mỗi
năm và nếu tỷ lệ đó là hằng số thì vật mẫu có kích thước 1 m (3.3 ft) phải được
khoảng 5.000 năm tuổi. Một số loài hải miên bắt đầu sinh sản hữu tính khi chỉ một
vài tuần tuổi, trong khi những loài khác chờ đợi cho đến khi vài năm tuổi [18].
- Kẻ thù:
Hải miên có kẻ thù là Sponge ruồi, còn được gọi là spongilla-ruồi (bộ cánh
gân , Sisyridae), là loài chuyên săn các loại hải miên nước ngọt. Con cái đẻ trứng
của mình trên thảm thực vật nước nhô. Ấu trùng nở và duy chuyển vào nước, sau đó
tìm hải miên để ăn. Chúng sử dụng phần miệng thuôn dài của chúng để xuyên qua
miếng mải miên và hút chất lỏng bên trong. Ấu trùng của một số loài bám vào bề
mặt của miếng hải miên trong khi những loài khác thì nương náu trong hốc trong
của miếng hải miên. Các ấu trùng trưởng thành hoàn toàn thoát ra khỏi nước và

quay một cái kén, trong đó để thành nhộng [7].
- Phối hợp với các sinh vật khác:
Hải miên được ghi nhận của chúng về sự hợp tác với các sinh vật khác trên
phạm vi rộng [18]. Việc đóng cặn xốp Lissodendoryx colombiensis là phổ biến nhất
trên bề mặt đá, nhưng hải miên đã mở rộng phạm vi của chúng nhờ cỏ biển, bằng
cách cho phép cỏ biển được bao quanh hoặc mọc trên người chúng, ngăn chặn sự


9

lấn áp của các loài sao biển bản địa và do đó bảo vệ Lissodendoryx; bù lại hải
miên-cỏ biển có được vị trí cao hơn đi từ trầm tích biển tầng [10].
Tôm thuộc chi Synalpheus là loại tôm sống bên trong miến hải miên, mỗi
loài tôm sống ở một loài hải miên khác nhau. Cụ thể, synalpheus regalis sử dụng
miếng hải miên không chỉ như là một nguồn thức ăn, mà còn là một bảo vệ chống
lại các loài tôm và động vật ăn thịt khác [11], số lượng có thể lên tới 16.000 cá nhân
sống trong một đơn sponge caretta, ăn thức ăn là các hạt lớn hơn mà chúng thu thập
trên các miếng hải miên khi được các miếng hải miên lọc ra [12].
1.1.2. Phân loại, môi trường sống
- Phân loại:
Hải miên được phân phối theo truyền thống thành ba lớp: hải miên đá vôi
(Calcarea), hải miên thủy tinh (Hexactinellida) và Demosponges (Demospongiae).
Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong nhóm Demospongiae có sự khác biệt
về

phylogenetically

nên

người

ta

chia

ra

thành

Demospongiae

và

Homoscleromorpha. Gần đây họ đã công nhận Homoscleromorpha là lớp thứ tư của
hải miên [18][9].
Hải miên được chia thành các lớp chủ yếu theo các thành phần của xương theo
bảng sau:


10

Bảng 1.1. So sánh giữa các lớp hải miên.
Loài

Loại tế bào

Gai

Spongin Bộ xương
sợi

ngoài lớn

Hình dáng cơ
thể

Calcarea

Calcite
Asconoid,
Nhân đơn, Có thể là cá
Được làm
syconoid,
màng đơn nhân hoặc Không bằng calcite
leuconoid hoặc
bên ngoài khối lượng
nếu có.
điện từ
lớn

Hexactinellidas

Chủ yếu là
Silica
syncytia Có thể là cá
Không
trong tất cả nhân hoặc
các loài
hợp nhất

Không

Demospongiae

Nhân đơn,
màng đơn
bên ngoài

Silica

Ở một số
loài.
Ở nhiều
Xuất xứ của
loài
aragonit nếu
có.

Homoscleromorpha

Nhân đơn,
màng đơn
bên ngoài

Silica

Ở nhiều Không bao
loài
giờ

Leuconoid

Leuconoid

Sylleibid hoặc
leuconoid

- Môi trường sinh sống:
Hải miên hầu như là có mặt trên toàn thế giới, chúng sống trong một loạt các
môi trường sống dưới đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới [15]. Hầu
hết sống trong vùng biển yên tĩnh, bởi vì trầm tích khuấy động bởi sóng hoặc dòng
sẽ chặn các lỗ chân lông, làm cho chúng khó khăn trong việc ăn và thở [12]. Phần
lớn hải miên thường được tìm thấy trên bề mặt vững chắc như đá, nhưng một số
loài có thể gắn vào trầm tích mềm mại bằng phương tiện của một cơ sở gốc như thế
nào [14].
Hải miên dồi dào hơn ở vùng biển ôn đới nhưng ít đa dạng hơn so với ở vùng
nhiệt đới, có thể vì các sinh vật và con mồi của chúng phong phú ở vùng biển nhiệt


11

đới [15]. Hải miên kính là phổ biến nhất ở vùng biển Bắc cực và trong chiều sâu
của vùng biển ôn đới và nhiệt đới, cơ thể rất xốp cho phép họ trích xuất thực phẩm
từ các vùng biển nghèo thức ăn mà không cần phải hoạt động nhiều. Demosponges
và hải miên đá vôi phong phú và đa dạng ở các vùng nước không phân cực nông
hơn [16].
Bảng 1.2. Sự khác nhau giữa các lớp hải miên sống trong các phạm vi khác
nhau của môi trường sống
Loài
Calcarea

Loại nước
Ở biển

Hải miên
Ở biển
thủy tinh
Biển, nước lợ
Demospon
hoặc
nước
ges
ngọt

Độ sâu
ít hơn 100 m (330 ft)
Sâu

Loại bề
mặt
Cứng
Mềm hoặc
trầm tích

Một Demosponge ăn thịt đã được
Bất kỳ
tìm thấy tại 8840 m

1.1.3. Cấu tạo cơ thể

Mesohyl

Pinacocyte
Choanocyte
Lophocyte
Porocyte
Tế bào trứng
Archeocyte
Sclerocyte
Spicule
Lưu lượng nước

Hình 1.3. Loại tế bào chính của Porifera [13]


12

- Loại tế bào:
Cơ thể của miếng hải miên là rỗng và được tổ chức hình dạng bằng các
mesohyl, một chất giống như thạch được làm chủ yếu bằng collagen và củng cố bởi
một mạng lưới dày đặc của sợi cũng được làm bằng collagen. Bề mặt bên trong
được phủ bằng choanocytes, các tế bào có hình trụ hoặc hình nón đai xung quanh
mỗi một roi là một choanocyte. Các chuyển động sóng của roi lái nước qua cơ thể
của miếng hải miên. Tất cả hải miên có Ostia, các kênh vận chuyển hàng đầu với
các cơ quan thông qua các mesohyl và trong hầu hết các miếng xốp này được điều
khiển bởi ống giống như porocytes hình thành van hút gió closable. Pinacocytes,
các tế bào giống như tấm, tạo thành một làn da bên ngoài duy nhất, lớp trên tất cả
các bộ phận khác của mesohyl không được bao phủ bởi choanocytes và pinacocytes
cũng tiêu hóa các hạt thức ăn quá lớn để nhập Ostia [9][10], trong khi những cơ
quan khác có trách nhiệm giữ nó [10].
Mesohyl (mesenchyme) - lớp gelatin giữa các cơ thể bên ngoài của miếng hải
miên và các spongocoel (khoang bên trong).

Các loại tế bào sống và di chuyển trong mesohyl [9][10]:
•

Lophocytes là amip tế bào mà di chuyển chậm qua mesohyl và tiết ra các

sợi collagen.
•

Collencytes là một loại tế bào collagen sản xuất.

•

Rhabdiferous tế bào tiết ra polysaccharides đó cũng là một phần của

mesohyl.
•

Tế bào trứng và tinh trùng là những tế bào sinh sản.

•

Sclerocytes tiết ra các khoáng gai (gai nhỏ) đã hình thành bộ xương của

nhiều hải miên và trong một số loài này cung cấp một số bảo vệ chống lại kẻ thù..
•

Thêm vào hoặc thay vì sclerocytes, demosponges có spongocytes tiết ra

một dạng collagen polymerizes vào spongin, một loại vật liệu dạng sợi dày cứng
mesohyl.

•

Tế bào cơ (các tế bào cơ bắp) tiến hành các tín hiệu.

•

"Các tế bào xám" hành động như một hệ thống miễn dịch .


13

Archaeocytes (hoặc amoebocytes ) là totipotent. Các tế bào có giả hành, nằm
trong mesohyl, có khả năng chuyển đổi thành bất kỳ loại hình khác của tế bào.
Chúng được sử dụng trong tiêu hóa thức ăn, phân phối nó tới các tế bào khác, và cho
các chức năng khác.
Một số loại tế bào có một nhân đơn và màng nhân, nhưng được kết nối với
các tế bào nhân đơn khác và các hợp bào chính bởi cầu nối làm bằng tế bào chất.
Các sclerocytes được tạo thành gai có nhiều hạt nhân, và trong ấu trùng hải miên
thủy tinh chúng kết nối với các mô khác bằng cầu tế bào chất; các kết nối như vậy
giữa sclerocytes đến nay vẫn không được tìm thấy ở hải miên trưởng thành. Những
cây cầu được kiểm soát bởi mối nối cắm có thể cho phép hoặc ngặn một số chất
vượt qua[15].
- Lưu lượng nước và cấu trúc cơ thể:
Choanocyte - còn được gọi là tế bào cổ áo, choanocytes lót khoang bên trong
của miếng hải miên. Chúng có một nếp, hình phễu cổ áo (thu thập các hạt thức ăn) và
một roi (roi xung quanh, di chuyển nước). Các miếng hải miên có được chất dinh
dưỡng và oxycủa nó bằng cách xử lý choanocytes nước chảy qua. Choanocytes cũng
tham gia vào tái sản xuất xốp; bắt nổi tinh trùng.
Lớp biểu bì (pinacocyte) - lớp biểu bì là lớp tế bào bao gồm các bề mặt bên
ngoài của miếng hải miên. Các tế bào mỏng, phẳng của lớp biểu bì được gọi là

pinacocytes.
Flagellum - cấu trúc giống như cái roi của một choanocyte; di chuyển roi, đẩy
nước (trong đó có chứa chất dinh dưỡng) thông qua các miếng hải miên.
Osculum - một cửa trong một miếng hải miên qua đó nước có thể chảy ra. Hải
miên có thể có nhiều hơn một oscula.
Pinacocyte - là tế bào mỏng, phẳng của lớp biểu bì, lớp ngoài của miếng hải
miên của các tế bào.
Porocyte - tế bào với lỗ chân lông cho phép nước vào miếng hải miên; chúng
được đặt trên khắp cơ thể của miếng Hải Miên.
Spicule - spicules là gai nhọn (calcium carbonate) nằm trong mesohyl.


14

Spicules tạo thành bộ xương của hải miên.
Spongin - các, sợi xơ linh hoạt tạo thành bộ khung của hải miên sừng; spongin
nằm trong mesohyl.
Spongocoel - các trung tâm, khoang mở trong một miếng hải miên, mà qua đó
nước chảy vào miếng hải miên. Nước chảy vào một miếng hải miên thông qua các tế
bào với các lỗ chân lông (các tế bào được gọi là porocytes) nằm trên khắp cơ thể của
nó. Nước chảy ra từ một miếng Hải Miên qua các lỗ hở lớn gọi oscula (số nhiều). Mỗi
một lỗ lớn được gọi là một osculum.

Hình 1.4. Giải phẩu cấu tạo cơ thể hải miên
Hầu hết các miếng xốp làm việc giống như ống khói: chúng lấy nước ở
phía dưới và đẩy nó từ osculum (miệng nhỏ) ở đầu. Kể từ môi trường xung quanh là
dòng nhanh hơn ở phía trên, các hiệu ứng hút mà họ sử dụng bằng nguyên lý
Bernoulli. Bọt biển có thể kiểm soát lưu lượng nước bằng cách kết hợp khác nhau
của toàn bộ hoặc một phần đóng osculum và Ostia (các lỗ chân lông hấp thu) và
thay đổi nhịp đập của hai roi, và có thể đóng cửa nếu có nhiều cát hoặc bùn trong

nước [9].
Các cấu trúc cơ thể đơn giản nhất trong miếng xốp là một ống hoặc lọ hình
dạng gọi là "asconoid", nhưng điều này bị giới hạn kích thước của con vật. Các cấu


15

trúc cơ thể được đặc trưng bởi một spongocoel cuống giống như được bao quanh
bởi một lớp duy nhất của choanocytes. Nếu chúng chỉ đơn giản là mở rộng quy mô,
tỷ lệ khối lượng cho các diện tích bề mặt tăng lên, bởi vì bề mặt tăng theo bình
phương của chiều dài hoặc chiều rộng trong khi khối lượng tăng lên tương ứng với
các khối lập phương. Số lượng mô cần thức ăn và oxy được xác định bởi khối lượng,
nhưng năng lực bơm mà nguồn cung cấp thức ăn và oxyphụ thuộc vào diện tích của
các choanocytes.
1.1.4. Đặc điểm của các nhóm hoạt chất sinh học chống oxy hóa có trong hải miên
a) Nhóm hợp chất phenol:
Các hợp chất phenol là nhóm hợp chất hữu cơ có chứa một hay nhiều nhóm
hydroxyl (-OH) gắn với một hay nhiều vòng thơm. Cấu trúc của chúng tương tự các
hợp chất dạng rượu nhưng lớp phenol có các thuộc tính duy nhất chỉ chúng có (do
nhóm hydroxyl không liên kết với nguyên tử cacbon no). Trong cấu trúc của chúng,
vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử oxyvà liên kết tương đối lỏng lẻo giữa
nguyên tử oxynày với nguyên tử hydro trong nhóm hydroxyl do đó dễ tách nguyên
tử hydro ra khỏi nhóm nên chúng có tính acid tương đối cao. Một số polyphenol
thực vật tiêu biểu như catechine, flavanone, anthocyanidin, flavones, flavonol,
isoflavone, acid hydroxycinnamic, lignin, tachin. Polyphenol là những hợp chất
phân cực nên thường dùng các dung môi phân cực để chiết tách chúng ra khỏi
nguyên liệu, các dung môi thường dùng để tách chiết như nước cất, ethanol,
methanol,… Trong đó, dung môi được sử dụng phổ biến là nước cất và ethanol do
tính an toàn, có khả năng hòa tan tốt các polyphenol, cũng như giá thành rẻ.
b) Nhóm hợp chất sterol:

Sterol là rượu đa vòng, no đơn chức và là dẫn xuất của steran. Các sterol
là các chất kết tinh, dễ tan trong cloroform, ete, rượu nóng…, không tan trong nước.
Đặc tính của sterol là không phân cực, nên rất kém tan trong nước nhưng tan trong
dầu béo và các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, dầu hỏa, benzen,
cloroform, aceton,… nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol ra khỏi
nguyên liệu. Đối với các sterol glycoside có thể chiết bằng ethanol. Sản phẩm chiết


16

bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp của sterol và các chất béo, các chất kém
phân cực khác có trong nguyên liệu như lipid (đối với sterol động vật), caroten,
leucithin (đối với sterol thực vật). Phải thực hiện phản ứng xà phòng hóa để tách
các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Thực hiện sắc
ký (cột, lớp mỏng, giấy,...) để phân lập hoặc kết tinh phân đoạn, tinh chế sterol.
c) Nhóm hợp chất flavonoid:
Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật,
có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao. Flavonoid có khung cơ bản
là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu
trúc có thể là vòng kín hoặc mở. Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai
dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với đường (glycoside). Trong đó, dạng
aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như
không tan trong nước, còn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong
các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform.
d) Nhóm hợp chất saponin:
Saponin là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose,
galactose, pentose, metyl pentose,...) và phần sapogenin (aglycol). Phân sapogenin
có thể là steroid hay triterpenoid. Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào
nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính
chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với

cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh. Thường các steroid saponin thì tả truyền
còn triterpenoid saponin thì hữu truyền. Điểm nóng chảy của các sapogenin thường
rất cao. Saponin là hợp chất phân cực nên thường sử dụng các dung môi phân cực
để chiết xuất saponin.
e) Nhóm hợp chất polypeptide:
Polypeptide là hợp chất hữu cơ được cấu tạo từ các acid amin liên kết với
nhau bằng liên peptide. Khác với protein, polypeptide có khối lượng phân tử dưới
10.000 Da trong khi protein có khối lượng phân tử lớn hơn.
Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các polypeptide có hoạt tính chống