Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH LÊ ANH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CÁC HOẠT
CHẤT TRONG THUỐC TIÊM CGI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I

HÀ NỘI 2015


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH LÊ ANH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CÁC HOẠT
CHẤT TRONG THUỐC TIÊM CGI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I
CHUYÊN NGÀNH: CNDP VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ:

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
Nơi thực hiện: Trường Đại Học Dược Hà Nội
Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa
Thời gian thực hiện: 20/01 – 20/5/2015

HÀ NỘI 2015


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp tôi đã nhận
được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ quý báu từ các thầy cô giáo
trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị đồng nghiệp của Trung tâm
kiểm nghiệm Thanh Hóa.
Nhân dịp này tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn
Thị Kiều Anh đã hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ những kiến thức quý báu
trong quá trình thực hiện luận văn cũng như trong quá trình học tập, công
tác.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, và tạo điều kiện để tôi hoàn thành
khóa học này.
Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng tập thể cán
bộ Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi
trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi trân thành cảm ơn và bày tỏ tình cảm sâu sắc tới những
người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Học viên Trịnh Lê Anh


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CGI

: Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection

ESI

: Chế độ ion hóa bằng phun điện tử

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC

: Sắc ký lỏng

LC-MS/MS

: Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần

m/z

: Khối lượng/ điện tích

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

mM

: Milimol

MRM

: Chế độ bắt đa mảnh phổ

MS

: Khối phổ

PA

: Tinh khiết phân tích

PDA

: Detector photo diod array

Q

: Quadrupple tứ cực

R

: Hệ số tương quan tuyến tính

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối

SD, CV

: Độ lệch chuẩn tuyệt đối

SIM

: Chế độ bắt phổ chọn lọc

SRM

: Chế độ bắt một mảnh phổ

UPLC

: Sắc ký lỏng siêu cao áp

UV

Tia tử ngoại


MỤC LỤC
MỤC

TRANG

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1. TỔNG QUAN

3

1.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZIN
INJECTION (CGI).
1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI.
1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạt
chất.
1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định
thuốc tiêm CGI.

3
3
3

5

1.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI

7

1.2 SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS)

9

1.2.1.Khái niệm.

9

1.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba [20], [18]

9

1.2.3 Ứng dụng

14

1.3 NỘI DUNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

15

1.3.1. Tính đặc hiệu

15

1.3.2. Độ tuyến tính

15

1.3.3. Độ đúng

15

1.3.4. Độ chính xác

16

1.3.5. Độ vững

17

Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGUYÊN CỨU

18
18


2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU

18

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

20

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

21

2.3.3 Xử lý kết quả

24

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

25

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

25

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ

25

3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thành
phần của thuốc tiêm CGI.

29

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

31

3.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp

31

3.2.2 Độ tuyến tính của phương pháp

34

3.2.3 Độ chính xác

36

3.2.4 Độ đúng

41

3.2.5 Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích

45

Chương 4. BÀN LUẬN

46

4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

48

4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

52

KẾT LUẬN

52

KIẾN NGHỊ

53

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
TÊN BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Thành phần công thức mẫu Placebo số 1.

19

Bảng 2.2. Thành phần công thức mẫu Placebo số 2.

19

Bảng 2.3. Thành phần công thức mẫu Placebo số 3.

19

Bảng 2.4. Thành phần công thức mẫu Placebo số 4.

20

Bảng 3.1 Các thông số khối phổ

25

Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần
hoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI.

31

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương pháp

33

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương pháp

35

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp

38

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương
pháp

40

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với thành phần Glycin

42

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với thành phần Glycyrrhizin

43

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với thành phần L-Cystein

44

Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của dược chất trong điều
kiện thí nghiệm.

45


DANH MỤC CÁC HÌNH
TÊN HÌNH

TRANG

Hình 1.1 – Công thức cấu tạo của Glycyrrhizin

3

Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của Glycine.

4

Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid

4

Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ.

9

Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI

11

Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba

12

Hình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực

12

Hình 3.1 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycin (m/z = 76) tạo ra
mảnh con (m/z = 29).

26

Hình 3.2 Phổ khối khi phân mảnh Glycin-H+ (m/z = 76).

26

Hình 3.3 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh glycyrrhizin (m/z = 840)

tạo ra mảnh con (m/z = 453)

27

Hình 3.4 Phổ khối khi phân mảnh Glycyrrhizin-H+ (m/z = 840).

27

Hình 3.5 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Cystein (m/z = 121) tạo
ra mảnh con (m/z = 58).

28

Hình 3.6 Phổ khối khi phân mảnh Cystein-H+ (m/z = 121).

28

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng.

32

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng.

32

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn L-Cystein và mẫu trắng.

33

ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection (CGI) chứa ba thành
phần hoạt chất bao gồm: Glycyrrhizin 40mg; Glycin 400mg; L-Cystein
20mg, được dùng trong điều trị rối loạn chức năng gan, hỗ trợ điều trị viêm
gan C; hỗ trợ điều trị eczema [14], [15]. Thuốc có trong danh mục thuốc
thanh toán bảo hiểm y tế và danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam vì vậy
thuốc được sử dụng ngày càng nhiều trong điều trị nhất là điều trị nội trú,
bảo vệ gan trước sự tác động có hại của các loại thuốc khác.
Tại Việt Nam hiện nay đang tiến hành làm hồ sơ xin cấp phép lưu
hành [14]. Tại Nhật Bản thuốc có thành phần tương tự được sử dụng rộng
rãi trong điều trị [15].
Để xây dựng tiêu chuẩn của thuốc, một trong những chỉ tiêu quan
trọng nhất là phải xây dựng được phương pháp định tính và định lượng
được các hoạt chất đảm bảo tính đặc hiệu, ổn định và chính xác [5], [6].
Đối với hai thành phần acid amin L-Cystein, Glycin trong chế phẩm thuốc
Compound Glycyrrhizin Injection - là những hoạt chất không hấp thụ UV
nên không thể định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-VIS [12],
[18], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector
thông thường như: UV-VIS; PDA cũng không định lượng được các thành
phần hoạt chất này. Các hoạt chất này có thể phân tích được dựa vào phản
ứng dẫn xuất nhóm amin với thuốc thử thích hợp và phát hiện bằng HPLC
với detector huỳnh quang [17]. Quá trình dẫn xuất được thực hiện trước cột
hoặc sau cột khi phân tích bằng sắc ký, nhưng kết quả thường kém ổn định
và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai
lần (LC-MS/MS) là phương pháp phân tích hiện đại, có tính đặc hiệu và
lặp lại cao, có thể phân tích trực tiếp đồng thời các chất trong hỗn hợp ngay
cả khi các chất phân tích không tách rời nhau khi qua hệ thống sắc ký. Do

1

đó, kỹ thuật này được sử dụng ngày càng nhiều trong phân tích thuốc, đặc
biệt những phép phân tích khó như các thuốc có thành phần phức tạp, phân
tử lớn, hàm lượng thấp.
Để góp phần triển khai kỹ thuật phân tích mới tại trung tâm Kiểm
nghiệm thuốc Thanh Hóa và nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc
lưu hành trên thị trường, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký
lỏng khối phổ” với mục tiêu cụ thể như sau:
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích để định tính, định lượng
đồng thời Glycin, Glycyrrhizin, L-cystein bằng kỹ thuật LCMS/MS.
2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời Glycin,
Glycyrrhizin, L-cystein trong chế phẩm thuốc CGI, từ đó hoàn
thiện qui trình định tính, định lượng các thành phần hoạt chất
trong chế phẩm thuốc CGI bằng LC-MS/MS.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION
(CGI).
1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI.
+ Nguồn gốc:
Thuốc tiêm CGI (Compound Glycyrhizin Injection) được sản xuất
bởi: Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd. No.7 Rongchang
East Street, BDA, Beijing, China.
+ Công thức bào chế 20 ml dung dịch tiêm CGI:
Monoamoni Glycyrrhizinate tương đương Acid Glycyrrhizin

40 mg

Glycin

400 mg

L-cystein hydrochlorid

20 mg

Tá dược: Natri sulfit khan, natri clorid, amoniac, nước cất vừa đủ 20 ml
[13].
Thuốc đóng trong lọ thủy tinh trung tính, màu trắng, dung dịch thuốc trong
suốt, không màu.
1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạt chất.
Monoamoni Glycyrrhizinat
COOH
H

O

H

O

NH4OOC

O

HO HO

H
O

HOOC
HO HO

O
OH

Hình 1.1 – Công thức cấu tạo của Glycyrrhizin
3


- Công thức phân tử: C42H62O16;
- Trọng lượng phân tử: 839,97 g/mol;
- Tên khoa học: Acid (3β,18α)-30-hydroxy-11,30-dioxoolean-12-en-3yl 2-O-β-D-glucopyranuronosyl-β-D-glucopyranosiduronic.
- Bột kết tinh màu trắng;
- Tan tốt trong nước; tan trong ethanol, khó tan trong methylen clorid,
không tan trong ether [14]
Glycin
O
OH
NH2

Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của Glycin
-

Công thức phân tử: C2H5NO2;
Công thức cấu tạo: H2N-CH2-COOH;

Trọng lượng phân tử: 75,07 g/mol;
Tên khoa học: Acid aminoacetic;
Bột kết tinh màu trắng, vị ngọt;
Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trường
kiềm, tan trong ethanol, không tan trong ether [4], [13], [18].
L – Cystein hydroclorid

O
OH . HCL

HS
NH2

Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid.
-

Công thức phân tử: C2H5NO2;
Công thức cấu tạo: HSCH2CH(NH2)COOH . HCl;
Trọng lượng phân tử: 157,62 g/mol;
Tên khoa học: 2-Amino-3-sulfhydrypropanoic hydroclorid;
4


- Bột kết tinh màu trắng;
- Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trường
kiềm, tan trong ethanol, không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân
cực [4], [13], [18].
1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định thuốc
tiêm CGI
Dược lực học [15]

+ Tác dụng chống viêm: Ức chế các enzym chuyển hóa acid
arachidonic: Glycyrrhizin có thể liên kết với phospholipase A2 (enzym
hoạt hóa cho sự chuyển hóa acid arachidonic) và lipoxygenase (chất gây
ảnh hưởng đến acid arachidonic và là nguyên nhân sản xuất trung gian
viêm), thông qua đó ức chế chọn lọc sự phosphoryl hóa và gây ức chế sự
hoạt hóa các enzym.
+ Tác dụng ức chế sự tổn thương tế bào gan: Thử nghiệm nuôi cấy tế
bào gan chuột trong ống nghiệm, glycyrrhizin ức chế sự tổn thương tế bào
gan do tetracloromethan gây ra.
+ Ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính của virus: Ở những chuột thí
nghiệm bị nhiễm viêm gan virus, điều trị với glycyrrhizin có thể kéo dài
thêm tuổi thọ. Ở thỏ thí nghiệm bị nhiễm virus bệnh đậu mùa, glycyrrhizin
có thể ức chế sự phát triển của virus. Trong các thử nghiệm in-vitro khác,
glycyrrhizin cũng thể hiện tác dụng ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính
của virus. Glycin và cystein gây ức chế hoặc giảm chứng tăng aldosteron
giả do các bất thường trao đổi điện giải trong quá trình điều trị dài ngày với
glycyrrhizin.
Dược động học [15]
+ Hấp thu: Đối với người khỏe mạnh, nồng độ thuốc trong máu giảm
đáng kể sau 10 giờ tiêm 40 ml dung dịch Compound Glycyrrhizin Injection
(chứa 80 mg glycyrrhizin). Sau đó nồng độ thuốc giảm dần dần. Acid
glycyrrhizic, sản phẩm thủy phân của glycyrrhizin, xuất hiện sau 6 giờ tiêm
thuốc, đạt nồng độ đỉnh sau 24 giờ và bị thải trừ hoàn toàn khỏi cơ thể sau
48 giờ.

5


+ Thải trừ qua nước tiểu: Đối với người khỏe mạnh sau khi tiêm
glycyrrhizin, nồng độ thuốc trong nước tiểu giảm dần. Tốc độ thải trừ là

1,2% liều sau 27 giờ tiêm thuốc. Acid glycyrrhizic bắt đầu xuất hiện sau 6
giờ và đạt nồng độ đỉnh sau 22 -27 giờ tiêm thuốc.
Chỉ định [15]
+ Hỗ trợ điều trị viêm gan mạn tính và cải thiện rối loạn chức năng gan.
+ Hỗ trợ điều trị eczema, viêm da, nổi mày đay.
Liều lượng và cách sử dụng [15]
+ Thuốc dùng đường tiêm truyền tĩnh mạch. Dùng theo chỉ dẫn của bác
sĩ điều trị.
Người lớn: Liều thông thường: Tiêm 5-20 ml mỗi ngày một lần. Có thể
điều chỉnh liều lượng tùy thuộc vào tuổi và triệu chứng của bệnh nhân.
+ Bệnh nhân viêm gan: Tiêm hoặc truyền tĩnh mạch 40-60 ml mỗi ngày
một lần. Có thể điều chỉnh liều lượng tùy thuộc vào tuổi và triệu chứng của
bệnh nhân. Liều hàng ngày tối đa không được vượt quá 100 ml/ ngày.
+ Bệnh nhân nhi: Chưa có nghiên cứu đầy đủ. Không khuyến cáo dùng
cho nhóm đối tượng này.
+ Bệnh nhân cao tuổi: Bệnh nhân cao tuổi thường có khuynh hướng bị
hạ kali máu. Do đó, việc sử dụng thuốc của bệnh nhân cần được theo dõi
chặt chẽ.
+ Sử dụng cho phụ nữ có thai và cho con bú: Chưa có nghiên cứu đầy
đủ và được kiểm soát tốt trên bệnh nhân nhi. Không dùng cho nhóm đối
tượng này.
Chống chỉ định [15]
+ Quá mẫn cảm với bất kỳ thành phần nào của thuốc.
+ Tăng aldosteron, đau cơ hoặc hạ kali máu.
+ Phụ nữ có thai hoặc nuôi con bú.
6


1.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI
Trên thế giới đã có nhiều tài liệu công bố về các phương pháp định

tính, định lượng: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein khác nhau bằng các kỹ
thuật: sắc ký lỏng [11], [13], [16]; chuẩn độ thể tích [12], [13], [18]; sắc ký
lỏng khối phổ [19], [17], [22].
Tuy thuốc CGI đã được sản xuất tại Nhật Bản, Trung Quốc và sử
dụng tại nhiều nơi trên thế giới, xong chưa có quốc gia nào đưa chuyên
luận thuốc tiêm có chứa các thành phần nói trên vào Dược Điển của mình.
Cũng chưa tìm thấy tài liệu công bố phương pháp định lượng đồng thời ba
hoạt chất nói trên.
Đối với thành phần Glycin dạng nguyên liệu một số dược điển đã
xây dựng phương pháp định lượng bằng chuẩn độ môi trường khan, trong
đó chất phân tích được hòa tan trong acid actetic băng, hoặc hỗn hợp acid
acetic băng và acid formic rồi chuẩn độ bằng acid percloric 0,1N với chỉ thị
tím tinh thể hoặc xác định điểm tương đương bằng đo điện thế [13]; [16];
[18]. Với phương pháp này dựa vào tính kiềm của nhóm -NH2 trong phân
tử hoạt chất, phương pháp này sẽ bị hạn chế nếu có mặt của nước (là một
dung môi khá phổ biến của thuốc tiêm), làm cho chất phân tích vừa thể
hiện tính kiềm, vừa thể hiện tính acid nên dung dịch trở nên trung tính,
không chuẩn độ được.
Chuyên luận thuốc tiêm Glycin (Glycine Irrigation Solution) trong
một số dược điển của các nước tiên tiến đã sử dụng phương pháp trung hòa
[13]; [16]; [18]. Nguyên tắc của phương pháp này là trong môi trường
nước các acid amin vừa thể hiện tính base vừa thể hiện tính acid nên dung
dịch trung tính. Khi có mặt formol các nhóm –NH2 bị khóa lại nên tính acid
trội lên có thể định lượng được bằng một dung dịch base chuẩn. Cả hai
phương pháp định lượng hóa học dựa vào tính kiềm của nhóm –NH2; hoặc
tính acid của nhóm –COOH đều không đặc hiệu. Phương pháp có giới hạn
phát hiện cũng như giới hạn định lượng cao. Khi trong công thức có thêm
các thành phần tá dược có tác dụng đệm pH, nền mẫu phức tạp phương
pháp sẽ gặp sai số hoặc không tiến hành được.
7

Hoạt chất Cystein dạng nguyên liệu một số dược điển đã xây dựng
phương pháp định lượng bằng chuẩn độ oxy hóa khử, trong đó chất phân
tích được hòa tan trong nước rồi chuẩn độ bằng dung dịch iod 0,1N phương
pháp thừa trừ hoặc chuẩn độ trực tiếp với chỉ thị hồ tinh bột [13]; [16];
[18]. Phương pháp này dựa vào tính khử của nhóm -SH trong phân tử hoạt
chất, độ đặc hiệu kém và đôi khi bị ảnh hưởng của sự có mặt một số chất
oxy hóa, như oxy hòa tan trong dung dịch.
Chế phẩm thuốc chứa Cystein một số tài liệu đã sử dụng phương
pháp oxy hóa khử với dung dịch chuẩn độ iod 0,1N chuẩn độ bằng phương
pháp trực tiếp hay phương pháp thừa trừ; hoặc dùng dung dịch chuẩn độ là
dung dịch bromid, phương pháp thừa trừ. Các phương pháp trên đều có
chung nhược điểm như độ nhạy kém, và không đặc hiệu với thành phần
hoạt chất, phương pháp gặp phải sai số nhất định khi có một số tá dược
chất chống oxy hóa trong thuốc tiêm [12], [13], [18].
Một số tài liệu công bố phương pháp định lượng thành phần LCystein dạng nguyên liệu cũng như dạng chế phẩm bằng phương pháp
HPLC detetor huỳnh quang; sử dụng bộ Kit tạo dẫn xuất huỳnh quang, tuy
nhiên phương pháp này gặp phải một số khó khăn như bộ Kit đắt tiền và
không sẵn có [23].
Hoạt chất Glycyrrhizin trong chế phẩm thuốc tiêm CGI được xây
dựng phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector
UV bước sóng 252 nm; hoặc detector PDA với bước sóng lấy pic là 252
nm [12].
Krähenbühl S, Hasler F, Krapf R đã tiến hành định lượng acid
Glycyrrhizin và các chất chuyển hóa của Acid Glycyrrhizin bằng phương
pháp LC-MS/MS, ở khoảng nồng độ thấp khoảng 1-2 µg/ml [22].

8

1.2 SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS)
1.2.1 Khái niệm
Sắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật phân tích có sự kết hợp giữa
khả năng phân tách của hệ thống sắc ký (HPLC) với khả năng phân tích
khối của hệ thống khối phổ.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một hệ thống có vai trò tách các chất
dựa trên sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng [4].
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của
ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu
dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một
điện trường hoặc một từ trường nhất định [18], [13].
1.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba (Triple
Quadrupole) hay còn gọi là khối phổ hai lần (MS/MS) được sử dụng nhiều
trong công tác nghiên cứu, kiểm tra chất lượng thuốc, nhất là định lượng
thuốc trong dịch sinh học, nghiên cứu tương đương sinh học, nghiên cứu
định lượng các thuốc có thành phần phức tạp vì thiết bị có độ nhạy, độ
chọn lọc cao.
Trong các kiểu hình thành ion, kỹ thuật phun điện tử ESI
(Electrospray Ionazition – ESI) được sử dụng nhiều hơn cả. Trong nghiên
cứu này chúng tôi cũng sử dụng kiểu ion hóa theo kỹ thuật ESI vì vậy trong
phần tổng quan này chúng tôi sẽ trình bày về hệ Triple Quadrupole với
nguồn Ion hóa kiểu ESI [18], [20].

Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ.

9

Một máy khối phổ tứ cực chập ba gồm có các bộ phận chính sau:
Bộ phận nạp mẫu, đưa mẫu vào (Inlet);
Bộ nguồn ion hóa (ion source);
Bộ phận phân tích khối lần 1 (Q1): phân tích mảnh mẹ;
Bộ phận buồng va chạm (Collision cell);
Bộ phận phân tích khối lần 2 (Q2): phân tích mảnh con;
Bộ phận phát hiện ion (Detector);
Bộ phận ghi nhận và xử lý số liệu (data system).
Bộ phận nạp mẫu
Bộ phận nạp mẫu để chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion
hóa của thiết bị khối phổ. Do quá trình nạp mẫu từ áp suất thường (760 mm
Hg) vào buồng chân không (10-5 – 10-8 Torr) phải không được ngắt chân
không của bộ phận phân tích khối (mass analyzer) và bộ phận phát hiện
(detector) nên bộ phận nạp mẫu của LC-MS có khác biệt:
Đầu ra của LC là dòng dung môi, nếu đưa trực tiếp và toàn bộ dòng
dung môi vào phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy và
vận hành của thiết bị. Mặt khác khi các ion có trong thành phần của dung
môi dễ dàng va chạm với các phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng
di chuyển và bị bơm chân không hút ra ngoài. Do đó quá trình nạp mẫu từ
LC vào MS thường phải qua giao diện ghép nối phù hợp.
Một ghép nối LC-MS cần có các đặc tính: cho phép chuyển mẫu hiệu
quả và chính xác từ LC sang MS mà không phá hủy hay làm mất chất phân
tích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm pha loãng mẫu.

10


Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)

Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI

Trong ESI, tại đầu mao quản dưới ảnh hưởng của điện thế cao, sự hỗ
trợ của khí mang và nhiệt độ mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ
mang điện tích bề mặt. Điều kiện nhiệt độ trong buồng phun cao làm cho
dung môi trong các hạt sương bốc hơi khi đó mật độ điện tích tại các bề mặt
hạt sương gia tăng đến một giá trị tới hạn và tiếp tục phân chia thành các hạt
sương nhỏ hơn vì lực đẩy tĩnh điện lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá
trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ
những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này các ion phân tích được chuyển
thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi từ đó đi vào bộ phận phân tích khối.
Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra ngoài bởi bơm chân không
của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc và hội tụ bởi một
điện thế, khi đi ra khỏi buồng ion hóa các phân tử có tốc độ đạt cao nhất rồi
đi vào phần phân tích khối là một dòng tập trung và đồng nhất.
Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải biến thành chất điện ly,
tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào dung môi
sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch.
Kỹ thuật ion hóa kiểu phun điện tử được áp dụng để phân tích những
chất phân cực hoặc bán phân cực, các chất có trọng lượng phân tử lớn và
các chất kém bền với nhiệt.

11


Bộ phận phân tích khối kiểu tứ cực chập 3

Q3

Q1

Q2 (Collision cell)

Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba

Hình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực
Bộ phận phân tích khối gồm ba tứ cực Q1; Q2; Q3. Các tứ cực này
được cấu tạo gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau tạo thành
hai cặp điện cực.
Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào
từng cặp đối diện của tứ cực. Dưới tác động của dòng điện từ trường trong
lòng ống điện cực, các ion di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào số
khối. ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại.
Q1 sẽ tách các ion cần quan tâm bằng cách các ion có tỷ số m/z xác
định đã lựa chọn sẽ đi thẳng đến tứ cực thứ 2 (Q2), những ion khác bị dập
tắt do va chạm với thành của tứ cực ở các bản điện cực trái dấu.
Tứ cực thứ 2 (Q2) còn gọi là buồng va chạm (Collision cell), bên
trong chứa khí trơ (Argon) thường được thiết kế cong để tăng sự va chạm.
Các ion di chuyển từ tứ cực Q1 vào Q2 có vận tốc lớn va chạm với các
12


phân tử khí trơ trong Q2, lúc này năng lượng động học của ion biến thành
nội năng nên các ion bị vỡ ra từng mảng tạo thành các ion con bé hơn.
Tứ cực thứ 3 (Q3) có cấu tạo giống Q1, các ion mới được hình thành
trong Q2 sẽ được di chuyển tiếp đến Q3. Q3 sẽ phân tích tách và bắt giữ tín
hiệu của các ion con đặc trưng cần quan tâm của chất phân tích và đưa đến
bộ phận phát hiện (Detector).
Bộ phận phát hiện (detector)
Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion sẽ được đưa tới bộ
phận nhận tín hiệu, phát hiện ion. Bộ phận tín hiệu cho phép khối phổ tạo
ra một tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được

đưa đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.
Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ
Full-scan: Khi thao tác với chế độ full-scan, đầu dò sẽ nhận được tất
cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt
quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân
tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN
thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.
Chế độ chọn lọc ion: (Selected Ion Monitoring SIM): Trong chế
độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một mảnh ion đặc trưng cho chất
cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của ion đã được lựa chọn
trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện
có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa
chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple
Reaction Monitoring): Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai
lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử
dụng là SRM và MRM.
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò
để phát hiện.
13


MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi
lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật
ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion
mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất
là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần
quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
1.2.3 Ứng dụng

Phương pháp phân tích khối phổ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau của khoa học và công nghệ như: thực phẩm – đồ uống; môi
trường; độc chất học; tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật; dược phẩm …
Trong ngành dược một số ứng dụng cơ bản của kỹ thuật này:
Xác định khối lượng phân tử, khối lượng nguyên tử;
Xét đoán cấu trúc phân tử;
Kiểm nghiệm thuốc: định tính, định lượng, kiểm tra độ tinh khiết
nguyên liệu, xác định tạp chất liên quan…;
Nghiên cứu phát triển hợp chất mới;
Phân tích thuốc trong dịch sinh học: nghiên cứu dược động học, sinh
khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị…;
Một số trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh đã được trang bị thiết bị
này như: Hà Nội, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Huế… nhưng chưa
triển khai được nhièu để phục vụ công tác kiểm nghiệm.
+ Nghiên cứu xác định tạp chất liên quan là lĩnh vực thế mạnh của
thiết bị khi các tạp chất có nồng độ thấp, độ nhạy của các thiết bị HPLC
thông thường không đủ đáp ứng, đặc biệt khi không có chất chuẩn, vẫn có
thể định tính và xác định được dựa thư viện phổ của các chất đã được lưu
giữ trong Detector khối phổ.
+ Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng một số nhóm
hoạt chất không hấp thụ quang như: bán thành phẩm kháng sinh nhóm

14


Aminoglycosid, phục vụ sản xuất mà trước đây không thực hiện được bằng
các phương pháp khác.
+ Phân tích dư lượng một số dung môi tồn dư trong nguyên liệu làm
thuốc, theo quy định của GMP.
1.3 NỘI DUNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

1.3.1. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu là khả năng phân biệt rõ chất cần phân tích khi các thành
phần khác có thể tồn tại trong mẫu thử. Thông thường gồm: các tạp chất,
sản phẩm phân hủy, chất nền.
Trong LC-MS, tính đặc hiệu được thể hiện khi kết quả thu được trên
sắc ký đồ mẫu thử cho thấy pic của chất cần phân tích được phân tách và
nhận diện rõ ràng. Tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng tại vị trí các pic của chất
phân tích không được vượt quá 2%.
1.3.2. Độ tuyến tính
Độ tuyến tính của một qui trình phân tích diễn tả đáp ứng phân tích
thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích
trong mẫu thử.
Độ tuyến tính được xác định bằng cách quan sát đồ thị đáp ứng giữa
nồng độ hoặc hàm lượng của chất phân tích với giá trị đo được.
Như vậy khoảng tuyến tính phải phủ toàn bộ khoảng xác định.
Đường chuẩn phải có dạng đồ thị: Y = ax + b
Yêu cầu:
- Số điểm đường chuẩn n ≥ 5
- Hệ số tương quan r ≥ 0,998
1.3.3. Độ đúng
Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn mức độ gần nhau
giữa giá trị trung bình của dãy kết quả thực nghiệm với giá trị thực của chất
phân tích có trong mẫu thử hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận.
15


Thường tiến hành ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng xác định của
phương pháp (80% - 100% và 120%), mỗi mức nồng độ tối thiểu 3 mẫu
hoặc 6 mẫu ở mức nồng độ 100%.
Yêu cầu:

- Định lượng: Thu hồi 98,0 – 102,0 %; RSD ≤ 2,0%;
(Tỉ lệ thu hồi: lượng tìm thấy/ lượng lí thuyết)
1.3.4. Độ chính xác
Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ gần nhau
(mức độ phân tán) giữa một dãy kết quả thu được của các mẫu thử được
chuẩn bị từ một mẫu đồng nhất trong điều kiện đã đề ra.
Độ chính xác chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và
độ tái lặp.
Độ lặp lại
Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích tiến hành
trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại
biểu thị độ chính xác trong định lượng.
Thường được tiến hành trên 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ 3
lần (suy ra từ độ đúng). Cũng có thể 6 lần ở nồng độ 100%.
Yêu cầu:
- Định lượng: RSD ≤ 2,0%
- Độ hòa tan: RSD ≤ 3,0%
Độ chính xác trung gian
Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong
cùng một phòng thí nghiệm, nhưng được thực hiện: các ngày khác nhau,
kiểm nghiệm viên khác nhau, và hóa chất khác lô sản xuất.

16


Yêu cầu:
- Định lượng: RSD ≤ 2,0%
- Độ hòa tan: RSD ≤ 4,0%
- Tạp chất: RSD ≤ 10 -15%.
Độ tái lặp

Độ tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm (Phối hợp
nghiên cứu giữa các phòng thí nghiệm thường được áp dụng để tiêu chuẩn
hoá phương pháp).
1.3.5 Độ vững
Đánh giá ảnh hưởng của các thay đổi nhỏ trong quy trình phân tích
đến kết quả phân tích và độ ổn định của kết quả. Trong nghiên cứu này
chúng tôi đánh giá độ ổn định theo thời gian của hoạt chất trong điều kiện
phân tích.

17