Xác định một số đặc điểm sinh hóa và so sánh protein màng của các chủng vi khuẩn vibrio spp phân lập từ cá chẽm (lates calcarifer)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ SO SÁNH
PROTEIN MÀNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Vibrio
spp. PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer)

Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc
Sinh viên thực hiện

: Trần Đàn

Mã số sinh viên

: 53130024

Khánh Hòa, tháng 6 năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Trong 4 năm học tại trƣờng Đại học Nha Trang, tôi đã tiếp thu đƣợc rất nhiều
kiến thức từ sự dạy bảo và giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô và bạn bè. Với tất cả sự chân
thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới:
ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt
quá trình làm đề tài tốt nghiệp. Cảm ơn cô đã luôn luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện để em có thể học hỏi đƣợc nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý giá.

Chị Nguyễn Minh Nhật đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc thực hành tại Trung
tâm Thí nghiệm - Thực hành, Trƣờng Đại học Nha Trang.
Quý thầy cô giáo chuyên ngành Công nghệ Sinh học đã trang bị cho em những
kiến thức cơ bản và chuyên ngành trong suốt 4 năm học.
Tôi xin đƣợc cảm ơn những ngƣời bạn thân yêu của lớp 53CNSH, đặc biệt là
bạn Nguyễn Anh Thƣ đã luôn quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt những năm qua.
Cuối cùng, con xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến gia đình. Cảm ơn ba mẹ và
mọi ngƣời trong gia đình đã tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần để con có thể
hoàn thành khóa học một cách tốt nhất.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, tháng 06, năm 2015
Sinh viên thực hiện
Trần Đàn


ii

TÓM TẮT
Vibriosis là bệnh phổ biến thƣờng gặp ở các đối tƣợng thủy sản, trong đó có cá
chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790). Cho đến nay, các phƣơng pháp mới đã không
ngừng đƣợc nghiên cứu phát triển để chống lại vi khuẩn Vibrio nhằm trị bệnh cho thủy
sản khi mà các phƣơng pháp truyền thống nhƣ sử dụng thuốc sát trùng hay kháng sinh
không mang lại hiệu quả. Và protein màng ngoài đƣợc xem là một đối tƣợng rất tiềm
năng trong phát triển các loại vaccine hay làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể
chống lại vi khuẩn Vibrio. Mục đích của nghiên cứu này là xác định một số đặc điểm
sinh hóa của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa và so sánh
protein màng của các chủng phân lập đƣợc. Một số đặc điểm sinh hóa cơ bản của các
chủng đƣợc xác định bằng kit định danh sinh hóa API-20E, kết hợp với các phần mềm
API, ABIS trực tuyến và khóa phân loại Bergey (1994) để định danh. Kết quả đã thu
nhận đƣợc 7 chủng phân lập: NH1, NH2, NH3, NH4, VN1, VN2, NT1 có những đặc

điểm sinh hóa tƣơng đồng với các chủng tƣơng ứng là V. mimicus, V. anguillarum, V.
harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. anguillarum và V. diazotrophicus.
Phân tích protein màng của các chủng thu đƣợc bằng phƣơng pháp điện di SDSPAGE, kết quả cho thấy các protein màng có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78,
40 kDa xuất hiện ở tất cả các chủng. 160, 150, 62, 52, 38, 35 và 31 kDa là những
protein xuất hiện ở đa số các chủng. Đặc biệt, protein màng có khối lƣợng phân tử là
58 kDa chỉ xuất hiện ở chủng NH1 và protein màng 36 kDa chỉ xuất hiện ở chủng
NH3. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có thể làm cơ sở tham khảo cho việc phát triển
một loại vaccine hay làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể chống lại nhiều chủng
Vibrio gây bệnh trên thủy sản.


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. 1
TÓM TẮT........................................................................................................................ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. v
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. vi
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 3
1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới ...................................................................... 3
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam ...................................................................... 4
1.2 Một số đặc điểm của cá chẽm.................................................................................... 5
1.2.1 Đặc điểm phân loại và hình thái ............................................................................. 5
1.2.2 Đặc điểm phân bố ................................................................................................... 6
1.2.3 Vòng đời ................................................................................................................. 6
1.3 Các bệnh thƣờng gặp trên cá chẽm ........................................................................... 6

1.3.1 Bệnh do virus .......................................................................................................... 6
1.3.2 Bệnh do vi khuẩn .................................................................................................... 7
1.3.3 Bệnh do nguyên sinh động vật kí sinh ................................................................... 8
1.4 Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ............................ 10
1.4.1 Tổng quan về Vibrio spp. ..................................................................................... 10
1.4.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ....................................................... 11
1.4.2.1 Cơ chế gây bệnh ................................................................................................12
1.4.2.2 Đặc điểm dịch tễ ...............................................................................................12
1.4.3 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn gây ra ................................. 13
1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu protein màng ngoài của vi khuẩn Vibrio ........ 13
1.6 Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide ......................................................... 15
1.6.1 Sơ lƣợc về lịch sử gel polyacrylamide và sự phát triển của phƣơng pháp điện di
trên gel polyacrylamide ................................................................................................. 15
1.6.2 Gel polyacrylamide .............................................................................................. 15
1.6.3 Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................................ 16


iv
1.6.4 Nhuộm gel sau khi điện di .................................................................................... 17
1.6.5 Một số yếu tố cần quan tâm trong điện di trên gel polyacrylamide ..................... 17
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 19
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 19
2.2 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................. 19
2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu .............................................................................. 19
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 20
2.4.1 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn ........................................................................... 20
2.4.2 Định danh vi khuẩn .............................................................................................. 20
2.4.3 Phƣơng pháp tách chiết protein màng của vi khuẩn ............................................. 21
2.4.4 Phƣơng pháp điện di SDS - PAGE ....................................................................... 22
2.4.5 Phƣơng pháp Bradford ......................................................................................... 25

2.4.6 Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................................... 26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 27
3.1 Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm ............. 27
3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn .................................................................................... 27
3.1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc .................................. 28
3.2 Kết quả xác định protein màng của các chủng vi khuẩn Vibrio theo phƣơng pháp
điện di SDS - PAGE ...................................................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 34
1 Kết luận....................................................................................................................... 34
2 Kiến nghị .................................................................................................................... 34
PHỤ LỤC A
PHỤ LỤC B


v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
APS

Ammonium Persulphate

cfu

Colony Forming Unit

cs

Cộng sự

h

Giờ

kDa

Kilodalton

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

OD

Optical Density

OMP

Outer membrane protein.

PAGE

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Rpm

Revolutions per minute

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

TCBS

Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar

TEMED

Tetramethylethylenediamine

Tris

Electrophoresis purity reagent Tris (hydrorymethyl) – aminomethane

TSA

Tryptic Soy Agar

TSB

Tryptic Soy Broth


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Tỷ lệ acrylamide trong gel SDS – PAGE và phạm vi phân tách protein ......24

Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch điện di protein ...............................................24
Bảng 2.3. Nồng độ dung dịch BSA (µg/ml) .................................................................26
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ........27
Bảng 3.2. Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá
chẽm...............................................................................................................................29


vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sản lƣợng cá chẽm thế giới qua các năm ........................................................ 3
Hình 1.2. Hình thái bên ngoài của cá chẽm ..................................................................... 5
Hình 1.3. Quá trình polymer hóa của acrylamide ........................................................ 16
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu .................................................................... 19
Hình 2.2. Bộ điện di SDS-PAGE (Bio-Rad) ................................................................. 22
Hình 2.3. Mô hình điện di SDS-PAGE ......................................................................... 23
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng TCBS ................................................. 27
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trƣờng NA bổ sung 2% NaCl . 28
Hình 3.3. Nhuộm Gram vi khuẩn ................................................................................. 28
Hình 3.4. Kết quả phân tích protein màng của các chủng Vibrio phân lập từ cá
chẽm bằng phƣơng pháp SDS-PAGE ........................................................................... 31


1

LỜI MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, khi mà nền kinh tế Việt Nam đang có những bƣớc
tăng trƣởng đáng kể, thì ngành nuôi trồng thủy sản cũng đã có những bƣớc tiến nhảy
vọt và đang đƣợc coi là một trong những ngành mũi nhọn trong tiến trình phát triển
nền kinh tế của nƣớc ta.

Việt Nam đƣợc thiên nhiên ƣu đãi với nhiều lợi thế trong nuôi trồng các đối
tƣợng thủy sản, đặc biệt là cá biển. Trong số các loài cá biển đang đƣợc nuôi ở nƣớc ta
thì cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) là một trong những đối tƣợng nuôi có giá
trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cao. Sản lƣợng và diện tích nuôi cá chẽm đã không
ngừng tăng lên qua từng năm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc và xuất khẩu. Tuy
nhiên, đi kèm với sự gia tăng nhanh chóng cả về số lƣợng và diện tích nuôi, đó là sự
suy giảm chất lƣợng môi trƣờng do thiếu sự quản lý, quy hoạch cũng nhƣ ý thức bảo
vệ môi trƣờng của ngƣời nuôi. Những yếu tố này làm cho dịch bệnh xảy ra ngày càng
nhiều và gây ra những thiệt hại ngày càng lớn.
Trong số các bệnh thƣờng gặp ở cá chẽm thì bệnh do các chủng vi khuẩn Vibrio
là nguy hiểm và gây ra nhiều thiệt hại nhất. Chúng là những vi khuẩn Gram âm, hình
que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thƣớc 0,3 - 0,5 µm x 1,4 - 2,6 µm. Chúng không
hình thành bào tử và chuyển động nhờ một hoặc nhiều tiên mao mảnh [1]. Nhóm vi
khuẩn này gây ra thiệt hại rất lớn đến nghề nuôi cá biển trên thế giới cũng nhƣ ở Việt
Nam. Vì vậy, việc nghiên cứu các chủng vi khuẩn Vibrio để điều trị bệnh cho cá chẽm
nói riêng và thủy sản nói chung là điều hết sức cần thiết.
Hiện nay, các biện pháp phòng và trị bệnh chủ yếu trong thủy sản vẫn là sử
dụng thuốc sát trùng, kháng sinh. Nhƣng thuốc sát trùng thƣờng để lại hậu quả nghiêm
trọng cho môi trƣờng. Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh cũng có nguy cơ phá vỡ cân
bằng hệ vi sinh môi trƣờng và để lại dƣ lƣợng trong sản phẩm, gây nguy hại cho môi
trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Trƣớc thực trạng đó, có rất nhiều phƣơng pháp chữa
bệnh mới đã đƣợc nghiên cứu và phát triển nhƣ việc đƣa vaccine vào phòng bệnh cho
thủy sản. Chính vì thế, những hiểu biết về protein màng ở vi khuẩn sẽ góp phần phát
triển cũng nhƣ đem lại hiệu quả cho các phƣơng pháp chữa bệnh mới.


2
Mục tiêu của đề tài:
Xác định một số đặc điểm sinh hóa và so sánh protein màng của các chủng vi
khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790).

Các nội dung chính của đề tài:
1. Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio
từ cá chẽm.
2. Phân tích protein màng của các chủng thu đƣợc.
Những sai sót trong đồ án là điều không thể tránh khỏi do thời gian thực hiện đề
tài có hạn, bên cạnh đó là những hạn chế về kiến thức và bƣớc đầu làm quen với
phƣơng pháp nghiên cứu khoa học. Kính mong quý thầy cô cùng bạn đọc góp ý kiến
để đồ án đƣợc hoàn thiện hơn.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới
Cá chẽm là loài cá có giá trị kinh tế cao, dễ nuôi do cá có khả năng chịu đựng
tốt với điều kiện môi trƣờng, với các loại thức ăn đa dạng nên là đối tƣợng nuôi thích
hợp và thực tế đã đƣợc nuôi phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới, đặc biệt là khu vực
Châu Á - Thái Bình Dƣơng. Nghề nuôi cá chẽm đƣợc hình thành từ những năm đầu
của thập niên 1970 ở Songkla - Thái Lan. Đến năm 1973, Thái Lan đã thành công
trong việc kích thích cá nuôi vỗ cho sinh sản bằng phƣơng pháp điều chỉnh môi
trƣờng. Từ đó, vòng đời của loài cá này đã đƣợc khép kín trong sản xuất giống nhân
tạo. Đến năm 1985, mỗi năm Thái Lan sản xuất trên 100 triệu con giống và là nguồn
cung cấp giống chủ yếu cho các trại nuôi cá biển trong nƣớc và cả các nƣớc trong khu
vực. Từ đó nghề nuôi cá chẽm đƣợc nhân rộng ở các nƣớc Châu Á nhƣ Trung Quốc,
Đài Loan, Singgapore, Indonesia, Malaysia và Việt Nam, đóng góp không nhỏ vào sản
lƣợng cá thế giới [4].

Hình 1.1. Sản lượng cá chẽm thế giới qua các năm (Nguồn: FAO, 2013)

4
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam
Nuôi trồng thủy sản đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế ở
Việt Nam và đã đƣợc FAO đánh giá là một phƣơng tiện xóa đói giảm nghèo hiệu quả.
Năm 2014, với sản lƣợng nuôi trồng đạt 3,393 triệu tấn đã góp phần khẳng định thế
mạnh của nƣớc ta trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản so với các nƣớc trong khu vực và
thế giới. Mục tiêu đầy tham vọng của ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam năm 2015
là sản xuất ra 3,95 triệu tấn sản phẩm đã nhận đƣợc sự hỗ trợ to lớn cả về tài chính
cũng nhƣ kỹ thuật từ Bộ Thủy Sản (Việt Nam) và một số tổ chức quốc tế khác.
Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao, cũng là nơi phát sinh nhiều
loài cá biển có giá trị kinh tế cao và cá chẽm là một trong số đó. Cá chẽm phân bố dọc
theo bờ biển từ Móng Cái đến Cà Mau trong tất cả các thủy vực từ nƣớc ngọt, nƣớc lợ
đến nƣớc mặn. Vì vậy, diện tích nuôi phù hợp cho cá chẽm ở Việt Nam rất lớn. Hiện
nay, cá chẽm đƣợc nuôi ở nhiều nơi trên khắp cả nƣớc nhƣ Đồng bằng sông Cửu
Long, Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Thừa Thiên Huế….
Việc chọn đối tƣợng nuôi có ý nghĩa rất quan trọng trong nghề nuôi cá biển.
Đối tƣợng nuôi phải có giá trị kinh tế cao đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu dùng của thị
trƣờng trong và ngoài nƣớc. Đặc biệt là phải chủ động nguồn giống cả về số lƣợng,
chất lƣợng và tính mùa vụ. Cá chẽm đƣợc đƣa vào nghiên cứu, sản xuất giống nhân
tạo ở các Viện Nghiên Cứu Thủy Sản I, II, Trƣờng Đại học Cần Thơ, Trƣờng Đại học
Nha Trang từ những năm 1994. Năm 2000, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II
đã nghiên cứu thành công và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nhân tạo giống cá
chẽm khép kín từ quy trình thuần dƣỡng và nuôi cá bố mẹ thành thục trong bể xi
măng, kích thích sinh sản, ƣơng nuôi cá bột thành cá giống đã góp phần to lớn phát
triển ngành nuôi cá chẽm ở nƣớc ta [6].


5
1.2 Một số đặc điểm của cá chẽm

1.2.1 Đặc điểm phân loại và hình thái
Theo FAO (1974) cá Chẽm có hệ thống phân loại nhƣ sau:
Ngành động vật có xƣơng sống
Lớp cá xƣơng

Chordata

Osteichthyes

Phân lớp cá vây tia

Actianopteryga

Phân bộ cá vƣợc
Họ cá Sơn biển
Giống cá chẽm
Loài cá chẽm

Percoidei
Centropomidal
Lates
Lates calcarifer (Bloch, 1790)

Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Đầu nhọn,
nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm xuống ở giữa và hơi lồi ở lƣng. Miệng rộng và hơi
so le, hàm trên kéo dài đến phía dƣới sau hốc mắt. Răng dạng nhung, không có răng
nanh, trên nắp mang có gai cứng, vây lƣng gồm có 2 vi: vi trƣớc có 7 - 9 gai cứng và
vi sau có 10 - 11 tia mềm. Vi hậu môn có 3 gai cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy
dạng lƣợc và có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đƣờng bên [29].

Hình 1.2. Hình thái bên ngoài của cá chẽm
Khi cá còn khoẻ, trên mặt lƣng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi
sống trong môi trƣờng nƣớc biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trƣờng nƣớc ngọt.
Khi cá ở giai đoạn trƣởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lƣng và màu
vàng bạc ở mặt bụng.


6
1.2.2 Đặc điểm phân bố
Cá chẽm là loài phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới thuộc Tây Thái
Bình Dƣơng và Ấn Độ Dƣơng, giữa kinh tuyến 500 Đông đến 1600 Tây, vĩ tuyến 260
Bắc đến 250 vĩ tuyến Nam.
Cá chẽm rất rộng muối và có tính di cƣ xuôi dòng, cá lớn lên chủ yếu ở vùng
nƣớc ngọt nhƣ sông, hồ. Khi thành thục (3 - 4 năm tuổi), chúng sẽ di cƣ ra vùng cửa
sông, ven biển có độ mặn thích hợp từ 30 - 32 ‰ để sinh sản. Ấu trùng sau khi nở ra
sẽ di cƣ vào vùng cửa sông, ven bờ và lớn lên, cá con sẽ dần dần di cƣ vào các thủy
vực nƣớc ngọt sinh sống và phát triển thành cá thể trƣởng thành [6].
1.2.3 Vòng đời
Cá chẽm trải qua phần lớn thời gian sinh trƣởng (2 - 3 năm) trong các thủy vực
nƣớc ngọt nhƣ: sông, hồ nơi nối liền với biển. Cá có tốc độ tăng trƣởng nhanh, thƣờng
đạt cỡ 3 - 5 kg sau 2 - 3 năm. Cá trƣởng thành 3 - 4 tuổi di cƣ từ vùng nƣớc ngọt về
vùng cửa sông và ra biển nơi có độ muối dao động 30 - 32‰ để phát triển tuyến sinh
dục và đẻ trứng sau đó. Cá đẻ trứng theo chu kỳ trăng (thƣờng vào lúc khởi đầu của
tuần trăng hay lúc trăng tròn) vào lúc buổi tối (6 - 8 giờ) và thƣờng cá đẻ đồng thời với
thủy triều lên. Điều này giúp trứng và ấu trùng trôi vào vùng cửa sông. Nơi đó, ấu
trùng sẽ phát triển và di chuyển ngƣợc dòng để lớn. Hiện tại, điều chƣa biết là cá
trƣởng thành có đi ngƣợc dòng không hay chúng giữ giai đoạn còn lại cuối đời sống ở
biển [6].
1.3 Các bệnh thƣờng gặp trên cá chẽm
1.3.1 Bệnh do virus

Bệnh bạch cầu
Bệnh bạch cầu tìm thấy ở cá chẽm nuôi lồng, đặc biệt ở cá giống cỡ 4 - 7 cm,
bệnh này xuất hiện ở mọi nhiệt độ trong môi trƣờng nƣớc có nồng độ muối cao. Dấu
hiệu chính của bệnh là sự nở rộng các tế bào nằm ở tầng hạ bì của da cá, trông giống
nhƣ bệnh hình hoa cải. Bệnh truyền nhiễm từ cá này sang cá khác. Bệnh này vẫn chƣa
có thuốc trị đặc hiệu [1].
Bệnh hội chứng lở loét ở cá
Rhabdovirus gây bệnh cho nhiều loài cá biển, trong đó có cá chẽm và ở nhiều
vùng địa lý khác nhau. Virus lây nhiễm qua đƣờng tiêu hóa, xâm nhập qua vết thƣơng,
qua mang, mắt và chủ yếu theo chiều ngang. Khi cá mắc bệnh thƣờng có những triệu


7
chứng sau: xuất huyết từng đám nhỏ trên thân, đầu, gốc vây và cuống đuôi dẫn đến cá
bị hoại tử từng phần và chết sau 1 - 2 tuần nhiễm bệnh. Khi mổ xoang bụng thấy chứa
nhiều chất nhờn có hiện tƣợng ruột bị viêm. Thời gian gây bệnh tùy theo sức đề kháng
của cá, mùa vụ và chất lƣợng môi trƣờng nƣớc, tỷ lệ nhiễm 20 - 100%. Không có
thuốc trị đặc hiệu [1].
Bệnh hoại tử thần kinh
Bệnh truyền nhiễm cấp tính gây ra bởi Nodavirus tác động vào hệ thần kinh, tỷ
lệ chết có thể 90 - 100% trong vòng 10 ngày. Cá chẽm mắc bệnh có dấu hiệu thân sẫm
màu, bơi vòng tròn mất phƣơng hƣớng, cá nổi lên bề mặt hoặc chìm. Bệnh lây lan qua
niêm mạc mắt mũi, qua vết thƣơng trên da…lây từ cá bệnh sang cá khỏe hoặc lây gián
tiếp qua vật trung gian, lây từ cá bố mẹ sang cá con, gây bệnh từ giai đoạn ấu trùng
đến cá giống nhiều nhất là giai đoạn ấu trùng dƣới 20 ngày tuổi. Thời gian ủ bệnh
khoảng 4 ngày, nhiệt độ gây bệnh rất rộng là 0 - 28oC [2].
1.3.2 Bệnh do vi khuẩn
Bệnh nhiễm khuẩn do Aeromonas sp.
Aeromonas sp. là loài vi khuẩn sinh sản trong môi trƣờng nƣớc, chúng có thể
hiện diện trong mô của cá con hoặc cá trƣởng thành bình thƣờng, nhƣng khi cá bị sốc

môi trƣờng hoặc bị tổn thƣơng, Aeromonas sp. sẽ bộc phát gây bệnh xuất huyết trong
với mức tử vong cao. Các yếu tố nhƣ: nhiệt độ, pH, CO2, O2 thay đổi bất lợi, NH3 tự
do trong nƣớc cao…đƣợc coi là những nguyên nhân có thể gây sốc và gây ra sự tấn
công của Aeromonas sp. vào cơ thể cá. Bệnh xuất hiện quanh năm, nếu kèm với
nấm, bệnh sẽ nặng hơn, tỷ lệ chết 30 - 80% [18].
Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio
Vi khuẩn Vibrio tấn công nhƣ là một trƣờng hợp điển hình của bệnh nhiễm
trùng máu và gây chết. Cá bỏ ăn, bị sẫm màu toàn thân, các đặc trƣng của bệnh bao
gồm: xung huyết các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể, xuất huyết lở loét trên mô da
và cơ, phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm. Gan, lá lách và thận bị xung
huyết và thƣờng kèm theo sự hoại tử. Ruột, trực tràng có thể bị sƣng lên và có dịch
nhờn trong suốt. Bệnh do vi khuẩn Vibrio ở cá con ít biểu hiện rõ triệu chứng lâm
sàng, toàn thân phủ với một lớp chất nhờn, thỉnh thoảng xuất hiện những vết thƣơng
nhỏ nhƣng chƣa lở loét, các vây đuôi và hậu môn bị sƣng đỏ. Cá con chết nhanh hơn


8
cá lớn. Cá trong bể ƣơng chết do bị nhiễm Vibrio thƣờng xuất hiện những đốm đỏ trên
toàn thân, trƣờng hợp cấp tính cá chết khi chƣa có biểu hiện lâm sàng [18].
Bệnh do nhóm vi khuẩn hình trụ
Bệnh do nhóm vi khuẩn hình trụ Plexibacter columnaris gây ra thƣờng gặp ở cá
chẽm nuôi ở nồng độ muối thấp vào suốt mùa mƣa và cả mùa nắng. Biểu hiện bệnh là
xuất hiện những vết thƣơng dạng nhƣ cái yên ngựa ở giữa cơ thể cá. Vết thƣơng xuất
hiện đối xứng hai bên cơ thể có dạng dĩa màu vàng nhạt và biến màu đen ăn sâu vào
da cá. Đây có thể là bệnh mãn ác tính [1].
Bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus
Chủ yếu là Streptococcus iniae, S. agalactiae..., có dạng hình cầu gây ra, bệnh
xuất hiện gây tổn thất lớn, tỷ lệ chết 50 - 100% thƣờng xảy ra khi môi trƣờng nuôi
không thuận lợi, ở những tháng có nhiệt độ cao và cũng có thể xảy ra bất cứ tháng nào
trong năm. Cá giống và cá trƣởng thành đều dễ mắc bệnh này, nhất là cá dƣới 5 tháng

tuổi. Vi khuẩn theo đƣờng thức ăn vào hệ tiêu hóa hoặc qua vết thƣơng ngoài da vào
cơ thể cá, thời gian ủ bệnh 2 - 3 ngày có khi 7 ngày tùy số lƣợng vi khuẩn xâm nhập,
độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cá. Khi cá mắc bệnh có các biểu hiện: bơi
không định hƣớng xoay vòng tròn, thân sẫm màu, bơi trên tầng mặt, mắt lồi, xuất
huyết ở mắt và gốc vây, hậu môn và một số nơi trên cơ thể. Trong cơ quan nội tạng:
xoang bụng chƣớng có dịch đặc, túi mật sƣng sẫm, lá lách sƣng xuất huyết, gan tái,
thận sƣng viêm. Khi bệnh xuất hiện cùng với nấm sẽ làm cho bệnh nặng thêm [18].
Bệnh do nấm
Đây là bệnh truyền nhiễm xảy ra riêng lẻ hoặc kết hợp với virus hay vi khuẩn
hoặc kết hợp cả ba loại tác nhân gây bệnh làm cho bệnh trầm trọng hơn, rất khó điều
trị triệt để. Chính vì thế, việc phòng bệnh luôn đƣợc đặt lên hàng đầu.
1.3.3 Bệnh do nguyên sinh động vật kí sinh
Bệnh do ký sinh trùng Crytocaryon sp.
Crytocaryon sp. là một loài ký sinh nƣớc mặn. Bề mặt của cá bị ký sinh trùng
có những đốt mủ màu trắng hoặc nhiều túi nang nhỏ màu hơi xám, đó là những tổ của
tiêm mao trùng nằm dƣới lớp biểu bì của cá. Ký sinh trùng sẽ sử dụng những tế bào
dƣới lớp biểu mô của cá bị ký chủ và gây kích thích mạnh dẫn đến tình trạng cá tiết
nhiều nhớt và cuối cùng gây hại hoàn toàn bề mặt hô hấp của các tia mang. Trên da, ký


9
sinh trùng gây ra những vết thƣơng lớn phá hoại cả một vùng rộng trên lớp biểu bì. Sự
nhiễm trùng thứ cấp làm cho bệnh thêm trầm trọng và gây chết cá [18].
Bệnh do ký sinh trùng Trichodina sp.
Đây là những nguyên sinh động vật ký sinh nhiều nhất, đặc biệt gây hại cho cá
con. Chúng ký sinh trên mang cá và hơn 50% cá chẽm giống chết do bị nhiễm nặng
loại ký sinh này. Chúng cũng gây nhiều trở ngại cho cá chẽm nuôi lồng ở mật độ cao.
Cá bị bệnh ký sinh này tiết nhiều nhớt, da rƣớm máu, suy nhƣợc nhanh và da bị hoại
tử. Khi cá bị nhiễm bệnh, vây bị rách tả tơi và có thể kèm theo sự biếng ăn hoặc bỏ ăn.
Trƣờng hợp có quá nhiều ký sinh trùng bám vào mang, sẽ ảnh hƣởng đến hô hấp của cá [1].

Bệnh do ký sinh trùng Henneguya sp.
Tiêm mao trùng hay trùng roi thƣờng ký sinh ở trên mang cá nuôi lồng. Trƣờng
hợp bị nhiễm trùng bệnh nặng có thể ký sinh trên da cá. Dấu hiệu bị nhiễm ký sinh
trùng đặc trƣng là lây lan nhanh; mang và cơ thể cá bị viêm dẫn đến hoại tử. Chu kì
sống của trùng roi trải qua giai đoạn bào nang bơi tự do bằng 2 tiêm mao, khi bám vào
vật chủ, trùng chuyển sang giai đoạn sinh trƣởng có dạng túi và có cơ chế ký sinh phức
tạp, chúng hút dinh dƣỡng từ vật chủ và lớn lên rời ký chủ tìm các giá thể để đẻ trứng
bào sát và tạo bào nang [1].
Bệnh do ký sinh trùng Epistylia sp.
Nguyên sinh động vật Epistylia sp. này tìm thấy trên cá chẽm nuôi ở nƣớc
ngọt. Epistylia sp. thƣờng là ngoại cộng sinh, đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh bám
vào cá. Nguyên sinh động vật này có thể sống ở những nhiệt độ khác nhau và khi cá bị
ký sinh nhiều, trên cơ thể sẽ thành từng nhóm bề mặt màu xám [1].
Bệnh do giun ký sinh
Sán đơn chủ Diplectanum latersi thƣờng ký sinh trên mang cá và có thể ký sinh
quanh năm ở cá nuôi trong lồng hay trong ao. Nhiệt độ giữ vai trò quan trọng trong
việc dẫn đến sự bộc phát bệnh do sán lá đơn chủ. Trong các giai đoạn sinh trƣởng của
cá thì giai đoạn cá con có tính mẫn cảm cao nhất với bệnh sán lá đơn chủ.
Sán lá song chủ ký sinh trong ruột cá chẽm thƣờng là Pseudometadena
celebesensis.
Giun tròn có nhiều loài đƣợc phát hiện ở cá chẽm lớn, nhỏ và ấu trùng cá bột,
cá con nhƣng chỉ có 1 vài loài đƣợc xem là mầm bệnh gây nguy hiểm cho cá. Giun
tròn Cucullanus thƣờng thấy trong ruột cá lớn hơn là ruột cá nhỏ.


10
Giun đầu móc mặc dù có vòi với những hàng móc bám đáng sợ nhƣng không
đƣợc xem là gây bệnh nguy hiểm cho cá. Phần lớn giun đầu móc ở cá chẽm thƣờng
thấy ở ruột những con cá trƣởng thành [18].
Các loài giáp xác ký sinh

Giáp xác Caligus sp. chúng bám vào mang cá, xoang miệng, xoang nắp mang,
đôi khi trên da và vây của cá. Nếu mức độ bị ký sinh nặng có thể gây tử vong hàng
loạt đặc biệt là ở cá con.
Giáp xác Lernanthropus sp. thƣờng tìm thấy ở mang cá chẽm nuôi lồng, với số
lƣợng lớn ký sinh trùng này có thể gây bệnh thiếu máu cho cá và dẫn đến cá chết. Giáp
xác Aega sp. thƣờng thấy nhiều ở cá chẽm nuôi lồng, ký sinh trùng này bám vào mang
cá, cá bị nhiễm bệnh biếng ăn thiếu máu và chậm lớn. Cá con bị nhiễm nặng có thể
chết nhanh trong hai, ba ngày [18].
1.4 Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển
1.4.1 Tổng quan về Vibrio spp.
 Hệ thống phân loại: Khóa phân loại của Bergey (1994)
Ngành : Proteobacteria
Lớp : Gamma Proteobacteria
Bộ : Vibrionales
Họ : Vibrionaceae
Giống : Vibrio
Loài: V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. anguillarum,…
 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa
Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram âm, hình que
thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thƣớc 0,3 - 0,5 µm x 1,4 - 2,6 µm. Chúng không sinh
bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Tất
cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Vi khuẩn
không phát triển trong môi trƣờng không muối (NaCl) và không sinh H2S. Phần lớn
các loài Vibrio sống hoại sinh, chỉ một số ít có khả năng lây bệnh cho ngƣời. Một số
chủng Vibrio có khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc. Chúng sống
trong nƣớc ấm và bùn lắng ở đầm hồ và vùng nƣớc lợ ven biển. Vi khuẩn bám vào
chitin của cua và các loại thân mềm, tồn tại trong thịt hay nội tạng của tôm, cua… Đặc


11

trƣng của loài Vibrio là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (8,5 - 9,5) và bị
tiêu diệt nhanh ở môi trƣờng acid [1], [10].
Về cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trƣờng nƣớc, đặc biệt là
nƣớc biển và cửa sông, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và
nhiều loài là nhu cầu cần thiết tuyệt đối.
1.4.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển
Bệnh Vibriosis trên cá biển xảy ra ở khắp nơi trên thế giới ở cả môi trƣờng
nƣớc mặn và các vùng gần cửa sông. Một khi đã bùng phát dịch Vibriosis thì tỷ lệ tử
vong là rất cao và có thể lên đến trên 50 % đối với cá nuôi.
Vibrio anguillarum là loài vi khuẩn đầu tiên thuộc giống Vibrio đƣợc phát hiện
gây bệnh trên cá và nó đã đƣợc phân lập từ cá chình nuôi ở Địa Trung Hải bởi
Canestrini vào năm 1883. Và những năm sau đó, ngƣời ta cho rằng các tác nhân gây
bệnh Vibriosis chính là loài vi khuẩn này. Cho đến nay, có rất nhiều loài Vibrio đã
đƣợc báo cáo là nguyên nhân gây bệnh trên cá biển bao gồm: V. parahaemolyticus, V.
vulnificus, V. alginolyticus, V. carchariae, V. damsela, V. harveyi….
Nghiên cứu của Austin B. và cs (2006) đã xác định V. harveyi là một tác nhân
gây bệnh nghiêm trọng trên cá biển và động vật không xƣơng sống. Đối với cá biển, V.
harveyi gây ra các bệnh: viêm mạch, viêm dạ dày - ruột và tổn thƣơng mắt [7].
Một nghiên cứu khác của Sadok Khouadja và cs (2013) cho thấy độc lực của các
chủng V. parahaemolyticus phân lập từ cá chẽm bệnh ở các trang trại ở Tunisia là rất nguy
hiểm với liều gây chết 50% (LD50) dao động từ 3,52 x 104 và 2,29 x 106 cfu/g cá [17].
Các dấu hiệu bệnh Vibriosis ở cá cũng tƣơng tự nhƣ những bệnh khác do vi
khuẩn gây ra. Bệnh thƣờng bắt đầu với các dấu hiệu là cá bơi lờ đờ, bỏ ăn, xung huyết
các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể. Đặc biệt xuất huyết lở loét trên mô da và cơ,
phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm. Gan, lá lách và thận bị xung huyết và
thƣờng kèm theo sự hoại tử. Ruột, trực tràng có thể bị sƣng lên và có dịch nhờn trong suốt.
Sự quan tâm ngày càng nhiều đối với nghề nuôi cá trên thế giới đã giúp cho vấn đề
dịch bệnh đƣợc hiểu một cách rõ ràng hơn đối với mỗi vùng nuôi, từng hệ thống nuôi và vai
trò của mỗi loài vi khuẩn trong sự bùng nổ của dịch bệnh. Tuy nhiên, qua quá trình tồn tại và
phát triển, các loài vi khuẩn gây bệnh đã có sự biến đổi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc

này đã dẫn đến hiện tƣợng kháng thuốc, có tác hại nghiêm trọng đối với sự phát triển của
nghề nuôi thủy sản nói chung và nuôi cá biển nói riêng.


12
1.4.2.1 Cơ chế gây bệnh
Cơ chế gây bệnh của các loài Vibrio ở cá có điểm khác biệt so với giáp xác. Vì
trong thành phần máu cá có các tế bào hồng cầu, đây là nguồn cung cấp Fe++ cho vi
khuẩn Vibrio sống trên cơ thể cá. Khi cá nuôi có sức đề kháng tốt, các yếu tố môi
trƣờng ổn định, các đại thực bào có thể tăng sinh mạnh và tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh.
Trong trƣờng hợp cá có vấn đề về sức khỏe và điều kiện môi trƣờng thuận lợi cho sự
phát triển của vi khuẩn, số lƣợng đại thực bào không đủ để tiêu diệt vi khuẩn thì chúng
sẽ có cơ hội tấn công vào hệ cơ, mô và các bộ phận khác làm thƣơng tổn và ảnh hƣởng
xấu tới chức năng của các cơ quan này. Vi khuẩn lấy ion Fe++ từ máu cá để hình thành
enzyme protease phục vụ cho quá trình tổng hợp protein của chúng. Từ đó chúng sẽ
gây hoại tử mô cá, dần dần hình thành các vết loét trên cơ thể, tạo điều kiện thuận lợi
cho các tác nhân cơ hội khác xâm nhập.
1.4.2.2 Đặc điểm dịch tễ
Đặc điểm phân bố
Địa lý: bệnh do vi khuẩn Vibrio có thể quan sát đƣợc ở khắp mọi nơi có nghề
nuôi động vật thủy sản nƣớc lợ và nƣớc mặn.
Ký chủ: hầu nhƣ các loài động vật thủy sản nuôi nƣớc lợ, nƣớc mặn đều có thể bị
nhiễm và chịu tác hại của bệnh Vibriosis.
Giai đoạn phát triển: bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng, ấu
niên, cơ thể trƣởng thành…Tuy nhiên, tùy theo từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio có
thể gây nặng ở giai đoạn này và nhẹ hơn ở giai đoạn kia.
Con đƣờng lan truyền: trong hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn xâm nhập vào ao
theo một số con đƣờng: nguồn nƣớc, dụng cụ dùng, đàn giống, thức ăn tƣơi sống…[1]
Mùa vụ xuất hiện
Mùa vụ xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio tùy thuộc theo loài và địa điểm nuôi.

Vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 - 40 ppt, lây lan nhanh ở nhiệt
độ cao (mùa nóng). Phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7 - 9.
Trong bể ƣơng lƣợng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng
mặt. Mật độ vi khuẩn tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào các thời điểm biển
động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo con nƣớc thủy triều [1].


13
Tác hại của bệnh
Bệnh do Vibrio gây ra có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính. Trong
trƣờng hợp cấp tính, tỉ lệ chết có thể là 100% .
1.4.3 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn gây ra
Để hạn chế rủi ro và đạt hiệu quả cao trong nuôi trồng thủy sản thì phòng bệnh
là việc làm hết sức cần thiết. Do động vật thủy sản sống trong nƣớc nên vấn đề phòng
và trị bệnh không giống nhƣ gia súc, gia cầm trên cạn. Các biện pháp trị bệnh không
mang lại hiệu quả cao do phụ thuộc vào quá nhiều yếu tố. Vì vậy, trong nuôi trồng
thủy sản vấn đề phòng bệnh đƣợc đặt lên hàng đầu và nguyên tắc là “phòng bệnh là
chính, chữa bệnh khi cần thiết” [1].
Ngăn chặn sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh:


Xử lý nguồn nƣớc trƣớc khi đƣa vào ao nuôi



Sử dụng đàn bố mẹ và đàn giống không mang mầm bệnh



Sử dụng thức ăn không mang mầm bệnh



Tiêu diệt các tác nhân gây bệnh có sẵn trong ao nuôi



Kìm hãm sự phát triển của tác nhân gây bệnh



Ngăn chặn sự xâm nhập và tiêu diệt các sinh vật là ký chủ trung gian, là các

sinh vật mang tác nhân gây bệnh.
Quản lý môi trƣờng nuôi thích hợp và ổn định:


Thiết kế xây dựng trại nuôi phải phù hợp với điều kiện phòng bệnh cho động

vật thủy sản


Chống ô nhiễm hữu cơ xảy ra trong ao nuôi



Áp dụng các mô hình nuôi ghép, nuôi luân canh và nuôi tổng hợp
Tác nhân gây bệnh luôn luôn tồn tại trong ao nuôi do đó các biện pháp phòng

bệnh chỉ giúp giảm nguy cơ mắc bệnh. Một khi gặp điều kiện thuận lợi, tác nhân gây

bệnh sẽ phát triển và gây bệnh cho vật nuôi. Hiện nay biện pháp chủ yếu dùng để tiêu
diệt vi khuẩn trong ao nuôi là sử dụng thuốc kháng sinh. Một số loại kháng sinh đƣợc
dùng để tiêu diệt vi khuẩn nhƣ Enrofloxacin, Oxytetracyline, Sulfamethazine.
1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu protein màng ngoài của vi khuẩn Vibrio
Phần lớn các nghiên cứu về protein màng ngoài của vi khuẩn Vibrio là nhằm
mục đích phát triển vaccine chống lại chính các chủng vi khuẩn này để phòng ngừa
dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản.


14
Theo kết quả phân tích thành phần protein màng của các chủng Vibrio
alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thƣơng phẩm ở Khánh
Hòa [4] cho thấy thành phần protein của 4 chủng V. alginolyticus là tƣơng tự nhau với
các band protein có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 106; 92; 75; 73; 68; 62; 55; 45; 38;
36; 32; 30; 27,5; 16,4 và 15,5 kDa.
Một kết quả nghiên cứu khác của Koga T. và Kawata T. (1983) khi phân tích
protein màng ngoài tách chiết từ Vibrio parahaemolyticus nuôi cấy trong môi trƣờng
dinh dƣỡng bổ sung 3% NaCl cho thấy có 5 protein với trọng lƣợng phân tử gần đúng
lần lƣợt là 44; 36; 33,5; 26,5 và 22 kDa [11].
Nghiên cứu của Ningqiu L. và cs (2008) đã đƣa ra kết luận là các protein màng
ngoài của Vibrio harveyi, cụ thể là OmpK có một vai trò quan trọng trong sự tƣơng tác
giữa vi khuẩn và ký chủ và là một “ứng cử viên” tiềm năng để phát triển vaccine
chống lại V. harveyi [14].
Zanal Abiddin và cs (2010) đã nghiên cứu phân tử và đặc tính kháng nguyên của
hai loài Vibrio (V. fluvialis và V. mimicus) phân lập từ cá chẽm châu Á. Kết quả của
nghiên cứu cho thấy đối với V. fluvialis, các kháng nguyên protein màng ngoài quan
trọng nhất của tế bào có trọng lƣợng phân tử 50, 60 và 75 kDa. Trong khi đó, đối với
V. mimicus là 40 và 80 kDa. Những protein kháng nguyên này có thể gây đáp ứng
miễn dịch tốt trong sản xuất vaccine chống lại bệnh nhiễm trùng Vibrio [27].
VhhP2 là một protein màng ngoài của V. harveyi đƣợc phân lập từ cá bệnh. Khi

đƣợc sử dụng nhƣ một loại vaccine tiểu đơn vị, VhhP2 tái tổ hợp cho thấy khả năng
bảo vệ cao chống lại sự xâm nhiễm của V. harveyi. Khi cá đƣợc tiêm VhhP2 sẽ có
những biểu hiện của một số gen liên quan đến miễn dịch, đặc biệt là những gen mã hóa
immunoglobulin M (IgM) [19].
Một kết quả nghiên cứu của Poornima M. và cs (2013) đã cho thấy típ huyết
thanh O2a và O2b của V. anguillarum là tác nhân chính gây bệnh cho cá chẽm và
Vibrio anguillarum cũng là một trong những tác nhân chủ yếu gây ra bệnh Vibriosis
trên cá chẽm [16].
Một nghiên cứu khác của Yu L. P. và cs (2013) đã xác định 13 protein màng
ngoài của V. harveyi và phân tích khả năng gây đáp ứng miễn dịch của 13 loại protein
này trên cá Bơn Nhật Bản. Kết quả cho thấy cả 13 loại protein màng của V. harveyi


15
đều gây ra đáp ứng miễn dịch. Trong đó, Omp173 và Omp214 là 2 Omp có thể sản
xuất kháng huyết thanh với tỷ lệ sống trên 70% [26].
1.6 Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide
1.6.1 Sơ lược về lịch sử gel polyacrylamide và sự phát triển của phương pháp điện
di trên gel polyacrylamide
Điện di là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu sinh học
phân tử. Nó cho phép phân tách trọng lƣợng của các phân tử sinh học, từ đó ta có thể
xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử của chúng.
Vào khoảng thập niên 1930 phƣơng pháp điện di đầu tiên trên gel đƣợc biết đến.
Raymond và Winstraub lần đầu tiên giới thiệu về gel polyacrylamide vào năm 1959.
Ornstein và Osborn (1964) thực hiện điện di trên gel polyacrylamide không liên tục.
Beber và Osborn (1969) đã giới thiệu về tác nhân gây biến tính protein là sodium
dodecyl sulfate. Laemmli (1970) phát triển phƣơng pháp SDS - PAGE trong phân tách
thành phần của T4 – phage [4].
1.6.2 Gel polyacrylamide
Acrylamide là một đơn phân tử có cấu trúc: CH2=CH-CO-NH2 và bisacrylamide có cấu trúc: CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2. Acrylamide là một

độc tố thần kinh mạnh, khi hít phải sẽ làm mê mệt. Nó có khả năng thấm qua da khi
tiếp xúc trực tiếp. Hiệu quả độc tố sẽ tích tụ dần. Vì vậy khi thực hiện làm thí nghiệm
với acrylamide nên đeo khẩu trang và găng tay. Tuy nhiên ở dạng đã đƣợc polymer
hóa thành polyacrylamide thì lại không độc.
Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các đơn phân tử
acrylamide và N,N’- methylene-bis-acrylamide. Kích thƣớc lỗ gel phụ thuộc vào chiều
dài của chuỗi polymer và mức độ polymer hóa. Gel polyacrylamide đƣợc mô tả qua 2
đặc điểm: %C và %T.
 Tổng lƣợng đơn phân tử acrylamide chứa trong gel (% T)
%T=

ổ

ể í

 Lƣợng bis-acrylamide chứa trong gel (% C)
% C=


16
Quá trình polymer hóa đƣợc xúc tác bởi Ammoniumpersulfate (APS),
N,N,N’,N’- tetramethylethylenediamine (TEMED). Sử dụng gel polyacrylamide chạy
điện di thì việc chuẩn bị phức tạp hơn so với chạy điện di trên gel agarose.
Sự di chuyển của các phân tử sinh học trên gel phụ thuộc vào kích thƣớc của lỗ
gel, điện tích của phân tử cần phân tách và điện trƣờng. Giới hạn trọng lƣợng phân tử
của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và
bis-acrylamide: Nếu nồng độ gel thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân
tử sinh học có kích thƣớc lớn và ngƣợc lại nếu nồng độ gel cao sẽ tạo ra lỗ gel nhỏ,
cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc nhỏ [4].

Hình 1.3. Quá trình polymer hóa của acrylamide [31]
1.6.3 Phương pháp điện di SDS-PAGE
Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) còn đƣợc gọi là phƣơng pháp điện di trên gel acrylamide không liên
tục và mẫu protein đƣợc gây biến tính (discontinuous and denaturing). SDS là một tác
nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này, protein
đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2-mercaptoethanol
hoặc dithiotheitol (DTT). Khi xử lý protein với 2-mercaptoethanol hay dithiotheitol thì
các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối sulfite (S-S) của protein. Vì vậy, protein từ cấu
trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc một và nhờ sự có mặt của
SDS tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, dƣới tác động của điện trƣờng
sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những
phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi
đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử


17
tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng tạo ra sự phân tách giữa các protein có trọng
lƣợng phân tử khác nhau [12].
1.6.4 Nhuộm gel sau khi điện di
Sau khi điện di, để thấy đƣợc sự phân tách của các band protein trên gel chúng ta cần
phải tiến hành nhuộm gel. Sự lựa chọn phƣơng pháp nhuộm gel đƣợc xác định trên nhiều yếu
tố bao gồm độ nhạy, giải nhuộm, tính kinh tế, thiết bị nhuộm, thiết bị đọc sẵn có.
Nhuộm bằng Coomassie Brillant Blue R-250 là phƣơng pháp nhuộm phổ biến
nhất thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện protein trên gel polyacrylamide. Rất dễ phát
hiện khi có khoảng 0,1 - 1 µg protein trên band. Dung dịch nhuộm bao gồm các thành
phần: 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v), 40% methanol (v/v), 10% acid
acetic (v/v). Tùy theo hàm lƣợng protein mà ta có thể thay đổi tỉ lệ thành phần các chất
cũng nhƣ chất nhuộm
Nếu trên gel chứa polypeptide có trọng lƣợng phân tử thấp thì ta có thể nhuộm

trong hỗn hợp dung dịch: 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v), 40% methanol
(v/v), 10% acid acetic (v/v) khoảng một giờ. Ngoài ra chúng cũng có thể đƣợc nhuộm
với 0,025% Coomassie Brilliant Blue G-250 (w/v) trong methanol và acid acetic từ 12 giờ [8].
1.6.5 Một số yếu tố cần quan tâm trong điện di trên gel polyacrylamide
Hệ đệm điện di và các tác nhân gây biến tính protein
Hệ đệm quyết định nhu cầu về năng lƣợng và ảnh hƣởng đến sự phân tách
protein. Hệ đệm bao gồm đệm dùng để pha gel và đệm dùng để chạy điện di. Hệ đệm
của gel không liên tục đầu tiên đƣợc phát triển bởi Ornstein (1964) và Davis (1964) và
đã đƣợc ứng dụng để phân tách protein nguyên thể, tức là những protein chƣa bị biến
tính. Hệ đệm mà các nhà khoa học sử dụng gồm 4 yếu tố: gel gom dùng đệm Tris HCl pH 6,8; gel phân tác dùng đệm Tris - HCl pH 8,8; đệm điện di Tris - glycine pH
8,3; mẫu cần phân tách dùng đệm Tris - HCl pH 6,8. Nhƣng với hệ đệm đƣợc sử dụng
nhƣ vậy thì trong mô hình này, không thể tiến hành phân tách đƣợc một khoảng rộng
về trọng lƣợng protein.
Dựa trên mô hình và hệ đệm của Ornstein và Davis, Laemmli đã phát triển trong
việc sử dụng thêm tác nhân khử cầu nối disulfite và SDS. Nhờ đó, việc phân tách
protein trên gel chỉ phụ thuộc vào trọng lƣợng phân tử của protein. Do đó, việc phân
tách protein trở nên dễ thực hiện hơn và không bị phụ thuộc vào điện tích của các phân