Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phân bào của cao chiết từ thân cây xáo tam phân ( paramignya trimera) trên dòng tế bào ung thư vú MCF 7

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
----------------0o0--------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO CỦA CAO
CHIẾT TỪ THÂN CÂY SÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera)
TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MCS - 7

Giảng viên hướng dẫn : TS. PHẠM VĂN PHÚC
TS. NGUYỄN VĂN DUY
Sinh viên thực hiện

: HUỲNH PHÚ HIỀN

Mã số sinh viên

: 53130508

Khánh Hòa: tháng 6/2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------------0o0--------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO CỦA CAO
CHIẾT TỪ THÂN CÂY SÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera)
TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MCS - 7

GVHD

: TS. PHẠM VĂN PHÚC
TS. NGUYỄN VĂN DUY

SVTH

: HUỲNH PHÚ HIỀN

MSSV

: 53130508

Khánh Hòa, tháng 06/2015


i

LỜI CẢM ƠN
Truớc tiên, tôi xin chân thành cảm ơn đến:
TS. Phạm Văn Phúc, Phó Truởng phòng, Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và
ứng dụng tế bào gốc – Trường Đại học KHTN TP. Hồ Chí Minh, người đã trực tiếp
huớng dẫn tôi thực nghiệm, tạo mọi điều kiện học tập, hỗ trợ, động viên và truyền
đạt nhiều kinh nghiệm quý báu để tôi có thể thực hiện tốt khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Văn Duy, Phó viện trưởng, Viện công nghệ sinh

học và môi trường, Trường Đại học Nha Trang là người đã truyền những kiến thức
kinh nghiệm và đã tận tâm góp ý, chia sẻ cũng như hướng dẫn tôi để hoàn thiện đề
tài này.
Tôi xin cảm ơn ThS. Phan Lữ Chính Nhân, người trực tiếp hướng dẫn kỹ
thuật tất cả các thí nghiệm, cũng như hoàn thành các thí nghiệm trong đề tài. Anh
cũng là người luôn chia sẻ, góp ý những suy nghĩ về khoa học và cách làm việc
khoa học.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô tại Truờng Ðại học Nha
Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức chuyên môn quý
báu làm nền tảng ban đầu vững chắc trong quá trình thực nghiệm nghiên cứu.
Xin cảm ơn anh chị cán bộ đang công tác tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu
và ứng dụng tế bào gốc – Trường Đại học KHTN TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn chị
Ngọc Linh, các anh, chị và các bạn sinh viên đang thực tập tại phòng đã luôn giúp
đỡ, ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực tập.
Xin chân thành cảm ơn!
Huỳnh Phú Hiền


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... i
MỤC LỤC ........................................................................................................................ ii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................................. v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... ix
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 1
1.1.

SINH HỌC UNG THƯ VÚ ................................................................................... 1

1.1.1. Ung thư vú .................................................................................................................... 1
1.1.2. Phân loại ....................................................................................................................... 1
1.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ ............................................................................ 2
1.1.4. Các giai đoạn phát triển ............................................................................................... 3
1.2.

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ...................................................... 4

1.2.1. Phẫu thuật ..................................................................................................................... 4
1.2.2. Xạ trị ............................................................................................................................. 4
1.2.3. Hóa trị ........................................................................................................................... 5
1.2.4. Hạn chế ......................................................................................................................... 5
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN TRONG ĐIỀU TRỊ UNG
THƯ ............................................................................................................................... 6
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................................. 6
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................................. 7
1.4.

XÁO TAM PHÂN .................................................................................................. 8

1.4.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm ............................................................................... 8
1.4.1.1.

Nguồn gốc ................................................................................................ 8

1.4.1.2.

Phân loại................................................................................................... 8

1.4.1.3.

Đặc điểm .................................................................................................. 9

1.4.1.4.

Thành phần hóa học .................................................................................. 9

1.4.2. Tình hình nghiên cứu Xáo tam phân .......................................................................... 10
1.5. TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG NUÔI CẤY TẾ BÀO TRONG LĨNH VỰC Y
SINH HỌC...................................................................................................................... 11
1.5.1. Giới thiệu nuôi cấy tế bào động vật ............................................................................ 11
1.5.1.1.

Đặc điểm của tế bào động vật ................................................................. 11


iii

1.5.1.2.

Môi trường nuôi cấy và sự kiểm soát nhiễm ............................................ 12

1.5.2. Ưu, nhược điểm của nuôi cấy tế bào động vật ........................................................... 15
1.5.2.1.

Ưu điểm ................................................................................................. 15

1.5.2.2.

Nhược điểm ............................................................................................ 15

1.5.3. Sử dụng tế bào nuôi cấy để sàng lọc thuốc ................................................................. 16
1.5.4. Một số phương pháp khảo sát tác động kháng phân bào của hoạt chất tự nhiên ....... 17
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................................. 18
2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................................... 18
2.1.1. Tế bào ......................................................................................................................... 18
2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................................... 18
2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................................... 20
2.1.4. Dụng cụ....................................................................................................................... 22
2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 22

2.2.1. Tổng quát nghiên cứu ................................................................................................. 22
2.2.2. Nuôi và bảo quản tế bào ............................................................................................. 22
2.2.3. Phương pháp đếm tế bào với Trypan blue ............................................................... 26
2.2.4. Khảo sát tác động các loại cao chiết khác nhau lên sự tăng sinh của tế bào ung thư
MCF-7 ................................................................................................................................ 28
2.2.5. Cách pha cao chiết ...................................................................................................... 31
2.2.6. Xử lý số liệu................................................................................................................ 31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 32
3.1.
7

KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO MCF ............................................................................................................................. 32

3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IC50 CỦA THUỐC THỬ DOXORUBICIN TRÊN DÒNG
TẾ BÀO MCF - 7 ............................................................................................................ 34

3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IC50 CỦA CAO CHIẾT METHANOL CỦA XÁO TAM
PHÂN TRÊN DÒNG TẾ BÀO MCF - 7 ......................................................................... 37
3.4. KHẢO SÁT ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG MCF - 7 KHI XỬ LÝ VỚI CAO
CHIẾT METHANOL XÁO TAM PHÂN Ở IC50 ............................................................ 40
3.5.

THẢO LUẬN CHUNG ........................................................................................ 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 45
KẾT LUẬN..................................................................................................................... 45
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 45


iv

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 46


v

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư - một trong những căn bệnh phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao
trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Hiện nay vẫn đang là vấn đề nan giải của
y học vì gần như vẫn chưa tìm ra được hoạt chất hay phương pháp điều trị
hữu hiệu nhất cho các loại ung thư. Hằng năm, tỷ lệ tử vong/ mắc ở bệnh
nhân ung thư trên toàn thế giới là 59,7% và tại Việt Nam số ca tử vong lên
đến 82000 ca tương ứng 73,5%. Trong đó, ung thư vú là một trong những
bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất. Đa phần người bệnh đến viện khi bệnh đã
nặng khiến hiệu quả điều trị thấp, khoảng 35% tử vong. Bộ Y tế cảnh báo, cứ
10 phụ nữ Việt Nam thì 1 người có nguy cơ bị ung thư vú, mỗi năm có thêm

15000 người mắc bệnh này.
Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm điều trị hiệu quả căn bệnh ung
thư. Hiện nay, xu hướng sàng lọc thuốc điều trị ung thư từ các loại thực vật
đang được quan tâm và phát triển nhiều hơn. Điểm nổi bật của dược liệu tự
nhiên là có thể hạn chế những tác dụng phụ từ hóa trị hay xạ trị. Bên cạnh đó,
với nguồn nguyên liệu dồi dào sẵn có trong thiên nhiên, dược liệu hứa hẹn sẽ
là liệu pháp mới điều trị ung thư.
Các nguồn dược liệu quý tập trung nhiều ở khu vực Đông và Nam
Châu Á như: Trung Quốc, Việt Nam, Triều Tiên,… Việt Nam nằm ở khu vực
nhiệt đới với nguồn tài nguyên về cây thuốc đa dạng và phong phú – tiềm
năng cho những dược liệu chứa hoạt chất kháng ung thư. Một trong những
dược liệu đã và đang được quan tâm nghiên cứu là Xáo tam phân. Dựa trên
những kết quả đã được công bố trước đó về tác dụng của Xáo tam phân trên
nhiều loại ung thư (ung thư gan, ung thư vú, …), đề tài này được thực hiện để
đánh giá khả năng kháng phân bào của cao chiết từ thân Xáo tam phân (XTP)
lên dòng tế bào ung thư vú MCF – 7. Nội dung thực hiện gồm:


vi

1. Khảo sát nồng độ gây chết 50% của thuốc chuẩn Doxorubicin lên
MCF - 7.
2. Khảo sát nồng độ gây chết 50% của cao chiết XTP trong dung môi
Methanol lên MCF - 7.
3. Xây dựng đường cong tăng trưởng, xác định thời gian nhân đôi của
tế bào MCF - 7 nuôi cấy bình thường, và MCF – 7 bị tác dụng bởi
cao chiết XTP.
Từ đó làm tiền đề cho việc nghiên cứu sâu hơn về khả năng kháng ung
thư cũng như những hoạt tính sinh học khác của Xáo tam phân.

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADSC

: Adipose tissue-derived stem cells

DMEM

: Dullbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO

: Dimethylsufoxide

EDTA

: Muối Ethylenediamine tetraacetic acid disodium

FBS

: Fetal Bovine Serum ( Huyết thanh bò)

IC50

: Concentration Inhibitory (Nồng độ tối thiểu ức chế 50% tế
bào)

MCF – 7

: Michigan Cancer Foundation 7

MeOH

: Methanol

OD

: Optical density

PBS

: Phosphate buffered Saline

XTP

: Xáo tam phân


viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Kết quả khảo sát đường cong tăng trưởng của tế bào MCF - 7 ..... 32
Bảng 1.2. Kết quả khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào
MCF – 7 ........................................................................................ 34
Bảng 1.3. Khảo sát IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân trên dòng tế
bào MCF – 7 .................................................................................. 37

Bảng 1.4. Khảo sát đường cong tăng trưởng MCF – 7 khi xử lý với cao chiết
Methanol Xáo tam phân ở IC50 ....................................................... 40
Bảng 1.5. Khảo sát tác dụng IC50 của cao chiết trên ADSC .......................... 42


ix

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.

Cây xáo tam phân ........................................................................... 9

Hình 2.1. Tế bào MCF – 7 ............................................................................ 18
Hình 2.2. Tủ nuôi tế bào ............................................................................... 21
Hình 2.3. Kính hiển vi điện tử ...................................................................... 21
Hình 2.4. Máy ly tâm ................................................................................... 21
Hình 2.5. Máy đo OD ................................................................................... 21
Hình 2.6. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu .......................................................... 24
Hình 2.7. Tế bào nhuộm với Trypan blue quan sát ...................................... 26
Hình 2.8. Buồng đếm hồng cầu .................................................................... 28
Hình 2.9. Sự biến đổi của MTT dưới tác động của enzyme trong ty thể ....... 29
Hình 3.1. Đồ thị đường cong tăng trưởng của tế bào MCF – 7 ..................... 33
Hình 3.2. Đồ thị khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin ............................ 35
Hình 3.3. Tế bào MCF – 7 khi thử thuốc Doxorubicin theo nồng độ ............ 36
Hình 3.4. Khảo sát IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân trên dòng tế
bào MCF - 7 ................................................................................................. 38
Hình 3.5. Tế bào MCF – 7 khi xử lý với cao chiết MeOH XTP theo nồng độ ...... 39
Hình 3.6. Khảo sát đường cong tăng trưởng MCF – 7 khi xử lý cao chiết
Methanol Xáo tam phân ở IC50 ..................................................................... 41
Hình 3.7. Thời gian nhân đôi của MCF – 7 nuôi cấy bình thường ................ 41

Hình 3.8. Tế bào ADSC khi xử lý cao chiết Methanol Xáo tam phân ở nồng
độ IC50 .......................................................................................................... 43


1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SINH HỌC UNG THƯ VÚ
1.1.1. Ung thư vú
Ung thư vú là một nhóm bệnh làm cho tế bào trong cơ thể thay đổi và
phát triển ngoài tầm kiểm soát. Đa số trường hợp, ở một giai đoạn nhất
định, các bệnh nhân đều có sự xuất hiện của một hoặc nhiều khối tế bào
ung thư được gọi là khối u trong cơ thể, và vị trí khối u hình thành được sử
dụng để đặt tên cho căn bệnh ung thư.
Ung thư vú bắt đầu từ mô vú, nơi được hình thành từ những tuyến tiết
sữa (được gọi là tiểu thùy), các ống dẫn liên kết giữa tuyến tiết và đầu vú
(tiểu quản). Các thành phần còn lại của vú được tạo bởi mô mỡ, mô liên
kết và mô lympho. Ung thư vú xuất hiện ở cả nam lẫn nữ, tuy nhiên ở nam
hiếm gặp hơn [15].
1.1.2. Phân loại
Có nhiều dạng ung thư vú và phổ biến nhất là các dạng:
U tiểu quản tại chỗ (Ductal Carcinoma In-Situ – DCIS): đây là dạng
phổ biến nhất cả ung thư vú lúc mới bắt đầu, tế bào ung thư được phát hiện
bên trong lòng các tiểu quản, chúng chưa phát triển và lan rộng qua thành
tiểu quản và chưa xâm nhập mô vú gần đó. Gần như mọi trường hợp mắc
phải DCIS đều có thể trị lành.
U tiểu thùy tại chỗ (Lobular Carcinoma In-Situ – LCIS): trường hợp
này khối u bắt đầu từ các tuyến tạo sữa và chúng cũng không tăng trưởng
xuyên qua u thành vách của tuyến. Đa số chuyên gia về ung thư vú đều cho
rằng LCIS không phải là ung thư. Tuy nhiên, LCIS lại là một chỉ số về sự

2

gia tăng nguy cơ xâm lấn của ung thư vú, và quả thật phụ nữ bị LCIS sẽ có
nguy cơ ung thư vú cao hơn.
Ung thư tiểu quản xâm lấn (Invasive Lobolar Carcinoma – IDC): đây là
dạng ung thư phổ biến nhất. Cũng giống như DCIS, trường hợp này bắt đầu tại
tiểu quản của vú nhưng những tế bào ung thư sẽ tăng trưởng xuyên qua thành
tiểu quản và xâm nhập vào mô mỡ của vú, sau đó đi đến các hạch bạch huyết
để từ đó chúng có thể theo hệ thống bạch huyến đi khắp nơi trong cơ thể
Ung thư tiểu thùy xâm lấn (Invasive Lobular Carcinoma – ILC): tương
tự như IDC, nhưng nới bắt đầu của ILC là các tiểu thùy.
Ung thư vú dạng viêm (Inflammatory Breast Cancer – IBC): đây là
dạng ung thư vú hiếm thấy. Thường gặp nhất là trường hợp không có cục u
hoặc ung bướu. IBC làm cho da ở vùng vú có màu đỏ và cảm thấy nóng
ấm. Có thể da sẽ dày lên và lỗ chỗ (nhìn giống như vỏ cam). Bầu vú, có thể
to hơn, cứng hơn, nhạy cảm với đau, hoặc bị ngứa. Do không có khối u nên
sẽ khó phát hiện được IBC từ sớm, làm bệnh dễ dàng lan rộng và gây hậu
quả tệ hơn ILC và IDC [16].
Ngoài ra, các thụ thể trên bề mặt tế bào ung thư như ER (Estrogen
receptor), PR (Progesterone receptor), và HER2 (hay HER2/neu, thụ thể
tăng trưởng biểu mô người – Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)
còn được sử dụng để phân ung thư vú thành các lớp phụ. Xác định được
chính xác các lớp phụ này giúp cho việc chẩn đoán và chữa trị diễn ra
thuân lợi hơn [15].
1.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ
Tuy ung thư vú do sự bất thường trong bộ máy di truyền gây ra, nhưng
chỉ có khoảng 5 - 10% bệnh nhân ung thư nhận gene bất thường từ cha

3

hoặc mẹ, bao gồm cả những gene nhạy cảm với ung thư vú như BRCA1 và
BRCA2 (Breast Cancer Gene - gen ung thư vú) [9], [15].
Khoảng 60% phụ nữ xuất hiện đột biến gene BRCA1 và BRCA2 sẽ bị
ung thư vú vào một khoảng thời gian nào đó trong cuộc sống của họ, cao
hơn nhiều so với tỷ lệ 12% ở những phụ nữ bình thường. Bên cạnh đó, việc
tồn tại đột biến ở gen BRCA1 và BRCA2 trong cơ thể còn làm cho họ có
nguy cơ cao đối với ung thư vú đã được tìm ra như TP53 (gene mã hóa
protein ngưng sự tăng sinh của tế bào ung thư) và PTEN/MMCA1
(phosphatase, tensin homologue/ mutated in multiple advanced cancer –
một trong những gene ức chế khối u trong cơ thể) [9], ATM (gen sửa chữa
DNA), CHEK2 (sản xuất ra protein kinase CHK2 được kích hoạt khi DNA
bị tổn thương và liên quan đến việc ngừng chu trình tế bào), CDH1 (sản
phẩm của CDH1 là E-cadherin, một loại protein đóng vai trò liên kết các tế
bào với nhau để tạo nên cấu trúc mô, phụ nữ bị đột biến CDH1 làm tăng
nguy cơ mắc ILC), STK11 (sản xuất ra serine/ threonine kinase 11, là một
enzyme ức chế khối u) .Ngoài yếu tố di truyền, ung thư vú còn nhiều yếu
tố nguy cơ khác như: tuổi tác, tiền sử sinh sản và chu kỳ kinh nguyệt, việc
sử dụng các liệu pháp hormone, phơi nhiễm phóng xạ, việc chụp tia X quá
thường xuyên, lượng cồn hấp thu, các tác động vật lý, các chỉ số cơ thể,
tiền sử bệnh án liên quan tới vú.
1.1.4. Các giai đoạn phát triển
Ung thư vú được chia thành các giai đoạn phát triển khác nhau dựa trên
4 đặc tính:
Kích thước khối u;
Có hay không sự di căn của khối u;
Có hay không sự xuất hiện của khối u ở các hạch lympho;

4

Vị trí di căn của khối u.
Căn cứ vào 4 đặc tính trên, hệ thống phân loại ung thư vú đang được sử
dụng hiện nay bao gồm hệ thống 4 giai đoạn (từ 0 - IV) và hệ thống TNM
(Tumor Nodes Metastasis).
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ UNG THƯ
Phương pháp điều trị được lựa chọn tùy thuộc vào nhiều yếu tố như:
tuổi tác, các căn bệnh đang mắc phải khác, giai đoạn ung thư vú, cơ hội
thành công của phương pháp, sức khỏe người bệnh để chịu đựng những
phản ứng phụ, điều kiện kinh tế của bệnh nhân…
1.2.1. Phẫu thuật
Các dạng phẫu thuật của ung thư vú thường thấy là cắt bỏ u vú và cắt
bỏ hạch bạch huyết ở dưới cánh tay.
Cắt bỏ u vú còn gọi là phẫu thuật bảo toàn vú. Ưu điểm là có thể giữ lại
hầu hết bầu vú. Nhược điểm là phải kết hợp với xạ trị sau phẫu thuật để đạt
được hiệu quả cao nhất. Nhìn chungthì có vẻ cắt bỏ vú là cách tốt nhất để
tiêu diệt “hoàn toàn” ung thư vú. Hơn 20 năm qua, các cuộc nghiên cứu
lớn trên hàng ngàn phụ nữ đã cho thấy được điều này [15].
1.2.2. Xạ trị
Dùng chùm tia năng lượng cao để tiêu diệt tế bào ung thư vú là nguyên
tắc cơ bản của xạ trị là dùng tia năng lượng cao. Phương pháp này dùng để
tiêu diệt tế bào ung thư còn sót sau khi phẫu thuật.
Có 2 cách chính để thực hiện liệu pháp này: chiếu xạ vào vú từ nguồn
phát xạ đặt bên ngoài cơ thể (chiếu xạ bằng chùm tia ngoài) và đặt các hạt


5

phóng xạ vào mô vú ở kế cận vùng ung thư (liệu pháp cận phóng xạ) [15],
[16].
1.2.3. Hóa trị
Hóa trị là việc sử dụng những chất hóa học làm thuốc để chống lại ung
thư có tác dụng làm giảm thiểu kích thước khối u đã di căn. Phương pháp
này phối hợp với những phương pháp điều trị khác nhằm đạt được hiệu quả
cao nhất. Hóa trị đạt được hiệu quả cao nhất với liều đầy đủ và chu trình
hoàn thành đúng thời gian được đưa ra. Hóa trị được thực hiện theo chu kỳ
hay chu trình, giữa mỗi chu trình điều trị thường kéo dài nhiều tháng.
Các nghiên cứu chỉ ra rằng, trong đại đa số các ca điều trị, việc phối
hợp nhiều loại thuốc sẽ có hiệu quả trị liệu tốt hơn là sử dụng riêng lẽ một
loại thuốc. Có nhiều sự kết hợp đang được sử dụng, và vẫn chưa thể kết
luận rõ ràng sự kết hợp nào sẽ mang lại hiệu quả cao nhất trong điều trị.
Các loại thuốc thường được sử dụng trong giai đoạn sớm của bệnh ung thư
vú (trừ ung thư vú âm tính HER2) bao gồm: cyclophosphamide,
methotretaxe,

fluorouracil,

doxorubicine

(Adriamycin),

epirubicin,

paclitaxel (Taxol) và docetaxol (Taxotere). Tùy thuộc loại thuốc sử dụng,
tá dược có thể được bổ sung từ 3 - 6 tháng [15], [16].
Việc đưa thuốc vào cơ thể có thể truy lùng những tế bào ung thư đã di
căn hoặc khối u chưa được phát hiện trong cơ thể. Bên cạnh đó thuốc này
có tác dụng phụ lên nhiều khu vực khác nhau, sẽ làm cho bệnh nhân cảm

thấy mệt mỏi, khó chịu và dễ bị rụng tóc [16].
1.2.4. Hạn chế
Ngày càng có nhiều loại thuốc được tạo ra, nhưng tỷ lệ tử vong của
bệnh nhân ung thư vú vẫn không giảm [15]. Việc sử dụng đơn lẻ từng liệu
pháp không thể mang lại hiệu quả cao, đối với những đặc điểm khác nhau


6

của ung thư vú. Trong khi việc kết hợp nhiều liệu pháp với nhau làm cho
cơ thể phải chịu nhiều tác dụng phụ như: thay đổi cấu trúc trong cơ thể;
mất tính thẩm mỹ…Cho dù sau khi điều trị thành công, với những tác dụng
phụ đó, chất lượng sức khỏe bệnh nhân bị thay đổi.
Ở Việt Nam đa số các trường hợp ung thư vú được phát hiện khá trễ, nên
việc chữa trị tận gốc dường như vô cùng khó khăn. Việc tìm ra phương pháp
điều trị mới có hiệu quả hơn luôn là mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN TRONG
ĐIỀU TRỊ UNG THƯ
Hiện nay thuốc phòng ngừa và chữa trị ung thư từ các nguồn dược liệu
thiên nhiên là một vấn đề đang rất được quan tâm trong vài thập kỷ trở lại
đây. Nguồn dược liệu này không chỉ bổ sung thuốc cho phương pháp hóa trị,
mà còn khắc phục tính chất gây tác dụng phụ của các hóa chất tổng hợp.
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Các hợp chất tự nhiên đóng vai trò rất quan trọng trong hóa trị liệu ung thư.
Các thuốc kháng ung thư có nguồn gốc từ tự nhiên đã được nghiên cứu và sử
dụng rộng rãi như Vincristine hay Vinblastine từ cây dừa cạn, Silymarin từ cây
cúc gai, …
Ở Việt Nam, đã có các nghiên cứu khảo sát cây thuốc, cũng như nghiên
cứu thành phần và hoạt tính của chúng. Giáo sư Vũ Văn Chuyên cho biết đã
tìm được 87 loại cây đặc hiệu chữa ung bướu và 18 cây có tác dụng chữa u ác

tính. Những năm gần đây, các chuyên gia về y dược học đã nghiên cứu và đã
đưa ra một số chế phẩm (nguồn gốc từ thảo mộc) có tác dụng phòng chống
ung thư như:
Chế phẩm Phulamin của Học viện Quân y;


7

Chế phẩm Gacvit của Hội ung thư Việt Nam;
Chế phẩm Cadef (còn gọi là HTCK) của Viện Công nghệ Sinh Học;
Giáo sư dược sỹ Đỗ Tất Lợi cũng đã nghiên cứu và ứng dụng cây Trinh
nữ hoàng cung, kết hợp với các bài thuốc 18 vị của y học cổ truyền, trong
điều trị ung thư vú, ung thư cổ tử cung, u xơ tiền liệt tuyến,…
Một số nơi đã có những thành tựu đáng kể trong lĩnh vực này: như công
ty Dược phẩm Trung ương II với thành công về cây Trinh nữ hoàng cung,
cây dừa cạn và công ty Dược phẩm Traphaco đã bán ra thị trường biệt
dược Cadef là thuốc hỗ trợ điều ung thư nguồn gốc thảo dược, trong đó có
thành phần chính được chiết từ cây dừa cạn.
Hiện nay, các phương pháp điều trị ung thư chủ yếu là phẫu thuật, xạ
trị và hóa trị. Tuy nhiên, các phương pháp này có thể gây ra tác dụng phụ
và những bất lợi trên tế bào lành. Vì thế, các nhà khoa học trên thế giới
đang hy vọng tìm ra nhiều chất mới có trong cây thuốc thiên nhiên để điều
trị ung thư hiệu quả mà không gây tác dụng phụ.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Từ năm 1986, Lương y Nam Hải (Chùa Thầy - Sơn Tây - Trung Quốc)
đã nghiên cứu ứng dụng y học cổ truyền để chữa bệnh máu trắng
(Leucemie cấp) đạt kết quả khả quan.
Trên tạp chí “Let’s Live” số 2/2002 về báo cáo y học của Đại học
Harvard xác nhận những người tiêu thụ cà chua nhiều và các hợp chất có
trong cà chua hơn 2 lần mỗi tuần có thể làm giảm tỷ lệ ung thư nhiếp hộ

tuyến đến 21 - 34%. Lycopene là một cấu chất chính của cà chua (tương
đương với carotene của sinh tố A) là một chất dinh dưỡng mạnh có thể
phòng chống ung thư nhiếp hộ tuyến, kích xúc tim và nhiều loại ung thư


8

khác. Theo TS. Lester Packer, một vị khảo cứu danh tiếng về sự chống
dưỡng khí hóa thuốc Viện Đại học Berkely, California và cũng là đồng tác
giả bộ sách “The Antioxidant Miracle” (Sứ chống dưỡng khí hóa kỳ diệu)
(John Wiley & Sons, Inc., 1999): “Sự khảo sát trong ống nghiệm đã cho
thấy Lycopene là một chất dưỡng khí hóa mạnh hơn chất beta carotene”.
Điều này chứng tỏ Lycopene là một vũ khí lý tưởng để chống lại mọi loại
ung thư.
Tháng 8/2006 các nhà khoa học Ý đã phát hiện một vũ khí mới đầy hứa
hẹn cho cuộc chiến chống ung thư: cây tùng lam, một loại cây mọc nhiều ở
khu vực Đông Nam Á. Theo các nhà nghiên cứu tại Viện Thí nghiệm cây
công nghiệp ở Bologna (Ý), trong cây tùng lam (tên khoa học Isatis
tinctoria) có chứa một lượng lớn Glucobrassicin (GBS) một chất có khả
năng chống ung thư và hiện được sử dụng như nguồn dược liệu chính để
điều chế các chất cần thiết trong một loại thuốc chữa ung thư hiện nay. Các
nhà khoa học tin rằng phát hiện này sẽ mở ra một nguồn dược liệu mới
dùng để điều chế các loại thuốc ngăn ngừa ung thư, đặc biệt là ung thư vú
1.4. XÁO TAM PHÂN
1.4.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm
1.4.1.1. Nguồn gốc
Cây Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum
[3]; đồng danh là Atalantia trimera Oliv. hay Luvunga monophylla (DC.) Mabb.
[10], thuộc họ Cam (Rutaceae), là một trong 7 loài thuộc chi Paramignya được
liệt kê có ở Việt Nam. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ trong cuốn sách Cây cỏ

Việt Nam, loài thực vật này phân bố ở Bình Dương của Việt Nam và Thái Lan.
1.4.1.2. Phân loại


9

Giới

: Plantae

Ngành

: Tracheophyta

Lớp

: Magnoligopsida

Bộ

: Sapindales

Phân họ : Rutaceae
Chi

: Paramignya

Loài

: Paramignya trimera

Hình 1. Cây xáo tam phân

1.4.1.3. Đặc điểm
Về đặc điểm hình thái thì đây là một loài dây trườn thân gỗ, vỏ màu nâu
vàng; thân dài trên 4 m; đường kính khoảng 10 cm.
Thân và cành có nhiều gai nhọn, dài đến 7 - 8 cm. Lá đơn, mọc cách, đôi
khi mọc chụm ở đầu cành, phiến dày, mép cong xuống dưới, có hình thuôn
hẹp, dài 8 - 12 cm, rộng 1 - 3 cm; lá mọc ở gần gốc có phiến kích thước lớn
hơn so với lá ở đoạn trên thân và cành; đầu lá tù hoặc hơi lõm.
Phiến lá có mặt trên xanh đậm, mặt dưới nhạt hơn; bên trong có nhiều
điểm dầu. Cuống lá ngắn 4 - 6 mm.
Gỗ hơi cứng có màu vàng, đối với phần rễ có màu vàng đậm hơn. Các bộ
phận của cây có tinh dầu, nhiều nhất ở rễ có mùi thơm dịu rất đặc trưng.
1.4.1.4. Thành phần hóa học
Hiện nay các nhà khoa học trong cũng như ngoài nước đang tích cực thực
hiện những nghiên cứu về thành phần chính xác của Xáo tam phân.


10

Qua khảo sát sơ bộ thì thành phần hóa học của Xáo tam phân có chứa các
hợp chất thuộc nhóm flavonoid, coumarin, ankaloid, triterpenoid và saponin [2],
[17].
Flavonoid: có khả năng chống ô xy hóa, có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn
ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não, lão hóa, thoái hóa gàn, tổn
thương do bức xạ.
Saponin: có tác dụng thông tiểu, chống viêm, kháng khuản, kháng nấm,
ức chế hoạt động của virus,…
Alkaloid: có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương gây ức chế hoặc kích thích,

gây mê tại chỗ, tăng huyết áp, diệt ký sinh trùng, có tác dụng chống ung thư,…
Coumarin: có tác dụng chống co thắt, làm giãn nở động mạch vành, chống
đông máu, kháng khuẩn…
Triterpenoid: có tác dụng lớn trong điều trị bệnh tiểu đường, bệnh xơ gan,
viêm gan cấp,…
1.4.2. Tình hình nghiên cứu Xáo tam phân
Hiện nay, mặc dù Xáo tam phân với những lời đồn đại của người dân
được xem là “Thần dược” và bị khai thác vô y thức, nhưng những nghiên cứu
về Xáo tam phân vẫn chưa nhiều ở trong cũng như ngoài nước.
Bước đầu các nhà khoa học đã nghiên cứu thành phần hóa học có trong
Xáo tam phân. Ngoài việc đánh giá sơ bộ về thành phần hóa học của Xáo tam
phân có chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, coumarin, ankaloid,
triterpenoid và saponin, các nhà khoa học còn tìm ra, phân lập và xác định cấu
trúc hóa học 3 hợp chất đó là: ostruthin; 6 - (3,7 dimethyl - 2,6 - octadienyl) 7 - hydroxyl - 8 - methyoxy - 2H - 1 - benzopyran - 2 - one và (2 hydroxyethyl) - 2,2 - dimethyl - 2H - 1 - benzopyran. Trong đó hợp chất 6 -


11

(3,7 dimethyl - 2,6 - octadienyl) - 7 - hydroxyl - 8 - methyoxy - 2H - 1 benzopyran - 2 - one là hợp chất thiên nhiên mới lần đầu tiên được tìm thấy
và được đặt tên là Ninhvanin [1],[2].
Xáo tam phân cũng đã được nghiên cứu tác dụng gây độc trên tế bào ung
thư. Với nghiên cứu này thì cao chiết methanol, phân đoạn n - hexan và hoạt
chất từ Xáo tam phân thể hiện được độc tính trên 5 dòng tế bào ung thư, trong
đó phân đoạn n - hexan và hoạt chất thể hiện độc tính ở mức trung bình, lần
lượt trên tế bào ung thư gan Hep - G2 (IC50 = 39,61 µg/ ml) và dòng tế bào
ung thu cổ tử cung (IC50 = 18,4 µM) [4].
Những nghiên cứu ban đầu về Xáo tam phân cho thấy công dụng và tiềm
năng Xáo tam phân trong ngành dược liệu để chữa ung thư là rất cao.
1.5. TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG NUÔI CẤY TẾ BÀO TRONG
LĨNH VỰC Y SINH HỌC

1.5.1. Giới thiệu nuôi cấy tế bào động vật
1.5.1.1. Đặc điểm của tế bào động vật
Tính bền cơ học yếu do tế bào động vật không có vách, kích thước lại lớn
(khoảng 10 µm), nên rất dễ vỡ bởi các lực tác động khi thao tác, do đó cần
nhẹ nhàng khi di chuyển các mẫu, thời gian thao tác cần cố gắng sao cho ngắn
nhất vì thời gian càng dài tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ.
Tăng trưởng và phân chia chậm.
Có cơ chế kìm hãm ngược: sự gia tăng nồng độ một chất nào đó trong môi
trường sẽ gây ra sự ức chế quá trình tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường chính
chất đó, đồng thời cũng ức chế cả sự phát triển tế bào, thậm chí làm chết tế bào
hàng loạt. Do đó, việc thay mới môi trường sau một thời gian nuôi cấy là rất cần
thiết.


12

Hầu hết các tế bào động vật, trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào
sinh dục, đều cần bám vào giá thể để sống và phát triển, thường là bề mặt rắn.
Tuy nhiên, một số dòng tế bào ung thư hoặc dòng tế bào liên tục, sau khi
được thuần hóa, có thể sinh trưởng trong trạng thái lơ lửng không cần bám
vào nền.
Có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thông qua quá trình dung hợp hai tế
bào có nhân khác nhau, hay quá trình biến nạp được thực hiện bởi một virus
cảm ứng ung thư hoặc bởi hóa chất.
Có thể được bảo quản bằng phương pháp lạnh sâu trong nitơ lỏng (196oC).
Ngoài ra, còn một số đặc tính khác như: kém thích nghi với môi trường,
nhạy cảm với ion kim loại, đa số đều cần huyết thanh, hormone,… để tăng
trưởng và phân chia [5], [12], [14].
1.5.1.2.Môi trường nuôi cấy và sự kiểm soát nhiễm
Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy tế bào động vật là một hỗn hợp rất phức tạp các
thành phần dinh dưỡng cùng các chất khác nhau cho tế bào sống và phát triển.
Chất dinh dưỡng giữ vai trò tối cần thiết trong nuôi cấy tế bào, chúng là nhân
tố quyết định sự thành bại của nuôi cấy tế bào in vitro. Hiện nay, có nhiều loại
môi trường đã được nghiên cứu thiết kế để phù hợp với yêu cầu nuôi cấy từng
loại tế bào khác nhau [7], như DMEM (Dullbecco), EMEM (H.Eagle), F10 và
F12 (R.G.Ham), 199 (R.C.Parker), RPMI – 1640 (G.E.Moore)… Bên cạnh đó
còn có các môi trường phối hợp hoặc bổ sung các chất để phù hợp với mục
đích nuôi cấy khác nhau (nuôi sơ cấp, nuôi thứ cấp, biệt hóa tế bào,…).


13

Nhìn chung, môi trường nuôi cấy tế bào động vật cơ bản gồm các thành
phần chủ yếu: muối vô cơ, hệ đệm, các amino acid, protein, carbohydrate,
vitamin, các acid béo và lipid, các yếu tố vi lượng,… Đặc biệt, trong hầu hết
các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật cần có huyết thanh vì những vai
trò quan trọng của nó (bổ sung chất dinh dưỡng và các nhân tố quan trọng cho
tế bào, giúp bất hoạt Trypsin và phục hồi tế bào bị tổn thương khi cấy chuyền,
chống sự oxy hóa có thể gây tổn thương tế bào, cải thiện tính tan của các chất
dinh dưỡng và tính bám dính của tế bào lên giá đỡ…). Ngoài ra, với những
dạng tế bào chuyên biệt có thể thêm các yếu tố bổ sung cần thiết khác [5], [12],
[13].
Khi tế bào được nuôi cấy phát triển dày đặc trên bề mặt của bình nuôi cấy
(đối với nuôi cấy lớp đơn) hoặc khi môi trường đã suy yếu chất dinh dưỡng
(đối với nuôi cấy tế bào ở thể huyền phù) thì tế bào cần phải được cấy chuyền
để duy trì khả năng phát triển chúng. Tuy thực hiện cấy chuyền thì mật độ tế
bào sẽ giảm xuống nhưng nếu mật độ tế bào được đảm bảo trong khoảng
thích hợp (khoảng 104 – 106 tế bào/ml) và lượng môi trường đầy đủ thì chúng
có thể phát triển trở lại một cách tối ưu.

Vấn đề kiểm soát nhiễm
Vấn đề quan trọng phải đương đầu trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro
là nhiễm (Contamination). Do tế bào động vật có tốc độ phân chia chậm (20 –
24 giờ một chu kỳ) nên chúng dễ bị lấn át bới các vi sinh vật ngoại nhiễm.
Đồng thời, chúng cũng bị đe dọa bởi các virus.
Các tác nhân nhiễm chủ yếu là bào tử nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus,
đôi khi là nhiễm dòng tế bào khác vào mẫu nuôi cấy...
Nấm và vi khuẩn phát triển rất nhanh so với tế bào động vật, gây hại
nhiều nhưng có thể phát hiện khá dễ dàng. Mycoplasma và virus tương đối


14

khó và tốn kém để xác định vì phải dùng các phương pháp sinh hóa và các kỹ
thuật cao như nhuộm huỳnh quang, kính hiển vi điện tử,…
Khó khăn nhất là nhiễm dòng tế bào khác. Chúng có thể xảy ra nhiều năm
mà không bị phát hiện. Tuy không gây hại nhiều đến tế bào mục tiêu đang
nuôi cấy như các tác nhân trên, nhưng sự nhiễm tế bào khác làm ảnh hưởng
lớn đến kết quả nghiên cứu cũng như sản phẩm nuôi cấy (đối với nuôi cấy tế
bào để sản xuất các hợp chất sinh học hay dùng làm vật liệu cấy ghép).
Một khi phát hiện ra mẫu nhiễm, cần nhanh chóng xử lý vô trùng, cách ly,
tìm nguyên nhân sự nhiễm để có biện pháp xử lý thích hợp, thậm chí loại bỏ
mẫu, tránh nhiễm sang các mẫu còn lại [6],[13].
Vô trùng là yếu tố cực kỳ quan trọng và được lưu ý đặc biệt trong nuôi
cấy tế bào động vật. Phòng nuôi cấy tế bào phải được vô trùng đúng phương
pháp và môi trường vô trùng trong phòng phải được duy trì.
Để đảm bảo vô trùng, các thiết bị vô trùng như đèn UV, màng lọc HEPA,
nồi hấp khử trùng, thiết kế “khóa không khí” … được sử dụng.
Con người và các không gian thao tác, môi trường, dụng cụ… cần được
giữ vô trùng trong suốt quá trình nuôi cấy. Tuyệt đối không mang thức ăn,

nước uống vào phòng nuôi cấy tế bào.
Riêng với môi trường nuôi, tùy theo tính chất hóa học của các thành phần
môi trường, đặc biệt là tính bền nhiệt, nên chọn phương pháp khử trùng phù
hợp, mà thường là hấp ướt hoặc lọc bằng milipore [5], [12], [13].